Name: Geregisseerd Protein Packaging binnen Outer membraanvesicles uit Escherichia coli: Ontwerp, Productie en zuivering (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Leer hoe u enzymgevulde outer membrane vesicles (OMVs) uit Escherichia coli zuivert en karakteriseert voor celvrije katalyse. Deze methode verbetert enzymstabiliteit aanzienlijk voor diverse biotechnologische toepassingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd gefinancierd door het Office of Naval Research via Kernfondsen die aan het Naval Research Laboratory werden verstrekt.

1. Bereiding van plasmiden <ol><li> Bereid een plasmide (bijvoorbeeld pET22) met het anker eiwit (OmpA) gefuseerd aan een biorthogonale koppeling domein (in dit protocol aangeduid als anchor-ST), epitooplabel (zoals 6xHis, myc of FLAG-tags voor zuivering en identificatie), periplasmatische localisatie tag, antibioticaresistentie en geschikte replicatieoorsprong basis van de geselecteerde bacteriestam 7. <ol><li> Extract plasmide-DNA uit overnachtkweken een los verkrijgbare DNA isolatie kit volgens het protocol van de fabrikant. </li></ol></li><li> Bereid een plasmide (bijvoorbeeld pACYC184) die het enzym / eiwit (PTE) te verpakken in de OMV gefuseerd met de complementaire bioorthogonal koppeling domein dat van het anker-eiwit (in dit protocol enzym-SC genoemd), epitooplabel, periplasmatische localisatie tag, antibiotische weerstand die verschilt van de ankereiwit plasmide en geschikte origin replicatie basis van de geselecteerde bacteriestam 7. <ol><li> Extract plasmide-DNA uit overnachtkweken een los verkrijgbare DNA isolatie kit volgens het protocol van de fabrikant 7. </li></ol></li></ol> 2. Genereren van een OMV Packaging E. coli Cultuur <ol><li> Plasmid Isolation <ol><li> Zuiver plasmiden dat codeert voor het enzym-SC bouwen en anchor-ST construeert uit afzonderlijke onderhoud cellijnen met behulp van een commercieel plasmide isolatie kit volgens protocol van de fabrikant 7. Bepaal DNA concentratie en zuiverheid meten van de absorptie bij 260 nm en 280 nm. </li></ol></li><li> Cotransformatie <ol><li> Selecteer een E. coli stam die commercieel beschikbaar is voor eiwitexpressie te vergemakkelijken. NOTE: BL21 (DE3) cellen werden hier gebruikt. De T7 lysogeen is vereist voor expressie van het anker-ST construct, dat berust op de T7 promoter en T7 RNA polymerase voor protein expressie. Het gebruik van andere bacteriestammen vereist hetzij de aanwezigheid van de T7 lysogeen gen of het gebruik van een andere dan pET22 7 plasmide. </li><li> Verdun gezuiverd plasmide-DNA bij gelijkwaardige molaire concentraties dan transformeren ze in competente bacteriecellen via ofwel heat shock transformatie of elektroporatie volgens het protocol van de fabrikant voor de bevoegde cellen gekozen. </li><li> Plaat getransformeerde cellen op antibioticum-bevattende Luria-Bertani (LB) agarplaten met zowel ampicilline (pET22) en chlooramfenicol (pACYC184); zowel in eindconcentraties van 25 ug / ml. </li><li> Plaats de kweekschaal bij 37 ° C gedurende de nacht alleen klonen die beide plasmiden te isoleren. OPMERKING: Kolonies die antibiotische selectie overleven worden gebruikt voor alle toekomstige OMV preparaten. Antibiotica (ampicilline en chlooramfenicol) wordt toegevoegd aan alle vloeibare culturen selectieve druk te handhaven en om de aanwezigheid van beide plasmiden. </li></ol></li></ol> 3. OMV Production <ol><li> Colony Expansion <ol><li> Inoculeer 5 ml van de cultuur media (meestal Terrific Broth (TB) of LB) met antibiotica bij de hiervoor genoemde concentraties (stap 2.2.3) met een enkele kolonie uit de in 2.2.4 beschreven selectie platen. </li><li> Voer een 1: 100-voudige verdunning van de nachtelijke starter cultuur in de war gebracht cultuur kolven. LET OP: Gebruik een volume van media tussen de 250-500 ml. </li><li> Handhaaf de kweek bij 37 ° C onder schudden bij 250 rpm opdat voldoende beluchting van de kweek wordt verkregen. </li></ol></li><li> Inductie van elk plasmide <ol><li> Laat de bacteriële kweek te groeien tot een OD600 van 0,6-0,8, ongeveer 3 uur na inoculatie van de groei van de primaire groei kolf. </li><li> Om de uiteindelijke opbrengst van PTE-SC geladen blaasjes te verbeteren, centrifuge de hele cultuur bij 7.000 g gedurende 15 min. Resuspendeer de cel pellet in voorverwarmde, verse kweekmedium. LET OP: Deze optional stap helpt om eventuele lege OMV, dat aanwezig is in het kweekmedium voorafgaand aan PTE-SC inductie zijn te verwijderen. </li><li> Maak een 20% voorraad oplossing van L-arabinose in water en steriel filter met behulp van een 0,22 pm filter. WINKEL L-arabinose oplossing bij 4 ° C gedurende 2-4 weken. </li><li> Voeg de L-arabinose oplossing voor de kweekfles tot een uiteindelijke concentratie 0,2% tot inleiding PTE-SC productie. LET OP: Dit helpt om de periplasmatische ruimte met PTE-SC preload voorafgaand aan de bevordering van meer blaasjes door middel van inductie van de mutant OmpA-ST. </li><li> Voeg een oplossing van 1 M Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) in water en steriel filter met een 0,22 urn filter. LET OP: IPTG moet onmiddellijk één keer gebruikt worden gehydrateerd. Hoeveelheden van IPTG kan ingevroren worden opgeslagen voor 3-6 maanden en kan onmiddellijk worden ontdooid voorafgaand aan gebruik. </li><li> Voeg IPTG na nog eens 3 uur incubatieperiode tot een eindconcentratie van 0,5 mM tot productie van het OmpA-ST initiëren. </li><li> Laat de cultuur groeien gedurende nog 8-14 uur bij 37 ° C onder schudden. </li></ol></li></ol> 4. OMV Zuivering <ol><li> Verwijdering van Intact Bacteriën <ol><li> Centrifugeer de bacteriële kweekmedia gedurende 15 minuten bij 7000 xg bij 4 ° C intacte bacteriën pelleteren. </li><li> Decanteer en opslaan, de media van de bovenkant van de celpellet na centrifugatie daarbij goed op de celpellet niet storen. </li><li> Herhaal stap 4.1.1 en 4.1.2 voor een extra centrifugeren cyclus te zorgen dat alle intact bacteriën uit het kweekmedium en zorg ervoor dat decanteren en opslaan van de media verwijderd. </li></ol></li><li> Verwijdering van Proteïneaggregaten <ol><li> Verder te zuiveren de bacteriële kweekmedia onder toepassing van een 0,45 urn membraanfilter om resterende bacteriën en ongewenst grote celmateriaal te verwijderen. OPMERKING: Gebruik een biologisch compatibel membraanmateriaal hogere terugwinning en lagere eiwitadsorptie zoals celluloseacetaat (CA) en polyvinylideendifluoride (PVDF). Spuitfilter volumes minder dan 100 ml en vacuüm filter volumes groter dan 100 ml. <ol><li> Om spuitfilter, trekken kweekmedium in steriele 10-50 ml spuit. Bevestig 0,45 pm filter om Luer einde van de spuit. Druk de zuiger en het verzamelen van doorstroming in een nieuw schip. </li><li> Om filter stofzuigen, transfer kweekmedium een ​​steriele filtratie apparaat. Bevestig de unit om de pomp te stofzuigen of de gootsteen aspirator om zuigkracht te genereren. Transfer gefilterd medium om nieuwe vaartuig. </li></ol></li></ol></li><li> Isolatie van OMV via Ultracentrifugatie <ol><li> Voeg de gefilterde cultuur media in centrifugeren buisjes voorzichtig om tegengestelde buizen in evenwicht te brengen in de centrifuge. </li><li> Pellet op ~ 150.000 xg gedurende 3 uur bij 4 ° C in een ultracentrifuge met de bijbehorende rotor overeenkomende zowel het instrument en pijpen worden gebruikt. </li><li> Schenk de OMV uitgeputte cultuur media uit de OMV pellet, zorg dat u de OMV pellet niet te verstoren, meteen bij de voltooiing of centrifugering zoals OMV waardoor de pellet in de media blijven de pellet verminderen OMV herstel verweken. LET OP: Deze pellet zal iets bruin en afhankelijk van het basisbedrag van de bacteriecultuur kan wel of niet zichtbaar zijn met het blote oog. Aanzuigen van de direct vanaf de bovenkant van de centrifugebuis is ook een optie in het achterhoofd dat de meer media uit de OMV pellet hoe zuiverder de uiteindelijke OMV monster zijn. </li><li> Sla de supernatant gecentrifugeerd voor later dynamische lichtverstrooiing (DLS) testen om te controleren of de OMV deeltjes waren volledig uitgeput van de media. </li><li> Voeg 0,5-1 ml steriel gefiltreerd fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) pH 7,4 of 100 mM N-cyclohexyl-2-aminoethaansulfonzuur (CHES) buffer bij pH 8,0 om de OMV pellet waardoor het incuberen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Zorg ervoor dat de pellet niet uitdroogt. OPMERKING: Extreme oplossing ionsterkte, pH en temperatuur kan tot verminderde OMV oplosbaarheid en bevorderen aggreking. </li><li> pipet voorzichtig de gezuiverde OMV oplossing uit de centrifugebuis, mengen langzaam aan de gehele pellet werd opgelost waarborgen. </li></ol></li></ol> 5. OMV karakterisering <ol><li> Gebruik een in de handel verkrijgbare DLS of nanodeeltjes tracking software volgende protocollen de verstrekte fabrikant uniek voor elk instrument te bepalen OMV grootteverdeling en deeltjesconcentratie. LET OP: Hier, OMV grootteverdeling en concentratie werd bepaald met behulp van NanoSight LM10 nanodeeltjes Tracking en NTA 2.3 Analysis-software. <ol><li> Open de software. </li><li> Schakel de microscoop en reinig alle oppervlakken op de microscoop en nanodeeltjes tracking unit. </li><li> Voeg ~ 0,5 ml van OMV monster rechtstreeks aan het kijkvenster van het deeltje tracking device via de Luer fitting met een 1 ml steriele spuit en zorg ervoor dat het hele kijkvenster dekken zonder het injecteren van enige luchtbellen in het systeem. </li><li> plaats tHij nanodeeltjes volgen eenheid op de microscoop podium en zet de laser. </li><li> Klik op &quot;Capture&quot; in de software. </li><li> Pas de microscoop focus en het podium om de deeltjes te visualiseren op het preview-scherm aanwezig is in de software-venster. </li><li> Pas de &quot;Camera Shutter&quot; en &quot;Camera Gain&quot; tot lichte deeltjes duidelijk worden gevisualiseerd op een donkere achtergrond. </li><li> Pas duur capture tot 60 sec. </li><li> Klik op &quot;Record&quot;. </li><li> Wanneer u wordt gevraagd, het invoeren van de temperatuur van het monster / het apparaat, het etiket van de steekproef, en de video-gegevens op te slaan bij de voltooiing van de elke lopen in een gebruiker aangewezen map. </li><li> Houd alle analyse parameters (Detection Threshold, Blur, Min Track lengte, Min Verwacht Particle Size) op automatisch detecteren mode en klik op &quot;Proces Sequence.&quot; OPMERKING: Raadpleeg de handleiding van hoe elke parameter afzonderlijk te fine-tunen analyseresultaten kan worden aangepast. </li><li> Neem deeltjesgrootteverdeling en deeltjes / ml concentratie zoals bepaald door de software. LET OP: Een typische OMV hydrodynamische grootte ligt tussen 30-200 nm met een deeltjes / ml concentratie van ~ 10 x 10 8. </li></ol></li><li> Het bepalen van OMV eiwitgehalte <ol><li> Gebruik standaard SDS-PAGE en Western blot protocollen OMV zuiverheid, de productie van enzymen, en de SC-ST verknoping efficiency 7 te beoordelen. LET OP: Het verknopen efficiëntie zal niet 100% 7. </li></ol></li></ol> 6. Keuring van Enzyme Packaging <ol><li> PTE Activity Assay <ol><li> Voer alle enzymatische assays in een geschikte buffer zoals 100 mM CHES-buffer (pH 8) bij 25 ° C in hetzij een cuvette of gemultiplext in een 96/384 putjes. </li><li> Voeg 5 ul van een 1: 1000 verdunning van paraoxon in CHES buffer 90 pl CHES en 5 pl van gezuiverde OMV (~ 36-voudig geconcentreerd in vergelijking met de concentratie OMV aanwezig in het kweekmedium). Let op: Paraoxon is een giftig bestrijdingsmiddelen moet per fabrikant en institutionele richtlijnen worden behandeld. </li><li> Neem absorptieaflezingen met regelmatige tussenpozen (elke 20 seconden voor ~ 2 uur totale reactietijd) en 405 nm (ε = 18,1 mM -1 cm -1) en 348 nm (isosbestic punt ε = 5,4 mM -1 cm -1) aan toezien op de reactie verloop van de chromogene paraoxon afbraakproduct, p-nitrofenol. LET OP: Bij pH-waarden boven 8 de dominante gedeprotoneerde vorm van p-nitrofenol is aanwezig waardoor voor nauwkeurige monitoring bij 405 nm. In alle andere complexe of lagere pH oplossingen moet de isosbestic punt van 348 nm te gebruiken als meerdere vormen van de p-nitrofenol aanwezig zijn. </li><li> Bereken initiële reactiesnelheden door bepaling van de helling van het lineaire gedeelte van de progressiekrommen uit stap 6.1.3 om de relatieve hoeveelheid PTE vergelijken elk monster, verpakkingsefficiëntie en PTE totale productie. </li><li> Voer standaard enzymatischeassay protocollen om te bepalen K M, V max en k kat voor de OMV ingekapselde PTE. OPMERKING: Lineweaver-Burk analyse kan worden gebruikt voor het bepalen van deze kinetische parameters waarbij de y-as = 1 / Vmax met helling = KM / Vmax 20. </li></ol></li><li> Transmembraan Substrate / Product Diffusion. <ol><li> Voer dezelfde kinetische assay als beschreven in stap 6.1 met gebruikmaking van toenemende concentraties van Triton X-100 in buffer CHES 0-3% vol. OPMERKING: De toevoeging van Triton X-100 aan het opgeloste OMV functioneert om de lipide bilaag waardoor de inhoud van de OMV vrij toegankelijk zijn voor de reactieoplossing te verstoren. </li><li> Bereken en vergelijk de initiële snelheid bij elke Triton X-100 niveau transmembraan passage van het substraat / product aangeduid met minimale veranderingen van de enzymactiviteit (aanvangssnelheden) verifiëren vergelijking enzymactiviteit ianneer Triton X-100. Als een aanzienlijke toename van enzymactiviteit waargenomen in aanwezigheid van Triton X-100 is het waarschijnlijk dat het substraat niet vrij diffunderen in de OMV. </li><li> Assay vrije enzymactiviteit (zoals hierboven beschreven in paragraaf 6.1) in aanwezigheid van Triton X-100 die enzymactiviteit verifiëren wordt niet geremd door de oppervlakteactieve stof zelf. OPMERKING: Indien de activiteit sterk wordt beïnvloed door Triton X-100, andere toevoegsels, zoals saponinen of diverse polysorbaat / kunnen tween oppervlakteactieve geschikter zijn om de OMV membraan scheuren. </li></ol></li></ol> 7. OMV Storage <ol><li> Invriezen <ol><li> Plaats ~ 100 ul fracties van gezuiverde OMV direct in vloeibare stikstof te breken bevriezing van de monsters die zeker niet volledig onderdompelen de flesjes of contact opnemen met een vloeibare stikstof met het monster zelf. OPMERKING: Gezuiverde OMV kunnen direct snel ingevroren in de buffer die werd geselecteerd voor oplossen van de pellet in de OMV zuiverinion proces zonder aanvullende cryoprotectants 7 nodig. </li><li> Bewaar de snap ingevroren monsters bij -80 ° C. </li><li> Ontdooi ingevroren aliquots van stap 7.1.1 door ze bij kamertemperatuur wordt dat de monsters niet te verwarmen. </li><li> Alvorens met alle monsters voor opslag op deze wijze uit te voeren het enzym assay stap 6,1 onze initiële snelheden voor en na het invriezen te verifiëren dat er geen significant verlies van enzymactiviteit na invriezen-ontdooien beschreven. OPMERKING: WINKEL gezuiverde OMV bij 4 ° C indien een verlaging van de enzymactiviteit waargenomen door vorst. </li></ol></li><li> vriesdrogen <ol><li> Lyofiliseren de snap bevroren gezuiverde OMV fracties gebruik te maken van commercieel verkrijgbare vriesdrogen apparatuur 21. </li><li> Opslag gelyofiliseerd fracties bij kamertemperatuur weken bij -80 ° C gedurende enkele maanden. </li><li> Voeg dezelfde hoeveelheid gezuiverd water om het gevriesdroogde OMV als vóór lyofilisatie en laat bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten tot t rehydraterenhij proeven. Meng voorzichtig wanneer dat nodig is dat zeker niet te vortex of ultrasone trillingen de OMV. </li><li> Voeg gevriesdroogd OMV poeder direct naar point-of-care voor toepassingen waarbij voorafgaande verdunning / oplosbaar maken is niet nodig. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Avila-Calderon, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+bacterial+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Roles of bacterial membrane vesicles.</a> Arch. Microbiol. 197, 1-10 (2015).</li>
<li>Kulp, A., Kuehn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+functions+and+biogenesis+of+secreted+bacterial+outer+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biological functions and biogenesis of secreted bacterial outer membrane vesicles.</a> Annu. Rev. Microbiol. 64, 163-184 (2010).</li>
<li>Beveridge, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+Gram+negative+cell+walls+and+their+derived+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Structures of Gram negative cell walls and their derived membrane vesicles.</a> J. Bacteriol. 181, 4725-4733 (1999).</li>
<li>Kulkarni, H. M., Jagannadham, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+and+multifaceted+roles+of+outer+membrane+vesicles+from+Gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Biogenesis and multifaceted roles of outer membrane vesicles from Gram-negative bacteria.</a> Microbiology. 160, 2109-2121 (2014).</li>
<li>Ellis, T. N., Kuehn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+and+immunomodulatory+roles+of+bacterial+outer+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Mol.+Biol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Virulence and immunomodulatory roles of bacterial outer membrane vesicles.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 74, 81-94 (2010).</li>
<li>Berleman, J., Auer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+bacterial+outer+membrane+vesicles+for+intra-+and+interspecies+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The role of bacterial outer membrane vesicles for intra- and interspecies delivery.</a> Environ. Microbiol. 15, 347-354 (2013).</li>
<li>Alves, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+nanobioreactors-directing+enzyme+packaging+into+bacterial+outer+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl.+Mater.+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Bacterial nanobioreactors-directing enzyme packaging into bacterial outer membrane vesicles.</a> ACS Appl. Mater. Interfaces. 7, 24963-24972 (2015).</li>
<li>Kim, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+bacterial+outer+membrane+vesicles+with+enhanced+functionality%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Engineered bacterial outer membrane vesicles with enhanced functionality.</a> J. Mol. Biol. 380, 51-66 (2008).</li>
<li>Haurat, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+sorting+of+cargo+proteins+into+bacterial+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Selective sorting of cargo proteins into bacterial membrane vesicles.</a> J. Biol. Chem. 286, 1269-1276 (2011).</li>
<li>Kesty, N. C., Kuehn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+heterologous+outer+membrane+and+periplasmic+proteins+into+Escherichia+coli+outer+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Incorporation of heterologous outer membrane and periplasmic proteins into Escherichia coli outer membrane vesicles.</a> J. Biol. Chem. 279, 2069-2076 (2003).</li>
<li>Zakeri, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+tag+forming+a+rapid+covalent+bond+to+a+protein%2C+through+engineering+a+bacterial+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Peptide tag forming a rapid covalent bond to a protein, through engineering a bacterial adhesion.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, e690-e697 (2012).</li>
<li>Li, L., Fierer, J. O., Rapoport, T. A., Howarth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+analysis+and+optimization+of+the+covalent+association+between+SpyCatcher+and+a+peptide+tag%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural analysis and optimization of the covalent association between SpyCatcher and a peptide tag.</a> J. Mol. Biol. 426, 309-317 (2014).</li>
<li>Dumas, D. P., Durst, H. D., Landis, W. G., Raushel, F. M., Wild, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+organophosphorus+nerve+agents+by+the+phophotriesterase+from+Pseudomonas-Diminuta%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Inactivation of organophosphorus nerve agents by the phophotriesterase from Pseudomonas-Diminuta.</a> Arch. Biochem. Biophys. 277, 155-159 (1990).</li>
<li>Bigley, A. N., Raushel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalytic+mechanisms+for+phosphotriesterases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biochim.+Biophys.+Acta%2C+Proteins+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Catalytic mechanisms for phosphotriesterases.</a> Biochimica et Biochim. Biophys. Acta, Proteins Proteomics. 1834, 443-453 (2013).</li>
<li>Minton, N. A., Murray, V. S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+organo-phosphate+poisoning%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Toxicol.+Adverse+Drug+Exper%22%5BJournal%5D)">A review of organo-phosphate poisoning.</a> Med. Toxicol. Adverse Drug Exper. 3, 350-375 (1988).</li>
<li>Bigley, A. N., Xu, C., Henderson, T. J., Harvey, S. P., Raushel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+neutralization+of+the+chemical+warfare+agent+VX%3A+Evolution+of+phosphotriesterase+for+phosphorothiolate+hydrolysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Enzymatic neutralization of the chemical warfare agent VX: Evolution of phosphotriesterase for phosphorothiolate hydrolysis.</a> J. Am. Chem. Soc. 135, 10426-10432 (2013).</li>
<li>Chatterjee, S. N., Chaudhuri, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gram-negative+bacteria%3A+the+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Outer+Membrane+Vesicles+of+Bacteria.+SpringerBriefs+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Gram-negative bacteria: the cell membranes.</a> Outer Membrane Vesicles of Bacteria. SpringerBriefs in Microbiology. , 15-34 (2012).</li>
<li>Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+function+of+OmpA+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">The function of OmpA in Escherichia coli.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 292, 396-401 (2002).</li>
<li>Danoff, E. J., Fleming, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+soluble%2C+periplasmic+domain+of+OmpA+folds+as+an+independent+unit+and+displays+chaperone+activity+by+reducing+the+self-association+propensity+of+the+unfolded+OmpA+transmembrane+beta-barrel%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+Chem%22%5BJournal%5D)">The soluble, periplasmic domain of OmpA folds as an independent unit and displays chaperone activity by reducing the self-association propensity of the unfolded OmpA transmembrane beta-barrel.</a> Biophys. Chem. 159, 194-204 (2011).</li>
<li>Alves, N. J., Kline, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+on+the+inhibition+of+plasmin+and+delta-plasmin+via+benzamidine+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Comparative study on the inhibition of plasmin and delta-plasmin via benzamidine derivatives.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 457, 358-362 (2015).</li>
<li>Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lyophilization+and+development+of+solid+protein+pharmaceuticals%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals.</a> Int. J. Pharm. 203, 1-60 (2000).</li>
<li>Goormaghtigh, E., Scarborough, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Density-based+separation+of+liposomes+by+glycerol+gradient+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Density-based separation of liposomes by glycerol gradient centrifugation.</a> Anal. Biochem. 159, 122-131 (1986).</li>
<li>Alves, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionalized+liposome+purification+via+Liposome+Extruder+Purification+%28LEP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Functionalized liposome purification via Liposome Extruder Purification (LEP).</a> Analyst. 138, 4746-4751 (2013).</li>
<li>Mayer, L. D., StOnge, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+free+and+liposome-associated+doxorubicin+and+vincristine+levels+in+plasma+under+equilibrium+conditions+employing+ultrafiltration+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Determination of free and liposome-associated doxorubicin and vincristine levels in plasma under equilibrium conditions employing ultrafiltration techniques.</a> Anal. Biochem. 232, 149-157 (1995).</li>
<li>Blakeley, B. D., Chapman, A. M., McNaughton, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Split-superpositive+GFP+reassembly+is+a+fast%2C+efficient%2C+and+robust+method+for+detecting+protein-protein+interactions+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+BioSyst%22%5BJournal%5D)">Split-superpositive GFP reassembly is a fast, efficient, and robust method for detecting protein-protein interactions in vivo.</a> Mol. BioSyst. 8 (2036), (2012).</li>
<li>De Crescenzo, G., Litowski, J. R., Hodges, R. S., O'Connor-McCourt, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+the+interacation+of+two-stranded+de+novo+designed+coiled-coils%3A+effect+of+chain+length+on+the+kinetic+and+thermodynamic+constants+of+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of the interacation of two-stranded de novo designed coiled-coils: effect of chain length on the kinetic and thermodynamic constants of binding.</a> Biochemistry. 42, 1754-1763 (2003).</li>
<li>Charalambous, A., Antoniades, I., Christodoulou, N., Skourides, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Split-Intein+for+simultaneous+site-specific+conjugation+of+quantum+dots+to+multiple+protein+targets+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nanobiotechnol%22%5BJournal%5D)">Split-Intein for simultaneous site-specific conjugation of quantum dots to multiple protein targets in vivo.</a> J. Nanobiotechnol. 9, 1-14 (2011).</li>
<li>Lee, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+proteomic+profiling+of+native+outer+membrane+vesicles+derived+fromEscherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Global proteomic profiling of native outer membrane vesicles derived fromEscherichia coli.</a> Proteomics. 7, 3143-3153 (2007).</li>
<li>Alves, N. J., Turner, K. B., Medintz, I. L., Walper, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protecting+enzymatic+function+through+directed+packaging+into+bacterial+outer+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Protecting enzymatic function through directed packaging into bacterial outer membrane vesicles.</a> Sci. Rep. 6, 24866(2016).</li>
<li>Alves, N. J., Turner, K. B., Medintz, I. L., Walper, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+therapeutic+delivery+capabilities+and+challenges+utilizing+enzyme%2Fprotein+packaged+bacterial+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Ther.+Delivery%22%5BJournal%5D)">Emerging therapeutic delivery capabilities and challenges utilizing enzyme/protein packaged bacterial vesicles.</a> Ther. Delivery. 6, 873-887 (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit protocolfuncties een representatieve tonen gerichte verpakkingstechniek waarbij een enzym van interesse wordt geproduceerd en in OMV verpakt door E. coli. Zoals met vele complexe technieken er meerdere gebieden waarop het protocol kan worden aangepast om geschikt voor gebruik in verschillende unieke toepassingen, waarvan sommige hieronder. Hoewel het mechanisme van OMV verpakking en enzym inkapseling kan worden aangepast aan de specifieke behoeften er verschillende stappen in dit protocol dat cruciaal voor ...

Hier gepresenteerd is een methode voor het ontwerp, de productie en zuivering van enzym geladen bacteriële buitenste membraan blaasjes (OMV). OMV zijn klein, vooral unilamellaire, proteoliposomen die variëren in grootte 30-200 nm 1,2. Alle Gram-negatieve en Gram-positieve bacteriën die zijn tot nu toe onderzochte aangetoond loslaten van OMV of extracellulaire blaasjes (EV) vanaf hun oppervlak 3,4. Het precieze mechanisme waardoor OMV geproduceerd nog niet volledig opgehelderd door de diverse bacteriële populaties die hen evenals de variërende functies die zij dienen afscheiden. OMV is aangetoond dat een breed scala van vracht van kleine moleculen, peptiden en proteïnen genetisch materiaal waar een verscheidenheid aan complexe signaal, gen translocatie en virulentie functies 5,6. De exacte mechanismen van OMV biogenese zijn niet goed gekarakteriseerd, en lijken te verschillen tussen bacteriesoorten. ondanks this feite hebben wij een werkwijze voor het verbeteren van de verpakkingsefficiëntie van een recombinant eiwit in OMV door een synthetische binding tussen een eiwit van interesse en een zeer overvloedige eiwit endogeen voor de bacteriële buitenmembraan en daaropvolgende OMV ontwikkeld. Aangezien een synthetische verbinding of kunstmatig opgenomen affiniteit tussen het recombinant tot expressie gebrachte eiwit en het OMV de waargenomen verpakkingsefficiëntie zeer laag 7. Dit resultaat is als incorporatie van de eiwitten in de OMV hetzij gebeurt door toeval inkapseling precies op het moment van OMV formatie op het bacteriële oppervlak of via gerichte verpakkingen met mechanismen die niet goed begrepen worden verwacht. Enig succes is waargenomen bij het verpakken eiwitten eenvoudig door overexpressie in de periplasmatische ruimte die berust op toeval inkapseling maar effectieve verpakking is sterk afhankelijk eiwit met sommige eiwitten verpakking hoog rendement in vergelijking met andere ebij niet verpakken helemaal 8-10. Door gebruik gemeenschappelijke synthetische biologische technieken zochten we Escherichia coli (E. coli) gelijktijdig produceren, verpakken en uitscheiden een actief enzym plaats in OMV dat beperkingen huidige kennis over hoe OMV gevormd en hoe lading wordt geselecteerd door de bacteriën omzeilt ingenieur verpakking. Voor de toepassing van deze applicatie is een split-eiwit bioconjugatie systeem gekozen als de synthetische verbinding van de keuze om gerichte verpakkingen in het OMV vergemakkelijken. Zoals de naam suggereert een split eiwit bioconjugatie systeem bestaat uit twee complementaire domeinen subeenheid die interageren met elkaar. De splitsing eiwitdomeinen geselecteerd voor de toepassing van dit protocol worden aangeduid als de SpyCatcher (SC) en SpyTag (ST) domein en zijn afgeleid van de Streptococcus pyogenes-fibronectine bindend eiwit (FbaB) 11. Deze splitsing proteïnesysteem is ongebruikelijk doordat wanneer de twee subeenheden in de nabijheid een isopeptidebinding spontaan vormt tussen het proximale asparaginezuur en lysine aminozuurresiduen waardoor een covalente binding. Vorming isopeptidebinding niet de toevoeging van chaperone eiwitten, katalytische enzymen of cofactoren, en kan gemakkelijk plaatsvinden bij kamertemperatuur (KT) en over een groot aantal fysiologisch relevante omstandigheden 12. Als een proof of concept, phosphotriesterase (PTE) (EC 3.1.8.1) van Brevundimonas diminuta werd geselecteerd om te worden verpakt in E. coli afkomstig OMV 13. PTE bevat een binucleair Zn / Zn actieve plaats en heeft de mogelijkheid organofosfaten afbreken door een hydrolysereactie omzetten aryldialkylphosphates in dialkylphosphates en arylalcoholen 14. Blootstelling aan organofosfaten schaadt juiste neurotransmitter functie door middel van het remmen van de hydrolyse van acetylcholine door acetylcholinesterase bij neuromusculaire verbindingen making organofosfaat afgeleide verbindingen uiterst gevaarlijk 15. Langdurige of significante blootstelling aan organofosfaten vaak resulteert in oncontroleerbare stuiptrekkingen en meestal de dood veroorzaakt via stikken. Hoewel PTE vertoont de hoogste katalytische activiteit ten opzichte paraoxon, een zeer krachtige insecticide, maar ook kan hydrolyseren van een hele reeks andere pesticiden en V / G soort chemische zenuwgassen 16. Om OMV verpakking te vergemakkelijken, werd een bacterieel plasmide geconstrueerd dat codeert voor een genconstruct dat een induceerbare promoter, een periplasmatische lokalisatiesequentie en een korte meervoudige kloneringsplaats stroomopwaarts van de SC gensequentie bevat. Insertie van het PTE-gen tussen de leider en SC-sequentie toegestaan ​​voor de oprichting van een genetische schakelaar die de PTE-SC fusie-eiwit richt naar de periplasmatische ruimte voor OMV verpakking. Hoewel de hier beschreven inspannen PTE, het enzym gen uitwisselbaar en kan gemakkelijk worden vervangen door een ander gensequentie FACilitate verpakking van een alternatieve enzym of eiwit. Het tweede deel van de synthetische verbinding, is een overvloedig buitenmembraan eiwit (OmpA) gekozen om de ST peptidesequentie presenteren. Terwijl de keuze van anker-eiwit kan variëren, is het essentieel dat het eiwit een permissieve domein dat weer in de periplasmatische ruimte, tolereert de fusieconstruct zonder induceren cytotoxiciteit, bekend aanwezig OMV te zijn, en niet aggregeert als het recombinant geproduceerd. OmpA- is een 37,2 kDa transmembraan porine-eiwit dat bekend is in hoge mate tot expressie gebracht in de bacteriële buitenmembraan en daaropvolgende OMV 17. Het is betrokken bij het transport van kleine moleculen, &lt;2 nm in grootte, in het bacteriële membraan 18. Inheemse OmpA- twee structureel unieke domeinen, een transmembraan motief beta vat en een periplasmically oplosbare C-terminale deel gekende bindingspartners met peptidoglycan 19. In de mutant OmpA-ST fusie designed hier het C-terminale gedeelte van OmpA werd verwijderd en de ST werd gefuseerd met de periplasmically gerichte N- of C-termini. De periplasmatische gedeelte van OmpA verwijderen vermindert het aantal interacties tussen het buitenste membraan en peptidoglycan waardoor membraan destabilisatie leiden tot hyper-blaasjes 7. Genomisch OmpA- werd gehandhaafd evenals de recombinant tot expressie gebrachte OmpA-ST construct grove membraan destabilisatie beperken.

<table><tbody><tr><td>IPTG</td><td>Elk</td><td></td><td>Maak altijd vers klaar of verdeel in aliquoten en vries in.</td></tr><tr><td>L-arabinose</td><td>Elk</td><td></td><td>Kan van tevoren worden bereid en bewaard bij 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>Ampicilline</td><td>Elk</td><td></td><td>Voeg direct toe voor gebruik nadat het medium voldoende is afgekoeld na het autoclaven.&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>Chloramfenicol&nbsp;</td><td>Elk</td><td></td><td>Voeg direct toe voor gebruik nadat het medium voldoende is afgekoeld na het autoclaven.&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>TB/LB-kweekmedia</td><td>Elk</td><td></td><td>Andere groeimedia werken waarschijnlijk op vergelijkbare wijze.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Elk</td><td></td><td>Een van de vele potentieel geschikte oppervlakteactieve stoffen.&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>Baffled kweekkolven</td><td>Elk</td><td></td><td>De baffles bevorderen een hoger niveau van beluchting.&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>CHES</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP318-100</td><td>Optimale buffer gebruikt voor paraoxon degradtie (pH > 8).</td></tr><tr><td>Paraoxon</td><td>Chem Service</td><td>N-12816</td><td>Zeer giftige stof die voorzichtig moet worden behandeld en op de juiste manier moet worden gedisposeerd.&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>Spuitfilter 0.45 &micro;m</td><td>Thermo Scientific</td><td>60183-221 (30 mm)</td><td>De filterdiameter hangt af van het volume van het monster. Laag eiwitbindende membraan is cruciaal.</td></tr><tr><td>Schudincubator</td><td>New Brunswick</td><td>Excella E24</td><td>Precieze temperatuur en menging zijn essentieel voor reproduceerbare bacteriegroei.&nbsp;</td></tr><tr><td>Sorvall kweekcentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>RC 5B PLUS</td><td>Grote volume (500 ml) kweekcentrifuge met een capaciteit van 7.000 x g.</td></tr><tr><td>Sorvall ultracentrifuge&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>WX Ultra 90</td><td>Capabel voor centrifugale krachten &ge;150.000 x g.</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge rotor</td><td>Thermo Scientific</td><td>AH-629</td><td>Zorg ervoor dat de juiste rotor en buizen worden gebruikt en dat alles goed is uitgebalanceerd.</td></tr><tr><td>Ultra-Clear ultracentrifugebuizen (25 x 89 mm)</td><td>Beckman Coulter</td><td>344058</td><td>Zorg ervoor dat er geen spanningsfracturen aanwezig zijn voor gebruik en dat de buizen precies uitgebalanceerd zijn.</td></tr><tr><td>Spectrofotometer&nbsp;</td><td>Tecan</td><td>Infinite M1000</td><td>Noodzakelijk voor enzymkinetische assays.</td></tr><tr><td>DLS/deeltjestracking</td><td>NanoSight&nbsp;</td><td>LM10</td><td>Noodzakelijk voor OMV grootteverdeling en concentratiebepaling.&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>BL21(DE3)</td><td>NEB</td><td></td><td>Geschikt bacterieel expressiestrain.</td></tr><tr><td>pET22</td><td>EMD Millipore</td><td>69744-3</td><td>Andere plasmiden kunnen in plaats hiervan worden gebruikt.&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>pACYC184</td><td>NEB</td><td></td><td>Andere plasmiden kunnen in plaats hiervan worden gebruikt.&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>Gel extractiekit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Voorbeeldkit.</td></tr></tbody></table>

geregisseerd protein packaging binnen outer membraanvesicles uit<em&gt; escherichia coli</em&gt;: ontwerp, productie en zuivering

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Toenemende belang bij synthetische biologie technieken om buitenmembraan vesicles (OMV) programmeren leiden tot een aantal zeer interessante en unieke toepassingen voor OMV waarin traditionele nanodeeltjes te moeilijk te synthetiseren blijken. Tot op heden zijn alle Gram-negatieve bacteriën is aangetoond dat OMV demonstreren verpakken van diverse lading die kleine moleculen, peptiden, eiwitten en genetisch materiaal omvat te produceren. Op basis van hun verschillende lading worden OMV betrokken bij vele biologische processen gaande van cel-cel communicatie genoverdracht en levering van virulentiefactoren afhankelijk van welke bacteriën produceren het OMV. Pas onlangs zijn bacteriële OMV geworden toegankelijk zijn voor gebruik in een breed scala van toepassingen door de ontwikkeling van technieken voor de controle en de directe verpakking van recombinante eiwitten in OMV. Dit protocol beschrijft een werkwijze voor de productie, zuivering en gebruik enzym verpakte OMV wijze verbeterd overall productie van recombinant enzym, verhoogde vesiculatie en verbeterde enzymstabiliteit. Succesvolle gebruik van dit protocol zal resulteren in de creatie van een bacteriestam die tegelijkertijd produceert een recombinant eiwit en stuurt het voor OMV inkapseling door het creëren van een synthetische binding tussen het recombinante eiwit en een buitenste membraananker eiwit. Dit protocol Gegevens ook werkwijzen voor het isoleren van OMV uit bacteriële culturen evenals juiste behandeling technieken en dingen te overwegen bij de aanpassing van deze protocol voor gebruik voor andere unieke toepassingen zoals: farmaceutische afgifte van geneesmiddelen, medische diagnostiek, en het herstel van het milieu.

Gelijktijdige expressie van twee recombinante eiwitten, zoals is vereist voor de OMV verpakkingsstrategie die in dit protocol, kan worden bereikt door een aantal verschillende wegen. Hier werd een twee vectorsysteem gebruikt met compatibele oorsprongen van replicatie en een aparte induceerbare gencassettes. Voor de expressie van de PTE-SC construct commerciële plasmideskelet (pACY184) werd ontworpen om een ​​arabinose induceerbare gencassette en een twin arginine periplasmatische localis...

Een protocol voor de productie, zuivering en het gebruik van enzymverpakte buitenmembraanvesikels (OMV) dat zorgt voor verbeterde enzymstabiliteit voor implementatie in diverse toepassingen wordt gepresenteerd.

Geregisseerd Protein Packaging binnen Outer membraanvesicles uit<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Ontwerp, Productie en zuivering

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Het algemene doel van deze procedure is het zuiveren en karakteriseren van met enzymen gevulde bacteriële buitenmembraanvesikels voor gebruik als in vitro katalytische reagentia. Deze enzymisolatietechniek maakt het mogelijk om bacteriële OMV's uit kweekmedia te oogsten en deze vervolgens in te zetten voor de celvrije katalyse van een organofosfaatverbinding. Gerichte verpakking binnen bacteriële OMV's verbetert de enzymstabiliteit aanzienlijk onder uiteenlopende reactie- en bewaaromstandigheden, in tegenstelling tot traditionele technieken die vaak leiden tot een geleidelijk en continu verlies van enzymactiviteit.De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot het inkapselen van eiwitten met relevantie in meerdere vakgebieden, zoals de ontwikkeling van therapeutica, bioremediatie of de ontwikkeling van celvrije katalytische systemen. Hoewel dit protocol de zuivering van OMV's uit E.coli beschrijft, kunnen de technieken met aanpassingen in de inkapselingsstrategie gemakkelijk worden toegepast voor de zuivering van OMV's uit diverse microbiële celculturen. Nadat de buitenmembraanvesikels of OMV's in bacteriën zijn gegenereerd volgens het tekstprotocol, wordt het intacte bacteriële cultuurmedium gecentrifugeerd bij 7.000 ×g en vier °C gedurende 15 minuten.Verwijder en bewaar het supernatant, waarbij u er zorg voor draagt dat het celpellet niet wordt verstoord. Centrifugeer het supernatant vervolgens een tweede keer om er zeker van te zijn dat alle bacteriën uit het medium zijn verwijderd. Om eiwitaggregaten en groot cellulair materiaal uit het bewaarde kweekmedium te verwijderen, zuigt u de oplossing op in een steriele spuit van 10 tot 50 milliliter.Bevestig een filter van 0,45 micron aan het uiteinde van de spuit. Druk vervolgens op de zuiger en vang het filtraat op in een nieuwe buis. Alternatief kan het kweekmedium worden vacuümgefilterd door het over te brengen naar een steriel filtratieapparaat.Sluit de eenheid aan op een vacuümpomp of sink-aspirator om zuigkracht te genereren. Breng het gefilterde medium over naar een nieuw vat. Om de OMV's te isoleren, brengt u het gefilterde kweekmedium over naar ultracentrifugatiebuisjes.Centrifuge het medium gedurende drie uur bij ongeveer 150.000 ×g en vier °C met een rotor die geschikt is voor de gebruikte buizen. Decanteer direct na ultracentrifugatie het OMV-uitgeputte kweekmedium van de lichtbruine OMV-pellet, die wel of niet met het blote oog zichtbaar kan zijn, om verlies van pelletmassa te voorkomen. De na ultracentrifugatie gevormde OMV-pellet kan slechts losjes aan de centrifugatiebuis kleven.Er moet voorzichtig worden gegoten om te voorkomen dat de pellet loskomt en verloren gaat. Bewaar het supernatant voor latere dynamische lichtverstrooiing om te verifiëren dat de OMV-partikels volledig uit het medium zijn verwijderd. Voeg 0,5 tot één milliliter steriel gefilterde PBS, pH 7,4 of een andere gefilterde buffer toe aan de pellet, afhankelijk van de experimentele behoeften of condities, en laat dit 30 minuten incuberen bij kamertemperatuur.Pipette vervolgens voorzichtig de gezuiverde OMV-oplossing en meng deze zachtjes om er zeker van te zijn dat het volledige pellet is gesolubiliseerd. Om de grootteverdeling van de OMV's te bepalen, opent u de DLS nano-particle tracking software van het gebruikte instrument. Zet de microscoop aan en reinig alle oppervlakken van de microscoop en de nano-particle tracking unit.Voeg met een steriele spuit van 1 milliliter ongeveer 0,5 milliliter van het OMV-monster rechtstreeks toe aan het kijkvenster van het particle tracking-apparaat via de onderste fitting, waarbij u er zorg voor draagt dat het gehele kijkvenster wordt bedekt zonder luchtbellen in het systeem te injecteren. Plaats de nano-particle tracking-unit op de microscooptafel en schakel de laser in. Klik vervolgens op Capture in de software.Stel de focus van de microscoop en de tafel zo in dat de deeltjes zichtbaar zijn op het voorbeeldscherm in het softwarevenster. Pas de camerasluiter en de camera-gain aan totdat heldere deeltjes duidelijk zichtbaar zijn tegen een donkere achtergrond. Stel de opnameduur in op 60 seconden en klik vervolgens op Record.Voer bij aanvraag de temperatuur van het monsterapparaat in, label het monster en sla de videogegevens na voltooiing van elke run op in een door de gebruiker aangewezen map. Houd alle analyseparameters in de automatische detectiemodus en klik op Process Sequence. Registreer de deeltjesgrootteverdeling en de concentratie als aantal deeltjes per milliliter, zoals bepaald door de software.Om de eiwitgehalte van OMV te bepalen, worden SDS-PAGE en Western Blots gebruikt om de zuiverheid van de OMV, de enzymproductie en de crosslink-efficiëntie van SpyCatcher (SC) naar SpyTag (ST) te beoordelen. Het is essentieel om de expressie van de doelenzymen en het ankerprotein te bevestigen. De expressie van recombinante eiwitten kan om uiteenlopende redenen vaak mislukken; een succesvolle eiwitproductie dient daarom te worden bevestigd vóór de karakterisering van de OMV.Om een phosphotriesterase- of PTE-activiteitsassay uit te voeren, voegt u vijf µL van een 1:1.000 verdunning van paraoxon in CHES-buffer toe aan vijf µL gezuiverde OMVs in 90 µL CHES. Voer absorbentiemetingen uit bij 405 nm en 348 nm elke 20 seconden gedurende ongeveer twee uur totale reactietijd om de progressie van het chromogene paraoxon-afbraakproduct p-nitrofenol te volgen. Voer ten slotte de data-analyse uit volgens het tekstprotocol.Hier zijn voorbeelden te zien van de morfologie van gezuiverde OMV's van E.coli via SEM. OMV's variëren in grootte van 50 tot 250 nanometers, bepaald met behulp van particle tracking instrumentatie. In deze grafiek wordt de absolute OMV-concentratie getoond.Wanneer N-terminaal OMP-A-ST werd co-getransformeerd met PTE-SC in aanwezigheid van arabinose en IPTG, werd een significante toename in OMV-productie waargenomen in vergelijking met de controlemonsters. De hier getoonde SDS-PAGE en Western Blots karakteriseren verder de proteïne-inhoud van de OMV's en de expressie van recombinant proteïne voor OMP-A-ST, natief OMP-A, PTE-SC en OMP-A-ST-PTE-SC. In deze figuur werden de totale PTE-expressieniveaus en de efficiëntie van OMV-verpakking in de celpellets, het UC-supernatans en de gezuiverde UC OMV-pellets bepaald door metingen van de beginsnelheid met paraoxon als chromogeen substraat.Hier werd Triton X-100 gebruikt om de translocatie van paraoxon door intacte OMV-bilayers te verifiëren. Er was weinig verschil in activiteit met of zonder detergent, wat aangeeft dat paraoxon vrijwel ongehinderd door endogene poriën in de OMV passeert. Tot slot, zoals in dit experiment te zien is, worden de kinetische gegevens van PTE-SC gefit aan een standaard Michaelis-Menten enzymkinetiekvergelijking voor N-terminaal OMP-A-ST die samen met PTE-SC is getransformeerd in aanwezigheid van arabinose en IPTG, en voor PTE-SC in aanwezigheid van arabinose-activatie.Zodra alle genetische constructen zijn gemaakt en bevestigd, kunnen de enzymverpakking en de OMV-zuivering over een periode van twee dagen worden uitgevoerd. Een derde dag is nodig om de OMV's te bevestigen en te karakteriseren telkens wanneer er een nieuw construct is ontwikkeld. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de veiligheidsklasseringen van alle materialen en centrifugeapparatuur te controleren.Daarnaast is het belangrijk om het succes van elke stap te verifiëren voordat men overgaat naar de volgende. De hier beschreven karakteriseringsstappen kunnen worden aangevuld met andere stappen om de enzymverpakking en de morfologie van de OMV's te bevestigen. De eiwitconcentratie, het lipidegehalte, de LPS-concentratie en vele andere eigenschappen kunnen variëren afhankelijk van de verschillende payloads en adductiecondities, en kunnen invloed hebben op downstreamtoepassingen.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u enzymgevulde OMV's kunt zuiveren en karakteriseren, en hoe u preliminaire assays kunt uitvoeren om de activiteit van de enzymlading te beoordelen. Vergeet niet dat het werken met bacteriën en chemische reagentia uiterst gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen, zoals een correcte aseptische techniek en persoonlijke beschermingsmiddelen, altijd moeten worden toegepast bij het uitvoeren van deze procedure.

directed-protein-packaging-within-outer-membrane-vesicles-from

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Affiniteitszuivering van gemerkte eiwitten in combinatie met massaspectrometrie (APM) is een krachtige methode voor systematische mapping van eiwit interactie netwerken en het onderzoeken van de mechanistische basis van biologische processen. Hier beschrijven we een geoptimaliseerde sequentiële peptide affiniteit (SPA) APM procedure ontwikkeld voor de...

Identificatie van eiwit complexen in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Met Sequential Peptide Affinity Purification in combinatie met tandem massaspectrometrie

Source: Figueroa, D. M., et.al. Production and Visualization of Bacterial Spheroplasts and Protoplasts to Characterize Antimicrobial Peptide Localization. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates the production of Escherichia coli spheroplasts by first inhibiting cell division to induce filamentation, followed by enzymatic digestion of the cell wall. The process includes controlled addition of a chelating agent, DNase, and an osmotic stabilizer to ensure proper spheroplast formation and...

Preparation of E. coli Spheroplasts

Source: Streather, B. R., et al. Optimized Production and Analysis of Recombinant Protein-Filled Vesicles from E. coli. J. Vis. Exp. (2023)This video demonstrates the production and isolation of recombinant proteins tagged with Vesicle Nucleating Peptide (VNp) from bacterial vesicles. An inducer triggers VNp-tagged protein expression, driving vesicle formation and encapsulation, followed by centrifugation and sonication for efficient protein recovery without cell...

Recombinant Protein Production and Recovery from Bacteria-Derived Vesicles

Zinkvinger domeinen zijn intrinsiek cel permeabel en geschikt mediëren eiwit plaatsing in een breed scala aan zoogdier celtypen. Hier wordt een uitvoerige stap-voor-stap-protocol voor de uitvoering van zink-vinger-technologie voor intracellulaire eiwit levering gepresenteerd.

Direct Eiwit Levering aan zoogdiercellen behulp van Cell-permeabel Cys<sub&gt; 2</sub&gt; -Zijn<sub&gt; 2</sub&gt; Zinkvinger Domeinen

β-vat buitenmembraaneiwitten (OMP's) hebben veel functies binnen de buitenmembraan van gramnegatieve bacteriën, mitochondriën en chloroplasten. Hier hopen we een bekende knelpunt in structurele studies te verlichten door protocollen te presenteren voor de productie van β-vat OMP's in voldoende hoeveelheden voor structuurbepaling door röntgenkristallografie of NMR-spectroscopie.

Van Constructen naar Crystals - Naar Structuur Bepaling van β-barrel Outer Membrane Proteins

Proline-proline endopeptidase-1 (PPEP-1) is een uitgescheiden metalloprotease en veelbelovend geneesmiddel-doelwit van de humane ziekteverwekker Clostridium difficile. Hier beschrijven we alle methoden die nodig zijn voor de productie en structuurbepaling van dit eiwit.

Productie, kristallisatie en structuur bepalen van<em&gt; C. difficile</em&gt; PPEP-1 via Microseeding en zink-SAD

We beschrijven een methode voor de karakterisering van protonen-gedreven membraan transporteurs in membraan vesikel preparaten geproduceerd door heterologeuze expressie in E. coli en Lysis van cellen met behulp van een Franse pers.

Karakterisering van membraan transporters door Heterologeuze expressie in E. coli en productie van membraan blaasjes

Dit protocol beschrijft de methode, materialen, apparatuur en stappen voor bottom-up voorbereiding van RNA en eiwit produceren synthetische cellen. Het binnenste waterige compartiment van de synthetische cellen bevatte de S30 bacteriële lysaat ingekapseld in een lipide tweelaag (dat wil zeggen, stabiele liposomen), met behulp van een water-in-olie emulsie overdracht methode.

Voorbereiding van eiwit producerende synthetische cellen met behulp van cell free bacteriële extracten, liposomen en emulsie transfer

Op het snijvlak van organische en waterige oplosmiddelen assembleren op maat gemaakte amfifiele elastine-achtige eiwitten zich in complexe supramoleculaire structuren zoals blaasjes, vezels en coacervaten die worden geactiveerd door omgevingsparameters. De beschreven assemblageprotocollen leveren Op eiwitmembraan gebaseerde compartimenten (PMBC's) met tunable eigenschappen, waardoor de inkapseling van verschillende lading.

Geleid Assemblage van Elastin-achtige eiwitten in gedefinieerde supramoleculaire structuren en cargo-encapsulation in vitro

Bacteriën scheiden nanometergrote extracellulaire blaasjes (EV's) af die bioactieve biologische moleculen dragen. EV-onderzoek richt zich op het begrijpen van hun biogenese, rol in microbe-microbe en gastheer-microbe interacties en ziekte, evenals hun potentiële therapeutische toepassingen. Een workflow voor schaalbare isolatie van EV's van verschillende bacteriën wordt gepresenteerd om standaardisatie van EV-onderzoek te vergemakkelijken.

Schaalbare isolatie en zuivering van extracellulaire blaasjes van Escherichia coli en andere bacteriën

Het huidige protocol beschrijft een gedetailleerde methode voor de bacteriële productie van recombinante eiwitten, waaronder typisch onoplosbare of disulfide-bindingsbevattende eiwitten, verpakt in extracellulaire membraangebonden blaasjes. Dit heeft het potentieel om te worden toegepast op veelzijdige gebieden van wetenschappelijk onderzoek, waaronder toegepaste biotechnologie en geneeskunde.

Geoptimaliseerde productie en analyse van recombinante met eiwitten gevulde blaasjes van E. coli

Leer hoe u enzymgevulde outer membrane vesicles (OMVs) uit Escherichia coli zuivert en karakteriseert voor celvrije katalyse. Deze methode verbetert enzymstabiliteit aanzienlijk voor diverse biotechnologische toepassingen.

Geregisseerd Protein Packaging binnen Outer membraanvesicles uit

Meer video's verkennen