Name: Opsomming van neurale stamcellen Met behulp van klonen Testen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Leer neurale stamcellen tellen via neurosfeervorming onder klonale omstandigheden. Deze 13-daagse methode helpt onderzoekers bij het evalueren van NSC-markers en het zuiveren van stamcellen voor neurogenese-onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken het Agentschap voor Wetenschap, Technologie en Onderzoek (A * STAR), Singapore voor de financiering van dit onderzoek.

De behandeling van de dieren werd uitgevoerd in overeenstemming met de IACUC en NACLAR richtlijnen en goedgekeurd door de afdeling dier ((http://www.brc.astar.edu.sg/index.php?sectionID-11). OPMERKING: neurosfeerculturen werden bereid uit de voorhersenen van embryonale (E14) C57BL / 6-muizen zoals eerder beschreven 5. 1. Cultuur van klonen Sample Neurosferen (dag 1) <ol><li> Bereid NSC groeimedium combineert Dulbecco&#39;s gemodificeerd Eagle&#39;s medium / Nutrient F-12 (DMEM / F12) medium met B27 supplement (eindconcentratie: 1x), EGF (eindconcentratie: 20 ng / ml), bFGF (eindconcentratie: 10 ng / ml) en penicilline / streptomycine (uiteindelijke concentratie: 1x). </li><li> Distantiëren E14.5 muis neurosferen in 1 ml NSC groeimedium en 1 ml 0,05 N natriumhydroxide gedurende 7 min bij RT. Pipetteer de cellen op en neer af aan cellen in suspensie te houden. Voeg 1 ml 0,05 N zoutzuur tot neutraalize de alkali. OPMERKING: Neurosfeer cellen worden geënt bij 20.000 cellen / ml in een 10 cm kweekschaal en worden gedurende 5 dagen bij 37 ° C, 5% CO2. De verwachte opbrengst na ongeveer 10 miljoen cellen per 10 cm schotel. Deze cellen worden vervolgens gedissocieerd en geënt bij klonale dichtheid zoals beschreven in stap 1,2 en 1,3, respectievelijk. <ol><li> Voer celgetal met behulp van trypan Blue kleuring en een hemocytometer. </li></ol></li><li> Zaad één E14.5 muis neurosfeercellen bij een dichtheid van 50 cellen / ml of lager in 100 ul NSC groeimedium in een 96-putjes. Incubeer de cellen bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 1 w klonale neurosferen te genereren. OPMERKING: klonaliteit verzekerd tijdens neurosphere formatie bij deze dichtheid als de cellen niet met elkaar in contact. </li></ol> 2. Cultuur van Neurosferen voor geconditioneerd Medium (dag 3) <ol><li> Distantiëren E14.5 muis neurosferen zoals beschreven in stap 1.2. </li><li> Zaad enkele cellen van E14,5 muis neurosferen met een dichtheid van 20.000 cellen / ml in een 10 ml NSC groeimedium in een 10 cm kweekschaal. Incubeer de cellen bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 5 d bulk gekweekte neurosferen te genereren. </li></ol> 3. Voorbereiding van Neurosfeer Geconditioneerd Medium (Dag 8) <ol><li> Bereid bekledingsoplossing door het mengen van 700 ui 0,01% poly-L-lysine (PLL), 70 ui 1 mg / ml laminine en 6230 ui fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). </li><li> Coat een 10 cm kweekschaal met 7 ml PLL / laminine oplossing gedurende 2 uur bij 37 ° C. </li><li> Met behulp van een 10 ml serologische pipet alle bulk gekweekte neurosferen een 15 ml conische centrifugebuis. Centrifugeer de neurosferen bij 171 xg gedurende 1 min bij kamertemperatuur en volledig verwijderen van het supernatant. </li><li> Bereid NSC differentiatie medium door het combineren van DMEM / F12 medium met B27 (uiteindelijke concentratie: 1x) en Fetal Bovine Serum (FBS) (uiteindelijke concentratie: 0,5%) Add 10 ml van NSC differentiatie medium tot neurospheres. Pipet op en neer een paar keer om de neurospheres mengen. </li><li> Aspireren PLL / Laminine van 10 cm kweekschaal en eenmaal wassen met 10 ml PBS. Transfer alle neurosferen de PLL / laminine beklede 10 cm kweekschaal. Incubeer O / N bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende de neurosferen te houden aan de schotel. </li></ol> 4. Vaststelling van de NFU van Sample Neurosferen (Dag 8) <ol><li> Tel het aantal neurosferen (gezaaid op dag 1, punt 1), gevormd in elk putje onder een microscoop. OPMERKING: Bepaal het aantal neurosferen gevormd per 100 cellen uitgeplaat, waarbij de NFU geeft. </li></ol> 5. Overdracht van Sample Neurosferen tot 50-well Chambered Coverslip (Dag 8) <ol><li> Coat elk putje van een 50 putjes chambered dekglaasje met 10 pi van PLL / laminine bekledingsoplossing gedurende 2 uur bij 37 ° C. OPMERKING: Bereid bekledingsoplossing zoals is beschreven instap 3.1. </li><li> Bereid 3 x 50 ml conische centrifugebuizen met 30 ml PBS per. Met behulp van een steriel pincet, verwijder de gecoate 50-well chambered dekglaasje. Dompel de chambered dekglaasje in de eerste buis PBS, gevolgd door de tweede en de derde buis PBS, de bekledingsoplossing af te wassen. </li><li> Aspireren resterende vloeistof uit de putjes van de chambered dekglaasje. </li><li> Voorzichtig pipet alle medium en neurosferen uit elk putje van de 96-putjes en overgebracht naar een 10 cm kweekschaal. </li><li> Onder een microscoop, kies een monster neurosphere met behulp van een micropipet P10 uitgerust met een 10 pi pipet tip. Dat slechts enkele neurosfeer telkens wordt opgevangen door de pipet kolom 2 pl. Gebruik een nieuwe pipet tip voor elke neurosphere. </li><li> Breng de neurosfeer op het midden van een putje van de beklede 50 putjes chambered dekglaasje. </li><li> Herhaal stap 5.5 en 5.6 tot en met elk putje van de chambered dekglaasje Contains een neurosphere. LET OP: De neurosferen kan onder een microscoop geplaatst in een laminaire stroming kap of op een benchtop worden geplukt. </li><li> Voeg 10 ul van NSC differentiatie medium aan elk putje van de chambered dekglaasje. Plaats de chambered dekglaasje in een 10 cm kweekschaal en pipet PBS langs de randen van de schaal om uitdroging van de NSC differentiatiemedium voorkomen. Plaats maximaal twee chambered dekglaasjes in een 10 cm cultuur schotel. Incubeer de chambered dekglaasje (in de 10 cm kweekschaal) overnacht bij 37 ° C, 5% CO2. </li></ol> 6. Differentiatie van Sample Neurosferen (Dag 9) <ol><li> Breng de differentiatie medium uit de totale gekweekte neurosferen (uit paragraaf 3) om een ​​15 ml conische centrifugebuis. Zorg ervoor dat de 2-3 ml van differentiatie medium blijft in de cultuur schotel om te voorkomen dat gehandeld cellen uit los. Met behulp van een 20 ml steriele spuit, passeren de differentiatie medium door een 0,2 μm filter om alle cellen en vuil te verwijderen. </li><li> Breng de gefilterde differentiatie medium terug naar de 10 cm cultuur schotel met de aangehechte cellen. </li><li> Met behulp van een steriel pincet, plaats voorzichtig het chambered dekglaasje op de differentiatie medium in een omgekeerde, zodanig dat het monster neurospheres naar beneden worden geconfronteerd. Incubeer de chambered dekglaasje met differentiatiemedium voor 3 dagen bij 37 ° C, 5% CO2. Opmerking: Het monster neurosferen in contact met het differentiatiemedium maar niet in contact met de differentiërende cellen eronder. </li></ol> 7. Vaststelling van gedifferentieerde Neurosferen (Dag 12) <ol><li> Verwijder de chambered dekglaasje uit de 10 cm cultuur schotel met behulp van een steriel pincet. Voorzichtig Dompel de dekglaasje in PBS te wassen het geconditioneerd medium. </li><li> Trek het silicone pakking van het dekglaasje. Voer deze voorzichtig en langzaam om te voorkomen dat het breken van het dekglaasje. Kennis te nemen van de kant waar the gedifferentieerde neurospheres worden nageleefd. </li><li> Pipetteer 1 ml 4% paraformaldehyde (PFA) op een stuk paraffine film gesneden om de grootte van het dekglaasje. Plaats voorzichtig de dekglaasje op paraffine film met de neurosferen naar beneden in contact met het PFA. Bevestig de neurosferen gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Let op: PFA is giftig, zowel in vloeibare en dampvorm en is brandbaar. Vermijd inademing van dampen en contact met de huid en ogen. handvat PFA altijd in een goed geventileerde zuurkast. </li><li> Pipetteer 1 ml PBS op een stuk film paraffine. Was de neurosferen Hiertoe plaatst het dekglaasje met de neurosferen naar beneden in contact met PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Herhaal stap 7.4 nog twee keer. </li></ol> 8. O4 kleuring van gedifferentieerde Neurosferen (Dag 12) <ol><li> Bereid 3% runderserumalbumine (BSA) in PBS. Pipetteer 1 ml van de 3% BSA op een stuk film paraffine. Blokkeer de neurospheres door voorzichtig PlacinG het dekglaasje (de neurosferen naar beneden) in contact met de BSA gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Pipetteer 1 ml muizen anti-O4 IgM antilichaam (1: 300 verdunning in 3% BSA) op een stuk film paraffine en plaats het dekglaasje op paraffine film met de neurosferen naar beneden in contact met het antilichaam. Sta O4 kleuring optreedt gedurende 2 uur bij kamertemperatuur. </li><li> Was het dekglaasje tweemaal met PBS zoals in stap 7,4. </li><li> Pipetteer 1 ml groene fluorescente kleurstof geconjugeerd anti-muis IgM secundair antilichaam (1: 500 verdunning in 3% BSA) op een stuk paraffine film en plaats het dekglaasje op paraffine film met de neurosferen naar beneden in contact met het antilichaam . Laat gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker. OPMERKING: Voer immunokleuring in een donkere omgeving van deze stap verder. </li><li> Was het dekglaasje tweemaal met PBS zoals in stap 7,4. </li></ol> 9. Tuj1 en Glial Fibrillaire zuur eiwit (GFAP) kleuringvan gedifferentieerde Neurosferen (Dag 12) <ol><li> Bereid permeabilisatie door toevoeging van Triton X-100 (eindconcentratie: 0,5%) aan de 3% BSA. Pipetteer 1 ml van permeabiliserende oplossing op een stuk film paraffine. Plaats dekglaasje op paraffine film met de neurosferen naar beneden in contact met de permeabilisatie oplossing gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Was het dekglaasje tweemaal met PBS zoals in stap 7,4. </li><li> Pipetteer 1 ml muis anti-Tuj1 IgG2a-antilichaam (1: 500 verdunning in 3% BSA) en konijn anti-GFAP IgG antilichaam (1: 1000 verdunning in 3% BSA) op een stuk paraffine film en plaats dekglaasje op paraffine film met de neurosferen naar beneden in contact met de antilichamen. Toestaan ​​Tuj1 en GFAP kleuring optreedt gedurende 2 uur bij kamertemperatuur. OPMERKING: Beide antilichamen kunnen worden bereid als een enkele oplossing. </li><li> Was het dekglaasje tweemaal met PBS zoals in stap 7,4. </li><li> Pipetteer 1 ml rode fluorescerende kleurstofgeconjugeerde anti-muizen IgG2a (1: 500 verdunning in 3% BSA) en verre rode fluorescerende kleurstof geconjugeerd anti-konijn IgG (1: 500 verdunning in 3% BSA) secundaire antilichamen op een stuk paraffine film en plaats dekglaasje op de paraffine film met de neurosferen naar beneden in contact met de antilichamen. Laat gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. OPMERKING: Beide antilichamen kunnen worden bereid als een enkele oplossing. </li><li> Was het dekglaasje tweemaal met PBS zoals in stap 7,4. </li><li> Verdun 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) stockoplossing aan 300 nM in PBS. Pipetteer 1 ml DAPI op een stuk film paraffine en plaats dekglaasje op paraffine film met de neurosferen naar beneden in contact met DAPI gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur kernen kleuring. </li><li> Was het dekglaasje eenmaal met PBS en tweemaal met gedeïoniseerd water zoals beschreven in stap 7.4. Monteer het dekglaasje op een glasplaatje met een geschikt fixeermiddel en laten drogen O / N bij kamertemperatuur. </li></ol> 10. ImaGing van gedifferentieerde Neurosferen (Dag 13) <ol><li> Afbeelding neurosferen onder een confocale microscoop met een 40X. Gebruik de lasers bij 488 nm, 594 nm en 647 nm tot oligodendrocyten, neuronen en astrocyten te detecteren, respectievelijk. </li><li> Bepaal het percentage van unipotente, bipotent en tripotent neurospheres. OPMERKING: Sterkte wordt bepaald door het vermogen van de neurosfeer differentiëren tot drie neurale lineages - oligodendrocyten, astrocyten en neuronen 5,14,15,26. Oligodendrocyten worden geïdentificeerd door positieve kleuring voor O4 (rubriek 8). Neuronen worden geïdentificeerd door positieve kleuring voor Tuj1 (hoofdstuk 9). Astrocyten worden geïdentificeerd door positieve kleuring voor GFAP (hoofdstuk 9). Een unipotente neurosphere differentieert zich in slechts één van de afstamming en moet positief vlek voor zowel O4, GFAP of Tuj1. Een bipotent neurosphere differentieert in twee lijnen en moeten positief vlek voor O4 en GFAP of O4 en Tuj1 of GFAP en Tuj1. Een tripotent neurosphere verschillendeiates in alle drie de lijnen en moeten positief vlek voor O4, GFAP en Tuj1. </li><li> Bepaal NSC frequentie in de populatie van belang met behulp van de volgende formule: NSC frequentie = (NFU x% van tripotent neurospheres) / 100%. </li></ol>

<ol><li>Ahmed, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+culture+of+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biochem%22%5BJournal%5D)">The culture of neural stem cells.</a> J. Cell. Biochem. 106 (1), 1-6 (2009).</li>
<li>Reynolds, B. A., Tetzlaff, W., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multipotent+EGF-responsive+striatal+embryonic+progenitor+cell+produces+neurons+and+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A multipotent EGF-responsive striatal embryonic progenitor cell produces neurons and astrocytes.</a> J. Neurosci. 12 (11), 4565-4574 (1992).</li>
<li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).</li>
<li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+and+Population+Analyses+Demonstrate+That+an+EGF-Responsive+Mammalian+Embryonic+CNS+Precursor+Is+a+Stem+Cell%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Clonal and Population Analyses Demonstrate That an EGF-Responsive Mammalian Embryonic CNS Precursor Is a Stem Cell.</a> Dev. Biol. 175 (1), 1-13 (1996).</li>
<li>Narayanan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+mRNA+Profiling+Identifies+Progenitor+Subclasses+in+Neurospheres%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Dev%22%5BJournal%5D)">Single-Cell mRNA Profiling Identifies Progenitor Subclasses in Neurospheres.</a> Stem Cells and Dev. 21 (18), 3351-3362 (2012).</li>
<li>Uchida, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+isolation+of+human+central+nervous+system+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Direct isolation of human central nervous system stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (26), 14720-14725 (2000).</li>
<li>Capela, A., Temple, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LeX%2Fssea-1+Is+Expressed+by+Adult+Mouse+CNS+Stem+Cells%2C+Identifying+Them+as+Nonependymal%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">LeX/ssea-1 Is Expressed by Adult Mouse CNS Stem Cells, Identifying Them as Nonependymal.</a> Neuron. 35 (5), 865-875 (2002).</li>
<li>Capela, A., Temple, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LeX+is+expressed+by+principle+progenitor+cells+in+the+embryonic+nervous+system%2C+is+secreted+into+their+environment+and+binds+Wnt-1%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">LeX is expressed by principle progenitor cells in the embryonic nervous system, is secreted into their environment and binds Wnt-1.</a> Dev. Biol. 291 (2), 300-313 (2006).</li>
<li>Corti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+murine+neural+stem%2Fprogenitor+cells+based+on+Prominin-1+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of murine neural stem/progenitor cells based on Prominin-1 expression.</a> Exp. Neurol. 205 (2), 547-562 (2007).</li>
<li>Nagato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+characterization+of+neural+stem+cells+by+flow+cytometry+analysis+using+a+combination+of+surface+markers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Prospective characterization of neural stem cells by flow cytometry analysis using a combination of surface markers.</a> J. Neurosci. Res. 80 (4), 456-466 (2005).</li>
<li>Kim, M., Morshead, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+Populations+of+Forebrain+Neural+Stem+and+Progenitor+Cells+Can+Be+Isolated+Using+Side-Population+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Distinct Populations of Forebrain Neural Stem and Progenitor Cells Can Be Isolated Using Side-Population Analysis.</a> J. Neurosci. 23 (33), 10703-10709 (2003).</li>
<li>Murayama, A., Matsuzaki, Y., Kawaguchi, A., Shimazaki, T., Okano, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+neural+stem+cells+in+the+developing+and+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of neural stem cells in the developing and adult mouse brain.</a> J. Neurosci. Res. 69 (6), 837-847 (2002).</li>
<li>Rietze, R. L., Valcanis, H., Brooker, G. F., Thomas, T., Voss, A. K., Bartlett, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+a+pluripotent+neural+stem+cell+from+the+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Purification of a pluripotent neural stem cell from the adult mouse brain.</a> Nature. 412 (6848), 736-739 (2001).</li>
<li>Tham, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CSPG+Is+a+Secreted+Factor+that+Stimulates+Neural+Stem+Cell+Survival+Possibly+by+Enhanced+EGFR+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">CSPG Is a Secreted Factor that Stimulates Neural Stem Cell Survival Possibly by Enhanced EGFR Signaling.</a> PLoS ONE. 5 (12), e15341(2010).</li>
<li>Gan, H. T., Tham, M., Hariharan, S., Ramasamy, S., Yu, Y. H., Ahmed, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+ApoE+as+an+autocrine%2Fparacrine+factor+that+stimulates+neural+stem+cell+survival+via+MAPK%2FERK+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Identification of ApoE as an autocrine/paracrine factor that stimulates neural stem cell survival via MAPK/ERK signaling pathway.</a> J. Neurochem. 117 (3), 565-578 (2011).</li>
<li>Ramasamy, S., Narayanan, G., Sankaran, S., Yu, Y. H., Ahmed, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cell+survival+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Neural stem cell survival factors.</a> Arch. Biochem. Biophys. 534 (1-2), 71-87 (2013).</li>
<li>Ahmed, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factors+and+neural+stem+cell+self-renewal%2C+growth+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adh.+Migr%22%5BJournal%5D)">Transcription factors and neural stem cell self-renewal, growth and differentiation.</a> Cell Adh. Migr. 3 (4), 1-12 (2009).</li>
<li>Gritti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+Neural+Stem+Cells+Reside+into+the+Rostral+Extension+and+Olfactory+Bulb+of+Adult+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Multipotent Neural Stem Cells Reside into the Rostral Extension and Olfactory Bulb of Adult Rodents.</a> J. Neurosci. 22 (2), 437-445 (2002).</li>
<li>Gritti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+and+Fibroblast+Growth+Factors+Behave+as+Mitogenic+Regulators+for+a+Single+Multipotent+Stem+Cell-Like+Population+from+the+Subventricular+Region+of+the+Adult+Mouse+Forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Epidermal and Fibroblast Growth Factors Behave as Mitogenic Regulators for a Single Multipotent Stem Cell-Like Population from the Subventricular Region of the Adult Mouse Forebrain.</a> J. Neurosci. 19 (9), 3287-3297 (1999).</li>
<li>Vescovi, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+cloning+of+multipotential+stem+cells+from+the+embryonic+human+CNS+and+establishment+of+transplantable+human+neural+stem+cell+lines+by+epigenetic+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Isolation and cloning of multipotential stem cells from the embryonic human CNS and establishment of transplantable human neural stem cell lines by epigenetic stimulation.</a> Exp. Neurol. 156 (1), 71-83 (1999).</li>
<li>Azari, H., Louis, S. A., Sharififar, S., Vedam-Mai, V., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural-Colony+Forming+Cell+Assay%3A+An+Assay+To+Discriminate+Bona+Fide+Neural+Stem+Cells+from+Neural+Progenitor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells.</a> J. Vis. Exp. (49), e2639(2011).</li>
<li>Louis, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+of+Neural+Stem+and+Progenitor+Cells+in+the+Neural+Colony-Forming+Cell+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Enumeration of Neural Stem and Progenitor Cells in the Neural Colony-Forming Cell Assay.</a> Stem Cells. 26 (4), 988-996 (2008).</li>
<li>Coles-Takabe, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Don%27t+look%3A+growing+clonal+versus+nonclonal+neural+stem+cell+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Don't look: growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies.</a> Stem Cells. 26 (11), 2938-2944 (2008).</li>
<li>Mori, H., Fujitani, T., Kanemura, Y., Kino-Oka, M., Taya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observational+examination+of+aggregation+and+migration+during+early+phase+of+neurosphere+culture+of+mouse+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biosci.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Observational examination of aggregation and migration during early phase of neurosphere culture of mouse neural stem cells.</a> J. Biosci. Bioeng. 104 (3), 231-234 (2007).</li>
<li>Singec, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+actual+sensitivity+and+specificity+of+the+neurosphere+assay+in+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology.</a> Nat. Methods. 3 (10), 801-806 (2006).</li>
<li>Yu, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification%2C+Visualization%2C+and+Molecular+Signature+of+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Dev%22%5BJournal%5D)">Purification, Visualization, and Molecular Signature of Neural Stem Cells.</a> Stem Cells and Dev. 25 (2), 189-201 (2016).</li>
<li>Yu, Y. H. C1qR1 is comparable with LeX and Prom1 as a neural stem cell marker. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aYu%2C+YH+%22Identification+of+mouse+embryonic+neural+stem+cell+surface+markers%22">Identification of mouse embryonic neural stem cell surface markers</a>. , Chapter 3.5, Figure 3.17 (2012).</li>
<li>Tham, M. Neural colony-forming cell assay. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTham%2C+M+%22A+role+for+chondroitin+sulfate+proteoglycan+in+regulating+the+survival+and+growth+of+neural+stem+cells%22">A role for chondroitin sulfate proteoglycan in regulating the survival and growth of neural stem cells</a>. , Chapter 3.6.3, Figure 3.22A (2009).</li>
<li>Yuan, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-Surface+Marker+Signatures+for+the+Isolation+of+Neural+Stem+Cells%2C+Glia+and+Neurons+Derived+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Cell-Surface Marker Signatures for the Isolation of Neural Stem Cells, Glia and Neurons Derived from Human Pluripotent Stem Cells.</a> PLoS ONE. 6 (3), e17540(2011).</li>
<li>Hall, P. E., Lathia, J. D., Miller, N. G. A., Caldwell, M. A., Ffrench-Constant, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+Are+Markers+of+Human+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Integrins Are Markers of Human Neural Stem Cells.</a> Stem Cells. 24 (9), 2078-2084 (2006).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

We beschrijven hee de opsomming van NSCs onder klonale omstandigheden. Kritische stappen omvatten het gebruik van verse NSC groei en differentiatie medium, en ook het gebruik van vers bereide PLL / laminine oplossing het bekleden van de chambered dekglaasjes, evenals de kweekschalen. Dit zorgt voor optimale groei en differentiatie van neurosferen omstandigheden. Het gebruik van goede kwaliteit antilichamen tegen de neuronen en glia, evenals de selectieve plukken van klonale neurosferen die niet in contact met andere neurosferen effectief detecteren kritisch. Bovendien is het belangrijk te zorgen voor de geplukte neurosferen niet opdrogen. Aanbevolen wordt 10 ul van differentiatiemedium toevoegen aan elk putje na ophalen elke 10 neurosferen. Het is belangrijk om een ​​chambered dekglaasje gebruiken op een 10 cm schaal per monster overspraak tussen neurosferen uit verschillende monsters te vermijden. Als twee dekglaasjes (elk neurosferen uit verschillende monsters) worden in deDezelfde 10 cm schaal, neurosferen uit een dekglaasje zou loslaten factoren die de neiging van neurosferen kunnen veranderen in de andere dekglaasje te differentiëren tot specifieke lijnen. Twee dekglaasjes in dezelfde 10 cm schaal kan ook leiden tot verwarring tussen de monsters. In het geval dat de NFU en de NSC frequentie is lager dan verwacht, ervoor te zorgen dat de lage passage aantal neurospheres worden gebruikt. Het is ook belangrijk dat gezonde lage passage neurosferen worden gebruikt voor het genereren geconditioneerd medium. Vervolgens, als de neurosferen worden gekweekt in putjes met kleine diameter, zoals in 96-putjes, dan zal het moeilijk te manoeuvreren en kies neurosferen met behulp van een micropipet. In dit geval brengt de neurosferen met een grotere kweekschaal, zoals een 6-putjes voorafgaand aan het plukken. Sommige van de geplukte neurosferen kunnen tillen van de chambered dekglaasje tijdens de cultuur en immunokleuring. Het minimaliseren van de beweging van de chambered dekglaasje tijdens de cultuur en minder intensieve washing tijdens immunokleuring, zou helpen om detachement van neurosferen te voorkomen. Initial studies gekwantificeerd NSC met alleen de NFA 7,11,13. Echter, de NFA overschat de NSC frequentie als zowel NSCs en vroege NP genereren neurospheres 5. Louis et al. Ontwikkelden een andere methode NSC zogenaamde NCFCA 21,22 kwantificeren. De NCFCA behelst kweken enkele cellen in een collageen gebaseerde matrix klonaliteit waarborgen, en er werd aangetoond dat neurosferen boven 2 mm diameter worden gevormd door enkel NSC. Net als bij de NCFCA wordt clonaliteit verzekerd in dit protocol. Dit wordt bereikt door het genereren van neurosferen bij klonale dichtheid en differentiatie van neurosferen in chambered dekglaasjes. Het gebruik van chambered dekglaasjes geeft een aantal voordelen. De chambered dekglaasje kan elk monster neurosphere om onderscheid te maken, zonder fysiek contact met andere monster neurospheres, waardoor wordt gewaarborgd klonaliteit tijdens differentiatie.De chambered dekglaasje geplaatst kan worden opgehangen aan de differentiatie medium om het monster neurospheres continu te voorzien en om een ​​maximale differentiatie te garanderen. In afwezigheid van geconditioneerd medium en serum tijdens differentiatie, overleving van de neurosferen afneemt en de neurosferen meestal genereren astrocyten (Tham M en S Ahmed, ongepubliceerd). Bovendien kan de immunogekleurde neurosferen geschikt worden opgeslagen gedurende langere tijd en de chambered dekglaasjes kan direct op de microscoop glasplaatjes gemonteerd. Daarnaast is beeldvorming van de immuun-neurosferen gemakkelijk gemaakt als men snel de neurosphere in de kleine goed chambered kunt vinden, afzonderlijke beelden, en ga naar de volgende ook. We hebben de NSC frequentie in E14.5 muis neurosphere cultuur met behulp van zowel de in dit handschrift 27 en NCFCA 28 beschreven protocol vastgesteld. De NSC frequentie in E14.5 muis neurosferen bepaald door zowel mede werkwijze wordt vergelijkbaar. De NCFCA somt NSC dat multipotente zijn en op lange termijn zelfvernieuwingscapaciteit. Aangezien de NSC frequentie Aanbevolen methode is vergelijkbaar met die van NCFCA gaat de uitlezing van ons protocol lijkt erop dat de NSC frequentie overschatten. De NCFCA vereist drie weken worden afgerond en gaat het vooral om de cel plating en middelgrote aanvulling. De hier beschreven protocol vereist 13 dagen uit te voeren en het gaat om een andere reeks stappen, bijvoorbeeld neurosphere plukken en immunokleuring. Dit protocol zou kunnen dienen als alternatief voor NSC sommen. Onderzoekers kunnen zowel NCFCA en dit protocol te gebruiken om NSC frequentie controleren in hun monsters. Een beperking van dit protocol is dat een aantal belangrijke stappen staan ​​te worden uitgevoerd op dag 8. De bereiding van het geconditioneerde medium, bepaling van NFU monster neurosferen en overdracht van monster neurosferen de 50-well chambered dekglaasje moeten uitgevoerd op day 8. Men zou de tijd nemen om deze stappen uit te voeren. Bovendien vereist oefening om deze stappen uit te voeren op een efficiënte wijze. Neurosferen zijn op grote schaal gebruikt om NSC en gedrag te bestuderen. Echter, neurospheres bestaan ​​uit zowel NSCs en NP&#39;s. Daarom is het belangrijk om NSCs verrijken van neurospheres NSC studie biologie. Op dit moment hebben celoppervlak markers, kleurstof uitsluiting goederen, alsmede celgrootte en granulariteit gebruikt om te verrijken voor NSC 6,7,9-13,29,30. Dit protocol kan worden gebruikt om de verrijking van NSC kwantificeren NSC potentiële markers, en het zoeken naar een definitieve NSC marker vergemakkelijken. Vier recente studies hebben dit protocol gebruikt om NSC frequentie 5,14,15,26 sommen.

Neurale stamcellen (NSC&#39;s) zijn cellen van het centrale zenuwstelsel (CNS) die hernieuwen en zijn multipotente. NSC eerst gespecificeerd tijdens de ontwikkeling van de embryonale voorhersenen en blijven bestaan ​​in de volwassen hersenen op specifieke gebieden zoals subventriculaire zone (SVZ) van de laterale ventrikels en de dentate gyrus (DG) van de hippocampus. Een aantal NSC lijnen worden gebruikt in klinische studies voor de behandeling van beroerte en andere neurologische aandoeningen zoals de ziekte van Batten 1. NSCs en neurale voorlopercellen (NP) worden gekweekt in cultuur als drijvende 3-dimensionale structuren sferoïde genoemd neurospheres. Het neurosfeercultuur systeem is ontwikkeld door Reynolds en Weiss in de vroege jaren 1990, toen ze dat embryonale en volwassen corticale cellen in de aanwezigheid van epidermale groeifactor (EGF) en basische fibroblast groeifactor (bFGF) 2-4 kan verdelen. Neurosferen bestaan ​​uit een heterogeen mengsel van cells bestaande uit subklassen in verschillende ontwikkelingsstadia 5. Het een uitdaging om specifiek bestuderen NSCs gebruikt gegevens uit neurospheres door de aanwezigheid van NP. Daarom is het van cruciaal belang om NSCs verrijken van neurospheres. Momenteel zijn vier belangrijkste methoden gebruikt om te verrijken voor NSCs in vitro. Eerst is het gebruik van celoppervlak markers. Lewis-X (LEX) en CD133 (ook bekend als Prominin1) zijn de voornaamste celoppervlak markers NSC 6-9. Syndecan-1, Notch-1 en integrine-beta1 andere oppervlakte-eiwitten die verrijken NSCs 10. Ten tweede is de kleurstof uitsluiting. Aangetoond is dat de zij-populatie cellen, die het unieke vermogen te pompen uit de fluorescerende DNA-bindende kleurstof Hoechst 33342 hebben, worden verrijkt NSC 11. Ten derde is het gebruik van morfologische selectie. Er is aangetoond dat cellen met toegenomen grootte en granulariteit cel haven NSC meer dan hun tegenhangers 5,12,13. Ten vierde is de toevoeging van NSC survival factoren aan het kweekmedium. Het is aangetoond dat toevoeging van chondroïtinesulfaat proteoglycanen en apolipoproteïne E verbetert NSC overleving vergroot dan ook NSC frequentie 14,15. Hoewel veel markers waaronder transcriptiefactoren zijn geassocieerd met NSC 16,17, geen van deze markers kunnen NSC verrijken zuiverheid. Vanwege het ontbreken van definitieve NSC markers, blijft het een uitdaging om NSCs kwantificeren en ze onderscheiden van NP in vitro. Initial studies gebruikten de neurosphere formatie assay (NFA) te kwantificeren NSCs 7,11,13. In deze assay, gedissocieerde cellen worden gekweekt om neurosferen vormen en het aantal neurosferen gegenereerd voor elke 100 cellen uitgeplaat bepaald. Deze waarde wordt genoemd als de Neurosfeer Formation Unit (NFU). De NFU is gelijk aan de NSC frequentie als alle neurospheres voortvloeien uit NSC. Er werd aangetoond dat de NFU overschat de NSC frequentie als neurosferen worden gevormd door zowel NSCs en vroege NP 5. Derhalve is het onjuist te noemen NSC uitsluitend gebaseerd op neurosphere formatie. Het zou mogelijk te kwantificeren NSCs op basis van hun vermogen om zichzelf te vernieuwen, verspreiden op grote schaal en het genereren van multipotente neurospheres. NSC, dat EGF en bFGF responsief zijn, meestal overleven gedurende ten minste tien passages en dus uitgebreide zelfvernieuwingscapaciteit in cultuur 4,18-20 weer te geven. NPs, welke EGF en bFGF responsief zijn en kan ook neurosferen enkele passages maar niet voor langere tijd realiseren. Derhalve is het algemeen aanvaard dat bonafide NSCs kunnen worden geteld met eerlijke nauwkeurigheid gebaseerd op neurosphere vorming gedurende ten minste tien passages. In de meeste studies echter zelfvernieuwing wordt gewoonlijk gemeten op basis van secundaire of tertiaire vorming neurosfeer vanwege de lange tijd die nodig experimentele tien passages. Derhalve kan de secundaire NFA worden gebruikt om breed vergelijken zelfvernieuwing capaciteit between populaties, maar kan niet worden gebruikt om nauwkeurig te sommen NSC frequentie. NSC&#39;s hebben een grotere proliferatieve vermogen vergeleken NP. Deze eigenschap van NSC werd gebruikt door Louis et al. de neurale kolonievormende cel assay (NCFCA) 21,22 - met een test voor NSC opsomming te ontwikkelen. In deze assay, enkele cellen worden gedurende 3 weken in een collageenbevattende halfvaste matrix. Onder deze kweekomstandigheden werd aangetoond dat cellen die neurosferen boven 2 mm diameter kunnen vormen tripotent en kunnen hernieuwen voor lange termijn. Deze cellen worden gedefinieerd als NSC. Daarom worden de NSCs daadwerkelijk onderscheiden NP. NSC&#39;s hebben de mogelijkheid om te differentiëren tot astrocyten, oligodendrocyten en neuronen. Voor differentiatie van neurosferen worden groeifactoren verwijderd en serum toegevoegd aan het kweekmedium. Als alle drie neurale geslachten waargenomen in een neurosfeer, dan is de cel die dat neurosfeer geïnitieerd is een NSC. De differentiatie test een aantal beperkingen. Ten eerste kunnen de kweekomstandigheden voor differentiatie niet optimaal voor het genereren van drie neurale geslachten zijn. In feite, in een enkele neurosfeer differentiatieproces significante celdood optreedt en meestal astrocyt wordt gegenereerd (Tham M en S Ahmed, ongepubliceerd). Ten tweede is er de kwestie clonaliteit. Voor nauwkeurige telling van NSCs vorming en differentiatie van neurosferen moet uitgevoerd onder klonale omstandigheden, waarbij elke neurosfeer ontstaat uit een enkele cel. In bulk suspensiekweken, aggregatie vindt plaats op zowel cellulaire en neurosphere niveaus 23-25. Daarom is het mogelijk voor elke neurosphere ontstaan ​​uit meerdere cellen of neurosferen, die neurosfeer tellen en evaluatie van multipotent bemoeilijkt. Uit recente gegevens blijkt dat de samenvoeging van de cellen treedt niet op bij lage plating dichtheid van 0,5 cellen / ul of minder, en wanneer de cultuur platen niet tijdens neu worden verplaatstrosphere formatie 15. Zo kweken van cellen bij zulke lage dichtheid zou zorgen clonaliteit. Momenteel is de NCFCA is de meest gebruikte methode om NSCs onderscheiden van NP en sommen NSC frequentie. De NCFCA vereist echter een relatief lange tijd van drie weken. We beschrijven hier een protocol NSC frequentie opsommen gebaseerd op het vermogen van NSC multipotente neurosferen vormen. Dit protocol duurt slechts 13 dagen uit te voeren. De NCFCA zorgt clonaliteit de collageenmatrix beweging van de neurosferen voorkomt. De kweekomstandigheden die in dit protocol kunnen ook clonaliteit gehele te handhaven. Bijvoorbeeld, het gebruik van 50-well chambered dekglaasjes zodat de neurosferen zal differentiëren zonder contact met elkaar. Verder gebruiken we geconditioneerd medium dat neurotrofe factoren levert bij differentiatie de differentiatie potentieel van de neurosferen (figuur 1) te maximaliseren.

```html
<table><tbody><tr><td>15 mL conische centrifugebuizen&nbsp;</td><td>BD</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conische centrifugebuizen&nbsp;</td><td>BD</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>20 mL steriele spuit&nbsp;&nbsp;</td><td>BD</td><td>300141</td><td></td></tr><tr><td>50 mL steriele spuit&nbsp;</td><td>BD</td><td>300144</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum (FBS)&nbsp;</td><td>Biowest</td><td>S1810</td><td></td></tr><tr><td>Muis anti-Tuj1 IgG2a antilichaam</td><td>Covance</td><td>MMS-435P-100</td><td></td></tr><tr><td>Konijn anti-GFAP IgG antilichaam</td><td>Dako</td><td>Z033401</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer&nbsp;</td><td>Hausser Scientific</td><td>3100</td><td></td></tr><tr><td>Microscoop aangepast aan laminaire stroomkap&nbsp;</td><td>Leica</td><td>MZ6</td><td></td></tr><tr><td>Glasplaatjes</td><td>Marienfeld-superior</td><td>1000200</td><td></td></tr><tr><td>Muis anti-O4 IgM antilichaam&nbsp;</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB345</td><td></td></tr><tr><td>Hydromount</td><td>National Diagnostics</td><td>HS-106</td><td></td></tr><tr><td>Microscoop</td><td>Nikon Eclipse</td><td>TS100-F</td><td></td></tr><tr><td>Laminaire stroomkap</td><td>NuAire</td><td>NU-543</td><td></td></tr><tr><td>96-well kweekschalen</td><td>NUNC</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>10-cm kweekschalen&nbsp;</td><td>NUNC</td><td>150350</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Parafilm</td><td>PM999</td><td></td></tr><tr><td>Human Epidermal Growth Factor (EGF)&nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)&nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &micro;m filter&nbsp;</td><td>Sartorius Stedim</td><td>16534-K</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &micro;m filter</td><td>Sartorius Stedim</td><td>16555-K</td><td></td></tr><tr><td>1.0 N Natriumhydroxide (NaOH)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2770</td><td></td></tr><tr><td>1.0 N Zoutzuurgas (HCl)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9892</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blauw&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine (PLL)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA) poeder&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Toxisch</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumine (BSA) poeder&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>50-well kamerdeksels&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7735</td><td></td></tr><tr><td>Roerplaat met verwarmingsfunctie&nbsp;</td><td>Stuart</td><td>UC152</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Laminine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>1x Fosfaat Gebufferd Saline zonder Ca2+ en Mg2+ (DPBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 geit anti-muis IgM antilichaam</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21042</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 geit anti-muis IgG2a antilichaam</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21135</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 geit anti-konijn IgG antilichaam</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A31573</td><td></td></tr><tr><td>4&rsquo;,6&rsquo;-diamidino-2-fenylindoldihydrochloride (DAPI)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>Cel-kweekcentrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp;RT1 75002383</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipetten</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10006021</td><td></td></tr><tr><td>CO2 incubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Geventileerde afzuigkap</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aspirator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Confocale microscoop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipetten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipet tips</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kunststof pipetten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Meerkanaals pipetten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glas beker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Steriele pincetten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH meter</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>
```

opsomming van neurale stamcellen met behulp van klonen testen

Enumeration of Neural Stem Cells Using Clonal Assays

Neurale stamcellen (NSC) hebben de mogelijkheid om zichzelf te vernieuwen en het genereren van de drie grote neurale lineages - astrocyten, neuronen en oligodendrocyten. NSCs en neurale voorlopercellen (NP) zijn vaak gekweekt in vitro als neurospheres. Dit protocol beschrijft in detail hoe de NSC frequentie in een bepaalde cel populatie onder klonale voorwaarden vast te stellen. Het protocol begint met het zaaien van de cellen bij een dichtheid die het mogelijk maakt voor de productie van klonale neurosferen. De neurosferen worden vervolgens overgebracht naar chambered dekglaasjes en gedifferentieerde onder klonale omstandigheden in geconditioneerd medium dat de differentiatie potentieel van de neurosferen maximaliseert. Tenslotte wordt de NSC frequentie berekend op basis van neurosfeer vorming en multipotent mogelijkheden. Nut van deze protocollen zijn evaluatie van kandidaat NSC markers zuivering van NSCs, en het vermogen om NSCs onderscheiden van NP. Deze methode duurt 13 dagen om te presteren, dat is veel sHorter dan de huidige methoden om NSC frequentie te sommen.

We hebben dit protocol gebruikt om het vermogen van LeX, een bekende celoppervlak marker NSC 7, te verrijken NSC beoordelen. Gegevens uit deze studie worden gemaakt hoe NSC worden opgesomd met de klonale assays in het protocol. E14.5 muis neurosfeercellen werden geïncubeerd met anti-LeX antilichaam. Vervolgens cellen die LeX (LeX +) en cellen die niet tot expressie LeX (LeX -) tot expressie werden geënt bij 50 cellen / ml door Fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) en men liet klonale neurosferen te genereren voor 1 week. Time-lapse imaging blijkt dat de gegenereerde neurosferen bij 50 cellen / ml zijn klonale (Figuur 2). De NFU Lex + en LeX - cellen werd bepaald. Er wordt aangetoond dat LeX + cellen een significant hogere neurosfeer vorming vermogen vergeleken met LeX - cellen (Figuur 3g). De neurosferen gegenereerd werden vervolgens gedifferentieerdonder omstandigheden klonale vervolgens immunostained en afgebeeld (Figuur 3a-e). LeX + cellen te genereren aanzienlijk meer tripotent neurospheres dan LeX - cellen (figuur 3f). De NSC frequentie werd vervolgens berekend op basis van de NFU en% van tripotent neurospheres (figuur 3g). Selectie op basis van LeX, verrijkt NSC frequentie van meer dan 14 maal, valideren LeX als NSC marker. We hebben ook bepaald de NSC frequentie van E14.5 muis neurosferen met dit protocol 27 en NCFCA 28. Beide methoden rapporteren vergelijkbaar NSC frequentie van ongeveer 2% in E14.5 muis neurospheres. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/54456/54456fig1.jpg" /> Figuur 1. Protocol voor Neurosfeer Differentiatie onder klonen Voorwaarden. Sample neurospheres geteeld onder klonale voorwaarden zijn individueel geplaatst in elk PLL / laminine-coated putje van een 50 putjes chambered dekglaasje en liet hechten O / N. Op dezelfde dag, zijn bulk gekweekt neurospheres uitgezet in differentiatie medium in een PLL / laminine beklede 10 cm schotel, en mag O hechten / N. De volgende dag, geconditioneerde medium van de massa gekweekte neurosferen wordt gefiltreerd en opnieuw in de 10 cm schaaltje gebracht. Het monster neurospheres worden vervolgens omgekeerd op het geconditioneerde medium en mogen differentiëren voor 3-4 dagen 28. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54456/54456fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/54456/54456fig2.jpg" /> Figuur 2. Groei van een klonale Neurosfeer. Cellen verkregen uit E14.5 neurosferen werden gedissocieerd en geënt bij 50 cellen / ml in 96-putjes. Individuele cellen werden bijgehouden voor 6 d door time-lapse imaging. Beelden van one dergelijke cel groeien tot een neurosphere wordt getoond. Merk op dat de neurosphere handhaaft clonaliteit. (A) 0 dagen; (B) 1.19.45; (C) 2.95.37; (D) 3.32.76; (E) 4.46.53; (F) 5.61.44; waarbij het eerste getal verwijst naar de dag, tweede getal staat voor de fractie van de dag, en derde nummer verwijst naar de fractie van de h. 10x vergroting. Schaal bar, 100 micrometer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54456/54456fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 3" src="/files/ftp_upload/54456/54456fig3.jpg" /> Figuur 3. Differentiatie van klonen Neurosferen en telling van NSC Frequency. Single neurospheres werden opgepikt en gedifferentieerd in 50-well chambered dekglaasje 3 d. Een representatief beeld van een tripotent neurosphere stained met (a) en DAPI immunologisch voor (b) GFAP, (c) Tuj1 en (d) O4. (E) Toont de overlay van (a) - (d). Schaal bar, 65 micrometer. (F) Het% unipotente, bipotent en tripotent neurosferen gegenereerd door LeX + en LeX - cellen (gemiddelde ± SEM, n = 3). (G) NSC frequentie in LeX + en LeX -. Cellen berekend als het product van de NFU en% van tripotent neurospheres <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54456/54456fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Neurale stamcellen (NSC) verwijzen naar cellen die kunnen zichzelf vernieuwen en differentiëren in de drie neurale geslachten. We beschrijven hier een protocol NSC frequentie te bepalen in een bepaalde celpopulatie via neurosfeer vorming en differentiatie onder klonale omstandigheden.

Opsomming van neurale stamcellen Met behulp van klonen Testen

Neural stem cells (NSCs) have the ability to self-renew and generate the three major neural lineages &#8212; astrocytes, neurons and oligodendrocytes. ...

Het algemene doel van deze procedure is om de frequentie van neurale stamcellen in een gegeven populatie te bepalen met behulp van de vorming van neurosferen en differentiatie onder clonale omstandigheden. Deze methode is zeer nuttig binnen het vakgebied van neurale stamcellen, bijvoorbeeld voor de evaluatie van kandidaat-markers voor neurale stamcellen, de zuivering van neurale stamcellen en het onderscheiden van neurale stamcellen van neurale progenitorcellen. De voordelen van deze methode zijn dat de uitvoering 13 dagen in beslag neemt, wat korter is dan huidige methoden om de frequentie van neurale stamcellen te bepalen, en dat de procedure onder clonale omstandigheden wordt uitgevoerd.Om deze procedure te starten, bereid op dag één NSC-groeimedium door DMEM F12-medium te combineren met B27, EGF, BFGF en penicilline-streptomycine. Dissocieer vervolgens E14.5 muis-neurosferen in één milliliter NSC-groeimedium en één milliliter 0,05 normaal natriumhydroxide gedurende zeven minuten bij kamertemperatuur. Pipetteer de cellen af en toe op en neer om ze in suspensie te houden en voeg daarna één milliliter 0,05 normaal zoutzuur toe om het alkali te neutraliseren.Voer daarna een celtelling uit met behulp van trypanblauw-kleuring en een hemocytometer. Zaai vervolgens enkelvoudige E14.5 muis-neurosfeer-cellen uit in een 96-wellplaat in 100 µL NSC-groeimedium, met een dichtheid van 50 cellen per milliliter of lager. Incubeer de cellen gedurende één week bij 37 °C en 5% CO2 om clonale neurosferen te genereren.Om neurosferen voor het geconditioneerde medium te kweken, worden op dag drie E14.5 muizenneurosferen gedissocieerd en worden de enkelcellen gezaaid met een dichtheid van 20 000 cellen per milliliter in 10 milliliter NSC-groeimedium in een kweekschaal van 10 centimeter. Incubeer de cellen vervolgens vijf dagen bij 37 °C en 5% CO2 om bulk-gekweekte neurosferen te genereren. Bereid op dag acht de coatingoplossing door 700 microliter 0,01% poly-L-lysine, 70 microliter laminine (1 mg/ml) en 6 230 microliter PBS te mengen.Coat vervolgens een kweekschaal van 10 centimeter gedurende twee uur bij 37 °C met zeven milliliter poly-L-lysine laminine-oplossing. Draag alle bulk-gekweekte neurosferen met een serologische pipette van 10 milliliter over naar een conische centrifugebuis van 15 millimeter. Centrifugeer de neurosferen gedurende één minuut bij 171 ×g bij kamertemperatuur en verwijder het supernatant volledig.Bereid daarna NSC-differentiatiemedium door DMEM F12-medium te combineren met B27 en FBS. Voeg 10 milliliters NSC-differentiatiemedium toe aan de neurosferen en pipetteer dit enkele keren op en neer om de neurosferen te resuspenderen. Aspireer vervolgens de poly-L-lysine laminine uit de 10 centimeter kweekschaal en was één keer met 10 milliliters PBS.Breng alle neurosferen over naar de met poly-L-lysine laminine gecoate cultivatieschaal van 10 centimeter en incubeer ze een nacht bij 37 degrees Celsius, 5%CO2 zodat de neurosferen aan de schaal kunnen hechten. Tel op dag acht het aantal gevormde neurosferen in elke put onder een microscoop en coat vervolgens elke put van een 50-put chambered coverslip met 10 microliters poly-L-lysine laminine coating-oplossing gedurende twee uur bij 37 degrees Celsius. Bereid daarna drie conische centrifugebuizen van 50 milliliter voor, elk gevuld met 30 milliliters PBS.Verwijder met een steriele pincet het gecoate 50-well kamerdekglaasje, dompel het kamerdekglaasje onder in de eerste buis met PBS, gevolgd door de tweede en vervolgens de derde buis met PBS om de coatingoplossing af te wassen. Aspireer daarna alle resterende vloeistof uit de wells van het kamerdekglaasje. Breng voorzichtig al het medium en de neurosferen uit elke well van de 96-well plaat over naar één enkele kweekschaal van 10 centimeter.Zorg ervoor dat er telkens slechts één neurosfeer wordt geselecteerd door de pipetkolom op twee microliters in te stellen. Selecteer onder de microscoop een representatieve neurosfeer met behulp van een P10 micropipet voorzien van een 10 microliter pipetpunt. Neurosferen kunnen onder de microscoop, in een laminaire flowkast of op een laboratoriumbank worden geselecteerd. Breng de neurosfeer vervolgens over naar het centrum van een putje van het gecoate 50-wells kamerdekglas.Herhaal de procedures totdat elke put van het kamerdekglaasje een neurosfeer bevat. Voeg vervolgens 10 µL NSC-differentiatiemedium toe aan elke put van het kamerdekglaasje. Plaats het kamerdekglaasje in een kweekschaal van 10 cm.Tot twee dekglasjes met kamers kunnen in een schaal van 10 centimeter worden geplaatst. Pipetteer PBS langs de randen van de schaal om uitdroging van het NSC-differentiatiemedium te voorkomen. Incubeer het dekglasje met kamers overnacht bij 37 °C, 5% CO2.Breng op dag negen het geconditioneerde medium van de bulk-gekweekte neurosferen over naar een conische centrifugebuis van 15 milliliter. Gebruik een steriele spuit van 20 milliliter om het geconditioneerde medium door een filter van 0,2 micrometer te leiden om cellen of debris te verwijderen. Breng vervolgens het gefilterde geconditioneerde medium terug naar de kweekschaal van 10 centimeter.Plaats daarna met een steriele pincet voorzichtig het dekglas met kamer ondersteboven op het geconditioneerde medium, zodanig dat de neurosferen van het monster naar beneden zijn gericht. Incubeer het dekglas met kamer gedurende drie dagen bij 37 °C en 5% CO2. Verwijder op dag 12 voorzichtig het dekglas met kamer uit de cultuurpetrischaal van 10 centimeter met behulp van een steriele pincet.Dip het dekglas voorzichtig in PBS om het geconditioneerde medium af te wassen. Pel vervolgens de siliconen pakking voorzichtig en langzaam van het dekglas af om te voorkomen dat het dekglas breekt. Noteer aan welke zijde de gedifferentieerde neurosferen zijn gehecht.Pipetteer daarna 1 mm van 4% paraformaldehyde op een stuk paraffinefolie dat is gesneden op de grootte van het dekglas. Plaats het dekglas voorzichtig op de paraffinefolie, waarbij de neurosferen naar beneden gericht in contact komen met het paraformaldehyde, en fixeer de neurosferen gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Hier werden individuele neurosferen geselecteerd en gedurende drie dagen gedifferentieerd in een dekglas met een 50-well kamer.Dit is een representatief beeld van een tripotente neurosfeer gekleurd met dapi en immuunkleuring voor GFAP, TUJ1 en O4. Deze afbeelding toont de overlay van dapi, GFAP, TUJ1 en O4. Dit protocol wordt gebruikt om het vermogen van LeX, een bekende NSC-marker, om NSC's te verrijken te beoordelen. Deze grafiek toont het percentage unipotente, bipotente en tripotente neurosferen gegenereerd door LeX-positieve en LeX-negatieve cellen. LeX-positieve cellen genereren significant meer tripotente neurosferen dan LeX-negatieve cellen.Deze tabel laat zien dat de NSC-frequentie van LeX-positieve en LeX-negatieve cellen is berekend als het product van NFU en het percentage tripotente neurosferen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe neurosferen onder clonale omstandigheden kunnen worden gekweekt en gedifferentieerd om de frequentie van neurale stamcellen te bepalen. Tijdens het uitvoeren van deze methode is het belangrijk om vers bereide groeimedia, differentiatiemedia en een vers bereide coating-oplossing te gebruiken om optimale groei- en differentiatiecondities voor de neurosferen te garanderen.Zodra deze methode onder de knie is, kan deze in 13 dagen worden uitgevoerd, een kortere tijd in vergelijking met de huidige methoden om de frequentie van neurale stamcellen te bepalen. Deze methode zou samen met huidige methoden, zoals de neural colony forming cell-assay, kunnen worden gebruikt om nieuwe stamcellen te verrijken en een definitieve marker voor neurale stamcellen te identificeren.

enumeration-of-neural-stem-cells-using-clonal-assays

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Kennis van het exacte aantal levensvatbare cellen is nodig voor vele weefselkweek manipulaties. Dit protocol beschrijft hoe onderscheid te maken tussen levende en dode cellen en kwantificeren cellen met behulp van een hemacytometer. Hoewel het beschrijft het tellen van menselijke neurale stamcellen / precursor cellen (hNSPCs), kan het worden gebruikt voor andere celtypen.

Het tellen van menselijke neurale stamcellen

Deze video protocol laat de neurosphere assay methode voor het genereren en uit te breiden neurale stamcellen uit een volwassen muis periventriculaire regio, en biedt technische inzichten om ervoor te zorgen kan men reproduceerbare neurosphere culturen te bereiken.

Isolatie en uitbreiding van de volwassen muis neurale stamcellen Met behulp van de Neurosphere Assay

Deze video protocol laat zien hoe om te discrimineren en te goeder trouw neurale stamcellen te sommen in een gemengde populatie van neurale voorloper cellen met behulp van de neurale kolonievormende cell assay.

Neurale-Colony Forming Cell-test: Een test om Bona Fide neurale stamcellen van Neural Progenitor Cellen Discrimineer

Deze video protocol geeft blijk van een nieuwe methode voor het genereren en daaropvolgende zuivering van neuronale stamcellen uit een hernieuwbare bron van neurale stamcellen (NSC) op basis van hun fysieke (grootte en interne granulariteit) en fluorescerende eigenschappen met behulp van flowcytometrie-technologie.

De Neuroblast test: een test voor de generatie en de verrijking van Neuronale stamcellen uit Onderscheidende factor voor neurale stamcellen Nakomelingen met behulp van flowcytometrie

Neurale stamcellen geoogst uit de volwassen hersenen worden steeds gebruikt in toepassingen, variërend van het fundamenteel onderzoek van de ontwikkeling van het zenuwstelsel aan het verkennen van potentiële klinische toepassingen in de regeneratieve geneeskunde. Dit maakt strenge controle op de isolatie en kweekomstandigheden gebruikt om deze cellen cruciaal voor experimentele resultaten goed groeien.

Groeiende neurale stamcellen uit Conventionele en Niet-conventionele Regio&#39;s van de Adult knaagdierhersenen

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor het gelijktijdig opwekken van neurale precursoren celculturen, hetzij als hechtende monolagen of neurosferen, uit de subventriculaire zone en dentate gyrus van individuele volwassen muizen.

Een muis, twee culturen: Isolatie en Cultuur van adulte neurale stamcellen uit de Twee Neurogeen Zones van individuele muizen

Het volwassen zoogdierspinaalmerg bevat neurale stam-/voorlopercellen (NSPC's) die kunnen worden geïsoleerd en uitgebreid in cultuur. Dit protocol beschrijft het oogsten, isoleren, kweken en passeren van NSPC's die zijn gegenereerd uit de periventriculaire regio van het volwassen ruggenmerg van de rat en van menselijke orgaantransplantatiedonoren.

Isolatie van neurale stamcellen / stamcellen uit de periventriculaire regio van de volwassen rat en Human Spinal Cord

Een robuust protocol controleren neurale populaties time-lapse video-microscopie gevolgd door softwarematige nabewerking is beschreven. Deze methode geeft een krachtig hulpmiddel voor het identificeren van biologische gebeurtenissen in een geselecteerde populatie tijdens live imaging experimenten.

Live Imaging gevolgd door eencellige bijhouden van de biologie van de cel van de Monitor en de progressie van de bloedlijn van meerdere neurale populaties

Hier presenteren we methodologie voor de klonale analyse van hematopoietische stamcellen precursoren tijdens lymfkliertest embryonale ontwikkeling. Wij combineren index sortering van afzonderlijke cellen uit de embryonale aorta-gonaden-mesonephros regio met endothelial co celkweek en transplantatie te karakteriseren de fenotypische eigenschappen en het engraftment potentieel van één hematopoietische precursoren.

Klonen analyse van embryonale hematopoietische stamcellen precursoren met eencellige Index sorteren gecombineerd met Endothelial Niche co celkweek

Het doel van dit protocol is om een aanpak te beschrijven voor het analyseren van gedrag van volwassen neurale stam/voorlopercellen in reactie op chemogenetische manipulatie van een specifiek lokaal neuraal circuit.

Asgezegde circuit specifieke regulering van volwassen Hippocampal neurale precursor cellen

Hier beschrijven we een nucleofectiesysteem dat is ontworpen om de efficiëntie van genafgifte te verbeteren in uitgebreide neurale stamcellen (NSC's) geïsoleerd uit de subventriculaire zone van volwassen muizen. De bevindingen tonen aan dat deze methode de genverstoring in NSC's aanzienlijk verbetert, de effectiviteit van traditionele transfectieprotocollen overtreft en de celoverleving verbetert.

Isolatie, expansie en nucleofectie van neurale stamcellen uit de subventriculaire zone van volwassen muizen

Leer neurale stamcellen tellen via neurosfeervorming onder klonale omstandigheden. Deze 13-daagse methode helpt onderzoekers bij het evalueren van NSC-markers en het zuiveren van stamcellen voor neurogenese-onderzoek.

Opsomming van neurale stamcellen Met behulp van klonen Testen

Meer video's verkennen