Monstervoorbereiding Mass Cytometry Analysis

Het algemene doel van dit monstervoorbereidingsproces is om een robuuste en consistente antilichaamkleuring van diverse monsters te produceren om de ondervraging van heterogene celpopulaties mogelijk te maken. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van vragen over celidentiteit, celsignalering en celrespons in een complexe heterogene celpopulatie. Het grote voordeel van deze techniek is dat het de meting van eiwitniveaus met hoge parameter op single-celniveau mogelijk maakt.

Deze procedure wordt gedemonstreerd door Aundrietta Duncan, een afgestudeerde student uit ons laboratorium. Voor elk monster van single-cel suspensie, herschort het in vier keer 10 tot de zesde cellen per milliliter in serumvrij medium, voeg 500 microliter van vers bereid 50 MicroMolar Cisplatin per 2/10 toe aan de zes cellen, en incubeer de monsters op een orbitale shaker met constante menging bij kamertemperatuur. Na één minuut, doof het Cisplatin met een gelijk volume wasbuffer en centrifugeer de cellen.

Gooi de supernatant weg en was de monsters nog twee keer door 500 microliter wasbuffer toe te voegen, de cellen te centrifugeren en de wasbuffer af te gieten. Volg dit met twee wasbeurten in 500 microliter PBS door op dezelfde manier de monsters te centrifugeren en de supernatant weg te gooien. Na de tweede PBS wassing, herschort de pellets in 500 microliter verse PBS en fixeer de cellen met 500 microliter 4%PFA.

Pipet de cellen om te mengen. Plaats vervolgens de monsters op de orbitale shaker met constante menging gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Aan het einde van de incubatie, pellet de cellen door centrifugatie, gooi het supernatant weg en volg dit met een wassing in verse PBS.

Om de cellen te permeabiliseren, draai de cellen opnieuw neer en gooi de supernatanten weg. Herschort de monsters in het resterende PBS door voorzichtig te vortexen, en voeg onmiddellijk één milliliter 100% methanol per 2/10 10 tot de zesde cellen toe met voorzichtig pipetteren. Incubeer de monsters gedurende ten minste één uur bij vier graden, en centrifugeer de cellen aan het einde van de incubatie.

Giet vervolgens de methanol weg. Was vervolgens de pellets in één milliliter wasbuffer voor elke milliliter methanol, gevolgd door twee extra wasbeurten in 500 microliter verse wasbuffer. Gebruik een 200 microliter pipet ingesteld op 50 microliters om de resterende wasbuffer van elk pellet over te brengen naar een buis met het juiste corresponderende antilichaamcocktail.

Pipet de gecombineerde oplossing terug zonder lucht in de tip te trekken door de zuiger gedeeltelijk ingedrukt te houden. Breng vervolgens de pipettip over in een 1,5 milliliter microcentrifugebuisje met 500 microliter wasbuffer zonder de zuiger los te laten. Laat de zuiger los en trek de wasbuffer op voor een totaal antilichaamcocktailvolume van 50 microliters en label het juiste corresponderende monster met het geaspireerde antilichaamcocktail door voorzichtig te pipetteren.

Na één uur bij kamertemperatuur met constante schudbeweging, was de monsters vier keer, gooi elke keer de wasbuffer weg. Om de cellen met irridium te labelen, herschort de laatste pellets in 500 microliter PBS, gevolgd door de toevoeging van 500 microliter vier procent PFA gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens 500 microliter vers bereid 62,5 nanomolar irridium en PFA toe aan de monsters voor nog eens 15 minuten schudbeweging bij kamertemperatuur.

Centrifugeer vervolgens de cellen, gooi het supernatant weg en volg met twee wasbeurten in 500 microliter 0,1 procent BSA en gefilterd gedeïoniseerd water. Analyseer de monsters door normalisatiekralen toe te voegen in de putjes van monsterplaten, cellen in deze putjes te pipetteren en vervolgens massa-cytometrie uit te voeren binnen 24 uur. Na normalisatie van de signaalintensiteit, kunnen de kalibratiekralen uit de gegevens worden verwijderd door te gaten op de irridium 191 positieve kraal negatieve populatie.

De single-cel gebeurtenissen kunnen vervolgens worden gegatet om de puinhopen en celmultipletten te verwijderen met behulp van een biaxiale plot van irridium 193 negatieve expressie versus de gebeurtenislengte. Cisplatin labelen kan worden gebruikt om de hoeveelheid celafstand te meten. Bijvoorbeeld, hier zijn monsters met lage en hogere hoeveelheden dode cellen getoond.

De dode cellen kunnen worden verwijderd door de platina 198 positieve populatie weg te gaten, barcoderesultaten resulteren in een duidelijke scheiding van de monsters binnen de barcodeparameters, waardoor de cellen kunnen worden toegewezen aan hun oorspronkelijke monsteridentiteiten. IDU labelen kan worden gebruikt om US-gezichtscellen te detecteren die hier worden waargenomen. Na de initiële normalisatie, ontbarcodering en gating, kunnen de hoge dimensionale gegevens worden geanalyseerd met behulp van het SPADE-algoritme om een lagere dimensionale representatie van de gegevens te genereren die beter geschikt is voor visuele interpretatie.

Eenmaal onder de knie, kan deze techniek binnen vier tot zes uur worden voltooid als deze goed wordt uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden om monstersverlies tijdens de wasstap te minimaliseren. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u monsters kunt voorbereiden voor massa-cytometrie analyse.

Vergeet niet dat het werken met natriumazid gevaarlijk kan zijn, daarom moet u voorzorgsmaatregelen nemen, zoals het dragen van geschikte PPL bij het uitvoeren van deze procedure.