Meten van Lactase enzymatische activiteit in het onderwijs Lab
6 augustus 2018
De enzymatische activiteit van lactase is essentieel voor de katabole verwerking van het disaccharide lactose. Hier is de activiteit van lactase gevonden in voedingssupplementen vehiculumcontrolegroep met behulp van een colorimetrische bepaling. Dit biedt studenten met een experimenteel platform voor het begrijpen van de activiteit van de lactase en enzym kinetiek.
Deze methode is een nuttige tool om studenten kennis te laten maken met de concepten die enzymreacties beheersen. Het grote voordeel van deze techniek is dat het geschikt is voor studenten met zeer weinig natte laboratoriumervaring, en het geeft robuuste resultaten die de studenten kunnen observeren en interpreteren. Om het protocol te starten, moet je een 15 milliliter buisje met suspensie labelen.
Vermaal één lactase tablet, die 200 milligram enzym bevat, met een vijzel en stamper tot een gelijkmatige poeder. Doe het resulterende poeder in de gelabelde buis en breng het opnieuw in suspensie in 10 milliliter 100 millimolar fosfaat gebufferde zoutoplossing, of PBS. Vortex de oplossing gedurende één minuut om de enzymextractie te maximaliseren.
Breng vervolgens één milliliter van de suspensie over naar een 1,5 milliliter buisje en centrifugeer het monster gedurende één minuut bij 10.000 keer G om de vaste deeltjes te sedimenteren. Breng 500 microliter van het supernatant over naar een schoon 1,5 milliliter buisje gelabeld lactase extract. Doe 390 microliter van 100 millimolar PBS in een 1,5 milliliter buisje gelabeld reactie A. Voeg vervolgens 100 microliter van vijf millimolar ONPG oplossing toe en meng goed door te vortexen.
Voeg 10 microliter extract toe aan de reactie A buis en vortex de inhoud. Observeer het reactiemengsel vaak gedurende vijf minuten en noteer eventuele colorimetrische veranderingen van de oplossing. Zet twee 1,5 milliliter buisjes op, één gelabeld reactie B, één gelabeld controle.
Voeg 390 microliter van 100 millimolar PBS toe aan de reactie B buis, 400 microliter van 100 millimolar PBS aan de controlebuis en vervolgens 100 microliter van vijf millimolar ONPG aan elke buis. Meng de inhoud door te vortexen. Voeg 10 microliter lactase extract toe aan de reactie B buis, meng door te vortexen en laat de reactie een minuut op kamertemperatuur doorgaan.
Zodra een minuut is verstreken, voeg 500 microliter van een molaar natriumcarbonaat toe aan beide buisjes om het lactase-enzym te remmen door de pH te verhogen, waardoor de reactie stopt. Breng 500 microliter van elk buisje over in schone spectrofotometer cuvetten en meet de absorptie bij 420 nanometer. Zet drie controlebuisjes en drie reactiebuisjes op en label ze met vier graden Celsius, kamertemperatuur en 37 graden Celsius.
Na de toevoeging van het enzymextract, incubeer één buisje op ijs, één bij kamertemperatuur en één bij 37 graden Celsius in een voorverwarmd waterbad gedurende één minuut. Stop vervolgens de reactie door 500 microliter van een molaar natriumcarbonaat toe te voegen aan elk buisje. Meet de absorptie bij 420 nanometer voor elk buisje.
Noteer de waarden, trek in elke geval de controlewaarde af van de reactiewaarde. Volgens het protocol blijft de controle helder, terwijl de reactieoplossing die extract van de lactase tablet bevat, geel wordt als ONPG wordt gehydrolyseerd, waarbij ortho nitrofenol vrijkomt. Na analyse van monsters met behulp van de spectrofotometer is de productie van ortho nitrofenol het laagst wanneer de reactie op ijs wordt geïncubeerd en het hoogst wanneer de reactie wordt uitgevoerd bij 37 graden Celsius.
Wanneer je deze procedure uitvoert, is het belangrijk om te onthouden dat de reacties op de juiste temperatuur moeten zijn voordat je het enzymextract toevoegt.
Overzicht
Dit artikel presenteert een colorimetrische assay om de enzymatische activiteit van lactase te meten, wat essentieel is voor de vertering van lactose. De methode is ontworpen voor studenten met minimale ervaring in het natte laboratorium, zodat zij enzymkinetiek effectief kunnen observeren en interpreteren.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Biochemie
- Enzymkinetiek
- Educatie in laboratoriumtechnieken
Achtergrond
- Lactase is een enzym dat lactose afbreekt tot glucose en galactose.
- Het begrijpen van enzymactiviteit is fundamenteel in de biochemie en aanverwante vakgebieden.
- Colorimetrische assays bieden een visuele weergave van enzymatische reacties.
- Deze methode is toegankelijk voor studenten met beperkte laboratoriumervaring.
Doel van de studie
- Studenten kennis laten maken met enzymkinetiek via een praktijkexperiment.
- Een betrouwbare methode bieden voor het meten van de lactase-activiteit.
- Het begrip van de factoren die enzymreacties beïnvloeden vergroten.
Gebruikte methoden
- Bereiding van lactase-extract uit voedingssupplementen.
- Colorimetrische meting van de productie van ortho-nitrofenol.
- Vergelijking van de enzymactiviteit bij verschillende temperaturen.
- Gebruik van spectrofotometrie om veranderingen in absorbentie te kwantificeren.
Belangrijkste resultaten
- Het reactiemengsel kleurt geel wanneer ONPG wordt gehydrolyseerd door lactase.
- De enzymactiviteit is het hoogst bij 37 °C en het laagst op ijs.
- Controlemonsters blijven helder, wat de specificiteit van de assay bevestigt.
- De resultaten tonen de invloed van temperatuur op de enzymkinetiek aan.
Conclusies
- De colorimetrische assay illustreert de lactase-activiteit op effectieve wijze.
- Deze methode is geschikt voor educatieve doeleinden binnen de biochemie.
- Inzicht in enzymkinetiek is essentieel voor toekomstige studies naar metabole processen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Dit educatieve protocol demonstreert een fundamentele enzymactiviteitsassay met gebruik van lactase, een therapeutisch relevant doelwit bij gastro-intestinale aandoeningen. De colorimetrische methode biedt een schaalbare, reproduceerbare aanpak voor het onderwijzen van principes van enzymkinetiek die van toepassing zijn op targetvalidatie in een vroeg stadium en assayontwikkeling in biofarmaceutische R&D. Door de enzymatische functie te koppelen aan een klinisch significant substraat (ONPG), ondersteunt de assay mechanistische risicoreductie en voorspellend vertrouwen in therapeutische strategieën die gericht zijn op enzymen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek naar de lactase-enzymfunctie en substraatspecificiteit mogelijk, wat het testen van doelhypothesen in gastro-intestinale ziektemodellen ondersteunt.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van commercieel beschikbare lactase uit voedingssupplementen, wat een kosteneffectief en toegankelijk systeem biedt voor preliminaire studies naar target engagement.
- Voorspellende waarde: Kwantitatieve absorbantiemetingen bij 420 nm maken de beoordeling van de enzymactiviteit onder variërende condities mogelijk, wat informatie verschaft over structuur-activiteitsrelaties en de screening van lead-kandidaten.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Klaarheid van de assay: De op ONPG gebaseerde colorimetrische reactie produceert een kwantificeerbaar geel product (ortho-nitrofenol), wat read-outs mogelijk maakt die compatibel zijn met high-throughput screening voor enzymremming of -activatie.
- Reproduceerbaarheid: Gestandaardiseerde extractie uit tabletten en gecontroleerde incubatiecondities (ijs, kamertemperatuur, 37°C) zorgen voor consistente resultaten over replicates, wat de robuustheid van de assay ondersteunt.
- Schaalbaarheid: Het eenvoudige formaat op basis van buisjes met spectrophotometrische detectie maakt aanpassing aan multi-well platforms mogelijk voor het screenen van compound-bibliotheken.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziekten: Lactasedeficiëntie is direct gekoppeld aan lactose-intolerantie, waardoor deze assay een relevant instrument is voor het evalueren van enzymvervangende therapieën of dieetinterventies.
- Translationele continuïteit: Temperatuurafhankelijke activiteitsprofielen (laagste op ijs, hoogste bij 37°C) weerspiegelen fysiologische omstandigheden, wat helpt bij het voorspellen van het in vivo gedrag van het enzym.
- Mechanische risicoreductie: Een duidelijk onderscheid tussen reactiebuisjes en controlebuisjes bevestigt de specificiteit van de assay, waardoor het risico op fout-positieven bij verdere therapeutische validatie wordt verkleind.
Integratie van Pijplijn & Workflow
De lactase-activiteitsassay past binnen het vroege stadium van het ontdekkingscontinuüm, ondersteunt de targetvalidatie via functionele enzymmetingen en maakt assayontwikkeling mogelijk voor screeningscampagnes gericht op gastro-intestinale targets.
- Discovery Biology: Meet de lactase-gemedieerde hydrolyse van ONPG om de enzymfunctie te beoordelen, ter ondersteuning van biologische risicoanalyse van lactase als therapeutisch doelwit.
- Screening: Levert kwantitatieve, colorimetrische resultaten die geschikt zijn voor het evalueren van modulator-effecten in screening-workflows gericht op enzymen.
- Analytics: Spectrofotometrische meting bij 420 nm levert objectieve gegevens voor het vergelijken van enzymatische activiteit onder verschillende condities, wat datagestuurde selectie van hits mogelijk maakt.
- Translationeel onderzoek: Koppelt enzymactiviteit aan lactosemetabolisme, waardoor in vitro bevindingen worden verbonden met de klinische relevantie bij malabsorptiestoornissen.
- Enterprise Reuse: Het protocol maakt gebruik van standaard laboratoriumapparatuur (vortex, centrifuge, spectrofotometer), wat brede adoptie door discovery- en preklinische teams vergemakkelijkt.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Biedt mechanistisch inzicht in enzym-substraatinteracties, waardoor het vertrouwen in het target wordt vergroot en ambiguïteit bij vroege targetvalidatie wordt verminderd.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van robuuste, gestandaardiseerde stappen (tablet-extractie, centrifugatie, temperatuurgecontroleerde incubatie), wat reproduceerbaarheid waarborgt en variabiliteit minimaliseert.
- Strategische waarde: Ondersteunt gefundeerde go/no-go-beslissingen door het leveren van duidelijke, kwantitatieve activiteitsgegevens, waardoor de afhankelijkheid van indirecte of surrogaatmarkers afneemt.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering mogelijk van lactase-gerichte interventies op basis van empirische activiteitsprofielen onder fysiologisch relevante omstandigheden.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist basisbiochemische vaardigheden in de omgang met enzymen, spectrophotometrie en het bereiden van oplossingen.
- Afhankelijk van toegang tot een spectrophotometer die in staat is tot absorbentiemetingen bij 420 nm en een centrifuge voor het klaren van het supernatant.
- Standaardisatie van de extractbereiding en de reactietijd is noodzakelijk om consistente resultaten tussen gebruikers en batches te garanderen.
- Aanpassing aan andere enzymen kan optimalisatie van het substraat en de buffer vereisen, aangezien de specificiteit van ONPG beperkt is tot galactosidase-activiteit.
- De pH-verschuiving door toevoeging van natriumcarbonaat is cruciaal voor het beëindigen van de reactie; onvolledige quenching kan de nauwkeurigheid van de absorbentie beïnvloeden.
