Name: Voorbereiding en Levering van Protein Microcrystals in lipidische Cubic fase voor Serial Femtoseconde Kristallografie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Leer de voorbereiding en levering van membraaneiwitmicrokristallen in lipidekubische fase voor seriële femtoseconde-kristallografie. Deze methode minimaliseert sampleverbruik en stralingsschade.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health subsidies R01 GM108635 en U54 GM094618, Mayo Clinic-ASU Collaborative Seed Grant Award en NSF STC award 1231306. Wij danken A. Walker voor hulp bij het manuscript voorbereiding.

1. Filtering Solutions en Lipids Opmerking: Alle reagentia en instrumenten die in dit protocol moet zo schoon mogelijk om de invoering van deeltjesvormige verontreinigingen in de monsters die het LCP injector kunnen verstoppen te voorkomen. <ol><li> Filter alle neerslag oplossingen en gesmolten lipiden tot en met 5 micrometer spin-neer filters. Schone spuiten grondig en breng perslucht te drogen. Optioneel gebruik maken van een draagbare clean-room kap om te voorkomen dat het vangen stofdeeltjes of vezels tijdens de voorbehandeling procedures. </li></ol> 2. Reconstitutie van MP in LCP Opmerking: De keuze van de beste LCP gastheer lipiden Kristallisatieoplosmiddel afhankelijk van de doelgroep MP en wordt meestal geïdentificeerd tijdens gastheer lipide screening kristallisatie proeven 14. Monoacylglycerolen (MAG) vertegenwoordigen de meest voorkomende klasse van lipiden gebruikt voor LCP kristallisatie 15. De protocollen zijn gebaseerd op het gebruik van 9,9 MAG (oleïne) alsgastheer lipide, aangezien dit de meest succesvolle lipide in meso kristallisatie date 16. 9.9 MAG kan worden vervangen door andere LCP gastheer lipiden of lipide mengsels na rekening houdend met verschillen in hun fasegedrag. Bijvoorbeeld in het geval van GPCRs, monooleïne typisch gedoteerd met cholesterol receptor voor stabilisatie. Hier, Gebruik 9: 1 (w / w) 9,9 MAG: cholesterol mengsel als gastheer lipide. <ol><li> Mix richten MP, die wordt gezuiverd in detergens miceloplossing, de juiste LCP gastheer lipiden met twee spuiten (# 1 en # 2) en een koppelaar, zoals hiervoor 13 beschreven. </li><li> In het kort, load spuit # 1 met het gesmolten lipide en spuit # 2 met de MP-oplossing. Gebruik een verhouding tussen lipide en waterige MP die overeenkomt met het niveau dat net onder de maximale hydratatie capaciteit van de overeenkomstige LCP gastheer lipiden, bijvoorbeeld 3: v / v lipide / MP oplossing 9,9 MAG, 2 1: 1 v / v lipide / MP voor de meeste andere kortere keten MAGs (7,9 MAG, 9,7 MAG, etc.). </li><li> Sluit de spuiten met een injectiespuit en start weer mengen van de stoffen door op de plunjers aan het mengsel heen en weer tussen de spuiten te verplaatsen, totdat het monster homogeen en transparant wordt. Bereid ongeveer 50 gl van het monster LCP voor het verzamelen van een volledige dataset van LCP-SFX. De uiteindelijke steekproef volume zal doorgaans te verhogen met ongeveer een factor twee (tot ~ 100 pi) na het monster consolidatie en lipide titratie (hoofdstuk 5). </li></ol> 3. Het opzetten van kristallisatie in Spuiten <ol><li> Na een transparante en homogene LCP wordt gevormd, beweegt het gehele monster in de injectiespuit # 2. Los spuit # 1, terwijl de koppelaar verbonden injectiespuit # 2. </li><li> Sluit een verwisselbare naald (gauge 26s) naar een andere 100 ui schoon spuit (spuit # 3) en zuig ongeveer 70 ul van de neerslag oplossing erin. De samenstelling van het neerslagmiddel oplossing f triggersormatie van high-density microkristallen is uniek voor elk doel MP en moet worden bepaald alvorens tot deze protocollen. Hier gebruikt een geoptimaliseerde precipitatiemiddel oplossingssamenstelling die stromen van microkristallen van de A2A receptor (40 mM natrium- thiocyanaat, 100 mM natriumcitraat pH 5, 26-28% PEG400) oplevert. </li><li> Koppel de naald van de spuit # 3 terwijl de Teflon ferrule binnen de spuit. </li><li> Sluit spuiten # 2 en # 3 door middel van de koppeling, om ervoor te zorgen dat de Teflon ferrules zijn correct op hun plaats in beide spuiten. Schroef de koppeling stevig in positie. </li><li> Richt de gekoppelde spuiten verticaal met spuit # 2 op de bodem en injecteer de eiwit-beladen LCP monster uit spuit # 2 in de spuit # 3 langzaam en gestaag totdat de LCP reeks de plunjer van de spuit # 3 raakt. De geïnjecteerde LCP volume bedraagt ​​ongeveer 1/10 van het oorspronkelijke volume neerslag in spuit # 3 (~ 7 pl). Controleer of het volume van de schaal-lezing over beide Syringe (beide zuigers moeten bewegen met ongeveer 7 ui). </li><li> Koppel spuit # 2. De koppeling is nu alleen verbonden met spuit # 3 dat het monster ondergedompeld in de neerslag oplossing bevat. </li><li> Gebruik Parafilm volledig afdichten spuit # 3, inclusief de plunjer injectiespuit, het openingseind ​​van de koppeling en de naald moer. Onvolledige verzegeling tijdens deze stap kan de neerslag voorwaarden te veranderen en het monster te dehydrateren veroorzaken. </li><li> Herhaal stap 3,3-3,7 voor het opzetten van kristallisatie in 6 extra spuiten (# 4 # 9) met behulp van een totaal van ~ 50 ul van de LCP monster (~ 7 pi van LCP per elke spuit). </li><li> WINKEL verzegeld spuiten in een afsluitbare kunststof zak met één of twee pluisvrije reinigingsdoekjes vooraf geweekt met water te beschermen tegen uitdroging monster. Sluit de zak en bewaar spuiten in een 20 ° C incubator gedurende kristalgroei. </li></ol> 4. Crystal Detection <ol><li> Verwijder de spuiten uit de incubator het imago van de LCP monsters direct in de spuiten (# 3 # 9) om de 12-24 uur onder een stereomicroscoop met cross-gepolariseerd licht. Identificeren kristallen als opeengepakte glanzende deeltjes of, bij kleinere kristalgrootte als eenvormig gloed van de LCP filament. </li><li> Zet de verzegelde spuiten om de zak en bewaren bij 20 ° C voor toekomstig gebruik. </li></ol> 5. Sample Consolidatie en titratie met 7,9 MAG Opmerking: De lipide titratiestap beschreven dient twee doelen: a) de overmaat precipiterende oplossing te absorberen en b) lipide voorkomen bevriezing bij injectie in de XFEL bundel. Wanneer een LCP monster uit 9,9 MAG in een vacuümkamer voor gegevensverzameling wordt geïnjecteerd, kan intensieve verdamping het monster afkoelen tot temperaturen onder de evenwichtstemperatuur faseovergangstemperatuur (~ 18 ° C), het omzetten van delen van het monster in een lamellaire kristallijne fase (Lc). Deze patches van Lc fase, toen geraakt door de bundel, produceren intense poeder diffractie ringen die een detector 6 kunnen beschadigen, zoals de Cornell-SLAC pixel array detector (CSPAD). Titratie van 9,9 MAG monster met een kortere keten lipide (9.7 MAG of 7.9 MAG) vermindert dit probleem, omdat dergelijke mengsels hebben een lagere faseovergang temperaturen. We beschrijven titratie van een LCP bestaande uit 9,9 MAG met 7,9 MAG. Bij kortere keten MAGs (MAG 9,7, 7,9 MAG, etc.) worden gebruikt voor kristallisatie of als seriële kristallografie gegevens worden verzameld bij omgevingsdruk de titratie stap 5,11 wordt nog steeds vereist, maar kan worden uitgevoerd met de oorspronkelijke LCP gastheer lipiden toegepast voor kristallisatie. <ol><li> Ongeveer 1 uur voor het begin van de gegevensverzameling, verwijder spuiten met monsters uit de 20 ° C incubator. </li><li> Selecteer 2-4 spuiten voor steekproef consolidatie gebaseerd op een soortgelijk kristal uiterlijk en de gelijkenis van kristallisatie omstandigheden. </li><li> Haal de Parafilm de sluiting van de geselecteerde spuiten. </li><li> Verwijderende spuit koppeling en bevestig een schone verwisselbare naald (gauge 26s) naar de eerste geselecteerde spuit. Voorzichtig en langzaam duw de zuiger uit naar de neerslag uit te persen door middel van de naald in een microcentrifugebuis. Wees voorzichtig bij deze stap, omdat het aanbrengen van een hoge druk op de plunjer in deze stap kunnen enkele kristal beladen LCP uitgeworpen samen met het precipiterende oplossing, wat leidt tot een gedeeltelijk of volledig verlies van het monster. </li><li> Stop de plunjer wanneer de meeste neerslag is verwijderd en de LCP heeft opgelopen bij de naald ingang. </li><li> Herhaal stap 5,4-5,5 met andere geselecteerde spuiten. </li><li> Aan de verkregen LCP monsters te consolideren, verbinden twee injectiespuiten met elkaar door middel van een schone koppeling. </li><li> Druk de zuiger op een spuit om het gehele monster van het ene van de spuiten naar de andere. </li><li> Koppel de lege spuit. </li><li> Herhaal stap 5,7-5,9 om alle kristallen beladen LCP-materiaal te consolideren van 3:58 pre-Selected spuiten in een spuit. Verwijder zoveel mogelijk neerslagmiddelen. </li><li> Voeg ~ 5 ul van 7,9 MAG of de oorspronkelijke kortere keten MAG gastheer lipide naar een lege injectiespuit. Sluit deze spuit om de spuit met de geconsolideerde monster door een spuit koppeling en meng door afwisselend indrukken spuit plunjers. Herhaal dit tot alle overblijvende oplossing wordt opgenomen en een homogene transparante LCP wordt gevormd. De uiteindelijke hoeveelheid LCP na titratie variëren 20-35 gl afhankelijk van het volume van de overmaat precipitatiemiddel en de samenstelling. </li><li> Verplaats het gehele gemengde LCP monster in een spuit en verwijder de lege spuit. </li></ol> 6. Karakterisering van Microcrystals <ol><li> Sluit een LCP-injector loading naald (punt 3 stijl, maat 22, een centimeter in lengte) aan de spuit met een geconsolideerde monster. </li><li> uitwerpen zorgvuldig ~ 1 ui van het LCP monster op een glasplaatje en bedek het met een glazen afdekplaat slip. Druk voorzichtig op dedekglas naar sandwich het monster. </li><li> Neem beelden van de LCP monster onder een stereomicroscoop met de hoogst mogelijke vergroting (100X gewoonlijk) met een bright-field verlichting en cross-polarisatoren. Neem indien mogelijk extra beelden met UV-fluorescentie microscoop en een SonicC (tweede orde niet-lineaire beeldvorming van chirale kristallen) 17 imager het bestaan ​​van microkristallen eiwit in het monster te bevestigen. </li><li> Schatting kristal grootte en dichtheid 10. De ideale kristaldichtheid voor een gegevensverzameling experiment zal afhangen van de kristalgrootte, de diameter van de röntgenbundel en de diameter van de LCP stroom, en moet resulteren in een kristal hit van ongeveer 10-40%. </li></ol> 7. Aanpassing van Crystal Density Opmerking: Als het kristal dichtheid in stap 6,4 te hoog, wat resulteert in een groot percentage van meerdere kristallen hits, moet de kristallen worden verdund volgens de hieronder beschreven stappen voor het optimaliserenmonster voor het verzamelen van gegevens. Als het kristal dichtheid te laag is voor een efficiënte gegevensverzameling in alle bereide monsters, dan is de kristalgroei voorwaarden moeten opnieuw worden geoptimaliseerd, aangezien er geen betrouwbare methode voor het concentreren MP kristallen LCP. <ol><li> Bereid de benodigde hoeveelheid LCP netjes worden gebruikt voor het verdunnen door het nabootsen van de LCP samenstelling (dezelfde lipiden en neerslagmiddel) van het oorspronkelijke monster met kristallen die moet worden verdund. </li><li> Verplaats alle nette LCP in een spuit. Maak lege spuit maar laat de koppeling aangesloten. </li><li> Verwijder de naald van de spuit die de LCP monster met microkristallen bevat. Sluit het monster spuit om de spuit met nette LCP door de koppeling. </li><li> Meng de inhoud van de spuiten door heen en weer te duwen door het koppelstuk totdat homogeniteit is bereikt. </li><li> Herhaal Hoofdstuk 6 opnieuw te evalueren de microkristallijne dichtheid in de aangepaste monster. </li></ol> 8. LCP Injector Laden eennd LCP-SFX Data Collection <ol><li> Koppel de koppeling van de spuit met het monster en bevestig een 1 &quot;loading naald op de spuit. </li><li> Transfer 20-40 gl van het monster in het reservoir van een LCP injector. </li><li> Plaats de LCP injector in de monsterkamer 18, start de injector, past het debiet en het verzamelen van LCP-SFX data. </li></ol> 9. Het opnemen van oplosbare proteïne Kristallen in LCP Opmerking: Met behulp van zeer visceuze zoals LCP, voor levering van kristallen van oplosbare eiwitten kan men aanzienlijk korter eiwitinname op seriële kristallografie experiment. In deze stappen beschrijven we hoe u kristallen van oplosbare eiwitten te nemen in LCP. Kristallen kan worden verkregen door elke techniek, tezamen geconsolideerd in de vorm van een kristalsuspensie en gefilterd indien nodig. <ol><li> Pas kristaldichtheid in suspensie om ervoor te zorgen kristal hit percentages van ongeveer 10-40%. </li><li> Test de verenigbaarheid van het neerslagmiddel oplossing LCP gebruikt MAG 7,9, 9,7 MAG of een 1: 1 mengsel van 7,9 en 9,9 MAG MAG als gastheer lipide. </li><li> Meng ~ 25 ul van de kristalsuspensie met ~ 25 ul van de gastheer lipide met een injectiespuit mixer tot een homogene LCP vormen. </li><li> Evalueer kristal grootte en dichtheid zoals beschreven in hoofdstuk 6. Plaats het monster in de LCP injector en het verzamelen van gegevens, zoals beschreven in hoofdstuk 8. </li></ol>

<ol><li>Cherezov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+crystal+structure+of+an+engineered+human+beta2-adrenergic+G+protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor.</a> Science. 318 (5854), 1258-1265 (2007).</li>
<li>Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidic+cubic+phase+technologies+for+membrane+protein+structural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struc+Biol%22%5BJournal%5D)">Lipidic cubic phase technologies for membrane protein structural studies.</a> Curr Opin Struc Biol. 21 (4), 559-566 (2011).</li>
<li>Chapman, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femtosecond+X-ray+protein+nanocrystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Femtosecond X-ray protein nanocrystallography.</a> Nature. 470 (7332), 73-77 (2011).</li>
<li>Neutze, R., Wouts, R., van der Spoel, D., Weckert, E., Hajdu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+for+biomolecular+imaging+with+femtosecond+X-ray+pulses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potential for biomolecular imaging with femtosecond X-ray pulses.</a> Nature. 406 (6797), 752-757 (2000).</li>
<li>DePonte, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gas+dynamic+virtual+nozzle+for+generation+of+microscopic+droplet+streams%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+D+Appl+Phys%22%5BJournal%5D)">Gas dynamic virtual nozzle for generation of microscopic droplet streams.</a> J Phys D Appl Phys. 41 (19), 195505(2008).</li>
<li>Weierstall, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidic+cubic+phase+injector+facilitates+membrane+protein+serial+femtosecond+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Lipidic cubic phase injector facilitates membrane protein serial femtosecond crystallography.</a> Nat Commun. 5, 3309(2014).</li>
<li>Fenalti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+bifunctional+peptide+recognition+at+human+%CE%B4-opioid+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Strcut+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural basis for bifunctional peptide recognition at human δ-opioid receptor.</a> Nat Strcut Mol Biol. 22 (3), 265-268 (2015).</li>
<li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+femtosecond+crystallography+of+G+protein-coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Serial femtosecond crystallography of G protein-coupled receptors.</a> Science. 342 (6165), 1521-1524 (2013).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+Angiotensin+Receptor+Revealed+by+Serial+Femtosecond+Crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structure of the Angiotensin Receptor Revealed by Serial Femtosecond Crystallography.</a> Cell. 161 (4), 833-844 (2015).</li>
<li>Liu, W., Ishchenko, A., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+microcrystals+in+lipidic+cubic+phase+for+serial+femtosecond+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation of microcrystals in lipidic cubic phase for serial femtosecond crystallography.</a> Nat Protoc. 9 (9), 2123-2134 (2014).</li>
<li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+allosteric+regulation+of+GPCRs+by+sodium+ions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural basis for allosteric regulation of GPCRs by sodium ions.</a> Science. 337 (6091), 232-236 (2012).</li>
<li>Caffrey, M., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallizing+membrane+proteins+using+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases.</a> Nat Protoc. 4 (5), 706-731 (2009).</li>
<li>Liu, W., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+of+membrane+proteins+in+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases.</a> J Vis Exp. (49), (2011).</li>
<li>Li, D., Shah, S. T. A., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+Lipid+and+Temperature+as+Important+Screening+Variables+for+Crystallizing+Integral+Membrane+Proteins+in+Lipidic+Mesophases.+Trials+with+Diacylglycerol+Kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Cryst+Growth+Des%22%5BJournal%5D)">Host Lipid and Temperature as Important Screening Variables for Crystallizing Integral Membrane Proteins in Lipidic Mesophases. Trials with Diacylglycerol Kinase.</a> Cryst Growth Des. 13 (7), 2846-2857 (2013).</li>
<li>Caffrey, M., Lyons, J., Smyth, T., Hart, D. J. Monoacylglycerols: The Workhorse Lipids for Crystallizing Membrane Proteins in Mesophases. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCaffrey%2C+M+%22Current+Topics+in+Membranes%22">Current Topics in Membranes</a>. 63, Elsevier. (2009).</li>
<li>Kulkarni, C. V., Wachter, W., Iglesias-Salto, G., Engelskirchen, S., Ahualli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoolein%3A+a+magic+lipid%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Chem+Chem+Phys%22%5BJournal%5D)">Monoolein: a magic lipid?</a> Phys Chem Chem Phys. 13 (8), 3004-3021 (2011).</li>
<li>Kissick, D. J., Gualtieri, E. J., Simpson, G. J., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+optical+imaging+of+integral+membrane+protein+crystals+in+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Nonlinear optical imaging of integral membrane protein crystals in lipidic mesophases.</a> Anal Chem. 82 (2), 491-497 (2010).</li>
<li>James, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJames%2C+D+%22Injection+Methods+and+Instrumentation+for+Serial+X-ray+Free+Electron+Laser+Experiments%22">Injection Methods and Instrumentation for Serial X-ray Free Electron Laser Experiments</a>. , Arizona State University. 1-126 (2015).</li>
<li>Kang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+rhodopsin+bound+to+arrestin+by+femtosecond+X-ray+laser%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of rhodopsin bound to arrestin by femtosecond X-ray laser.</a> Nature. 523 (7562), 561-567 (2015).</li>
<li>Rasmussen, S. G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+%CE%B22+adrenergic+receptor-Gs+protein+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the β2 adrenergic receptor-Gs protein complex.</a> Nature. 477 (7366), 549-555 (2011).</li>
<li>Fromme, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+femtosecond+crystallography+of+soluble+proteins+in+lipidic+cubic+phase%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">Serial femtosecond crystallography of soluble proteins in lipidic cubic phase.</a> IUCrJ. 2 (Pt 5), 545-551 (2015).</li>
<li>Sugahara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grease+matrix+as+a+versatile+carrier+of+proteins+for+serial+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Grease matrix as a versatile carrier of proteins for serial crystallography.</a> Nat Meth. 12 (1), 61-63 (2014).</li>
<li>Conrad, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+inert+crystal+delivery+medium+for+serial+femtosecond+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">A novel inert crystal delivery medium for serial femtosecond crystallography.</a> IUCrJ. 2 (Pt 4), 421-430 (2015).</li>
<li>Botha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Room-temperature+serial+crystallography+at+synchrotron+X-ray+sources+using+slowly+flowing+free-standing+high-viscosity+microstreams%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+Sct+D%22%5BJournal%5D)">Room-temperature serial crystallography at synchrotron X-ray sources using slowly flowing free-standing high-viscosity microstreams.</a> Acta Crystallogr Sct D. 71 (Pt 2), 387-397 (2015).</li>
<li>Nogly, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidic+cubic+phase+serial+millisecond+crystallography+using+synchrotron+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">Lipidic cubic phase serial millisecond crystallography using synchrotron radiation.</a> IUCrJ. 2, 168-176 (2015).</li>
<li>Tenboer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-resolved+serial+crystallography+captures+high-resolution+intermediates+of+photoactive+yellow+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Time-resolved serial crystallography captures high-resolution intermediates of photoactive yellow protein.</a> Science. 346 (6214), 1242-1246 (2014).</li>
<li>Kupitz, C., Basu, S., Grotjohann, I., Fromme, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+time-resolved+crystallography+of+photosystem+II+using+a+femtosecond+X-ray+laser%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Serial time-resolved crystallography of photosystem II using a femtosecond X-ray laser.</a> Nature. 513, 261-265 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

De hier beschreven protocollen geven een algemeen overzicht van het monster voorbereiding procedure voor een standaard LCP-SFX experimenteren met een LCP injector. Gebaseerd op onze ervaring, het totale bedrag van de definitieve microkristallijne beladen LCP monster dat nodig is voor het verzamelen van een volledige dataset typisch 50-100 gl (Tabel 1, 25-50 pl oorspronkelijke proteïne beladen LCP sample), afhankelijk van de microkristallijne maat , en -dichtheid. Aangezien elk 100 pi gasdichte glazen spuit kan ongeveer 7 ui van LCP in de vorm van een volledig uitgestrekte string goede en zelfs diffusie van het precipitatiemiddel oplossing in de LCP waarborgen, moet ten minste 6:56 monsters injectiespuiten worden voorbereid elke LCP-SFX experiment. Aangezien het monster wordt geëxtrudeerd door een smalle 20-50 micrometer diameter capillair, is het cruciaal om op ongerechtigheden materiaal in het monster te voorkomen. Stof en vezels die soms in het LCP kan worden geïntroduceerdmonster of precipitatiemiddel oplossingen kan de injector capillaire verstoppen en verhoging van de down-time tijdens het experiment. Daarom is het belangrijk om de lipide en alle oplossingen door een 5 um poriegrootte filter filteren voordat monstervoorbereiding. Eventueel kan een clean room of een draagbare clean room kap worden gebruikt voor de monstervoorbereiding. Deze protocollen zijn gebaseerd op het gebruik van 9,9 MAG (oleïne) als de gastheer lipide voor MP kristallisatie. Zij zijn echter niet beperkt tot 9,9 MAG en kunnen gemakkelijk worden aangepast aan andere LCP gastheer lipiden en lipide mengsels rekening houdend met de verschillen in de lipidefase gedrag. De meeste van de structuur van MPs gekristalliseerd in LCP werden verkregen via een van de tijdschriften, met 9,9 MAG de meest succesvolle representatieve dusver 15. Het belangrijkste nadeel van het gebruik van 9,9 MAG SFX is de overgang naar lamellaire kristalfase na afkoelen onder 18 ° C, die vaak optreedt wanneer de metingen worden uitgevoerd onder vacuüm. de titratiop 7,9 MAG beschreven in paragraaf 5 van dit protocol biedt een goede oplossing voor dit probleem. In onze ervaring, kristallen weerstaan ​​zo&#39;n titratie zonder nadelige effecten. Indien echter de toevoeging van 7,9 MAG of een korte keten MAG is niet wenselijk, kan de titratie uitgevoerd met 9,9 MAG. In dit geval moet het gas dat de stroom van LCP bij injectie in het vacuüm stabiliseert omschakelbaar van helium stikstof, die de vorming van een kristallijne lipidefase in de meeste monsters kunnen voorkomen ten koste van een minder stabiel monsterstroom. De gelachtige consistentie van LCP heeft een groot voordeel voor gebruik als een kristal dragermedium, aangezien het aanpassen van de stroomsnelheid kristal in een breed assortiment, geschikt voor seriële kristallografie gegevensverzameling op moderne XFEL en synchrotron bronnen. Passend bij de kristallen stroom met de XFEL pulsherhalingsfrequentie resulteert in een drastische vermindering van kristal verbruik van ordes van grootte compared te vloeistofinjectie. LCP is een geschikt dragermedium voor afgifte niet alleen MP kristallen gegroeid, maar ook om kristallen van oplosbare eiwitten 21. Verschillende alternatieve viskeuze kristal carrier media zijn onlangs geïntroduceerd 22-24, de uitbreiding van het arsenaal aan instrumenten en reagentia voor het uitvoeren van seriële kristallografie experimenten. Bovendien heeft seriële kristallografie met LCP als een kristal aflevermedium aangetoond bij conventionele synchrotron bronnen, althans voor goed buigen van kristallen 24,25. Toekomstige upgrades van synchrotron bronnen die boost X-ray intensiteit door ordes van grootte, evenals verbeteringen in de detector technologieën, zal seriële kristallografie een nog toegankelijker en aantrekkelijker methode om de structuur te bepalen. LCP-SFX heeft de potentie voor MP structurele bepaling aangetoond. Voor uitdagende biologische systemen (zoals GPCR&#39;s of macromoleculaire complexen) waarbij large, diffractie kwaliteit kristallen zijn moeilijk om te groeien, kan LCP-SFX een aantrekkelijk bieden, zo niet de enige, haalbare optie om een ​​atomaire resolutie structuur op te lossen. Met al zijn voordelen, dat wil zeggen, met behulp van LCP als de matrix voor MP kristallisatie en kristal levering, lage eiwitconsumptie, de afwezigheid van stralingsschade, kamertemperatuur verzamelen van gegevens, de mogelijkheden van tijdsopgeloste studies 26,27 en geen kristal oogsten vereiste, LCP- SFX moeten een belangrijke rol spelen in de toekomst van de structurele biologie spelen.

Röntgenkristallografie is de meest succesvolle techniek tot nu toe voor het oplossen atomaire resolutie structuren van membraaneiwitten (MPs). Kristallisatie uit lipide mesofasen, ook bekend als lipide kubische fase (LCP), of meso kristallisatie, is een van de belangrijke ontwikkelingen MP kristallografie dat de hoge-resolutie structuurbepaling van uitdagende doelen is mogelijk zoals G-proteïne gekoppelde receptoren (GPCRs ) 1. Recente ontwikkelingen in LCP instrumenten en technologieën hebben deze techniek beschikbaar is voor een grote gemeenschap van structurele biologen over de hele wereld 2 gemaakt. In veel gevallen MP kristallen die zich in LCP te klein om te worden gebruikt zelfs bij geavanceerde microfocus synchrotron faciliteiten, waarbij de monsters met ernstige stralingsschade en achteruitgang voor voldoende signaal met een hoge resolutie kunnen worden verkregen 3. Een nieuwe benadering van kristallografische dataverzamelingwerd ingeschakeld met de ingebruikname van de eerste X-ray vrije-electron laser (XFEL). De methode is gebaseerd op het principe van &quot;diffractie voor vernietiging&quot;, voor het eerst geïntroduceerd in theorie 4 en vervolgens bevestigd experimenteel op biologische monsters op de Linac Coherent Light Source (LCL) 3, &#39;s werelds pionier in hard XFELs. Een XFEL genereert hoge helderheid X-ray pulsen binnen enkele tientallen femtoseconde duur dat buigen van een ongerepte kristallen voordat het eiwit atomen kan bewegen in reactie op stralingsschade. In de eerste experimenten werden microkristallen continu toegevoerd aan de kruising met de XFEL balk in een waterige stroom door een vloeistof injector 5. Deze experimentele opstelling staat bekend als seriële femtoseconde kristallografie (SFX). Het belangrijkste nadeel van vloeibare injectoren voor SFX is hun hoge flux die dientengevolge vereist tientallen tot honderden mg gezuiverd eiwit voor het verzamelen van een volledige dataset. door employing een speciale injector die kan omgaan met de gel-achtige LCP monsters (LCP microextrusion injector) 6, hebben we met succes opgeleverd microkristallen van een aantal verschillende menselijke GPCR&#39;s geteeld in een LCP matrix en verkregen hun high-resolution structuren 6-9, met een aanzienlijk verminderd eiwit consumptie onder 0,3 mg per dataset. De injector bestaat uit een reservoir dat kan vasthouden tot 20, 40 of 100 pl kristal beladen LCP en een smal capillair (10-50 pm in diameter) waardoor het monster wordt geëxtrudeerd door toepassing van een hoge druk (tot 10.000 psi) van een hydraulische plunjer met een druk geamplificeerd fase aangedreven door een vloeistof uit een HPLC (high-performance Liquid Chromatography) pomp. De stroom verlaat de LCP capillairmondstuk wordt gestabiliseerd door een parallelle stroom reactief gas (meestal helium of stikstof). Hier bieden we visuele demonstraties van de stappen die nodig zijn om voor te bereiden en te karakteriseren monsterseen LCP-SFX experiment. Verdere details zijn te vinden in de gepubliceerde protocollen 10. Als voorbeeld zullen we adenosine A2A receptor 11 kan worden en bereid kristallen van dit eiwit in LCP voor de röntgenbron gegevensverzameling via SFX benadering. Terwijl onze protocollen compatibel met elk injector die in staat van streaming LCP voor het verzamelen van gegevens door de seriële kristallografie aan XFEL en synchrotron bronnen, ter illustratie, zullen we de LCP injector in Ref beschreven gebruiken. 6. Geoptimaliseerde neerslag voorwaarden die high-density microkristallen in LCP produceren moeten worden geïdentificeerd door high-throughput screening kristallisatie 12,13 alvorens tot dit protocol. Een typische stroomdiagram van dit protocol wordt weergegeven in figuur 1.

<table><tbody><tr><td>LCP host lipid monoolein (9.9 MAG)</td><td>Nu Chek Prep</td><td>M239</td><td>Hosting lipid voor het te kristalliseren eiwit</td></tr><tr><td>LCP host lipid monoolein (9.9 MAG)</td><td>Sigma</td><td>M7765&nbsp;</td><td>Hosting lipid voor het te kristalliseren eiwit</td></tr><tr><td>LCP host lipid monopalmitolein (9.7 MAG)</td><td>Nu Chek Prep</td><td>M219</td><td>Hosting lipid voor het te kristalliseren eiwit</td></tr><tr><td>LCP host lipid 7.9 MAG</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850534</td><td>Hosting lipid voor titratie om lamellenvormige kristallijne fase (Lc) vorming tijdens monsterinjectie te voorkomen</td></tr><tr><td>Geconcentreerde oplossing van gezuiverd eiwit tot 20-50 mg/ml</td><td></td><td></td><td>Doeleiwit</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher Scientific</td><td>C606-1</td><td>Gebruikt om lipiden op te lossen</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179337-500ML</td><td>Gebruikt om spuiten te wassen</td></tr><tr><td>Elf 100 &#956;l Hamilton gasdichte spuiten zonder naalden</td><td>Hamilton</td><td>7656-01</td><td>Voor LCP voorbereiding</td></tr><tr><td>Acht spuitkoppelingen</td><td>Formulatrix</td><td>SKU 209526</td><td>Voor LCP voorbereiding</td></tr><tr><td>LCP-injector laadnaald</td><td>Hamilton</td><td>7804-01 puntstijl 3, lengte 1 inch</td><td>Voor LCP dispenseren en injector laden</td></tr><tr><td>Verwisselbare naald</td><td>Hamilton</td><td>7768-01</td><td>Voor het verwijderen van precipitaat oplossing</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Parafilm</td><td>PM992</td><td>Gebruikt voor spuitverzegeling</td></tr><tr><td>Lensreinigingsdoekjes, pluisvrij</td><td>Fisher</td><td>NC9592151</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeerfilterbuisjes, Ultrafree-MC, 0,5 ml, Durapore 5 &micro;m</td><td>Millipore</td><td>UFC3 0SV 00</td><td>Gebruikt voor het filteren van precipitaat oplossingen en lipiden</td></tr><tr><td>Microscoopglazen, 1 inch x 3 inch&nbsp;</td><td>GoldSeal</td><td>3010</td><td></td></tr><tr><td>Twee wasflessen met fijne punten. Een gevuld met milli-Q of gedistilleerd water, de andere met methanol</td><td>VWR</td><td>89094-640</td><td>Deze worden gebruikt om de spuiten, naalden en koppeling te reinigen.  Methanol wordt eerst gebruikt, dan water.</td></tr><tr><td>Handschoenen</td><td>Microflex</td><td>XC-310-L</td><td>Voor het afblazen van spuiten, naalden, ferrules en koppelingen</td></tr><tr><td>Veiligheidsbril</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perslucht blikjes</td><td>Office Depot (Dust-Off)</td><td>527494</td><td>Voor spuitreiniging</td></tr><tr><td>Droog blok verwarmer met een digitale temperatuurregelaar</td><td>Fisher</td><td>11-720-10BQ&nbsp;</td><td>Gebruikt voor het ontdooien van lipiden</td></tr><tr><td>Centrifuge op tafel</td><td>Fisher</td><td>05-413-340</td><td>Oplossingen centrifugeren</td></tr><tr><td>Clean Room Mini - 12 inch Draagbare Positieve Druk Kap met HEPA-filter</td><td>Sentry Air Systems, Inc.</td><td>SS-112-PCR</td><td>Reiniging van monstervoorbereiding</td></tr><tr><td>Stereo zoommicroscoop uitgerust met een lineaire polarisator en roterende analyzer&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>SMZ1500</td><td>Controle van kristaldichtheid</td></tr><tr><td>UV-microscoop</td><td>JAN Scientific</td><td>UVEX-P</td><td>Optioneel, voor kristalbeeldvorming</td></tr><tr><td>SHG imager</td><td>Formulatrix</td><td>SONICC</td><td>Optioneel, voor kristalbeeldvorming</td></tr></tbody></table>

voorbereiding en levering van protein microcrystals in lipidische cubic fase voor serial femtoseconde kristallografie

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

Membraaneiwitten (MPS) zijn essentiële onderdelen van celmembranen en primaire drug targets. Rationele drug design is gebaseerd op een nauwkeurige structurele informatie, meestal verkregen door kristallografie; MPs echter moeilijk te kristalliseren. Recente vooruitgang in MP structurele bepaling heeft sterk geprofiteerd van de ontwikkeling van de lipide kubieke fase (LCP) kristallisatie methoden, die levert doorgaans goed voor buigen, maar vaak kleine kristallen die last hebben van straling schade tijdens de traditionele kristallografische het verzamelen van gegevens bij synchrotron bronnen. De ontwikkeling van de nieuwe generatie X-ray vrije-electron laser (XFEL) bronnen die extreem heldere femtoseconde pulsen heeft ingeschakeld verzameling kamertemperatuur gegevens van microkristallen met geen of verwaarloosbare stralingsschade. Onze recente inspanningen combineren LCP technologie seriële femtoseconde kristallografie (LCP-SFX) hebben geleid tot hoge resolutie structuren van verschillende menselijke G-eiwit gekoppelde receptoren, which vertegenwoordigen een notoir moeilijk doelwit voor structuur bepalen. In de LCP-SFX techniek wordt LCP aangeworven als matrix voor zowel de groei en levering van MP microkristallen naar het snijpunt van de injector stroom met een XFEL balk kristallografische gegevensverzameling. Er is aangetoond dat LCP-SFX hoofdzaak diffractie resolutie kan verbeteren wanneer slechts sub- 10 urn kristallen beschikbaar zijn, of wanneer het gebruik van kleinere kristallen bij kamertemperatuur diverse problemen van grotere cryocooled kristallen, zoals de accumulatie van defecten te overwinnen, hoge mosaicity en cryocooling artefacten. Toekomstige ontwikkelingen in de X-ray bronnen en de detector technologieën moeten seriële kristallografie zeer aantrekkelijk en bruikbaar is voor de uitvoering niet alleen op XFELs, maar ook op toegankelijker synchrotron faciliteiten te maken. Hier presenteren wij gedetailleerde visuele protocollen voor de voorbereiding, de karakterisering en de levering van microkristallen in LCP voor seriële kristallografie experimenten.Deze protocollen omvatten werkwijzen voor het uitvoeren van kristallisatie-experimenten in injectiespuiten, detecteren en karakteriseren van het kristal monsters optimaliseren kristaldichtheid, loading microkristallijne beladen LCP in de injector en het leveren van het monster op de balk gegevensverzameling.

Hieronder geven we representatieve resultaten verkregen met monsters bereid door het volgen van de bovenstaande protocollen, wat ons toeliet om SFX-gegevens te verzamelen en op te lossen met een hoge resolutie structuren van vijf menselijke GPCR&#39;s te beschrijven: serotonine receptor 5-HT 2B in complex met een agonist ergotamine 8 (VOB ID 4NC3 ), smoothened receptor (SMO) in complex met een antagonist cyclopamine 6 (VOB ID 4O9R), δ-opioïdereceptor in complex met een bifunctionele peptideligand DIPP-NH2 7 (VOB ID 4RWD), angiotensine receptor in complex met een blocker ZD7155 9 (VOB ID 4YAY), en een complex tussen rhodopsine en arrestin 19 (VOB ID 4ZWJ); en twee test-oplosbare eiwitten: lysozym (VOB ID 4ZIX) en fycocyanine (VOB ID 4ZIZ). 5-HT 2B bemiddelt diverse centrale en perifere fysiologische functies van de neurotransmitter serotonine. deze receptorwerd gebruikt om vast te stellen en valideren van de LCP-SFX-methode, door het vergelijken van de kamertemperatuur structuur verkregen bij LCL met de cryocooled structuur opgelost door traditionele microcrystallography op de Advanced Photon Bron (APS). Een totaal van 100 pi ~ LCP monster met eiwit microkristallen (gemiddelde grootte ongeveer 5 pm) werd bereid en gebruikt voor SFX gegevensverzameling en de LCP-SFX structuur van 5HT 2B werd met succes opgelost 2,8 A (figuur 2) 8. Aanvullende nuttige informatie over de bereiding van de monsters en het verzamelen van gegevens zijn te vinden in tabel 1. Smoothened receptor (SMO) is een lid van de klasse F GPCRs en het moleculaire doelwit van de teratogeen cyclopamine, met goed aangetoond functies in embryonale ontwikkeling en tumorgroei. Aanvankelijk relatief grote kristallen van SMO / cyclopamine met een gemiddelde grootte van 120 x 10 x 5 urn werden verkregen en gebruikt voor data collectiop een synchrotron bron met conventionele goniometer gebaseerde kristallografie. Echter, deze grote kristallen geproduceerd poor diffractie op micro-focus bundellijn (10 urn in diameter) die lijden aan grote mosaicity (hierboven 2-3 graden), waarschijnlijk door de accumulatie van kristalgroei defecten of van effecten die samenhangen met cryocooling. LCP-SFX, echter, stelde ons in staat om de kwaliteit van diffractie gegevens te verzamelen bij LCL van 5 micrometer-sized kristallen bij kamertemperatuur. De structuur werd opgelost door moleculaire vervanging door een anisotrope 3,4, 3,2 en 4,0 A resolutie langs de drie hoofdassen, duidelijk de locatie van cyclopamine in de bindingsplaats 6 (figuur 3). Alkaloïde opiaten, zoals morfine, gericht μ-opioid receptor (μ-OR) worden veel gebruikt bij ernstige pijn. Echter, hun uitgebreide gebruik leidt tot verworven tolerantie en verslaving. Gelijktijdige toediening van morfinesmet δ-opioïdereceptor (δ-OR) antagonisten is aangetoond dat de bovengenoemde bijwerkingen voorkomen, waardoor het zoeken naar verbindingen met een gemengde δ-OR-antagonist en μ-OR-agonist functie bevorderen. We kregen de eerste diffractie gegevens δ-OR in een complex met een bifunctionele tetra-peptide DIPP-NH2 behulp cryocooled kristallen die afgebogen tot 3,3 A bij een synchrotron röntgenbron toepassing van gebruikelijke goniometer-gebaseerde gegevensverzameling strategie. Volgens deze gegevens een gedeeltelijk dubbelzinnige elektronendichtheid voor de peptide ligand. Vervolgens XFEL diffractie gegevens werden bij kamertemperatuur verkregen en de structuur werd bepaald bij 2,7 A resolutie toont een duidelijke densiteit voor het ligand en de receptor 7. Deze structuur biedt een gelegenheid voor een beter begrip opioïdereceptorfunctie en selectiviteit en waardevolle inzichten voor de ontwikkeling van nieuwe analgetica. 1 R) is een GPCR die als primaire regulator van de bloeddruk. We gekristalliseerd AT 1 R in complex met een antagonist ZD7155 in LCP. Geoptimaliseerde kristallen bereikte een maximale grootte van 40 x 4 x 4 micrometer 3 met alle diffractie namelijk met niet ~ 4 A een synchrotronbron. Door het veranderen kristallisatieomstandigheden, verkregen we douches kleinere kristallen (10 x 2 x 2 pm 3), die werden gebruikt om de kamertemperatuur structuur te verkrijgen bij 2,9 A resolutie met behulp XFEL straling. Een totaal van 2.764.739 detector beelden werden verzameld om een complete dataset van ongeveer 65 ul van kristal beladen LCP overeenkomt met ongeveer 0,29 mg eiwit 9 te maken. Van het totale aantal frames, 457.275 geïdentificeerd als treffers kristal, corresponderend met een treffer percentage van 17%, waarvan 73.130 frames (16% van de hits) met succes geïndexeerd en geïntegreerd. GPCR-signaal via twee belangrijke wegen bemiddeld door ofwel G-eiwitten of arrestins. De structuur van de β 2 adrenerge receptor gebonden aan een heterotrimeer Gs-eiwit werd enkele jaren geleden 20 opgelost, terwijl de structuur van een GPCR in complex met arrestin ongrijpbaar gebleven. We verkregen kleine kristallen van een rhodopsine-arrestin fusie-eiwit in LCP dat 25-30 urn in de langste dimensie bereikt, maar ondanks uitgebreide optimalisatie, afgebogen alleen ~ 7 Resolutie A bij synchrotron bronnen. Met behulp van de LCP-SFX-methode, binnen 12 uur na XFEL beamtime, we verzamelde 22.262 kristal hits, waarvan 18.874 patronen werden met succes geïndexeerd en geïntegreerd om de resolutie grenzen van 3,8 A / 3,8 A / 3,3 A 19 anisotrope. Rhodopsine-arrestine is een zeer uitdagende eiwitcomplex dat structuurbepaling weerstaan ​​met behulp van traditionele benaderingen. De succesvolle bepaling van deze structuur heeft het enorme potentieel van bewezende LCP-SFX methode voor het aanpakken van moeilijke problemen en voorzien van een unieke kans om het mechanisme van arrestin-biased signalering in GPCRs te onderzoeken. Tenslotte naast eiwitkristallen gekweekt in de lipide fase membraan, onze monstervoorbereiding en levering methode is succesvol aangepast voor oplosbare eiwitten kristallen, waarbij LCP wordt toegepast als dragermedium voor het afleveren van kristallen, zodat we drastisch verminderen de eiwitconsumptie vereist voor structuurbepaling. Structuren van twee model eiwitten, lysozym en fycocyanine, respectievelijk opgelost 1,89 A en 1,75 A resolutie van deze werkwijze, met minder dan 0,1 mg van elk eiwit 21. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> Serotonine receptor 2B </td><td> smoothened receptor </td><td><strong&gt; Δ-opioïde receptor </td><td> Angiotensine II receptor type 1 </td><td> Rhodopsine-arrestin </td><td> lysozym </td><td> Phycocyanin </td></tr><tr><td> VOB ID </td><td> 4NC3 </td><td> 4O9R </td><td> 4RWD </td><td> 4YAY </td><td> 4ZWJ </td><td> 4ZIX </td><td> 4ZIZ </td></tr><tr><td> Totale steekproef gebruikt *, ui </td><td> 100 </td><td> 83 </td><td> 50 </td><td> 65 </td><td> 75 </td><td> 10 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> Totaal eiwit gebruikt, ug </td><td> 300 </td><td> 500 </td><td> 300 </td><td> 290 </td><td> 340 </td><td> 100 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> Gemiddelde kristalgrootte, um </td><td> 5 × 5 × 5 </td><td> &lt;5 </td><td> 5 x 2 x 2 </td><td> 10 x 2 x 2 </td><td> 5-10 </td><td> 5 x 2 x 2 </td><td> 10 × 10 × 5 </td></tr><tr><td> Hit rate,% </td><td>3.6 </td><td> 7.8 </td><td> 5.9 </td><td> 17 </td><td> 0.45 </td><td> 40 </td><td> 6.5 </td></tr><tr><td> Totaal dataverzameling tijd, hr </td><td> 10 </td><td> 8 </td><td> 4.6 </td><td> 6.4 </td><td> 12 </td><td> 0.75 </td><td> 0.67 </td></tr><tr><td> Aantal geïndexeerde patronen </td><td> 32.819 </td><td> 61.964 </td><td> 36.083 </td><td> 73.130 </td><td> 18.874 </td><td> 54.544 </td><td> 6629 </td></tr><tr><td> Space groep </td><td> C 2 2 2 1 </td><td> P 2 1 </td><td> C 2 </td><td> C 2 </td><td> P 2 1 2 1 2 1 </td><td> P 4 3 2 1 2 </td><td> H 3 2 </td></tr><tr><td> Resolutie, Å </td><td> 2.8 </td><td> 3.2 / 3.4 / 4.0 </td><td> 2.7 </td><td> 2.9 </td><td> 3,3 / 3,8 / 3,8 </td><td> 1.89 </td><td> 1.75 </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Samenvatting van het monster voorbereiding en het verzamelen van gegevens statistieken voor representatieve structuren opgelost met behulp van de LCP-SFX-methode. De hoeveelheid monster dat nodig is voor een LCP-SFX experiment afhankelijk van de kristaldiffractie kwaliteit, kristaldichtheid, de diameter van de inspuitopening, en de XFEL bundelgrootte, intensiteit en pulsherhalingsfrequentie. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/54463/54463fig1.jpg" /> Figuur 1. Stroomschema van een typische monstervoorbereiding procedure voor LCP-SFX. Voorbereiding van het monster begint met LCP kristallisatie van het doelwit eiwit in gasdichte glazen spuiten. Na kristallen worden verkregen, wordt het kristal beladen LCP geconsolideerd in één spuit en getitreerd met extra lipide, om Opname inb de overtollige neerslag oplossing. Kristallen worden vervolgens gekarakteriseerd met behulp van verschillende microscopie methoden voorafgaand aan XFEL het verzamelen van gegevens. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54463/54463fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/54463/54463fig2.jpg" /> Figuur 2. Een representatief resultaat is de structuur van 5-HT 2B in complex met ergotamine. (a) Microcrystals van 5-HT 2B / ergotamine afgebeeld met behulp van een helder-veld microscoopmodus 8. Dit cijfer is hergebruikt uit referentie 8 met het auteursrecht toestemming van Science. (B) Microcrystals van 5-HT 2B / ergotamine afgebeeld met behulp van een cross-gepolariseerde microscoop modus 8. Dit cijfer is hergebruikt uit referentie 8 met het auteursrechttoestemming Science. (c) Een cartoonvertegenwoordiging van de 5-HT 2B / ergotamine structuur verkregen door de LCP-SFX benadering. Lipiden die werden gebouwd in het model worden weergegeven in stok vertegenwoordiging. De ligand ergotamine wordt getoond in sferen representatie. Solid lijnen geven de geschatte membraan heen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54463/54463fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 3" src="/files/ftp_upload/54463/54463fig3.jpg" /> Figuur 3. Een representatief resultaat is de structuur van SMO in complex met cyclopamine. Linkerpaneel, microkristallen van SMO / cyclopamine afgebeeld met een kruis-gepolariseerd microscoopmodus 6. Dit cijfer is hergebruikt uit referentie 6 met het auteursrecht toestemming van Nature Communications. Rechts paneel, een cartoon representatieen van de WIM / cyclopamine structuur verkregen door de LCP-SFX benadering. Ligand cyclopamine is te zien in sferen representatie. Solid lijnen geven de geschatte membraan heen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54463/54463fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

We beschrijven procedures voor de bereiding en aflevering van membraaneiwitmicrokristallen in lipidische kubieke fase voor seriële kristallografie bij röntgenvrije-elektronlasers en synchrotronbronnen. Deze protocollen kunnen ook worden toegepast voor de incorporatie en aflevering van oplosbare eiwitmicrokristallen, wat leidt tot een aanzienlijk verminderde sampleconsumptie in vergelijking met vloeibare injectie.

Voorbereiding en Levering van Protein Microcrystals in lipidische Cubic fase voor Serial Femtoseconde Kristallografie

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

Het algemene doel van deze procedure is het voorbereiden van monsters van membraaneiwitkristallen in een lipidische kubische fase voor seriële kristallografische gegevensverzameling bij synchrotron- en röntgen-vrije-elektronlaserbronnen. Deze methode moet helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de structurele biologie van membraaneiwitten, zoals transport en signaaltransductie door het membraan. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de structuurbepaling van membraaneiwitten in hun natuurlijke lipidomgeving bij kamertemperatuur mogelijk maakt, met een minimaal monsterverbruik en verwaarloosbare stralingsschade.Personen die nieuw zijn met deze methode zullen moeite hebben, omdat lipidische kubische fase een viskeus, gelachtig materiaal is dat moeilijk te hanteren is zonder speciaal gereedschap en eerdere ervaring. Begin deze procedure met de reconstitutie van membraaneiwitten in de Lipidische Kubische Fase, of LCP, met behulp van spuit nummer één en nummer twee, zoals beschreven in het tekstprotocol. Nadat een transparante en homogene LCP is gevormd, wordt het gehele monster overgebracht naar Spuit Nummer Twee.Koppel spuit nummer één los terwijl de koppeling verbonden blijft met spuit nummer twee. Bevestig een verwijderbare naald aan een andere schone spuit van 100 µL, genaamd spuit nummer drie. Aspireer ongeveer 70 µL van de precipitantoplossing in deze spuit.Koppel de naald los van spuit nummer drie, terwijl de Teflon-sferule in de spuit blijft. Verbind spuit nummer twee en spuit nummer drie via de koppeling, en zorg ervoor dat de Teflon-sferules in beide spuiten correct op hun plaats zitten. Draai de koppeling voorzichtig stevig vast.Plaats de gekoppelde spuiten verticaal, met spuit nummer twee onderaan, en injecteer het eiwithoudende LCP-monster vanuit spuit nummer twee langzaam en gestaag in spuit nummer drie, totdat de LCP-streng de zuiger van spuit nummer drie raakt. Het geïnjecteerde LCP-volume zal ongeveer 1/10 deel van het oorspronkelijke precipitantvolume in spuit nummer drie bedragen. Verifieer het volume aan de hand van de schaalverdeling op beide spuiten.Koppel vervolgens spuit nummer twee los. De koppelaar is nu alleen verbonden met spuit nummer drie, waarin het monster is ondergedompeld in de neerslagoplossing. Gebruik Parafilm om spuit nummer drie volledig af te dichten, inclusief de overgang tussen zuiger en spuit, het open uiteinde van de koppelaar en de naaldmoer.Onvolledige afsluiting tijdens deze stap kan ertoe leiden dat de precipitantcondities veranderen en het monster uitdroogt. Herhaal de stappen voor het injecteren van het eiwitbevattende LCP-monster om kristallisatie op te zetten in zes extra spuiten, waarbij in totaal ongeveer 50 µL van het LCP-monster wordt gebruikt. Bewaar de afgesloten spuiten in een afsluitbare plastic zak met één of twee met water voorverzadigde pluisvrije reinigingsdoekjes om uitdroging van het monster te voorkomen.Sluit de zak af en bewaar de spuiten tijdens de kristalgroei in een incubator van 20 °C. Voor de detectie van kristallen worden de spuiten elke 12 tot 24 uur uit de incubator gehaald om de LCP-monsters direct in de spuiten te inspecteren onder een stereomicroscoop met kruisgepolariseerd licht. Identificeer kristallen als dichtgepakte glanzende deeltjes, of, in het geval van een kleinere kristalgrootte, als een uniforme gloed vanuit de LCP-filament.Plaats de verzegelde spuiten terug in de zak en bewaar deze bij 20 °C voor toekomstig gebruik. De lipidtitratiestap is noodzakelijk om de overtollige precipitante-oplossing te absorberen en om bevriezing van lipiden bij injectie in de x-ray-free electron laserstraal te voorkomen. Ongeveer één uur voor het begin van de gegevensverzameling haalt u de spuiten met de monsters uit de incubator van 20 °C.Selecteer twee tot vier spuiten voor monsterconsolidatie op basis van een vergelijkbaar kristaluiterlijk en gelijkenis in de crystallisatiecondities. Verwijder voorzichtig de Parafilm-afdichting van de geselecteerde spuiten. Verwijder de spuitkoppeling en bevestig een schone, afneembare naald aan de eerste geselecteerde spuit.Duw de zuiger voorzichtig en langzaam naar voren om het precipiteermiddel via de naald in een microcentrifugebuis te persen. Wees bij deze stap voorzichtig; het uitoefenen van een hoge druk op de zuiger kan ervoor zorgen dat een deel van de kristalhoudende LCP samen met de precipiteeroplossing wordt uitgestoten, wat leidt tot een gedeeltelijk of volledig verlies van het monster. Stop de zuiger wanneer het grootste deel van het precipiteermiddel is verwijderd en de LCP zich bij de naaldopening heeft verzameld.Voer dit proces uit voor de andere geselecteerde spuiten. Om de resulterende LCP-monsters samen te voegen, worden twee spuiten met elkaar verbonden via een schone koppeling. Druk de zuiger van één spuit in om het volledige monster van de ene spuit naar de andere over te brengen.Koppel de lege spuit los. Herhaal deze stap om al het kristalhoudende LCP-materiaal in één spuit te concentreren. Verwijder zoveel mogelijk neerslagmiddel.Voeg ongeveer 5 µL 7.9 MAG of het oorspronkelijke korterketenige MAG-gastlipide toe aan een lege spuit. Verbind deze spuit via een spuitkoppeling met de spuit met het geconsolideerde monster en meng door afwisselend op de zuigers van de spuiten te drukken. Herhaal dit proces totdat alle resterende oplossing is geabsorbeerd en een homogeen en transparant LCP is gevormd.Verplaats het volledige gemengde LCP-monster naar één spuit en koppel de lege spuit los. Bevestig een LCP-injector laadnaald aan de spuit met het geconsolideerde monster. Spuit voorzichtig ongeveer één microliter van het LCP-monster op een glazen objectglas en dek dit af met een glazen dekglas.Druk voorzichtig op het dekglas om het monster te omsluiten. Maak afbeeldingen van het LCP-monster onder een stereomicroscoop bij de hoogst mogelijke vergroting, met gebruik van helderveldverlichting en kruispolarisatoren. Maak indien mogelijk aanvullende afbeeldingen met een UV-fluorescentiemicroscoop en imager om het bestaan van eiwitmicrokristallen in het monster te bevestigen.Schat de kristalgrootte en dichtheid in. De ideale kristaldichtheid voor een data-collectieexperiment is afhankelijk van de kristalgrootte, de diameter van de röntgenbundel en de diameter van de LCP-stroom, en moet resulteren in een crystal hit rate van ongeveer 10 tot 40%. Laad tot slot de LCP-injector en voer LCP seriële femtoseconde kristallografie, of LCP SFX data-collectie, uit zoals beschreven in het tekstprotocol. Hier worden microkristallen van de serotonine-receptor in complex met ergotamine getoond, gefotografeerd met een bright-field microscoopmodus en gefotografeerd met een kruisgepolariseerde lichtmicroscoopmodus.De structuur van het serotonine-receptor-ergotaminecomplex werd verkregen via de LCP SFX-methode. Hier worden microkristallen van de smoothant-receptor in complex met cyclopamine getoond, die zijn afgebeeld met behulp van een microscoop in kruispolaire modus. De structuur van het receptor-cyclopaminecomplex werd verkregen via de LCP SFX-methode.Zodra deze procedure onder de knie is, kan deze in minder dan twee uur worden voltooid als deze correct wordt uitgevoerd. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de structuur van membraaneiwitten als doelwit, kan deze met een kleine aanpassing ook worden toegepast op andere eiwitten. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot geneesmiddelenonderzoek, aangezien structuren met een hoge resolutie uitstekende sjablonen bieden voor standaard lignaan-eiwitinteracties en helpen bij het ontwerpen van efficiëntere geneesmiddelen.

preparation-delivery-protein-microcrystals-lipidic-cubic-phase-for

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Hierin wordt beschreven de procedure geïmplementeerd in de Caffrey Membrane Structurele en Functionele Biologie Groep handmatig in te stellen tot kristallisatie onderzoeken van membraaneiwitten in lipide mesofasen.

Kristalliseren membraaneiwitten voor structuurbepaling met behulp van lipide mesofasen

De protocollen beschrijven de essentiële stappen voor het verkrijgen van diffractie kwaliteit kristallen van een membraaneiwit vanaf reconstructie van het eiwit in een lipidische kubieke fase (LCP), het vinden van de eerste voorwaarden met LCP-FRAP pre-kristallisatie assays, het opzetten van LCP kristallisatie onderzoeken en oogsten kristallen .

Kristallisatie van membraaneiwitten in lipide mesofasen

β-vat buitenmembraaneiwitten (OMP's) hebben veel functies binnen de buitenmembraan van gramnegatieve bacteriën, mitochondriën en chloroplasten. Hier hopen we een bekende knelpunt in structurele studies te verlichten door protocollen te presenteren voor de productie van β-vat OMP's in voldoende hoeveelheden voor structuurbepaling door röntgenkristallografie of NMR-spectroscopie.

Van Constructen naar Crystals - Naar Structuur Bepaling van β-barrel Outer Membrane Proteins

Een protocol wordt gepresenteerd voor röntgenkristallografie onder toepassing van eiwitmicrokristallen. Twee voorbeelden die in vivo- gegroeide microkristallen analyseren na zuivering of in cellulose worden vergeleken.

Microkristallografie van eiwitkristallen en<em&gt; In Cellulo</em&gt; Diffractie

Hier presenteren we een protocol voor gecontroleerde productie van eiwitten microcrystals. Het proces maakt gebruik van een automatische inrichting waarmee gecontroleerde manipulatie van verschillende parameters van de kristallisatie. De eiwit kristallisatie is uitgevoerd-out door gecontroleerde en automatische toevoeging van kristallisatie oplossingen terwijl monitoring en onderzoek naar de RADIUS-verdeling van de deeltjes in de kristallisatie druppel.

Groeiende eiwit kristallen met verschillende afmetingen, met behulp van geautomatiseerde kristallisatie in combinatie met In Situ Dynamische lichtverstrooiing

Dit protocol beschrijft in detail hoe te fabriceren en te exploiteren van microfluidic apparaten voor röntgendiffractie gegevensverzameling bij kamertemperatuur. Bovendien, het beschrijft hoe eiwitten kristallisatie controleren door Dynamische lichtverstrooiing en hoe om te verwerken en analyseren diffractie gegevens verkregen.

Microfluidic Chips voor In Situ Crystal röntgendiffractie en In Situ Dynamische lichtverstrooiing voor seriële kristallografie

Het succes van een time-resolved seriële femtoseconde kristallografie experiment is afhankelijk van efficiënte monster levering. We beschrijven hier protocollen voor het optimaliseren van de extrusie van de bacteriorhodopsin microcrystals van een hoge viscositeit micro-extrusie injector. De methodologie steunt op monster homogenisering met een roman drieweg koppelstuk en visualisatie met een high-speed camera.

Verbetering van de extrusie van de hoge viscositeit van Microcrystals voor Time-resolved seriële femtoseconde kristallografie aan X-ray Lasers

Het doel van dit protocol is om te demonstreren hoe seriële kristallografiemonsters kunnen worden voorbereid voor het verzamelen van gegevens op een hoge stroperige injector, Lipidico, onlangs in opdracht van de Australische synchrotron.

Lipidico Injection Protocol voor seriële kristallografie metingen bij de Australische Synchrotron

Het doel van dit artikel is om de kijker een goed begrip te geven van hoe ze hun kleine volume, dampdiffusieprotocol, voor het kweken van grote, enkele eiwitkristallen, kunnen transformeren in een grote batch microkristallisatiemethode voor seriële kristallografie.

Optimaliseren van de groei van endothiapepsine kristallen voor seriële kristallografie experimenten

Het gepresenteerde protocol beschrijft een eenvoudige aanpak voor het screenen van eiwitkristallisatieomstandigheden en kristalgroei met behulp van een 96-well high-throughput dialyseplaat. Het gebruik van dialysatorbuizen voor de grootschalige groei van microkristallen wordt ook gedemonstreerd voor seriële kristallografie en MicroED-toepassingen.

High-Throughput Eiwitkristallisatie via microdialyse

Dit protocol beschrijft een opstelling voor de kristallisatie van de steroltransporter ABCG5/G8. ABCG5/G8 wordt gereconstitueerd tot bicelles voor kristallisatie met hangende druppels. Het protocol vereist geen gespecialiseerde materialen of substraten, waardoor het toegankelijk en gemakkelijk aan te passen is in elk laboratorium voor het bepalen van de eiwitstructuur door middel van röntgenkristallografie.

ABCG5/G8-kristallisatie in een lipidenbicelle-omgeving voor röntgenkristallografie

Leer de voorbereiding en levering van membraaneiwitmicrokristallen in lipidekubische fase voor seriële femtoseconde-kristallografie. Deze methode minimaliseert sampleverbruik en stralingsschade.

Voorbereiding en Levering van Protein Microcrystals in lipidische Cubic fase voor Serial Femtoseconde Kristallografie

Meer video's verkennen