Geregisseerd Protein Packaging binnen Outer membraanvesicles uit Escherichia coli: Ontwerp, Productie en zuivering
16 november 2016
Een protocol voor de productie, zuivering en het gebruik van enzymverpakte buitenmembraanvesikels (OMV) dat zorgt voor verbeterde enzymstabiliteit voor implementatie in diverse toepassingen wordt gepresenteerd.
Het algemene doel van deze procedure is om enzymgevulde bacteriële buitenmembraanvesikels te zuiveren en te karakteriseren voor gebruik als in vitro katalytische reagentia. Deze enzymisolatietechniek maakt het mogelijk om bacteriële OMV's uit kweekmedia te oogsten en vervolgens in te zetten voor celvrije katalyse van een organofosfaatverbinding. Gerichte verpakking binnen bacteriële OMV's verbetert de enzymstabiliteit aanzienlijk over een reeks reactie- en opslagomstandigheden, in tegenstelling tot traditionele technieken die vaak resulteren in een geleidelijke en continue verlies van enzymactiviteit.
De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot het verpakken van eiwitten met relevantie in meerdere velden, zoals de ontwikkeling van therapeutische middelen, sanering of de ontwikkeling van celvrije katalytische systemen. Hoewel dit protocol de zuivering van OMV's uit E.coli beschrijft, kunnen de technieken met aanpassingen van de verpakkingsstrategie gemakkelijk worden gebruikt voor OMV-zuivering uit een verscheidenheid aan microbiële celculturen. Na het genereren van buitenmembraanvesikels of OMV's in bacteriën volgens het tekstprotocol, centrifugeer het intacte bacteriële kweekmedium bij 7.000 keer G en vier graden Celsius gedurende 15 minuten.
Verwijder en bewaar het supernatant, zorg ervoor dat de cellenpellet niet wordt verstoord. Daarna, laat het supernatant een tweede keer centrifugeren om er zeker van te zijn dat alle bacteriën uit het medium zijn verwijderd. Om eiwitaggregaten en groot cellulair materiaal uit het bewaarde kweekmedium te verwijderen, trek de oplossing in een steriele 10 tot 50 milliliter spuit.
Bevestig een 0,45 micron filter aan het einde van de spuit. Druk vervolgens op de plunjer en verzamel het doorlaat in een nieuwe buis. Als alternatief kun je het kweekmedium vacuümfiltreren door het over te brengen naar een steriele filtratie-inrichting.
Koppel de eenheid aan een vacuümpomp of afvoer om zuiging te genereren. Breng het gefilterde medium over naar een nieuw vat. Om de OMV's te isoleren, breng het gefilterde kweekmedium over in ultracentrifugeerbuizen.
Centefugeer het medium ongeveer 150.000 keer G en vier graden Celsius gedurende drie uur met een rotor die overeenkomt met de gebruikte buizen. Direct na ultracentrifugatie om verlies van pelletmassa te voorkomen, decanteer het OMV-gedepleteerde kweekmedium van de lichtbruine OMV-pellet die al dan niet zichtbaar is met het oog. De OMV-pellet gevormd na ultracentrifugatie kan slechts losjes aan de centrifugatievesikel zijn gehecht.
Er moet voorzichtig worden omgegaan bij het decanteren om ervoor te zorgen dat de pellet niet wordt losgemaakt en verloren gaat. Bewaar het supernatant voor later dynamisch lichtverstrooiing om te verifiëren dat de OMV-deeltjes volledig uit het medium zijn verwijderd. Voeg 0,5 tot één milliliter sterieel gefilterd PBS, PH 7,4 of een andere gefilterde buffer toe aan de pellet, zoals bepaald door experimentele behoeften of omstandigheden, en laat het gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur incuberen.
Pipet vervolgens voorzichtig de gezuiverde OMV-oplossing en meng voorzichtig om ervoor te zorgen dat de volledige pellet is opgelost. Om de OMV-grootteverdeling te bepalen, open je de DLS nano-deeltjesvolgsoftware voor het gebruikte instrument. Schakel de microscoop in en maak alle oppervlakken op de microscoop en de nano-deeltjesvolgunit schoon.
Gebruik een steriele spuit van één milliliter om ongeveer 0,5 milliliter OMV-monster rechtstreeks toe te voegen aan het kijkvenster van het deeltjesvolgapparaat via de onderste fitting, zorg ervoor dat het volledige kijkvenster wordt bedekt zonder luchtbellen in het systeem te injecteren. Plaats de nano-deeltjesvolgunit op de microscoopstandaard en schakel de laser in. Klik vervolgens op Vastleggen in de software.
Wanneer daarom wordt gevraagd, voer de temperatuur van het monsterapparaat in, label het monster en sla de videogegevens op aan het einde van elke run in een door de gebruiker aangewezen map. Houd alle analyseparameters in de automatische detectiemodus en klik op Volgorde verwerken. Neem de deeltjesgrootteverdeling en concentratie op als deeltjes per milliliter zoals bepaald door de software.
Om het OMV-eiwitgehalte te bepalen, gebruik SDS-PAGE en Western Blots om de OMV-zuiverheid, enzymproductie en SpyCatcher of SC tot SpyTag of ST cross-link-efficiëntie te beoordelen. Het is van essentieel belang om de expressie van de doeleiwitten en ankereiwitten te bevestigen. Expressie van recombinante eiwitten kan vaak om verschillende redenen onsuccesvol zijn en succesvolle eiwitproductie moet worden bevestigd voordat OMV-karakterisering plaatsvindt.
Om een fosfotriesterase of PTE-activiteitstest uit te voeren, voeg je vijf microliters van een een op 1.000 verdunning van paraoxon in CHES-buffer toe aan vijf microliters gezuiverde OMV's in 90 microliters CHES. Neem absorptiemetingen bij 405 nanometer en 348 nanometer om de 20 seconden gedurende ongeveer twee uur totale reactietijd om de progressie van het chromogene paraoxon afbraakproduct p-nitrofenol te monitoren. Voer ten slotte gegevensanalyse uit volgens het tekstprotocol.
Hier worden voorbeelden getoond van de morfologie van gezuiverde OMV's uit E.coli via SEM. OMV's variëren in grootte van 50 tot 250 nanometer, zoals bepaald met behulp van deeltjesvolginstrumenten. In deze grafiek wordt de absolute OMV-concentratie weergegeven.
Toen N-terminaal OMP-A-ST werd mede-getransformeerd met PTE-SC in de aanwezigheid van arabinose en IPTG, werd een significante toename in OMV-productie waargenomen in vergelijking met de controlemonsters. De SDS-PAGE en Western Blots hier zien verder het OMV-eiwitgehalte en de recombinante eiwitexpressie voor OMP-A-ST, natuurlijk OMP-A, PTE-SC en OMP-A-ST-PTE-SC te karakteriseren. In deze figuur werden de algemene PTE-expressieniveaus en OMV-verpakkingsefficiëntie in de cellenpellet, UC-supernatant en gezuiverde UC OMV-pellet bepaald door initiale snelheidsmet
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft de productie, zuivering en toepassing van enzymgevulde buitenmembraanvesikels (OMV's) afgeleid van bacteriën. Deze OMV's verbeteren de enzymstabiliteit, waardoor ze geschikt zijn voor diverse toepassingen, waaronder celvrije katalyse.
Belangrijkste studieonderdelen
Wetenschappelijk vakgebied
- Biochemie
- Microbiologie
- Enzymtechnologie
Achtergrond
- Buitenmembraanvesikels (OMV's) zijn natuurlijk voorkomende nanodeeltjes die door bacteriën worden uitgescheiden.
- OMV's kunnen enzymen inkapselen, waardoor hun stabiliteit verbetert in vergelijking met traditionele methoden.
- Deze techniek maakt het gebruik van OMV's mogelijk in diverse toepassingen, waaronder therapeutische ontwikkeling en milieusanering.
- Het protocol richt zich op OMV's afgeleid van E. coli, maar kan worden aangepast voor andere microbiële culturen.
Doel van de studie
- Om enzymgevulde OMVs te zuiveren en te karakteriseren voor in vitro katalytische toepassingen.
- Om de enzymstabiliteit te verbeteren voor langdurige activiteit onder verschillende omstandigheden.
- Om het potentieel van OMVs te onderzoeken in meerdere velden, zoals therapeutica en katalyse.
Gebruikte methoden
- Oogsten van bacteriële OMV's uit kweekmedia.
- Centrifugatie van bacteriële culturen om OMV's te isoleren.
- Karakterisering van de enzymactiviteit binnen de OMV's.
- Toepassing van OMV's in celvrije katalyse van organofosfaatverbindingen.
Belangrijkste resultaten
- OMV's verbeteren de enzymstabiliteit aanzienlijk in vergelijking met traditionele isolatietechnieken.
- De enzymactiviteit blijft behouden onder diverse reactie- en bewaaromstandigheden.
- Het protocol maakt een efficiënte zuivering van OMV's uit E. coli mogelijk.
- Potentiële toepassingen in therapeutica en milieusanering worden belicht.
Conclusies
- Het ontwikkelde protocol biedt een betrouwbare methode voor het produceren van stabiele enzymgevulde OMV's.
- OMV's kunnen dienen als effectieve katalytische reagentia in diverse biochemische toepassingen.
- Toekomstig werk kan het gebruik van deze techniek uitbreiden naar andere microbiële systemen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie
Gerichte verpakking van eiwitten in outer membrane vesicles (OMV's) maakt stabiele levering van enzymen mogelijk voor celvrije katalytische systemen, waarmee de uitdagingen rondom instabiliteit bij de productie van recombinant eiwit worden aangepakt. Deze aanpak ondersteunt biofarmaceutische R&D door de houdbaarheid en activiteit van enzymen onder variabele omstandigheden te verbeteren, wat het uitvalpercentage in de vroege fase van de ontwikkeling van enzymatische therapieën en diagnostiek vermindert. De methode biedt een schaalbaar, bacterieel afgeleid nanodeeltjesplatform voor gerichte levering van payloads met toepassingen in therapeutische enzymvervanging, bioremediatie en stabilisatie van diagnostische reagentia.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt functionele validatie van recombinante enzymen mogelijk door activiteit te behouden via OMV-inkapseling, waardoor het aantal fout-negatieven bij target-screening wordt verminderd.
- Operationele waarde: Ondersteunt high-throughput assessment van enzymvarianten door stabiliteitsmetingen over verschillende constructen te standaardiseren.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Biedt een stabiel formaat voor enzympresentatie voor consistente kinetische metingen in celvrije assays, wat de reproduceerbaarheid van de assay verbetert.
- Operationele waarde: Faciliteert de standaardisatie van assays door activiteitsdrift tijdens screeningcampagnes te minimaliseren, waardoor de noodzaak voor frequente herbereiding van reagentia wordt verminderd.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Maakt evaluatie van enzymtherapeutica onder fysiologisch relevante omstandigheden mogelijk door de lading te beschermen tegen proteolytische degradatie.
- Operationele waarde: Ondersteunt de formuleringsontwikkeling voor enzymgebaseerde therapeutica door een verbeterde stabiliteit aan te tonen onder opslag- en transportbelastingen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De OMV-verpakkingsmethode integreert in het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie tot leadoptimalisatie, waardoor stabiele enzymproductie mogelijk wordt gemaakt voor downstream screening en preklinische evaluatie.
- Discovery Biology: Bevestigt target-engagement en padmodulatie door de enzymfunctie te behouden tijdens in vitro karakterisering.
- Screening: Levert kwantitatieve, stabiele enzymoutputs voor dosis-responsanalyses, wat het vertrouwen bij de hit-to-lead transitie vergroot.
- Analytics: Genereert betrouwbare activiteitsgegevens via paraoxon-hydrolyse-assays, wat een vergelijkende beoordeling van enzymvarianten mogelijk maakt.
- Translationeel Onderzoek: Ondersteunt preklinische continuïteit door enzymstabiliteit aan te tonen in gesimuleerde biologische omstandigheden.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een herbruikbaar platform voor het inkapselen van diverse enzymen, waardoor de inspanning voor herontwikkeling over verschillende projecten heen wordt verminderd.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in de enzymfunctionaliteit door activiteitsverlies tijdens de uitvoering van de assay te beperken.
- Operationele waarde: Verbetert de consistentie van reagentia en de schaalbaarheid via gestandaardiseerde protocollen voor de isolatie en kwantificering van OMV's.
- Strategische waarde: Vermindert het biologische risico bij de ontwikkeling van enzymtherapeutica door het vermogen tot doelmodulatie in een vroeg stadium te valideren.
- Impact op de portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van enzymkandidaten mogelijk op basis van aangetoonde stabiliteit en katalytische efficiëntie.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in moleculaire klonering, eiwitexpressie en technieken voor bacteriële kweek.
- Is afhankelijk van toegang tot ultracentrifugatie en instrumentatie voor nanoparticle tracking voor de isolatie en karakterisering van OMV's.
- Maakt standaardisatie van inductiecondities (bijv. arabinose/IPTG) tussen teams noodzakelijk om reproduceerbare vesikulatie en verpakkingsefficiëntie te waarborgen.
- Omvat overwegingen voor adaptatie bij verschillende enzymgroottes, oplosbaarheden en verankeringsstrategieën wanneer het systeem wordt uitgebreid naar niet-PTE-ladingen.
- Omvat praktische beperkingen zoals een variabele OMV-opbrengst en potentiële aggregatie tijdens opslag, wat empirische optimalisatie per enzymdoel vereist.
