Voorbereiding en Levering van Protein Microcrystals in lipidische Cubic fase voor Serial Femtoseconde Kristallografie

Het algemene doel van deze procedure is het voorbereiden van monsters van membraaneiwitkristallen in een lipidische kubische fase voor seriële kristallografische gegevensverzameling bij synchrotron- en röntgen-vrije-elektronlaserbronnen. Deze methode moet helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de structurele biologie van membraaneiwitten, zoals transport en signaaltransductie door het membraan. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de structuurbepaling van membraaneiwitten in hun natuurlijke lipidomgeving bij kamertemperatuur mogelijk maakt, met een minimaal monsterverbruik en verwaarloosbare stralingsschade.

Personen die nieuw zijn met deze methode zullen moeite hebben, omdat lipidische kubische fase een viskeus, gelachtig materiaal is dat moeilijk te hanteren is zonder speciaal gereedschap en eerdere ervaring. Begin deze procedure met de reconstitutie van membraaneiwitten in de Lipidische Kubische Fase, of LCP, met behulp van spuit nummer één en nummer twee, zoals beschreven in het tekstprotocol. Nadat een transparante en homogene LCP is gevormd, wordt het gehele monster overgebracht naar Spuit Nummer Twee.

Koppel spuit nummer één los terwijl de koppeling verbonden blijft met spuit nummer twee. Bevestig een verwijderbare naald aan een andere schone spuit van 100 µL, genaamd spuit nummer drie. Aspireer ongeveer 70 µL van de precipitantoplossing in deze spuit.

Koppel de naald los van spuit nummer drie, terwijl de Teflon-sferule in de spuit blijft. Verbind spuit nummer twee en spuit nummer drie via de koppeling, en zorg ervoor dat de Teflon-sferules in beide spuiten correct op hun plaats zitten. Draai de koppeling voorzichtig stevig vast.

Plaats de gekoppelde spuiten verticaal, met spuit nummer twee onderaan, en injecteer het eiwithoudende LCP-monster vanuit spuit nummer twee langzaam en gestaag in spuit nummer drie, totdat de LCP-streng de zuiger van spuit nummer drie raakt. Het geïnjecteerde LCP-volume zal ongeveer 1/10 deel van het oorspronkelijke precipitantvolume in spuit nummer drie bedragen. Verifieer het volume aan de hand van de schaalverdeling op beide spuiten.

Koppel vervolgens spuit nummer twee los. De koppelaar is nu alleen verbonden met spuit nummer drie, waarin het monster is ondergedompeld in de neerslagoplossing. Gebruik Parafilm om spuit nummer drie volledig af te dichten, inclusief de overgang tussen zuiger en spuit, het open uiteinde van de koppelaar en de naaldmoer.

Onvolledige afsluiting tijdens deze stap kan ertoe leiden dat de precipitantcondities veranderen en het monster uitdroogt. Herhaal de stappen voor het injecteren van het eiwitbevattende LCP-monster om kristallisatie op te zetten in zes extra spuiten, waarbij in totaal ongeveer 50 µL van het LCP-monster wordt gebruikt. Bewaar de afgesloten spuiten in een afsluitbare plastic zak met één of twee met water voorverzadigde pluisvrije reinigingsdoekjes om uitdroging van het monster te voorkomen.

Sluit de zak af en bewaar de spuiten tijdens de kristalgroei in een incubator van 20 °C. Voor de detectie van kristallen worden de spuiten elke 12 tot 24 uur uit de incubator gehaald om de LCP-monsters direct in de spuiten te inspecteren onder een stereomicroscoop met kruisgepolariseerd licht. Identificeer kristallen als dichtgepakte glanzende deeltjes, of, in het geval van een kleinere kristalgrootte, als een uniforme gloed vanuit de LCP-filament.

Plaats de verzegelde spuiten terug in de zak en bewaar deze bij 20 °C voor toekomstig gebruik. De lipidtitratiestap is noodzakelijk om de overtollige precipitante-oplossing te absorberen en om bevriezing van lipiden bij injectie in de x-ray-free electron laserstraal te voorkomen. Ongeveer één uur voor het begin van de gegevensverzameling haalt u de spuiten met de monsters uit de incubator van 20 °C.

Selecteer twee tot vier spuiten voor monsterconsolidatie op basis van een vergelijkbaar kristaluiterlijk en gelijkenis in de crystallisatiecondities. Verwijder voorzichtig de Parafilm-afdichting van de geselecteerde spuiten. Verwijder de spuitkoppeling en bevestig een schone, afneembare naald aan de eerste geselecteerde spuit.

Duw de zuiger voorzichtig en langzaam naar voren om het precipiteermiddel via de naald in een microcentrifugebuis te persen. Wees bij deze stap voorzichtig; het uitoefenen van een hoge druk op de zuiger kan ervoor zorgen dat een deel van de kristalhoudende LCP samen met de precipiteeroplossing wordt uitgestoten, wat leidt tot een gedeeltelijk of volledig verlies van het monster. Stop de zuiger wanneer het grootste deel van het precipiteermiddel is verwijderd en de LCP zich bij de naaldopening heeft verzameld.

Voer dit proces uit voor de andere geselecteerde spuiten. Om de resulterende LCP-monsters samen te voegen, worden twee spuiten met elkaar verbonden via een schone koppeling. Druk de zuiger van één spuit in om het volledige monster van de ene spuit naar de andere over te brengen.

Koppel de lege spuit los. Herhaal deze stap om al het kristalhoudende LCP-materiaal in één spuit te concentreren. Verwijder zoveel mogelijk neerslagmiddel.

Voeg ongeveer 5 µL 7.9 MAG of het oorspronkelijke korterketenige MAG-gastlipide toe aan een lege spuit. Verbind deze spuit via een spuitkoppeling met de spuit met het geconsolideerde monster en meng door afwisselend op de zuigers van de spuiten te drukken. Herhaal dit proces totdat alle resterende oplossing is geabsorbeerd en een homogeen en transparant LCP is gevormd.

Verplaats het volledige gemengde LCP-monster naar één spuit en koppel de lege spuit los. Bevestig een LCP-injector laadnaald aan de spuit met het geconsolideerde monster. Spuit voorzichtig ongeveer één microliter van het LCP-monster op een glazen objectglas en dek dit af met een glazen dekglas.

Druk voorzichtig op het dekglas om het monster te omsluiten. Maak afbeeldingen van het LCP-monster onder een stereomicroscoop bij de hoogst mogelijke vergroting, met gebruik van helderveldverlichting en kruispolarisatoren. Maak indien mogelijk aanvullende afbeeldingen met een UV-fluorescentiemicroscoop en imager om het bestaan van eiwitmicrokristallen in het monster te bevestigen.

Schat de kristalgrootte en dichtheid in. De ideale kristaldichtheid voor een data-collectieexperiment is afhankelijk van de kristalgrootte, de diameter van de röntgenbundel en de diameter van de LCP-stroom, en moet resulteren in een crystal hit rate van ongeveer 10 tot 40%. Laad tot slot de LCP-injector en voer LCP seriële femtoseconde kristallografie, of LCP SFX data-collectie, uit zoals beschreven in het tekstprotocol. Hier worden microkristallen van de serotonine-receptor in complex met ergotamine getoond, gefotografeerd met een bright-field microscoopmodus en gefotografeerd met een kruisgepolariseerde lichtmicroscoopmodus.

De structuur van het serotonine-receptor-ergotaminecomplex werd verkregen via de LCP SFX-methode. Hier worden microkristallen van de smoothant-receptor in complex met cyclopamine getoond, die zijn afgebeeld met behulp van een microscoop in kruispolaire modus. De structuur van het receptor-cyclopaminecomplex werd verkregen via de LCP SFX-methode.

Zodra deze procedure onder de knie is, kan deze in minder dan twee uur worden voltooid als deze correct wordt uitgevoerd. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de structuur van membraaneiwitten als doelwit, kan deze met een kleine aanpassing ook worden toegepast op andere eiwitten. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot geneesmiddelenonderzoek, aangezien structuren met een hoge resolutie uitstekende sjablonen bieden voor standaard lignaan-eiwitinteracties en helpen bij het ontwerpen van efficiëntere geneesmiddelen.