Werken met Auditieve HEI-OC1 Cells

Het algemene doel van dit protocol is om de basisprocedures te beschrijven om met HEI-OC1-cellen te werken, die kunnen worden gebruikt om de effecten van farmacologische geneesmiddelen op gehoorcellen te bestuderen, en om te helpen bij de functionele karakterisering van het motorische eiwit prestin. HEI-OC1-cellen worden door veel onderzoekers over de hele wereld gebruikt in verschillende experimenten met verschillende doelen en met behulp van verschillende technieken. Hopelijk zullen de hier beschreven procedures een gemeenschappelijke basis bieden om deze studies vergelijkbaar te maken.

Natuurlijk kunnen deze experimentele procedures verder worden verbeterd. Maar de verschillen met de hier beschreven kunnen cruciaal zijn om mogelijk tegenstrijdige resultaten te begrijpen en te verklaren. In deze demonstratie zullen we beschrijven hoe we met HEI-OC1-cellen werken, beginnend vanaf een bevroren aliquot totdat er monsters klaar zijn om verschillende studies uit te voeren met algemeen beschikbare technieken.

Om deze procedure te beginnen, haalt u een flacon met cryogepreserveerde HEI-OC1-cellen uit vloeibare stikstof en plaatst u deze in een waterbad op 37 graden Celsius. Dompel alleen de onderste helft van de flacon onder en laat deze ontdooien tot er nog maar een kleine hoeveelheid ijs in de flacon achterblijft. Veeg in een biologische veiligheidskast de buitenkant van de flacon af met 70%alcohol.

Pipetteer vervolgens de cellen uit de flacon en breng het gehele volume druppelsgewijs, langzaam, in een conische buis van 15 milliliter met 10 milliliter voorverwarmd groeimedium zoals DMEM aangevuld met 10%FBS. Verwijder vervolgens het DMSO door de buis vijf minuten te centrifugeren. Na vijf minuten gooit u de supernatant weg en suspendeert u de cellen in negen milliliter vers groeimedium.

Ontkoppel de klonten of vellen cellen door de gesuspendeerde cellen drie tot vier keer tussen de pipettenpunt en het medium te laten vloeien en terugvloeien, waarbij de punt van de pipettenpunt de bodem van de buis raakt. Plaats vervolgens het totale volume cellen, gesuspendeerd in groeimedium, in een onbehandelde plastic celkweekschaal met een diameter van 100 millimeter. Incubeer de cellen bij 33 graden Celsius met 10%CO2.

Verwijder in deze stap het oude medium en was de cellen met twee milliliter PBS. Bedek vervolgens de celmonolaag met 0,25%trypsine. Onderzoek de cellen met een omgekeerd microscoop wanneer 40%van hen is losgelaten.

Als het nodig is, schudt u voorzichtig de kweekschaal om eventueel nog aanwezige gehechte cellen los te maken. Suspendeer de cellen opnieuw en verwijder de trypsine door de buis vijf minuten te centrifugeren. Gooi vervolgens de supernatant weg en suspendeer de cellen in negen milliliter vers groeimedium. Ontkoppel vervolgens de klonten of vellen cellen door de gesuspendeerde cellen drie tot vier keer tussen de pipettenpunt en het medium te laten vloeien en terugvloeien, waarbij de punt van de pipettenpunt de bodem van de buis raakt.

Zaai vervolgens de cellen in celkweekschalen met een diameter van 100 millimeter. Incubeer ze bij 33 graden Celsius met 10%CO2 en verdeel ze zo vaak als nodig is voor de geplande experimenten of voor het genereren van een nieuwe voorraad. Voor differentiatie, incubeer HEI-OC1-cellen onder de permissieve voorwaarden totdat ze ongeveer 80%conflueert bereiken.

Incubeer vervolgens de cellen bij 39 graden Celsius met 5%CO2 gedurende twee tot drie weken en ververs het medium om de dag om dode cellen te verwijderen. Begin deze procedure door de cellen te tellen met behulp van een automatische cellenteller of een hemocytometer en pas de celconcentratie aan tot de vereiste waarde. Zaai vervolgens de cellen in een 96-wells plaat met heldere platte bodem, een 96-wells plaat met witte wanden of een zes-wells plaat.

Als vereist door de specifieke test, incubeer de cellen een nacht voor substraatbinding voordat u ze behandelt met de geneesmiddelen van belang. Meet vervolgens het resultaat van de behandeling door middel van flowcytometrie of een andere geschikte techniek. Om de cellen te oogsten, wast u ze twee keer met 10 milliliter calcium- en magnesiumvrij PBS.

Voeg twee milliliter van de enzymvrije detacher oplossing toe en incubeer de cellen gedurende drie minuten bij 37 graden Celsius met 5%CO2. Gebruik een omgekeerd microscoop om de loslating van de cellen te controleren. Indien nodig, beweeg de celkweekschaal voorzichtig om meer cellen los te maken, en wees voorzichtig om het niet te schudden.

Voeg vervolgens 10 milliliter DMEM plus 10%FBS toe en pipetteer de cellen voorzichtig vijf keer op en neer. Kijk daarna naar de cellen onder een microscoop. Als meer dan 80%van de cellen al gescheiden zijn, is er geen verdere pipettering meer nodig.

Als de cellen nog steeds in clusters zitten, blijf voorzichtig pipetteren totdat meer dan 80%van de cellen niet meer in clusters zitten. Een optische controle van de cellen zou veel enkele ronde cellen met gladde membraanranden moeten laten zien. Ga vervolgens verder met patch-clamp en NLC metingen, zoals beschreven in het tekstprotocol.

HEI-OC1-cellen gekweekt onder niet-permissieve voorwaarden vertoonden een zeer significante afname van celviabiliteit en een even significante toename van celdood ten opzichte van celculturen onder permissieve voorwaarden. Omdat geneesmiddeleneffecten op cellen die al aan het sterven zijn of met een verminderde levensvatbaarheid anders kunnen zijn dan de effecten van hetzelfde geneesmiddel op gezonde cellen, moeten aanzienlijke inspanningen worden gericht op het onderscheiden van geneesmiddeleneffecten van de effecten van kweekvoorwaarden in elk cytotoxiciteitsonderzoek dat wordt uitgevoerd op NP-HEI-OC1-cellen. Daarom raden we aan HEI-OC1-cellen te gebruiken die onder permissieve voorwaarden zijn gekweekt voor experimenten die geen specifiek gedifferentieerde cellen vereisen.

De confocale beelden die hier worden getoond, bevestigen de expressie van het gehoormotorische eiwit prestin in HEI-OC1-cellen die zijn gekweekt bij 33 graden Celsius en 39 graden Celsius. Merk op dat prestin zich voornamelijk in het cytoplasma van HEI-OC1-cellen immunolocaliseert die groeien onder permissieve voorwaard