Anionische polymerisatie van een amfifiele copolymeer voor de bereiding van blokcopolymeer micellen gestabiliseerd door π-π stapelen interacties

Het algemene doel van dit werk is om de kritische stappen aan te tonen die nodig zijn voor de synthese van blokcopolymeermaterialen via anionische ringopeningspolymerisatie, en om de vereiste opeenvolging van studies te laten zien voor de formulering van blokcopolymeermicellen van een hydrofoob geneesmiddel. Dit protocol demonstreert de juiste uitvoering van de noodzakelijke stappen en procedures voor de synthese van blokcopolymeren via anionische polymerisatie. Het grote voordeel van anionische ringopeningspolymerisatie is de synthese van materialen met een goede opbrengst en een lage polydispersiteit.

Evenals de schaalbaarheid van het proces. Dit is een spannende tijd voor polymere geneesmiddelentoediening, aangezien een aantal geneesmiddelen die afhankelijk zijn van formulering en blokcopolymeer-micellen zich nu in een laat stadium van preklinische of klinische ontwikkeling bevinden.

Bereid de reagentia en de materialen voor de overdracht voor zoals beschreven in het tekstprotocol. Weeg methoxypolyethyleenglycol met een moleculair gewicht van 5.000 af. Voeg de mPEG toe aan een gedroogde kolf met een roerkolf en sluit de spoeladapter aan de bovenzijde af met een septum.

Sluit de kolf aan op het manifold en spoel de kolf gedurende twee tot drie minuten met Argon. Zet de klep in de vacuümpositie om de kolf te drogen. Roteer de kolf handmatig en droog het reactievat homogeen met een föhn of hittepistool totdat de mPEG smelt.

Breek na één minuut het vacuüm door het ventiel op de manifold met enkele snelle bewegingen naar de Argon-positie te draaien om de kolf af te koelen. Houd de polymere macroinitiator ongeveer twee uur onder vacuüm en vervolgens onder Argon voordat de reactie begint. Monteer daarna twee hoogvacuümdestillatie-opstellingen die vooraf in een oven onder de zuigkap zijn gedroogd.

Eén apparaat is bedoeld voor de distillatie van DMSO, en één apparaat is bedoeld voor de distillatie van het monomeer, fenylglycolylether. Sluit de afzonderlijke kolven aan op de twee apparaten en plaats deze elk op een halfronde verwarmingsmantel of in een oliebad. Sluit koud water aan op de bovenkant van elk apparaat en op de verdeelstukken.

Zorg ervoor dat elk apparaat stevig is bevestigd en goed is afgesloten. Schakel het vacuüm in via de klep. Stel de verwarming in via een temperatuurregelaar en begin met het roeren van de oplossingen.

Na twee uur circulatiedestillatie van DMSO wordt de hogevacuümklep gesloten om ongeveer 20 milliliter oplossing op te vangen. Laat vervolgens deze fractie in de kolf lopen en herhaal deze handeling nogmaals om de zuiverheid van de fractie die later wordt opgevangen, te garanderen. Verwarm de kolf met mPEG onder vacuüm met de hittekanon totdat het polymeer smelt en spoel daarna opnieuw met argon.

Sluit na twee uur de hogevacuümkraan en verzamel het volume oplosmiddel. Stop het verwarmen en verbreek het vacuüm van de manifold. Laat Argon in de kamer stromen, zoals eerder beschreven.

Sluit onder een positieve druk van argon één zijde van de canule aan op een maatkolf, of rechtstreeks op de kolf die de mPEG bevat, eveneens onder argon, en dompel het andere uiteinde voorzichtig in de vers gedistilleerde fractie. Sluit een extra bubbelglas aan op de kolf, sluit de argonstroom af en gebruik alleen de argondruk van het destillatieapparaat. Om ongevallen door argondruk te voorkomen, opent u de glazen stopkraan gedurende één tot twee seconden en sluit u deze vervolgens weer om de stroom DMSO voort te zetten totdat de overdracht volledig is voltooid.

Sluit vervolgens, onder argon, één zijde van de canule van de gedroogde maatcilinder, die is afgesloten met een septum, aan op een stamoplossing van 0,3 molair naftaleenkalium. Voeg daarna een extra borrelsteentje toe aan de maatcilinder, sluit de argonstroom naar de cilinder af en breng, onder positieve argondruk, vijf milliliter 0,3 molair naftaleenkalium via canulatie over van de stamoplossing naar de maatcilinder. Steek een andere naald vanuit het manifold in de cilinder en verwijder het extra borrelsteentje.

Verwijder voorzichtig de canule die is verbonden met de stamoplossing, voeg deze snel toe aan de reactiekolf en sluit een extra borrelsteentje aan. Voeg vervolgens, zoals eerder beschreven, de base druppelgewijs toe tot de oplossing donker wordt. Nadat de kleur langzaam is verdwenen, voegt u opnieuw een portie toe tot de donkere kleur weer verschijnt, en herhaal dit proces tot de volledige overdracht is voltooid.

Zoals eerder beschreven, brengt u het gewenste volume monomeer over naar de reactie om een polymerisatiegraad van polyphenolglycolether van ongeveer 18 tot 20 eenheden te bereiken. Laat de reactie 48 uur lang bij 80 °C rusten, onder een argonatmosfeer met constant roeren, om volledige polymerisatie te waarborgen. Stop de reactie door toevoeging van druppels 1 N zoutzuur en methanol, totdat de kleur is verdwenen.

Extraheer het naftaleen uit de DMSO-oplossing met hexaan. Verwijder ongeveer 70 milliliters DMSO door middel van vacuümdestillatie. Koel de slurry-oplossing af en voeg 15 milliliters THF toe.

Verwijder het zout uit de slurry-oplossing door centrifugatie bij 5.000 ×g gedurende tien minuten. Verplaats het supernatant en voeg dit druppelgewijs toe aan 500 milliliters koude diethylether. Verzamel het precipitaat door filtratie of centrifugatie.

Na het tweemaal herhalen van de precipitatie wordt het precipitaat een nacht bij kamertemperatuur onder de zuigkast gedroogd, en vervolgens 24 tot 48 uur onder vacuüm bij 30 °C, voor een opbrengst van 85%. Het copolymeer is nu klaar voor karakterisering, zoals beschreven in het tekstprotocol. Los 12 mg doxorubicine op in 1 mL acetonitril. Voeg 10 µL triethylamine toe en laat de oplossing twee uur in het donker roeren.

Los 45 milligram copolymeer op in één milliliter THF en roer gedurende dezelfde periode. Voeg de copolymeeroplossing toe aan de doxorubicine-oplossing en spoel het flesje met resterend copolymeer met een extra volume THF. Voeg vervolgens het copolymeer-geneesmiddelmengsel druppelgewijs toe aan een flesje van 20 milliliter met 15 milliliter 0,9% saline onder roeren.

Breng de oplossing over naar een dialysezak en dialyseer deze tegen 500 milliliters 0,9% zoutoplossing. Breng het dialysaat over naar een 15 milliliter buis en centrifugeer dit bij 5.000 ×g gedurende 15 minuten. Breng vervolgens het supernatant over naar een ultrafiltratiesysteem dat een dialysemembraan bevat.

Plaats de roeradapter in het ultrafiltratiesysteem, sluit het deksel en open dit voor een stroom stikstof. Concentreer de blokcopolymeermicellen-oplossing tot een volume van vier milliliters en voeg zes milliliters verse zoutoplossing toe. Concentreer de blokcopolymeermicellen-oplossing vervolgens opnieuw tot 4 milliliters, spoel de kamer met 0,5 milliliters zoutoplossing en voeg dit toe aan de oplossing.

Bewaar de resulterende oplossing in bruine flesjes bij kamertemperatuur in het donker, voorafgaand aan verder gebruik. De anionische ringopeningspolymerisatie van fenylglycerolether op de mPEG-macroinitiator werd gebruikt om het amfifiele diblokcopolymeer te bereiden door diepe protonering van de hydroxylgroep van mPEG. Hierbij werd naftaleenkalium als radicaalanion gebruikt, gevolgd door de polymerisatie van het fenylglycerolethermonomeer.

De karakterisering van het blokcopolymeer door middel van gelpermeatiechromatografie en proton-NMR-spectroscopie bevestigde een smalle molecuulgewichtsverdeling met een polymerisatiegraad van fenylglycorether van 15 eenheden. In waterige media assembleren de amfifiele blokcopolymeren tot micellen die bestaan uit een hydrofobe kern omringd door een hydrofiele schil. Transmissie-elektronenmicroscopie bevestigde een sferische morfologie en dynamische lichtverstrooiing wees op een hydrodynamische diameter van 25 nano meters.

Doxorubicine werd succesvol ingekapseld in de blokcopolymeermicellen. In vergelijking met het vrije geprotoneerde geneesmiddel in oplossing, bevestigde zelf-quenching van de doxorubicine, waargenomen via fluorescentiespectroscopie, de incorporatie van het geneesmiddel in de polymere micellen, met een drug loading capacity tot 14%. Het afgifteprofiel van doxorubicine vanuit de blokcopolymeermicellen wees op een goede stabiliteit van deze formulering bij een neutrale pH en een vertraagde afgifte van het geneesmiddel over vier dagen onder fysiologisch relevante omstandigheden.

Zodra deze techniek is beheerst, kan deze trainees in de farmaceutische wetenschappen helpen bij het voorbereiden van de synthese van diblokcopolymeren voor toepassingen in drugdelivery. De hier beschreven procedure kan worden toegepast voor de synthese van een breed scala aan copolymeren met PEG als initiator. Hierbij is de nadruk gelegd op het waarborgen van goede laboratoriumpraktijken, die zorgen voor anhydrische condities en resulteren in materialen van hoge kwaliteit.

Na het bekijken van deze video zou ik een goed begrip moeten hebben van hoe ik onder anhydrische omstandigheden moet werken en in staat moeten zijn om deze stappen toe te passen voor de synthese van PEG-polyester of PEG-polestermaterialen. Bij het uitvoeren van elk van de beschreven onderzoeken is het essentieel om te onthouden dat u onder gecontroleerde omstandigheden werkt, met potentieel gevaarlijke organische oplosmiddelen en andere reagentia. Bovendien zijn alle geneesmiddelen toxisch en moeten ze met de nodige voorzorgsmaatregelen worden gehanteerd.

Zoals het dragen van handschoenen, een laboratoriumjas, gesloten schoenen, en het dragen van een masker wanneer u de geneesmiddelen wilt afwegen.