Monstervoorbereiding Mass Cytometry Analysis
April 29th, 2017
Dit artikel beschrijft de verzameling en verwerking van monsters voor massa-cytometrie-analyse.
Het algemene doel van dit monstervoorbereidingsproces is om een robuuste en consistente antilichaamkleuring van diverse monsters te produceren om de ondervraging van heterogene celpopulaties mogelijk te maken. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van vragen over celidentiteit, celsignalering en celrespons in een complexe heterogene celpopulatie. Het grote voordeel van deze techniek is dat het de meting van eiwitniveaus met hoge parameter op single-celniveau mogelijk maakt.
Deze procedure wordt gedemonstreerd door Aundrietta Duncan, een afgestudeerde student uit ons laboratorium. Voor elk monster van single-cel suspensie, herschort het in vier keer 10 tot de zesde cellen per milliliter in serumvrij medium, voeg 500 microliter van vers bereid 50 MicroMolar Cisplatin per 2/10 toe aan de zes cellen, en incubeer de monsters op een orbitale shaker met constante menging bij kamertemperatuur. Na één minuut, doof het Cisplatin met een gelijk volume wasbuffer en centrifugeer de cellen.
Gooi de supernatant weg en was de monsters nog twee keer door 500 microliter wasbuffer toe te voegen, de cellen te centrifugeren en de wasbuffer af te gieten. Volg dit met twee wasbeurten in 500 microliter PBS door op dezelfde manier de monsters te centrifugeren en de supernatant weg te gooien. Na de tweede PBS wassing, herschort de pellets in 500 microliter verse PBS en fixeer de cellen met 500 microliter 4%PFA.
Pipet de cellen om te mengen. Plaats vervolgens de monsters op de orbitale shaker met constante menging gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Aan het einde van de incubatie, pellet de cellen door centrifugatie, gooi het supernatant weg en volg dit met een wassing in verse PBS.
Om de cellen te permeabiliseren, draai de cellen opnieuw neer en gooi de supernatanten weg. Herschort de monsters in het resterende PBS door voorzichtig te vortexen, en voeg onmiddellijk één milliliter 100% methanol per 2/10 10 tot de zesde cellen toe met voorzichtig pipetteren. Incubeer de monsters gedurende ten minste één uur bij vier graden, en centrifugeer de cellen aan het einde van de incubatie.
Giet vervolgens de methanol weg. Was vervolgens de pellets in één milliliter wasbuffer voor elke milliliter methanol, gevolgd door twee extra wasbeurten in 500 microliter verse wasbuffer. Gebruik een 200 microliter pipet ingesteld op 50 microliters om de resterende wasbuffer van elk pellet over te brengen naar een buis met het juiste corresponderende antilichaamcocktail.
Pipet de gecombineerde oplossing terug zonder lucht in de tip te trekken door de zuiger gedeeltelijk ingedrukt te houden. Breng vervolgens de pipettip over in een 1,5 milliliter microcentrifugebuisje met 500 microliter wasbuffer zonder de zuiger los te laten. Laat de zuiger los en trek de wasbuffer op voor een totaal antilichaamcocktailvolume van 50 microliters en label het juiste corresponderende monster met het geaspireerde antilichaamcocktail door voorzichtig te pipetteren.
Na één uur bij kamertemperatuur met constante schudbeweging, was de monsters vier keer, gooi elke keer de wasbuffer weg. Om de cellen met irridium te labelen, herschort de laatste pellets in 500 microliter PBS, gevolgd door de toevoeging van 500 microliter vier procent PFA gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens 500 microliter vers bereid 62,5 nanomolar irridium en PFA toe aan de monsters voor nog eens 15 minuten schudbeweging bij kamertemperatuur.
Centrifugeer vervolgens de cellen, gooi het supernatant weg en volg met twee wasbeurten in 500 microliter 0,1 procent BSA en gefilterd gedeïoniseerd water. Analyseer de monsters door normalisatiekralen toe te voegen in de putjes van monsterplaten, cellen in deze putjes te pipetteren en vervolgens massa-cytometrie uit te voeren binnen 24 uur. Na normalisatie van de signaalintensiteit, kunnen de kalibratiekralen uit de gegevens worden verwijderd door te gaten op de irridium 191 positieve kraal negatieve populatie.
De single-cel gebeurtenissen kunnen vervolgens worden gegatet om de puinhopen en celmultipletten te verwijderen met behulp van een biaxiale plot van irridium 193 negatieve expressie versus de gebeurtenislengte. Cisplatin labelen kan worden gebruikt om de hoeveelheid celafstand te meten. Bijvoorbeeld, hier zijn monsters met lage en hogere hoeveelheden dode cellen getoond.
De dode cellen kunnen worden verwijderd door de platina 198 positieve populatie weg te gaten, barcoderesultaten resulteren in een duidelijke scheiding van de monsters binnen de barcodeparameters, waardoor de cellen kunnen worden toegewezen aan hun oorspronkelijke monsteridentiteiten. IDU labelen kan worden gebruikt om US-gezichtscellen te detecteren die hier worden waargenomen. Na de initiële normalisatie, ontbarcodering en gating, kunnen de hoge dimensionale gegevens worden geanalyseerd met behulp van het SPADE-algoritme om een lagere dimensionale representatie van de gegevens te genereren die beter geschikt is voor visuele interpretatie.
Eenmaal onder de knie, kan deze techniek binnen vier tot zes uur worden voltooid als deze goed wordt uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden om monstersverlies tijdens de wasstap te minimaliseren. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u monsters kunt voorbereiden voor massa-cytometrie analyse.
Vergeet niet dat het werken met natriumazid gevaarlijk kan zijn, daarom moet u voorzorgsmaatregelen nemen, zoals het dragen van geschikte PPL bij het uitvoeren van deze procedure.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel beschrijft de verzameling en verwerking van monsters voor massa-cytometrieanalyse. De methode heeft tot doel consistente antilichaamkleuring te produceren om heterogene celpopulaties te onderzoeken.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Celbiologie
- Massa-cytometrie
Achtergrond
- Massa-cytometrie maakt het mogelijk om eiwitniveaus met veel parameters op het niveau van één cel te meten.
- Het is nuttig voor het begrijpen van cellidentiteit en signaaloverdracht.
- De techniek is toepasbaar op complexe heterogene celpopulaties.
- Monstervoorbereiding is cruciaal voor robuuste resultaten.
Doel van de studie
- Om een monstervoorbereidingsproces voor massa-cytometrie te demonstreren.
- Om het onderzoek van diverse celpopulaties mogelijk te maken.
- Om inzichten te bieden in celreacties en -interacties.
Gebruikte methoden
- Resuspenderen van monsters met een enkele celsuspensie in serumvrij medium.
- Gebruik van vers bereid Cisplatin voor celbehandeling.
- Incubatie op een orbitale shaker voor consistente menging.
- Centrifugeren en wassen van cellen na behandeling.
Belangrijkste resultaten
- Demonstratie van effectieve monstervoorbereidingstechniek.
- Consistente antilichaamkleuring bereikt over monsters.
- Analyse met veel parameters mogelijk op het niveau van één cel.
- Inzichten verkregen in heterogene celpopulaties.
Conclusies
- De methode verbetert het vermogen om complexe celpopulaties te analyseren.
- Robuuste monstervoorbereiding is cruciaal voor nauwkeurige massa-cytometrieresultaten.
- Deze techniek kan onderzoek in celbiologie en neurowetenschap bevorderen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Mass cytometry enables high-parameter single-cell protein analysis, supporting deep interrogation of heterogeneous cell populations in drug discovery. Reliable sample preparation is essential for generating consistent, reproducible data that informs target validation and mechanistic de-risking. This protocol helps biopharma R&D teams reduce variability and improve predictive confidence in early discovery workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables multiplexed protein profiling to clarify cellular identity and signaling states in complex tissues.
- Operational Value: Supports hypothesis-driven interrogation of drug target engagement and pathway modulation at single-cell resolution.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, high-dimensional readouts for assessing compound effects across diverse cell types.
- Operational Value: Establishes reproducible staining and fixation procedures critical for assay scalability and cross-experiment comparability.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates biomarker discovery and phenotypic characterization in disease-relevant models.
- Operational Value: Enables longitudinal tracking of cellular responses to support go/no-go decisions in preclinical advancement.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization, providing quantitative, single-cell resolution data that complements bulk assays and functional screens.
- Discovery Biology: Enables detailed mapping of cellular heterogeneity and dynamic protein expression changes in response to perturbations.
- Screening: Delivers multiplexed, quantitative outputs suitable for hit validation and mechanism-of-action deconvolution.
- Analytics: Produces high-dimensional data requiring computational gating and normalization for accurate interpretation.
- Translational Research: Supports alignment with preclinical models by enabling consistent immunophenotyping across sample sets.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized sample preparation foundation for reusable mass cytometry platforms across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence through comprehensive, single-cell resolution protein profiling.
- Operational Value: Enhances reproducibility and minimizes technical variability via standardized washing, fixation, and permeabilization steps.
- Strategic Value: Improves target selection and lead optimization by reducing biological ambiguity in complex samples.
- Portfolio Impact: Enables data-driven prioritization by revealing off-target effects and cell-state-specific responses early in discovery.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry principles, antibody panel design, and metal-conjugated reagent handling.
- Depends on access to a mass cytometer, centrifugation equipment, and orbital shakers for consistent sample processing.
- Necessitates standardized operating procedures for reagent preparation, particularly Cisplatin and methanol-based permeabilization, to ensure batch-to-batch consistency.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to diverse sample types such as primary tissues, blood, or cultured cells.
- Includes practical limitations related to sample loss during multiple wash steps and the need for careful titration of antibody cocktails to minimize background signal.
