Name: Herprogrammeren muis embryonale fibroblasten met transcriptiefactoren een Hemogenic Program Laten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Leer hoe je een hemogeen programma induceert in muizenembryonale fibroblasten via transcriptiefactor-overexpressie. Deze methode genereert hematopoëtische voorlopercellen zonder pluripotente tussenstadia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door een NHLBI-subsidie aan K.M. en I.R.L. (1RO1HL119404). Carlos-Filipe Pereira was de ontvanger van een Revson Senior Biomedical Fellowship. We danken hartelijk de Mount Sinai hESC/iPSC Shared Resource Facility en S. D'Souza voor hun hulp met materialen en protocollen. We danken ook de Mount Sinai Flow Cytometry, Genomics en Mouse-faciliteiten.

Ethiek statement: Muis cellijnen zijn afgeleid volgens de richtlijnen van de Icahn School of Medicine op de berg Sinaï verzorging van de dieren, en moet worden gedaan in overeenstemming met enige gastinstelling. 1. muis embryonale fibroblast (MEF) Isolatie van C57BL / 6 muizen <ol><li> Opzetten getimede paring 13. Zodra een vaginale plug wordt gevisualiseerd, overweeg deze Dag 0,5. </li><li> Scheid de aangesloten vrouwtjes op de stekker datum en controleren op hen op de Dag van 10-11 om zwangerschap te bevestigen. </li><li> Op dag 13,5-14,5 euthanaseren zwangere vrouwelijke muizen via CO 2 inhalatie, gevolgd door cervicale dislocatie. </li><li> Weken zwangere vrouw buik met 70% ethanol, ontleden de buikholte met steriele scharen en pincet langs de middellijn en operatief verwijderen baarmoederhoorns met het embryo 14. Haal de embryo&#39;s zachtjes terwijl het afsnijden van de resterende abdominale weefsel. OPMERKING: Recover ongeveer 8 embryo&#39;s met 4 aan elke kant. </li><li> Plaats de baarmoeder hORNs die de embryo&#39;s in een 10 cm schaal met 5-10 ml gekoelde steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). </li><li> Met een steriele schaar en pincet, maak dan een incisie langs de baarmoeder horens aan de zakken die de embryo&#39;s te isoleren. Breng de zakken om een ​​nieuwe 10 cm schotel met 5-10 ml steriele gekoelde PBS en plaats op ijs. </li><li> Plaats een paar van de zakjes in een nieuwe 10 cm schaal met 5-10 ml steriel PBS gekoeld. Met behulp van een steriele schaar en pincet voorzichtig opengesneden de zakken (zonder te snijden te diep) om te voorkomen dat het doorboren van de embryo&#39;s. </li><li> Scheid de embryo&#39;s uit placenta door het snijden van de navelstreng. </li><li> Overdracht van de embryo&#39;s om een ​​nieuwe 10 cm schotel met 5-10 ml koud PBS en laat op ijs bij het invullen van de resterende dissecties. </li><li> Onthoofden het embryo met steriele pincet. Knip voorzichtig langs de middellijn van het embryo met behulp van steriele schaar en pincet, vanaf de onthoofde gebied om het openstellen van de buik. Positie pincet eronder tHij viscerale organen (met inbegrip van het hart, lever en longen) en schrapen ze 15. </li><li> Snijd de resterende weefsel in kleine stukjes met een schaar en pincet overgebracht in een 50 ml conische buis met 10 ml van trypsine. </li><li> Pipet op en neer met een 10 ml pipet 20-30 keer mengen en dissociëren het weefsel. </li><li> Incubeer het weefsel en trypsine mix in een 37 ° C waterbad gedurende 45 min, wervelende af en toe. </li><li> Pipet op en neer met een 10 ml pipet ongeveer 5 minuten om de inhoud te mengen. </li><li> Voeg getrypsiniseerd cellen hoeveelheid gesteld Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) met 10% foetaal runderserum (FBS), 3x 10 ug / ml penicilline / streptomycine (P / S) en 1 mM L-glutamine (L-GLUT) in 10 cm schalen (~ 10 ml) en kweek bij 37 ° C totdat confluente (ongeveer 2-4 dagen). Cultuur ongeveer 1-2 embryo&#39;s per 10 cm schotel. LET OP: Freeze cellen eenmaal platen confluent. Bevroren cellen worden ontdooid en 2 keer doorgekweekt. Cellen kunnen als alternatiefsplit 2 keer voor het invriezen, en dan nog eens na te zijn ontdooid. </li></ol> 2. virusproductie <ol><li> Expand 293T cellen in 10 cm platen met 10 ml DMEM met 10% FBS, 1% P / S, en 1% L-GLUT voor transfectie. <ol><li> Trypsinize 293T cellen met 2 ml trypsine, incubeer bij 37 ° C gedurende 5 min, laat de cellen in 15 ml buizen draaien op 300 xg en plaat passend (10 ml per 10 cm schaal). </li></ol></li><li> 24 uur voorafgaand aan transfectie, splitsen confluente 10 cm plaat van 293T cellen 1: 6 en zaad in 10 cm gelatine beklede (0,1% gelatine in PBS) platen. LET OP: 4 platen per virus nodig zal zijn. <ol><li> Bekleden platen in gelatine, voeg ten minste 2 ml van de 0,1% gelatineoplossing bekleden onderaan 10 cm platen. Incubeer bij 37 ° C gedurende ten minste 20 min. Aspireren uit gelatine voorafgaand aan het toevoegen van cellen aan de platen. </li></ol></li><li> In een 15 ml buis, voeg 84 ug plasmide (bijv Gata2, Gfi1b, cFos of ETV6 (gesubkloneerd in de pFUW-TetO vectof 16) of FUW-M2rtTA 17), 84 ug psPAX2 en 42 ug pMD2.G. Voeg water toe (H 2 O) om het volume tot 2 ml. Bereid een buis voor elke factor (bijv. Gata2, Gfi1b, cFos, ETV6 en FUW-M2rtTA). </li><li> Voeg 250 gl 2M CaCl2 aan elke buis die het mengsel 2 ml bestaande uit 84 ug van het gekozen gen (Gata2, Gfi1b, cFos, ETV6 of FUW-M2rtTA) + 84 ug psPAX2 + 42 ug pMD2.G + H 2 O . </li><li> Met een Pasteur-pipet ingebracht in de pipet-steun afgifte bellen in de 2,25 ml DNA + H 2 O + 2 M CaCl2 mengsel. Aangezien de belletjes worden geproduceerd, plaatst de punt van een P1000 tegen de glazen pipet en langzaam uitwerpen 2 ml van 100 mM N, N-bis (2-hydroxyethyl) -2-aminoethaan sulfonzuur (BES) zoutoplossing langs de Pasteur pipet 1 ml per keer. </li><li> Incubeer alle buizen in de cultuur kap bij kamertemperatuur gedurende ten minste 15 min. LET OP: De 4,25 ml mengsel (nu DNA + H 2 O + 2M CaCl2 </sub&gt; + BES zoutoplossing) zal er enigszins bewolkt. </li><li> Als het mengsel inleggen, zuig media af 293T borden en voeg 10 ml DMEM + 10% FBS + 1 mM L-glutamine + 25 nm chloroquine. LET OP: Deze media niet P / S bevatten. </li><li> Na ten minste 15 min incubatie (of tot het wijzigen van de media op 293T-cellen), H 2 voeg de 4,25 ml DNA + O + 2 M CaCl2 + BES zoutoplossing mengsel druppelsgewijs naar de 293T-cellen, het verspreiden van gelijkmatig verdeeld over 4 cellen platen per buis (gemiddeld iets meer dan 1 ml van het mengsel per plaat). </li><li> Incubeer de platen gedurende de nacht (O / N) bij 37 ° C. </li><li> 24 uur na incubatie media vervangen op alle platen met 4 ml standaard DMEM (zie stap 1.15). </li><li> Houd cellen in een 32 ° C incubator voortaan. </li><li> 24 uur na stap 2,10, het verzamelen van media in afzonderlijke 50 ml buizen. Vervang de verzamelde media uit elke plaat met 4 ml van de standaard DMEM. LET OP: 4 platen per eerste buis mengsel resultaten in 16 ml van de verzamelde media. <ol><li> EENN a 12 uur van incubatie, het verzamelen van de media opnieuw in dezelfde 50 ml buizen en vervangen door een andere 4 ml van de standaard DMEM. </li><li> Na 12 uur incubatie, verzamel de media en voeg dezelfde 50 ml buizen. LET OP: elke buis moet nu bevatten ongeveer 48 ml van de media met virus. </li></ol></li><li> Om de verzamelde virus, eerste filter de verzamelde media concentreren door middel van 0,45 urn laag-eiwit binding filters. </li><li> Giet het gefiltreerde medium dat virus in virale concentratie centrifugebuizen (ongeveer 16 ml per keer). </li><li> Spin bij 4000 xg bij 4 ° C gedurende 25 minuten en verwijder doorstroming. OPMERKING: Een klein volume geconcentreerd media en virussen zijn zichtbaar in het filter. </li><li> Voeg nog 16 ml gefiltreerd virus-bevattende media aan de geconcentreerde media + virus restvolume in het filter en meng door de buis. </li><li> Spinbuis opnieuw bij 4000 xg bij 4 ° C gedurende 25 min en gooi doorstroming. </li><li> Voeg de resterende gefilterdverzameling aan de geconcentreerde media + virus volume links in het filter en meng door de buis. </li><li> Spin opnieuw bij 4000 xg bij 4 ° C gedurende 10-20 min (afhankelijk van het volume in het filter) en om de laatste deel geconcentreerd media + virus nog in het filter ongeveer 1 ml. Indien groter dan 1 ml geconcentreerd media + virus in het filter blijft draaien opnieuw bij 4000 xg gedurende 1 min en herhaal tot 1 ml overblijft in het filter. </li><li> Aliquot 200 ul van het geconcentreerde virus in 1,5 ml buisjes en bevriezen bij -80 ° C of onmiddellijk gebruik. </li></ol> 3. MEF herprogrammeren <ol><li> Pre-coat 6 goed platen met 0,5 ml 0,1% gelatine in PBS per well, ervoor te zorgen dat de gelatine bestrijkt het hele gebied van de put. Plaats in een 37 ° C incubator en incubeer gedurende ten minste 20 min. Na incubatie, verwijder de platen en zuig de gelatine. </li><li> MEF plaat met standaard DMEM bij een dichtheid van 25.000 cellen per putje (150.000 cellenper 6-wells plaat) op de ontsloten 6-well plaat (s) van stap 3,1 en laat O / N zich in een 37 ° C incubator. </li><li> Bereid een 100 ul virus cocktail door 50 gl M2rtTA en de resterende 50 ui van een mengsel van Gata2, Gfi1b, cFos en ETV6 (12,5 pi elk). </li><li> Aspireren media van MEFs en voeg 2 ml standaard DMEM met 8 ug / ml hexadimethrinebromide. </li><li> Transduceren elk putje van de MEF platen met 15 ul van het virus cocktail en geïncubeerd O / N bij 37 ° C. LET OP: Dit is de Dag 0 van de herprogrammering proces. </li><li> Op dag 1 na 16-20 h incubatie media te vervangen door 2 ml vers standaard DMEM aangevuld met 1 ug / ml per putje DOX. </li><li> Bereid hematopoietische kweekmedium aangevuld met hydrocortison (10 -6 M), 100 ng / ml stamcelfactor (SCF), 100 ng / ml-Fms-gerelateerde tyrosine kinase 3 ligand (Flt3L), 20 ng / ml interleukine-3 (IL 3), 20 ng / ml interleukine-6 ​​(IL-6), en 1 ug / ml DOX. </li><li> Op dag 4 aspirate media uit elk putje en wassen cellen met 1 ml PBS per putje. </li><li> Aspireren PBS, dissociëren cellen met behulp van 1 ml 0,05% trypsine per put en het verzamelen van de cellen. </li><li> Aantal cellen met een hemocytometer, rotatie bij 300 xg gedurende 5 minuten, resuspendeer in 12 ml hematopoietische media in stap 3.7 beschreven en plaat 60.000 cellen per 6-well plaat op 0,1% gelatine beklede platen (2 ml per putje, 10.000 cellen per putje ). </li><li> Vervang de media met verse aangevulde hematopoietische cultuur media om de 6 dagen tijdens de duur van de cultuur (35 tot 36 dagen). </li><li> Analyseer middelbaar cellen of opkomende hematopoietische-achtige cellen via immuno-kleuring 12, FACS-analyse 8,12, qRT-PCR 12 en mRNA sequencing 12 tot en met de overname van hemogenic endotheliale of HSC-achtige markers en gen expressie te bevestigen. </li></ol> 4. Placenta Samenvoeging en kiemgetal (CFU) Testen in Methylcellulose <ol><li> Ontleden placenta van zwangere C57BL / 6-muizen zoals eerder beschreven 18 aan E12.5 en houdt weefsel op het ijs. </li><li> Om placenta dissociatie 19 start, wassen placenta weefsel in 2-5 ml 0,2% collagenase type I in PBS met 20% FBS en mechanisch dissociëren met een 18G naald in een 5 ml injectiespuit voorzien door passage van de placenta en PBS door de naald ten minste Drie keer. </li><li> Na mechanische dissociatie Houd placenta cellen in 2-5 ml collagenase oplossing bij 37 ° C gedurende 1,5 uur. </li><li> Passage cellen door 20-25 G naalden aangebracht op 5 ml spuiten meerdere malen verder mechanisch te distantiëren van de cellen van de placenta. </li><li> Filter enkele cel suspensies m 70 micrometer cel zeven. </li><li> Aantal cellen met een hemocytometer en bestralen van 2000 cGy voor mitotische 20 inactivering. </li><li> Voeg 10 ml hematopoietische kweekmedium gesupplementeerd met 100 ng / ml SCF, 100 ng / ml Flt3L, 20 ng / ml IL-3, 20 ng / ml IL-6 en 10 ng / ml trombopoietine (TPO) met een 10 cm schotel. OPMERKING: DOX is niet op dit moment noodzakelijk. </li><li> Plaats een 0,65 urn filter direct op hematopoietische kweekmedia in de schaal, zodat het drijven van een vloeistof-gas-interface en zet de schotel opzij. </li><li> Distantiëren dag 25 getransduceerd MEFs (verkregen uit stap 3,11) zoals beschreven in stap 3,8-3,10 en meng 33.000 van de getransduceerde MEF met 167.000 cellen van de placenta aggregaten van stap 4,6 (1: 6 verhouding). </li><li> Om een aggregaat 18,21, eerste spin langs de MEF en placenta cel mix uit stap 4.9 te genereren gedurende 5 min bij 300 x g. Aspireren de media en resuspendeer de gepelleteerde cellen in 30-50 ul van standaard DMEM met behulp van een P200 pipet, het tekenen van de enkele celsuspensie in de 200 ul nonbevelled pipet tip. </li><li> Afsluiten van de pipet tip met paraffine film. Plaats de geblokkeerde tip in een 15 ml centrifugebuis en spin down gedurende 5 min bij 300 xg zodat een pellet vormt op het bedekte uiteinde van de punt. </li><li> Haal de tip van de 15 ml buis zorgvuldig en plaatsde punt op het uiteinde van het P200 pipet. Gooi de paraffine folie en extrusie van de celpellet op de drijvende filter uit stap 4.8. LET OP: Plate ten hoogste 3 aggregaten per filter. </li><li> Cultuur de aggregaten op de drijvende 0,65 urn filters gedurende 4-5 dagen in 37 ° C met 5% CO2. </li><li> Verzamel de aggregaten (maximaal 3 per filter) met een cel schraper, combineren en verteren met 0,2% collagenase, volgens hetzelfde protocol als gedaan met de hele placenta om de cellen te scheiden (stappen 4,2-4,5). </li><li> Na dissociatie, was de aggregaten met 2-5 ml PBS aangevuld met 5% FBS en spin down cellen bij 300 g gedurende 5 min. </li><li> Resuspendeer de aggregaten in 500 pl DMEM zonder FBS, P / S of L-GLUT. Neem deze 500 ul resuspensie toevoegen aan 3 ml 1% méthylcellulose medium aangevuld met 10 ng / ml TPO, daarbij vermijdt blaasvorming. Plate gelijke volumes van dit mengsel in 3 35 x 10 mm niet-behandelde cultuur gerechten voorCFU assays 12. </li><li> Als controle cultuur bestraald placenta aggregaten zonder menging in reprogrammed MEFs 4-5 dagen plaats CFU assays zoals hierboven beschreven in stappen 4,7-4,16. LET OP: Deze aggregaten alleen niet kolonies vormen. </li><li> Aantal hematopoietische kolonies handmatig onder de microscoop na 10-14 dagen kweken bij 37 ° C met 5% CO2. </li><li> Cytospin 22 kolonies uitgekozen morfologische fenotype van afzonderlijke cellen vertonen. </li></ol>

<ol><li>Zovein, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+tracing+reveals+the+endothelial+origin+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Fate tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3 (6), 625-636 (2008).</li>
<li>Bertrand, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haematopoietic+stem+cells+derive+directly+from+aortic+endothelium+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development.</a> Nature. 464 (7285), 108-111 (2010).</li>
<li>Papapetrou, E. P., Sadelain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstructing+blood+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22F1000+Med+Rep%22%5BJournal%5D)">Reconstructing blood from induced pluripotent stem cells.</a> F1000 Med Rep. 2, (2010).</li>
<li>Szabo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+human+fibroblasts+to+multilineage+blood+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of human fibroblasts to multilineage blood progenitors.</a> Nature. 468 (7323), 521-526 (2010).</li>
<li>Mitchell, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+evidence+for+OCT4-induced+plasticity+in+adult+human+fibroblasts+required+for+direct+cell+fate+conversion+to+lineage+specific+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Molecular evidence for OCT4-induced plasticity in adult human fibroblasts required for direct cell fate conversion to lineage specific progenitors.</a> Stem Cells. 32 (8), 2178-2187 (2014).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Qiu, J., Papatsenko, D., Niu, X., Schaniel, C., Moore, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divisional+history+and+hematopoietic+stem+cell+function+during+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Divisional history and hematopoietic stem cell function during homeostasis.</a> Stem Cell Reports. 2 (4), 473-490 (2014).</li>
<li>Riddell, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+committed+murine+blood+cells+to+induced+hematopoietic+stem+cells+with+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming committed murine blood cells to induced hematopoietic stem cells with defined factors.</a> Cell. 157 (3), 549-564 (2014).</li>
<li>Sandler, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+human+endothelial+cells+to+haematopoietic+cells+requires+vascular+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reprogramming human endothelial cells to haematopoietic cells requires vascular induction.</a> Nature. 511 (7509), 312-318 (2014).</li>
<li>Daniel, M. G., Pereira, C. F., Lemischka, I. R., Moore, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+a+Hematopoietic+Stem+Cell%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Making a Hematopoietic Stem Cell.</a> Trends Cell Biol. , (2015).</li>
<li>Pereira, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+a+hemogenic+program+in+mouse+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of a hemogenic program in mouse fibroblasts.</a> Cell Stem Cell. 13 (2), 205-218 (2013).</li>
<li>Mader, S. L., Libal, N. L., Pritchett-Corning, K., Yang, R., Murphy, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refining+timed+pregnancies+in+two+strains+of+genetically+engineered+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim+%28NY%22%5BJournal%5D)">Refining timed pregnancies in two strains of genetically engineered mice.</a> Lab Anim (NY. 38 (9), 305-310 (2009).</li>
<li>Jain, K., Verma, P. J., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+handling+of+mouse+embryonic+fibroblasts%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and handling of mouse embryonic fibroblasts).</a> Methods Mol Biol. 1194, 247-252 (2014).</li>
<li>Bryja, V., Bonilla, S., Arenas, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Derivation of mouse embryonic stem cells.</a> Nat Protoc. 1 (4), 2082-2087 (2006).</li>
<li>Carey, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+murine+and+human+somatic+cells+using+a+single+polycistronic+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of murine and human somatic cells using a single polycistronic vector.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (1), 157-162 (2009).</li>
<li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+drug-inducible+system+for+direct+reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A drug-inducible system for direct reprogramming of human somatic cells to pluripotency.</a> Cell Stem Cell. 3 (3), 346-353 (2008).</li>
<li>Taoudi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+hematopoietic+stem+cell+generation+in+the+AGM+region+via+maturation+of+VE-cadherin%2BCD45%2B+pre-definitive+HSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Extensive hematopoietic stem cell generation in the AGM region via maturation of VE-cadherin+CD45+ pre-definitive HSCs.</a> Cell Stem Cell. 3 (1), 99-108 (2008).</li>
<li>Gekas, C., K, E. R., H, K. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+analysis+of+hematopoietic+stem+cells+from+the+placenta%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and analysis of hematopoietic stem cells from the placenta.</a> J Vis Exp. (16), (2008).</li>
<li>Lewis, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Umbilical+cord+blood+cells+capable+of+engrafting+in+primary%2C+secondary%2C+and+tertiary+xenogeneic+hosts+are+preserved+after+ex+vivo+culture+in+a+noncontact+system%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Umbilical cord blood cells capable of engrafting in primary, secondary, and tertiary xenogeneic hosts are preserved after ex vivo culture in a noncontact system.</a> Blood. 97 (11), 3441-3449 (2001).</li>
<li>Sheridan, J. M., Taoudi, S., Medvinsky, A., Blackburn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+the+generation+of+reaggregated+organotypic+cultures+that+permits+juxtaposition+of+defined+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">A novel method for the generation of reaggregated organotypic cultures that permits juxtaposition of defined cell populations.</a> Genesis. 47 (5), 346-351 (2009).</li>
<li>Koh, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+cells+for+microscopy+using+cytospin%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Preparation of cells for microscopy using cytospin.</a> Methods Enzymol. 533, 235-240 (2013).</li>
<li>Orkin, S. H., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoiesis%3A+an+evolving+paradigm+for+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology.</a> Cell. 132 (4), 631-644 (2008).</li>
<li>Martinez-Agosto, J. A., Mikkola, H. K., Hartenstein, V., Banerjee, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hematopoietic+stem+cell+and+its+niche%3A+a+comparative+view%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The hematopoietic stem cell and its niche: a comparative view.</a> Genes Dev. 21 (23), 3044-3060 (2007).</li>
<li>Butler, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+vascular+niche+platform+for+expansion+of+repopulating+human+cord+blood+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Development of a vascular niche platform for expansion of repopulating human cord blood stem and progenitor cells.</a> Blood. 120 (6), 1344-1347 (2012).</li>
<li>Gori, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+niche+promotes+hematopoietic+multipotent+progenitor+formation+from+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Vascular niche promotes hematopoietic multipotent progenitor formation from pluripotent stem cells.</a> J Clin Invest. 125 (3), 1243-1254 (2015).</li>
<li>Bar-Nur, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+conversion+induced+by+pluripotency+factors+involves+transient+passage+through+an+iPSC+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Lineage conversion induced by pluripotency factors involves transient passage through an iPSC stage.</a> Nat Biotechnol. 33 (7), 761-768 (2015).</li>
<li>Maza, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+acquisition+of+pluripotency+during+somatic+cell+transdifferentiation+with+iPSC+reprogramming+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Transient acquisition of pluripotency during somatic cell transdifferentiation with iPSC reprogramming factors.</a> Nat Biotechnol. 33 (7), 769-774 (2015).</li>
<li>Kim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+memory+in+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).</li>
<li>Vaskova, E. A., Stekleneva, A. E., Medvedev, S. P., Zakian, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Epigenetic+memory%3A+phenomenon+in+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Naturae%22%5BJournal%5D)">"Epigenetic memory: phenomenon in induced pluripotent stem cells.</a> Acta Naturae. 5 (4), 15-21 (2013).</li>
<li>Elcheva, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+induction+of+haematoendothelial+programs+in+human+pluripotent+stem+cells+by+transcriptional+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Direct induction of haematoendothelial programs in human pluripotent stem cells by transcriptional regulators.</a> Nat Commun. 5, 4372(2014).</li>
<li>Vereide, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+expandable%2C+inducible+hemangioblast+state+regulated+by+fibroblast+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">An expandable, inducible hemangioblast state regulated by fibroblast growth factor.</a> Stem Cell Reports. 3 (6), 1043-1057 (2014).</li>
<li>Batta, K., Florkowska, M., Kouskoff, V., Lacaud, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+reprogramming+of+murine+fibroblasts+to+hematopoietic+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Direct reprogramming of murine fibroblasts to hematopoietic progenitor cells.</a> Cell Rep. 9 (5), 1871-1884 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Genereren HSPCs de novo uit makkelijk bereikbaar somatische cellen een unieke methode om hematopoëse in vitro, en de mogelijkheid te bestuderen om potentieel deze technologie toe te passen op het menselijk lichaam. Deze vertaling zou een nieuw instrument genereren menselijke hematologische ziekte te bestuderen in een schotel, en verstrekt drug testplatformen en gene targeting mogelijkheden talrijke aandoeningen met nieuwe therapieën of HSC transplantaties behandelen. Ter plaatse recente studies uitgebr...

Hematopoiese is een complex ontwikkelingsproces waarbij hematopoietische stamcellen (HSCs) knop uit hemogenic endothelium aanwezig in diverse embryonale hematopoietische sites zoals de aorta-Gonade-mesonephros en placenta 1,2. Het onvermogen cultuur HSCs in vitro voorkomt de grondige analyse van dit proces en de klinische toepassing van deze studies. Om deze beperking te omzeilen, hebben eerdere studies geprobeerd om af te leiden HSC de novo hetzij via differentiatie van pluripotente stamcellen (PSC) 3, of geïnduceerde plasticiteit in somatische cellen en geregisseerd differentiatie met behulp van het herprogrammeren van media 4,5. Deze onderzoeken echter genereren geen klinisch veilig engraftable cellen of toestaan ​​studie van ontwikkeling definitieve hematopoiese &quot;in een schotel.&quot; De roman werk die door Yamanaka en collega&#39;s voor het genereren van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) van somatische fibroblasten provides een kader voor transcriptiefactor (TF) op basis van overexpressie strategieën herprogrammering lot van de cel 6,7. Dit werk is in verschillende gebieden gevraagd onderzoekers om celtypen van keuze te genereren via TF herprogrammering van gemakkelijk verkrijgbaar somatische cellen. Het doel van de herprogrammering strategie hier beschreven een hemogenic werkwijze uit muizen somatische cellen met een TF gebaseerde herprogrammering benadering met als doel deze bevindingen neerkomt op het menselijke systeem patiëntspecifieke fibroblasten herprogrammeren om humane hematopoiese onderzoeken in vitro en induceren genereren patiëntspecifieke bloedproducten ziektemodel, drug testen en stamceltransplantatie. De eerste stap om juiste herprogrammering in deze muis te verzekeren werd een reporter lijn die diende als een uitlezing voor CD34 expressie, een bekende merker in endotheliale progenitorcellen en HSCs ontwikkelen. Om dit te doen, werden de huCD34-tTA en TetO-H2BGFP transgene muis lijnen gebruikt om generate dubbele transgene muis embryonale fibroblasten (MEF), nu aangeduid 34 / H2BGFP, dat groene bij activering van de CD34 promotor 8 fluoresceren. Dit maakte screening van verschillende TF bekend vereist op verschillende momenten tijdens hematopoietische specificatie en ontwikkeling. Beginnend met 18 TF&#39;s in PMX retrovial vectoren (bepaald door middel van literatuur en profilering van GFP label behoud van HSC uit de eerder beschreven 34 / H2BGFP muizen), 34 / H2BGFP MEFs werden getransduceerd met alle factoren en gekweekt op AFT024 HSC-ondersteunende stromale cellen. Na de detectie van 34 / H2BGFP activering, werden TF vervolgens verwijderd uit de herprogrammering cocktail tot de optimale set van TFS reporter activering werd geïdentificeerd. Na deze eerste screen werden de factoren naar een DOX pFUW induceerbaar vectorsysteem voor expressie regelbaar van het TF mogelijk. Aangezien beide DOX controleerbare onverenigbaar (de 34 / H2BGFP cellen en de pFUW induceerbare vectoren), MEF uitwild-type C57BL / 6 muizen werden vereist. Het was ook nodig om een ​​geschikte micro-omgeving te laten hemogenesis om verder te gaan en maak multilineage klonogene voorlopercellen te bieden. Huidige studies een poging om somatische cellen te herprogrammeren in hematopoietische stamcellen en voorlopercellen (HSPCs) hebben uiteenlopende niveaus van succes 9-11 voldaan. Tot op heden heeft het opwekken van zowel muis en mens transplantable HSPCs met de lange termijn en zelf-vernieuwing repopulatie vermogen niet is bereikt met behulp van dezelfde set van TF&#39;s. In dit protocol bieden wij een gedetailleerde beschrijving van de eerder vastgestelde strategie reproduceerbaar hemogenesis induceren in MEFs. We tonen aan dat de invoering van een minimaal aantal TF&#39;s (Gata2, Gfi1b, cFos en ETV6) kan aanzetten tot een complex ontwikkelingsprogramma in vitro dat een platform waarmee ontwikkeling hematopoiese en klinische toepassing van hematopoietische herprogrammering verder kan worden onderzocht 12 verschaft.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &mu;M filters</td><td>Corning</td><td>430625</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra centrifugal filters</td><td>Millipore</td><td>UFC900324</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gemini's Benchmark</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>18 G naalden</td><td>BD</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>20 G naalden</td><td>BD</td><td>305175</td><td></td></tr><tr><td>25 G naalden</td><td>BD</td><td>305125</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type I</td><td>Sigma</td><td>C0130-100MG</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Invitrogen</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>Myelocult media</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>M5300</td><td></td></tr><tr><td>SCF</td><td>R &amp; D Systems</td><td>455-MC</td><td></td></tr><tr><td>Flt3L</td><td>R &amp; D Systems</td><td>427-FL</td><td></td></tr><tr><td>IL-3</td><td>R &amp; D Systems</td><td>403-ML</td><td></td></tr><tr><td>IL-6</td><td>R &amp; D Systems</td><td>406-ML</td><td></td></tr><tr><td>TPO</td><td>R &amp; D Systems</td><td>488-TO</td><td></td></tr><tr><td>Doxycycline</td><td>Sigma</td><td>D9891-1G</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene (hexadimethrine bromide)</td><td>Sigma</td><td>AL-118</td><td></td></tr><tr><td>Durapore 0.65 &mu;M membraanfilters</td><td>Millipore</td><td>DVPP14250</td><td></td></tr><tr><td>Methylcellulose media</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>Methocult M3434</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortison</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>07904</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 muizen</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine</td><td>Sigma</td><td>G-1890 100g</td><td></td></tr><tr><td>pFUW-tetO</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #20321</td><td></td></tr><tr><td>Gata2</td><td>Origene</td><td>MR226728</td><td></td></tr><tr><td>Gfi1b</td><td>Origene</td><td>MR204861</td><td></td></tr><tr><td>cFos&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #19259</td><td></td></tr><tr><td>Etv6</td><td>Origene</td><td>MR207053</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #12260</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #12259</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C5670-100g</td><td></td></tr><tr><td>FUW-M2rtTA</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #20342</td><td></td></tr><tr><td>35 mm x 10 mm kweekschotels</td><td>Thermo Scientific</td><td>171099</td><td></td></tr></tbody></table>

herprogrammeren muis embryonale fibroblasten met transcriptiefactoren een hemogenic program laten

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

Dit protocol beschrijft de inductie van een hemogenetisch programma in muis embryonale fibroblasten (MEF's) via overexpressie van transcriptiefactoren (TF's). We ontwierpen eerst een reporterscreening met behulp van MEF's van humane CD34-tTA/TetO-H2BGFP (34/H2BGFP) dubbel transgene muizen. CD34+ cellen van deze muizen labelen H2B histonen met GFP en stoppen met labelen bij toevoeging van doxycycline (DOX). MEFS werden getransduceerd met kandidaat TF's en vervolgens waargenomen op het ontstaan van GFP+ cellen die zouden wijzen op het verkrijgen van een hematopoietische of endotheelcelbestemming. Beginnend met 18 kandidaat TF's, en door middel van een proces van combinatorische eliminatie, verkregen we een minimale set factoren die de hoogste percentage GFP+ cellen zou induceren. We ontdekten dat Gata2, Gfi1b en cFos noodzakelijk waren en dat de toevoeging van Etv6 de optimale inductie bood. Een reeks genexpressieanalyses uitgevoerd op verschillende tijdstippen tijdens het herprogrammeringsproces onthulde dat deze cellen door een precursorcel leken te gaan die een endotheel naar hematopoietische transitie (EHT) onderging. Als zodanig bootst dit herprogrammeringsproces ontwikkelingsmatige hematopoëse "in een schaal" na, waardoor het mogelijk is om hematopoëse in vitro te bestuderen en een platform te bieden om de mechanismen die ten grondslag liggen aan deze specificatie te identificeren. Deze methodologie biedt ook een raamwerk voor de translatie van dit werk naar het menselijk systeem in de hoop een alternatieve bron van patiëntspecifieke hematopoëtische stamcellen (HSC's) te genereren voor een aantal toepassingen in de behandeling en studie van hematologische ziekten.

Hematopoiese is een complexe ontwikkelingsstoornis proces dat begint in verschillende embryonale sites. Hemogenic endotheelcellen wonen in deze sites en aanleiding geven tot HSC via de mobiele ontluikende 23 geven. Dit proces kan op dit moment niet worden gereproduceerd door het plaatsen van HSC of hematopoietische voorlopers in de cultuur, noodzakelijk een methode om deze cellen in vitro of andere manier te verkrijgen, hetzij door HSPC uitbreiding ex vivo of...

Het hier beschreven protocol beschrijft de inductie van een hemogenetisch programma in muis embryonale fibroblasten via overexpressie van een minimale set transcriptiefactoren. Deze technologie kan worden toegepast op het menselijk systeem om platforms te bieden voor toekomstig onderzoek naar hematopoëse, hematologische ziekten en hematopoietische stamceltransplantatie.

Herprogrammeren muis embryonale fibroblasten met transcriptiefactoren een Hemogenic Program Laten

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

Het algemene doel van dit hemogene inductieprotocol is om via overexpressie van transcriptiefactoren een ontwikkelingsproces in muis fibroblasten op te wekken, om zo in vitro hematopoëtische precursorcellen te genereren die na langdurige kweek hematopoëtische cellen produceren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de hematopoëtische programmering, zoals de vraag of er een protocol ontwikkeld kan worden om de novo echte HSC's te verkrijgen die in staat zijn tot multi-lineage differentiatie en transplantatie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat door overexpressie van een minimale set transcriptiefactoren het ontwikkelingsproces kan worden geïnitieerd in gereprogrammeerde cellen zonder dat een passage via een pluripotente tussenstap vereist is.Nadat de muizenembryonale fibroblasten of MEFS zijn gekweekt en het virus volgens het tekstprotocol is geproduceerd, wordt 0,1 procent gelatine in PBS gebruikt om 6-well platen voor te coaten. Zorg ervoor dat de gelatine het gehele oppervlak van de well bedekt. Plaats de platen gedurende ten minste 20 minuten in de incubator bij 37 °C.Verwijder vervolgens de platen en aspireer de gelatine. Zaai MEFs uit in standaard DMEM met een dichtheid van 25, 000 cellen per well en laat de cellen overnight bezinken bij 37 °C. Bereid een viruscocktail van 100 µL voor door 50 µL M2RTTA te mengen met telkens 12,5 µL GATA2, GFI1B, CFOS en ETV6.Aspireer het medium van de MEFS en voeg twee milliliters standaard DMEM toe met 8 micrograms per milliliters hexadimethrinebromide. Transduceer vervolgens elke put met MEFs met 15 microliters van het viruscocktail en incubeer gedurende de nacht bij 37 degrees celsius. Vervang na 16 tot 20 uur incubatie het medium in elke put door twee milliliters vers standaard DMEM, aangevuld met one microgram per milliliter DOX.Incubeer gedurende drie dagen bij 37 °C. Bereid op dag vier hematopoëtisch cultuurmedium voor, aangevuld met hydrocortison, stem cell factor, MFS-gerelateerde tyrosinekinase drie ligand, interleukine 3, interleukine 6 en DOX. Aspireer vervolgens het medium van de MEF's en gebruik 1 mL PBS om de cellen te wassen.Aspireer daarna de PBS en voeg één milliliter 0,05 procent trypsine per putje toe om de cellen te dissociëren en te oogsten. Tel de cellen met behulp van de hemocytometer, centrifugeer deze vervolgens bij 300 ×g gedurende vijf minuten en gebruik 12 milliliter van het zojuist bereide hematopoëtische medium om de cellen te resuspenderen. Zaai daarna 10.000 cellen per putje uit op met gelatine gecoate zeswellplaten.Vervang elke zes dagen het medium door vers aangevuld hematopoëtisch kweekmedium gedurende de gehele cultuurperiode. Analyseer de cellen volgens het tekstprotocol. Na het dissekeren van placenta's van drachtige muizen volgens het tekstprotocol, gebruik twee tot vijf milliliter 0,2 procent collagenase type één in PBS met 20 procent FBS om het weefsel te wassen en ontbind het weefsel mechanisch in de PBS-oplossing met een 18 gauge naald op een spuit van vijf milliliter.Incubeer de placentacellen in twee tot vijf milliliters collagenase-oplossing bij 37 °C gedurende 1,5 uur. Passeer de cellen vervolgens meerdere keren door naalden van 20 tot 25 gauge, gemonteerd op spuiten van 5 milliliter, om ze verder mechanisch te dissociëren. Filtreer daarna de suspensies van enkelvoudige cellen door celzeven van 70 micron.Tel vervolgens de cellen met een hemocytometer en bestraal deze bij 2 000 centigray volt voor mitotische inactivatie. Voeg tien milliliter hematopoëtisch kweekmedium, aangevuld met de volgende bestanddelen, toe aan een schaal van tien centimeter. Plaats het filter van 0,65 micron direct op het kweekmedium in de schaal, zodat dit kan drijven om een vloeistof-gasinterface te creëren, en zet de schaal opzij.Dissocieer de getransduceerde MEF's van dag 25 zoals eerder in deze video gedemonstreerd en meng 33.000 van de getransduceerde MEF's met 167.000 cellen van de mitotisch geïnactiveerde placentale aggregaten. Om een aggregaat te genereren, centrifugeer het mengsel van MEF- en placentacellen bij 300 ×g gedurende vijf minuten. Aspireer het medium en gebruik 30 tot 50 µL standaard DMEM om de gepelletteerde cellen te resuspenderen, waarbij de single-cell suspensie wordt opgenomen in een niet-gefaceteerde pipetpunt van 200 µL.Sluit vervolgens de pipetpunt af met paraffinefolie. Plaats de geblokkeerde punt daarna in een centrifugebuis van 15 milliliter en centrifugeer deze 5 minuten bij 300 ×g, zodat er een pellet vormt aan het afgedekte uiteinde van de punt. Verwijder de punt voorzichtig uit de buis van 15 milliliter en plaats deze op het uiteinde van een P200-pipet.Verwijder de paraffinefolie en druk de celpellet door het filter dat in de schaal met kweekmedium drijft. Kweek de aggregaten op de drijvende filters bij 37 °C en vijf procent koolstofdioxide gedurende vier tot vijf dagen. Verzamel de aggregaten met een celscraper, voeg deze vervolgens samen en gebruik 0,5 procent collagenase om ze te verteren.Na dissociatie worden de aggregaten gewassen met twee tot vijf milliliter PBS met vijf procent FBS en vervolgens vijf minuten gecentrifugeerd bij 300 ×g. Resuspendeer de aggregaten in 500 µL DMEM zonder FBS, Pen-Strep of L-glutamine. Voeg de gehele suspensie toe aan drie milliliter methylcellulosemedium van één procent, aangevuld met tien ng/mL Tepo, waarbij u zorgvuldig voorkomt dat er bellen ontstaan.Plateer gelijke volumes van dit mengsel in drie niet-behandelde cultuurschalen van 35 bij tien millimeter voor CFU-assays. Kweek als controle bestraalde placentale aggregaten. Tel tot slot de hematopoëtische koloniën handmatig onder een microscoop na tien tot 14 dagen kweek bij 37 °C met 5% CO₂.Tijdens het proces van het herprogrammeren van MEF's tot HSC's worden cellen getransduceerd met transcriptiefactoren, zoals hier wordt getoond. Na drie dagen expansie en blootstelling aan DOX om de activering van het transgen te starten, worden de cellen gedissocieerd, gesplitst en gekweekt op met gelatine gecoate platen in aangevuld hematopoëtisch medium. Op dag 20 in kweek, na transductie met herprogrammeringsmedium, vertonen 34/H2BGFP MEF's duidelijke morfologische veranderingen, waaronder een endotheliale morfologie die onderscheidend is van die van MEF's.Verdere kweek tot dag 35 resulteert in het ontstaan van verschillende ronde hematopoëtische-achtige cellen uit de endotheel-achtige intermediairen die GFP-positief zijn en positief kleuren voor de hematopoëtische markers Sca1 en CD45. Verdere kweek resulteert in cellen die CD45 tot expressie brengen terwijl de expressie van de humane CD34-reporter behouden blijft. Na placentale aggregatie verkrijgen de gekweekte cellen clonogeen potentieel en genereren zij kolonies in methylcellulose die verschillende hematopoëtische morfologieën en blast-achtige cellen bevatten.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om elk gedeelte langzaam te doorlopen om verwarring te voorkomen. Eventuele fouten zullen pas weken na de start van de herprogrammering merkbaar zijn. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals assays voor het vormen van kasseistructuren (cobblestone-forming cell assays) en assays voor het initiëren van langetermijnculturen, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals of de afgeleide cellen daadwerkelijk hematopoëtische functies bezitten zoals aangetoond in de functionele assays.Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van hematopoëtische stamcelprogrammering om andere herprogrammeringsstrategieën en optimalisatieprotocollen in bloed-, endotheel- en andere celtypen te verkennen. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe een hemogeen programma in muis-fibroblasten kan worden geïnduceerd, de overexpressie van transcriptiefactoren en hoe de afgeleide cel functioneel kan worden geanalyseerd. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

reprogramming-mouse-embryonic-fibroblasts-with-transcription-factors

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Deze video toont de procedure voor het genereren van geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van induceerbare lentivirus die uitdrukken Oct4, Sox2, c-Myc en Klf4.

Het genereren van iPS Cellen van MEF door gedwongen Expressie van Sox-2, okt-4, c-Myc en Klf4

De Stemgent Dox Induceerbare Mouse TF lentivirus Set kan herprogrammeren muis embryonale fibroblasten (MEF) om geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen. Hier hebben we het protocol voor DOX-induceerbare expressie van muis herprogrammering transcriptiefactoren Oct4 te tonen, om Sox2, Klf4 en c-Myc genereren iPS kolonies die uitdrukken gemeenschappelijke MES pluripotentie markers.

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen door herprogrammeren embryonale fibroblasten van muizen met een vier transcriptiefactor, Doxycycline Induceerbare Lentivirale transductiesysteem

Muis embryonale fibroblasten kunnen met lage efficiëntie worden gereprogrammeerd tot geïnduceerde pluripotente stamcellen door de geforceerde expressie van transcriptiefactoren Oct-4, Sox-2, Klf-4, c-Myc. De zeldzame tussenproducten van de herprogrammeringsreactie worden via FACS geïsoleerd door middel van labeling met antilichamen tegen celoppervlaktemarkers Thy-1.2, Ssea-1 en Epcam.

Celoppervlaktemerker Mediated Zuivering van iPS Cell Intermediates van een Herprogrammeerbare muismodel

Dit protocol beschrijft de efficiënte inductie van hemogene endotheel en multipotente hematopoietische progenitorcellen van menselijke pluripotente stamcellen via de geforceerde expressie van transcriptiefactoren.

Direct Inductie van Hemogenic Endotheel en Bloed door overexpressie van transcriptiefactoren in menselijke pluripotente stamcellen

Dit manuscript beschrijft een stapsgewijs protocol voor het genereren en kwantificeren van diverse geherprogrammeerde hartsubtypen met behulp van een retrovirus-gemedieerde levering van Gata4, Hand2, Mef2c en Tbx5.

Het beoordelen van Cardiomyocyte Subtypen Na transcriptie Factor-gemedieerde herprogrammeren van muis embryonale fibroblasten

Hier presenteren we een robuuste methode om te herprogrammeren primaire embryonale fibroblasten in functionele cardiomyocytes via overexpressie van GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 en miR-133 (GHMT2m) naast remming van TGF-β signalering. Ons protocol genereert kloppend cardiomyocytes zo spoedig 7 dagen na transductie met korting tot 60% efficiëntie.

Onderdrukking van Pro-fibrotische signalering Potentiates Factor-gemedieerde herprogrammering van muis embryonale fibroblasten in geïnduceerde Cardiomyocytes

Hier presenteren wij ons protocol voor produceren geïnduceerde erythroid progenitoren (iEPs) van volwassen fibroblasten muis met behulp van transcriptie factor-gedreven directe bloedlijn herprogrammering (DLR).

Directe bloedlijn herprogrammering van volwassen muis Fibroblast te Erythroid voorlopercellen

Dit protocol demonstreert de inductie van een hemogeen programma in menselijke dermale fibroblasten door afgedwongen expressie van de transcriptiefactoren GATA2, GFI1B en FOS om hematopoietische stam en voorlopercellen te genereren.

Hemogene herprogrammering van menselijke fibroblasten door afgedwongen expressie van transcriptiefactoren

Experimentele validatie van enhancer-activiteit wordt het beste benaderd door middel van functieverliesanalyse. Hier wordt een efficiënt protocol gepresenteerd dat CRISPR/Cas9-gemedieerde deletie gebruikt om allelspecifieke regulatie van genregulatie in F1 ES-cellen te bestuderen die een hybride genoom bevatten (Mus musculus129 x Mus castaneus).

Het genereren van CRISPR / Cas9 Mediated monoallelische verwijderingen in Enhancer-functie van muis embryonale stamcellen Studie

Hematopoietische stamcellen en progenitorcellen (HSPC) afgeleid van gespecialiseerde (hemogenic) endotheelcellen tijdens de ontwikkeling, maar weinig bekend over het proces waarbij sommige endotheelcellen specificeren bloedvormende worden. We tonen een stroom-cytometrie-gebaseerde methode waarmee gelijktijdige isolatie van hemogenic endotheelcellen en HSPC van muizen embryonale weefsels.

Isolatie van muizen embryonale Hemogenic endotheelcellen

Leer hoe je een hemogeen programma induceert in muizenembryonale fibroblasten via transcriptiefactor-overexpressie. Deze methode genereert hematopoëtische voorlopercellen zonder pluripotente tussenstadia.

Herprogrammeren muis embryonale fibroblasten met transcriptiefactoren een Hemogenic Program Laten

Meer video's verkennen