Geregisseerd Protein Packaging binnen Outer membraanvesicles uit Escherichia coli: Ontwerp, Productie en zuivering
November 16th, 2016
Een protocol voor de productie, zuivering en het gebruik van enzymverpakte buitenmembraanvesikels (OMV) dat zorgt voor verbeterde enzymstabiliteit voor implementatie in diverse toepassingen wordt gepresenteerd.
Het algemene doel van deze procedure is om enzymgevulde bacteriële buitenmembraanvesikels te zuiveren en te karakteriseren voor gebruik als in vitro katalytische reagentia. Deze enzymisolatietechniek maakt het mogelijk om bacteriële OMV's uit kweekmedia te oogsten en vervolgens in te zetten voor celvrije katalyse van een organofosfaatverbinding. Gerichte verpakking binnen bacteriële OMV's verbetert de enzymstabiliteit aanzienlijk over een reeks reactie- en opslagomstandigheden, in tegenstelling tot traditionele technieken die vaak resulteren in een geleidelijke en continue verlies van enzymactiviteit.
De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot het verpakken van eiwitten met relevantie in meerdere velden, zoals de ontwikkeling van therapeutische middelen, sanering of de ontwikkeling van celvrije katalytische systemen. Hoewel dit protocol de zuivering van OMV's uit E.coli beschrijft, kunnen de technieken met aanpassingen van de verpakkingsstrategie gemakkelijk worden gebruikt voor OMV-zuivering uit een verscheidenheid aan microbiële celculturen. Na het genereren van buitenmembraanvesikels of OMV's in bacteriën volgens het tekstprotocol, centrifugeer het intacte bacteriële kweekmedium bij 7.000 keer G en vier graden Celsius gedurende 15 minuten.
Verwijder en bewaar het supernatant, zorg ervoor dat de cellenpellet niet wordt verstoord. Daarna, laat het supernatant een tweede keer centrifugeren om er zeker van te zijn dat alle bacteriën uit het medium zijn verwijderd. Om eiwitaggregaten en groot cellulair materiaal uit het bewaarde kweekmedium te verwijderen, trek de oplossing in een steriele 10 tot 50 milliliter spuit.
Bevestig een 0,45 micron filter aan het einde van de spuit. Druk vervolgens op de plunjer en verzamel het doorlaat in een nieuwe buis. Als alternatief kun je het kweekmedium vacuümfiltreren door het over te brengen naar een steriele filtratie-inrichting.
Koppel de eenheid aan een vacuümpomp of afvoer om zuiging te genereren. Breng het gefilterde medium over naar een nieuw vat. Om de OMV's te isoleren, breng het gefilterde kweekmedium over in ultracentrifugeerbuizen.
Centefugeer het medium ongeveer 150.000 keer G en vier graden Celsius gedurende drie uur met een rotor die overeenkomt met de gebruikte buizen. Direct na ultracentrifugatie om verlies van pelletmassa te voorkomen, decanteer het OMV-gedepleteerde kweekmedium van de lichtbruine OMV-pellet die al dan niet zichtbaar is met het oog. De OMV-pellet gevormd na ultracentrifugatie kan slechts losjes aan de centrifugatievesikel zijn gehecht.
Er moet voorzichtig worden omgegaan bij het decanteren om ervoor te zorgen dat de pellet niet wordt losgemaakt en verloren gaat. Bewaar het supernatant voor later dynamisch lichtverstrooiing om te verifiëren dat de OMV-deeltjes volledig uit het medium zijn verwijderd. Voeg 0,5 tot één milliliter sterieel gefilterd PBS, PH 7,4 of een andere gefilterde buffer toe aan de pellet, zoals bepaald door experimentele behoeften of omstandigheden, en laat het gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur incuberen.
Pipet vervolgens voorzichtig de gezuiverde OMV-oplossing en meng voorzichtig om ervoor te zorgen dat de volledige pellet is opgelost. Om de OMV-grootteverdeling te bepalen, open je de DLS nano-deeltjesvolgsoftware voor het gebruikte instrument. Schakel de microscoop in en maak alle oppervlakken op de microscoop en de nano-deeltjesvolgunit schoon.
Gebruik een steriele spuit van één milliliter om ongeveer 0,5 milliliter OMV-monster rechtstreeks toe te voegen aan het kijkvenster van het deeltjesvolgapparaat via de onderste fitting, zorg ervoor dat het volledige kijkvenster wordt bedekt zonder luchtbellen in het systeem te injecteren. Plaats de nano-deeltjesvolgunit op de microscoopstandaard en schakel de laser in. Klik vervolgens op Vastleggen in de software.
Wanneer daarom wordt gevraagd, voer de temperatuur van het monsterapparaat in, label het monster en sla de videogegevens op aan het einde van elke run in een door de gebruiker aangewezen map. Houd alle analyseparameters in de automatische detectiemodus en klik op Volgorde verwerken. Neem de deeltjesgrootteverdeling en concentratie op als deeltjes per milliliter zoals bepaald door de software.
Om het OMV-eiwitgehalte te bepalen, gebruik SDS-PAGE en Western Blots om de OMV-zuiverheid, enzymproductie en SpyCatcher of SC tot SpyTag of ST cross-link-efficiëntie te beoordelen. Het is van essentieel belang om de expressie van de doeleiwitten en ankereiwitten te bevestigen. Expressie van recombinante eiwitten kan vaak om verschillende redenen onsuccesvol zijn en succesvolle eiwitproductie moet worden bevestigd voordat OMV-karakterisering plaatsvindt.
Om een fosfotriesterase of PTE-activiteitstest uit te voeren, voeg je vijf microliters van een een op 1.000 verdunning van paraoxon in CHES-buffer toe aan vijf microliters gezuiverde OMV's in 90 microliters CHES. Neem absorptiemetingen bij 405 nanometer en 348 nanometer om de 20 seconden gedurende ongeveer twee uur totale reactietijd om de progressie van het chromogene paraoxon afbraakproduct p-nitrofenol te monitoren. Voer ten slotte gegevensanalyse uit volgens het tekstprotocol.
Hier worden voorbeelden getoond van de morfologie van gezuiverde OMV's uit E.coli via SEM. OMV's variëren in grootte van 50 tot 250 nanometer, zoals bepaald met behulp van deeltjesvolginstrumenten. In deze grafiek wordt de absolute OMV-concentratie weergegeven.
Toen N-terminaal OMP-A-ST werd mede-getransformeerd met PTE-SC in de aanwezigheid van arabinose en IPTG, werd een significante toename in OMV-productie waargenomen in vergelijking met de controlemonsters. De SDS-PAGE en Western Blots hier zien verder het OMV-eiwitgehalte en de recombinante eiwitexpressie voor OMP-A-ST, natuurlijk OMP-A, PTE-SC en OMP-A-ST-PTE-SC te karakteriseren. In deze figuur werden de algemene PTE-expressieniveaus en OMV-verpakkingsefficiëntie in de cellenpellet, UC-supernatant en gezuiverde UC OMV-pellet bepaald door initiale snelheidsmet
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit protocol beschrijft de productie, zuivering en toepassing van enzym-gevulde buitenmembraanvesikels (OMV's) afgeleid van bacteriën. Deze OMV's verhogen de enzymstabiliteit, waardoor ze geschikt zijn voor verschillende toepassingen, inclusief cel-vrije katalyse.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Biochemie
- Microbiologie
- Enzymtechnologie
Achtergrond
- Buitenvliesvesikels (OMV's) zijn natuurlijk voorkomende nanodeeltjes die door bacteriën worden vrijgegeven.
- OMV's kunnen enzymen inkapselen, waardoor hun stabiliteit verbetert in vergelijking met traditionele methoden.
- Deze techniek maakt het mogelijk om OMV's te gebruiken in diverse toepassingen, inclusief therapeutische ontwikkeling en milieusanering.
- Het protocol richt zich op OMV's afgeleid van E. coli, maar kan worden aangepast voor andere microbiële culturen.
Doel van het onderzoek
- Om enzym-gevulde OMV's te zuiveren en te karakteriseren voor in vitro katalytische toepassingen.
- Om de enzymstabiliteit te verbeteren voor langdurige activiteit onder verschillende omstandigheden.
- Om het potentieel van OMV's in meerdere velden zoals therapeutische toepassingen en katalyse te verkennen.
Gebruikte methoden
- Verzameling van bacteriële OMV's uit kweekmedia.
- Centrifugatie van bacteriële culturen om OMV's te isoleren.
- Karakterisering van de enzymactiviteit binnen de OMV's.
- Toepassing van OMV's in cel-vrije katalyse van organofosfaatverbindingen.
Belangrijkste resultaten
- OMV's verbeteren de enzymstabiliteit aanzienlijk in vergelijking met traditionele isolatietechnieken.
- Enzymactiviteit wordt gehandhaafd over een reeks reactie- en opslagomstandigheden.
- Het protocol maakt efficiënte zuivering van OMV's uit E. coli mogelijk.
- Mogelijke toepassingen in therapeutische toepassingen en milieusanering worden benadrukt.
Conclusies
- Het ontwikkelde protocol biedt een betrouwbare methode voor het produceren van stabiele enzym-gevulde OMV's.
- OMV's kunnen dienen als effectieve katalytische reagentia in verschillende biochemische toepassingen.
- Toekomstig werk kan het gebruik van deze techniek uitbreiden naar andere microbiële systemen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Directed protein packaging into outer membrane vesicles (OMVs) enables stable enzyme delivery for cell-free catalytic systems, addressing instability challenges in recombinant protein production. This approach supports biopharma R&D by improving enzyme shelf-life and activity under variable conditions, reducing attrition in early-stage enzyme therapeutic and diagnostic development. The method provides a scalable, bacteria-derived nanoparticle platform for targeted payload delivery with applications in therapeutic enzyme replacement, bioremediation, and diagnostic reagent stabilization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional validation of recombinant enzymes by maintaining activity through OMV encapsulation, reducing false negatives in target screening.
- Operational Value: Supports high-throughput assessment of enzyme variants by standardizing stability readouts across constructs.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a stable enzyme presentation format for consistent kinetic measurements in cell-free assays, improving assay reproducibility.
- Operational Value: Facilitates assay standardization by minimizing activity drift during screening campaigns, reducing need for frequent reagent re-preparation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enables evaluation of enzyme therapeutics in physiologically relevant conditions by protecting cargo from proteolytic degradation.
- Operational Value: Supports formulation development for enzyme-based therapeutics by demonstrating enhanced stability under storage and transport stresses.
Pipeline & Workflow Integration
The OMV packaging method integrates into the discovery continuum from target validation through lead optimization, enabling stable enzyme production for downstream screening and preclinical evaluation.
- Discovery Biology: Confirms target engagement and pathway modulation by preserving enzyme function during in vitro characterization.
- Screening: Delivers quantitative, stable enzyme outputs for dose-response analysis, improving hit-to-lead transition confidence.
- Analytics: Generates reliable activity data via paraoxon hydrolysis assays, enabling comparative assessment of enzyme variants.
- Translational Research: Supports preclinical continuity by demonstrating enzyme stability in simulated biological conditions.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for encapsulating diverse enzymes, reducing redevelopment effort across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence in enzyme functionality by mitigating activity loss during assay execution.
- Operational Value: Improves reagent consistency and scalability through standardized OMV isolation and quantification protocols.
- Strategic Value: Reduces biological risk in enzyme therapeutic development by validating target modulation capacity early.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of enzyme candidates based on demonstrated stability and catalytic efficiency.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, protein expression, and bacterial culture techniques.
- Depends on access to ultracentrifugation and nanoparticle tracking instrumentation for OMV isolation and characterization.
- Necessitates standardization of induction conditions (e.g., arabinose/IPTG) across teams to ensure reproducible vesiculation and packaging efficiency.
- Involves adaptation considerations for different enzyme sizes, solubilities, and anchoring strategies when extending to non-PTE cargos.
- Includes practical limitations such as variable OMV yield and potential aggregation during storage, requiring empirical optimization per enzyme target.
