Name: High-throughput, Multi-Beeld Cryohistology gemineraliseerde weefsels (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Leer een high-throughput cryohistologieplatform voor gemineraliseerde weefsels. Deze methode combineert meerdere fluorescente signalen in één preparaat voor efficiënte, observer-onafhankelijke analyse door musculoskeletale biologen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen de volgende financieringsbronnen erkennen: NIH R01-AR063702, R21-AR064941, K99-AR067283 en T90-DE021989.

<ol><li>Schofield, P. N., Vogel, P., Gkoutos, G. V., Sundberg, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+elephant%3A+histopathology+in+high-throughput+phenotyping+of+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Exploring the elephant: histopathology in high-throughput phenotyping of mutant mice.</a> Dis Model Mech. 5 (1), 19-25 (2012).</li>
<li>Adissu, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histopathology+reveals+correlative+and+unique+phenotypes+in+a+high-throughput+mouse+phenotyping+screen%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+and+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Histopathology reveals correlative and unique phenotypes in a high-throughput mouse phenotyping screen.</a> Disease Models and Mechanisms. 7 (5), 515-524 (2014).</li>
<li>Johnson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virtual+histology+of+transgenic+mouse+embryos+for+high-throughput+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Virtual histology of transgenic mouse embryos for high-throughput phenotyping.</a> PLoS Genet. 2 (4), e61(2006).</li>
<li>Ayadi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+large-scale+phenotyping+initiatives%3A+overview+of+the+European+Mouse+Disease+Clinic+%28EUMODIC%29+and+of+the+Wellcome+Trust+Sanger+Institute+Mouse+Genetics+Project%5BTitle%5D)+AND+%22Mamm.Genome%22%5BJournal%5D)">Mouse large-scale phenotyping initiatives: overview of the European Mouse Disease Clinic (EUMODIC) and of the Wellcome Trust Sanger Institute Mouse Genetics Project.</a> Mamm.Genome. 23 (9-10), 600-610 (2012).</li>
<li>Utreja, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+and+matrix+response+of+temporomandibular+cartilage+to+mechanical+loading%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthr+Cartil%22%5BJournal%5D)">Cell and matrix response of temporomandibular cartilage to mechanical loading.</a> Osteoarthr Cartil. 24 (2), 335-344 (2016).</li>
<li>Dyment, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gdf5+progenitors+give+rise+to+fibrocartilage+cells+that+mineralize+via+hedgehog+signaling+to+form+the+zonal+enthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.Biol%22%5BJournal%5D)">Gdf5 progenitors give rise to fibrocartilage cells that mineralize via hedgehog signaling to form the zonal enthesis.</a> Dev.Biol. 405 (1), 96-107 (2015).</li>
<li>Lalley, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+biomechanical+and+biological+outcomes+in+the+MRL%2FMpJ+murine+strain+following+a+full-length+patellar+tendon+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.Orthop.Res%22%5BJournal%5D)">Improved biomechanical and biological outcomes in the MRL/MpJ murine strain following a full-length patellar tendon injury.</a> J.Orthop.Res. 33 (11), 1693-1703 (2015).</li>
<li>Breidenbach, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ablating+hedgehog+signaling+in+tenocytes+during+development+impairs+biomechanics+and+matrix+organization+of+the+adult+murine+patellar+tendon+enthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.Orthop.Res%22%5BJournal%5D)">Ablating hedgehog signaling in tenocytes during development impairs biomechanics and matrix organization of the adult murine patellar tendon enthesis.</a> J.Orthop.Res. 33 (8), 1142-1151 (2015).</li>
<li>Ushiku, C., Adams, D., Jiang, X., Wang, L., Rowe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+Bone+Fracture+Repair+in+Mice+Harboring+GFP+Reporters+for+Cells+within+the+Osteoblastic+Lineage%5BTitle%5D)+AND+%22J.Orthop.Res%22%5BJournal%5D)">Long Bone Fracture Repair in Mice Harboring GFP Reporters for Cells within the Osteoblastic Lineage.</a> J.Orthop.Res. 28 (10), 1338-1347 (2010).</li>
<li>Matthews, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+asMA-labeled+progenitor+cell+commitment+identifies+notch+signaling+as+an+important+pathway+in+fracture+healing%5BTitle%5D)+AND+%22J.Bone+Miner.Res%22%5BJournal%5D)">Analysis of asMA-labeled progenitor cell commitment identifies notch signaling as an important pathway in fracture healing.</a> J.Bone Miner.Res. 29 (5), 1283-1294 (2014).</li>
<li>Dyment, N. A., Hagiwara, Y., Jiang, X., Huang, J., Adams, D. J., Rowe, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+knee+fibrocartilage+to+joint+destabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Response of knee fibrocartilage to joint destabilization.</a> Osteoarthritis Cartilage. 23 (6), 996-1006 (2015).</li>
<li>Grcevic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+fate+mapping+identifies+mesenchymal+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">In vivo fate mapping identifies mesenchymal progenitor cells.</a> Stem Cells. 30 (2), 187-196 (2012).</li>
<li>Hong, S. H., Jiang, X., Chen, L., Josh, P., Shin, D. G., Rowe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer-Automated+Static%2C+Dynamic+and+Cellular+Bone+Histomorphometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Sci+Eng%22%5BJournal%5D)">Computer-Automated Static, Dynamic and Cellular Bone Histomorphometry.</a> J Tissue Sci Eng. Suppl 1, 004(2012).</li>
<li>Matthews, B. G., Torreggiani, E., Roeder, E., Matic, I., Grcevic, D., Kalajzic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteogenic+potential+of+alpha+smooth+muscle+actin+expressing+muscle+resident+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Osteogenic potential of alpha smooth muscle actin expressing muscle resident progenitor cells.</a> Bone. 84, 69-77 (2016).</li>
<li>Hagiwara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation+stability+dictates+the+differentiation+pathway+of+periosteal+progenitor+cells+in+fracture+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J.Orthop.Res%22%5BJournal%5D)">Fixation stability dictates the differentiation pathway of periosteal progenitor cells in fracture repair.</a> J.Orthop.Res. 33 (7), 948-956 (2015).</li>
<li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+analysis+of+GFP+expression+in+murine+bone%5BTitle%5D)+AND+%22J.Histochem.Cytochem%22%5BJournal%5D)">Histological analysis of GFP expression in murine bone.</a> J.Histochem.Cytochem. 53 (5), 593-602 (2005).</li>
<li>Nissanov, J., Bertrand, L., Tretiak, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryosectioning+distortion+reduction+using+tape+support%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.Res.Tech%22%5BJournal%5D)">Cryosectioning distortion reduction using tape support.</a> Microsc.Res.Tech. 53 (3), 239-240 (2001).</li>
<li>Kawamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+new+adhesive+film+for+the+preparation+of+multi-purpose+fresh-frozen+sections+from+hard+tissues%2C+whole-animals%2C+insects+and+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.Histol.Cytol%22%5BJournal%5D)">Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants.</a> Arch.Histol.Cytol. 66 (2), 123-143 (2003).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Hier hebben we presenteerde een gedetailleerd cryohistology protocol om samen te lokaliseren en te kwantificeren diverse biologische maatregelen door het gelijktrekken van beelden van meerdere rondes van vlekken / beeldvorming op een enkele sectie. De werkwijze beschreven met behulp van de cryotape is vooral handig als het de morfologie van moeilijk te vinden in hoofdstuk weefsel (bijv gemineraliseerd bot en kraakbeen) onderhoudt. Bovendien wordt het doorgesneden weefsel stevig gehecht op het glaasje, waardoor ...

Biologisch onderzoek vereist vaak efficiënt fenotypering, die vaak is geassocieerd met een soort van histologische analyse 1-3. Deze behoefte is nog duidelijker bij de ambitieuze projecten voor elk gen in de muis genoom 4 verstoren. Deze histologische analyses kunnen variëren van het beoordelen celmorfologie en / of anatomische kenmerken te brengen expressie van specifieke genen of eiwitten aan individuele cellen. In feite is een van de fundamentele bijdragen van histologie op het gebied van genomica is de mogelijkheid om een ​​specifieke moleculaire signaal koppelen aan een specifieke regio of celtype. Traditionele methoden van histologie, vooral voor musculoskeletale weefsels, zijn vaak tijdrovend en moeizaam, die soms weken op te lossen, ontkalken, sectie, vlek, beeld en het monster vervolgens analyseren van de beelden via menselijke interpretatie. Het analyseren van meerdere moleculaire signalen, hetzij via immunohistochemie, in situ hybridization, of speciale vlekken, vereist meerdere secties en zelfs meerdere specimens adequaat presteren. Bovendien, deze meerdere reacties kunnen niet gelijktijdig worden gelokaliseerd aan dezelfde cel en soms niet gelijktijdig gelokaliseerd in een bepaald gebied in een gegeven monster. Als het veld genomics en epigenomics verplaatst naar het digitale tijdperk, moet de histologische veld ook volgen op efficiënte, hoge doorvoer en geautomatiseerde analyse van moleculaire signalen in een histologische sectie verschaffen. Inderdaad is er een behoefte aan verbeterde histologische technieken die meerdere moleculaire signalen kunnen koppelen aan specifieke cellen in een gegeven monster. Onlangs hebben we een nieuwe high-throughput cryohistological methode voor het bepalen van een aantal bestrijdingsmaatregelen binnen een bepaalde sectie van gemineraliseerd weefsel 14/05 gepubliceerd. Het proces omvat het stabiliseren van de cryosectie met bevroren cryotape, hechten van de afgeplakte gedeelte vast aan een microscoop glijbaan, engeleidende verschillende rondes van kleuring en beeldvorming op elke sectie. Deze rondes van beelden worden vervolgens uitgelijnd met de hand of via de computer automatisering voorafgaand aan beeldanalyse (figuur 1). Hier presenteren we gedetailleerde protocollen van dit proces en voorbeelden waarbij deze technieken ons begrip van verschillende biologische processen verbeterd.

<table><tbody><tr><td>10% neutraal gebufferd formalin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT501128-4L</td><td>Meerdere leveranciers beschikbaar. Giftig. Kan worden vervangen door 4% paraformaldehyde.</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9378</td><td>Meerdere leveranciers beschikbaar.</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5368</td><td>Meerdere leveranciers beschikbaar.</td></tr><tr><td>Cryomolds</td><td>Fisher Scientific</td><td>Fisherbrand #22-363-554</td><td>Er kunnen verschillende maten worden gebruikt, afhankelijk van het weefsel</td></tr><tr><td>Cryomatrix</td><td>Thermo Scientific</td><td>6769006</td><td>Kan worden vervangen door andere cryomatrices. PVA/PEG-gebaseerde harsen hebben echter het beste gewerkt in onze handen.</td></tr><tr><td>2-methyl-butaan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M32631</td><td>Meerdere leveranciers beschikbaar.</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica Biosystems</td><td>3050s</td><td>Kan worden vervangen door andere merken/modellen.</td></tr><tr><td>Specimen disc</td><td>Leica Biosystems</td><td>14037008587</td><td>Kan worden vervangen door andere merken/modellen.</td></tr><tr><td>Cryostat blades</td><td>Thermo Scientific</td><td>3051835</td><td>Kan worden vervangen door andere merken/modellen.</td></tr><tr><td>Cryotape</td><td>Section Lab</td><td>Cryofilm 2C</td><td></td></tr><tr><td>Roller</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>62800-46</td><td>Kan worden vervangen door andere merken/modellen.</td></tr><tr><td>Kunststof microscoopglazen</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71890-01</td><td>Kan worden vervangen door andere merken/modellen.</td></tr><tr><td>Glazen microscoopglazen</td><td>Thermo Scientific</td><td>3051</td><td>Kan worden vervangen door andere merken/modellen.</td></tr><tr><td>Norland Optical Adhesive, 61</td><td>Norland Optical</td><td>Norland Optical Adhesive, 61</td><td></td></tr><tr><td>UV Black Light</td><td>General Electric</td><td>F15T8-BLB</td><td></td></tr><tr><td>Glazuur azijnzuur</td><td>Sigma Aldrich</td><td>ARK2183</td><td>Meerdere leveranciers beschikbaar.</td></tr><tr><td>Chitosan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3646</td><td>Meerdere leveranciers beschikbaar.</td></tr><tr><td>InSpeck rode microscoopbolletjes</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>I-14787</td><td></td></tr><tr><td>InSpeck groene bolletjes</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>I-14785</td><td></td></tr><tr><td>Calcein Blauw</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1255</td><td>Meerdere leveranciers beschikbaar.</td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0875&nbsp;</td><td>Meerdere leveranciers beschikbaar.</td></tr><tr><td>Alizarine complexon</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3882&nbsp;</td><td>Meerdere leveranciers beschikbaar.</td></tr><tr><td>Demeclocycline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6140&nbsp;</td><td>Meerdere leveranciers beschikbaar.</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td>Meerdere leveranciers beschikbaar.</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5516</td><td>Meerdere leveranciers beschikbaar.</td></tr><tr><td>ELF 97 gele fluorescente zure fosfatase substraat</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>E-6588</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>62247</td><td>Meerdere leveranciers beschikbaar. Kan worden vervangen door Hoechst 33342 of andere nucleaire kleurstoffen.</td></tr><tr><td>TO-PRO-3 (Cy5 nucleaire tegenkleuring)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T3605</td><td></td></tr><tr><td>Propidiumjodide</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R37108</td><td>Meerdere leveranciers beschikbaar.</td></tr><tr><td>Natriumacetaat anhydrous</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2889</td><td>Meerdere leveranciers beschikbaar.</td></tr><tr><td>natriumtartraat dibasisch dihydraat&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6521</td><td>Meerdere leveranciers beschikbaar.</td></tr><tr><td>Natriumnitriet</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2252</td><td>Meerdere leveranciers beschikbaar.</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma Aldrich</td><td>15504</td><td>Meerdere leveranciers beschikbaar.</td></tr><tr><td>MgCl2 hexahydraat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9272</td><td>Meerdere leveranciers beschikbaar.</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td>Meerdere leveranciers beschikbaar.</td></tr><tr><td>Fast Red TR Salt</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8764</td><td>Meerdere leveranciers beschikbaar. Kan ook worden vervangen door andere substraatkits zoals Vector Blue (Vector Laboratories, Cat# SK-5300)</td></tr><tr><td>Naftol AS-MX&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N4875</td><td>Meerdere leveranciers beschikbaar.</td></tr><tr><td>N,N dimethylformamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D158550</td><td>Meerdere leveranciers beschikbaar.</td></tr><tr><td>Toluidine blauw O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3260</td><td>Meerdere leveranciers beschikbaar.</td></tr><tr><td>Axio Scan.Z1</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>Axio Scan.Z1</td><td>Ook andere lineaire of betegelde scanners kunnen worden gebruikt.</td></tr><tr><td>DAPI Filter Set</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49000</td><td></td></tr><tr><td>CFP Filter Set</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49001</td><td></td></tr><tr><td>GFP Filter Set</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49020</td><td></td></tr><tr><td>YFP Filter Set</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49003</td><td></td></tr><tr><td>Aangepaste gele (ELF 97) Filter Set</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>custom; HQ409sp, HQ555/30m, 425dxcr</td><td></td></tr><tr><td>TRITC Filter Set</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49004</td><td></td></tr><tr><td>Cy5 Filter Set</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49009</td><td></td></tr><tr><td>CryoJane Tape Transfer System</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>62800-10</td><td>Meerdere leveranciers beschikbaar.</td></tr><tr><td>CryoJane Tape Windows</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>62800-72</td><td>Meerdere leveranciers beschikbaar.</td></tr><tr><td>CryoJane Adhesive Slides</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>62800-4X</td><td>Meerdere leveranciers beschikbaar.</td></tr></tbody></table>

high-throughput, multi-beeld cryohistology gemineraliseerde weefsels

High-Throughput, Multi-Image Cryohistology of Mineralized Tissues

Er is een toenemende behoefte aan efficiënt fenotypering en histopathologie van verschillende weefsels. Deze behoefte aan fenotypering is duidelijk met de ambitieuze projecten om elk gen in het muizengenoom te verstoren. De onderzoeksgemeenschap heeft snelle en goedkope middelen nodig om weefsels via histologie te fenotyperen. Histologische analyses van skeletweefsels zijn vaak tijdrovend en op zijn best semi-kwantitatief, en vereisen regelmatig subjectieve interpretatie van dia's door getrainde personen. Hier presenteren we een cryohistologisch paradigma voor efficiënte en goedkope fenotypering van gemineraliseerde weefsels. Ten eerste presenteren we een nieuwe methode van tape-gestabiliseerde cryosectionering die de morfologie van gemineraliseerde weefsels behoudt. Deze secties worden vervolgens stijf op glazen dia's geplakt en herhaaldelijk geïmagineerd over verschillende rondes van kleuring. De resulterende beelden worden vervolgens handmatig of via computersoftware uitgelijnd om samengestelde stapels van verschillende gelaagde beelden op te leveren. Het protocol maakt co-lokalisatie mogelijk van talrijke moleculaire signalen naar specifieke cellen binnen een bepaalde sectie. Bovendien kunnen deze fluorescente signalen objectief worden gekwantificeerd via computersoftware. Dit protocol overwint veel van de tekortkomingen geassocieerd met histologie van gemineraliseerde weefsels en kan dienen als een platform voor hoog-doorvoer, hoog-inhoud fenotypering van musculoskeletale weefsels in de toekomst.

Een algemene Workflow voor de High-throughput, Multi-Beeld Cryohistology Figuur 1 het algemene werkschema voor deze techniek. Het omvat verschillende stappen van fixatie door verschillende rondes van beeldvorming en uiteindelijk beelduitlijning / analyse. De werkwijze kan vaak minder dan een week te gaan van monster fixatie tot 4 rondes van beeldvorming, die minder tijd dan nodig is om dit soo...

In dit manuscript presenteren we een hoogdoorvoerige, semi-geautomatiseerde cryohistologieplatform om gealignde composietbeelden te produceren van meerdere responsmaatregelen uit verschillende rondes van fluorescentiebeeldvorming op bevroren secties van gemineraliseerde weefsels.

High-throughput, Multi-Beeld Cryohistology gemineraliseerde weefsels

There is an increasing need for efficient phenotyping and histopathology of a variety of tissues. This phenotyping need is evident with the ambitious ...

Het doel van deze technologie is om histologische instrumenten te leveren die complexe modelsystemen integreren op een high-throughput, waarnemer-onafhankelijke en volledig digitale manier die zowel kosteneffectief als betekenisvol is voor biologen in het musculoskeletale vakgebied. Histologie is, hoewel cruciaal voor de meeste biologische onderzoekers, vaak arbeidsintensief en niet-kwantitatief. Daarom is er behoefte aan histologische technieken die zorgen voor een efficiënte, high-throughput en geautomatiseerde analyse.Met ons cryohistologieplatform kan de onderzoeker meerdere molecro-signalen koppelen aan specifieke cellen binnen een bepaald preparaat door dezelfde slide meerdere keren in een high-throughput-methode te beelden en te kleuren. De procedure zal worden gedemonstreerd door Dr. Xi Jiang en Li Chen, onderzoekassistenten in mijn laboratorium, die pioniers zijn geweest in de ontwikkeling en uitvoering van deze technieken. Om deze procedure te starten, verwijdert u het preparaat uit de formaline, snijdt u overtollig weefsel weg en brengt u het over naar 30% sucrose, bereid in 1x PBS.Incubeer de specimens in sucrose gedurende 12 tot 24 uur bij vier graden Celsius. Vul vervolgens een cryovorm met cryo-inbeddingsmedium en plaats de specimens in de vorm. Richt de monsters in de vorm vervolgens zo uit dat het snijvlak voor het interessegebied parallel loopt aan de bodem van de vorm.Plaats daarna de cryovorm op een stuk droogijs totdat een dunne laag cryo-insluitingsmedium bevriest, waardoor de monsters op hun plaats worden vastgezet. Vul vervolgens het resterende volume van de cryovorm met cryo-insluitingsmedium, terwijl de cryovorm op het droogijspellet blijft staan. Plaats daarna de cryovorm in een container met 2-methylbutaan dat is voorgekoeld met droogijs.Zodra de monsters volledig bevroren zijn, verwijdert u de cryomallen en schudt u het overtollige 2-methylbutaan eraf. Wikkel de cryomal in cellofaan en bewaar deze bij -20 °C of -80 °C. Verplaats in deze procedure het monsterblok vanuit de vriezer naar een cryostaat die is ingesteld op -20 tot -25 °C.Verwijder vervolgens het blok uit de cryomallen en snijd het overtollige cryo-inbeddingsmedium weg met een scheermesje. Voeg daarna wat cryo-inbeddingsmedium toe aan de specimen-schijf en richt het blok zo uit dat het oppervlak van de specimen-schijf parallel loopt aan het onderste oppervlak van het blok. Wacht tot het cryo-inbeddingsmedium is bevroren.Plaats vervolgens de specimen-schijf op de specimenhouder en stel de houder zo in dat het mes parallel aan het oppervlak van het specimenblok snijdt. Snijd daarna stukken cryotape af om het interessegebied te bedekken en koel deze vooraf af in de cryostaat. Trim vervolgens het blok tot een niveau binnen het interessegebied, waarbij u indien nodig verdere aanpassingen aanbrengt.Zodra het interessegebied is bereikt en er een coupesectie kan worden gemaakt, worden eventuele spanen van het oppervlak van het blok geborsteld. Verwijder vervolgens de niet-adherente achterzijde van de cryotape door de tape vast te pakken bij de niet-plakkerige zilverkleurige/gouden lipjes. Plaats de tape daarna met de plakzijde naar beneden op het blok.Oefen met de roller druk uit op de cryotape en maak een coupesectie met behulp van de automatische motor of het handmatige snijwiel van de cryostaat. Plaats vervolgens de sectie met de weefselzijde naar boven op een plastic microscoopglaasje in de cryostaat. Verwijder het plastic glaasje uit de cryostaat en laat het cryo-inbeddingsmedium smelten, zodat de sectie aan het oppervlak van het glaasje hecht.Herhaal het snijden voor de seriesneden of andere regio's van belang. Plaats de coupes na voltooiing in een objectglaskasje en bewaar ze bij 4, -20 of -80 °C, afhankelijk van de vereiste bewaartermijn en de stroomafwaartse responsvariabelen. Om de methode met UV-uithardende lijm uit te voeren, dient u eerst het objectglas te labelen.Breng een druppel UV-geactiveerde optische lijm aan op twee glazen objectglazen en gebruik de rand van een objectglas om een dunne laag lijm over het oppervlak van de glazen objectglazen te verspreiden. Snijd vervolgens het zilver-gouden tabblad af en leg het getapte weefselgedeelte met de weefselzijde naar boven op de lijmlaag van het eerste objectglas. Breng het gedeelte aan met een rollende beweging van de ene rand naar de andere om de vorming van ingesloten luchtbellen onder de tape te minimaliseren.Verwijder vervolgens het afgeplakte gedeelte van de eerste objectglasplaat, plaats dit op de adhesielaag van de tweede objectglasplaat en zorg ervoor dat er geen luchtbellen worden ingesloten. Zodra het juiste aantal coupes voor het betreffende experiment op elk objectglas is geplaatst, wordt het overtollige plakmiddel van de omliggende gebieden afgeveegd. Inspecteer daarna de coupes nauwkeurig op de aanwezigheid van luchtbellen of vezels onder de tape.Plaats vervolgens de microscoopglaasjes vijf tot tien minuten onder het UV-zwartlicht om de adhesielaag te crosslinken. Bereid in deze stap de referentiemarkeroplossing voor door 50 µL groene en 50 µL rode microsferen op te lossen in 100 µL water. Bewaar de oplossing in het donker bij 4 °C.Doop vervolgens een pipetpunt in de microsfeeroplossing en breng de microsfeeroplossing aan op elke sectie, naast het gebied van belang. Droog de objectglazen daarna bij kamertemperatuur en bescherm ze tegen licht door ze 30 minuten met folie af te dekken, indien de objectglazen die dag worden verwerkt. Plaats de objectglazen anders in een objectglazenbak bij vier graden Celsius.Nadat de coupes zijn gekleurd, worden de dekglasjes op de objectglazen gemonteerd met een geschikt montagemedium. Voor de beeldvorming worden de objectglazen in de microscoopbakken geplaatst en worden de bakken in de bakstapel van de slide-scanning microscoop geschoven. Klik vervolgens op de profiellijst in de microscoopsoftware om voor elk objectglas een profiel te laden met de juiste belichtingstijd voor elke fluorofoor.Klik op de knop Start Preview Scan om een voorbeeldbeeld van elke slide te maken. De software wijst automatisch een bestandsnaam toe door de barcodes op de slidelabels te lezen. Alternatief kan er handmatig een bestandsnaam aan elke slide worden toegewezen.Stel de regio's van interesse (regions of interest) in door de wezenhulp voor weefseldetectie te openen, elke regio te tekenen met het tekengereedschap, eventuele noodzakelijke aanpassingen door te voeren en deze op te slaan voor volgende imaging-rondes. Zodra elk objectglas is ingesteld, start u het scanproces door op de knop Start Scan te klikken. Dompel de objectglazen na elke imaging-ronde onder in een Coplin-pot gevuld met 1x PBS totdat de dekglasjes van de objectglazen afvallen, alvorens over te gaan naar de volgende kleuringsstap.Nadat alle imaging-rondes zijn voltooid, exporteert u de beelden van elk individueel kanaal als TIF- of JPG-bestanden voor beeldassemblage en analyse. In deze figuur is een sectie van een dijbeen van een drie maanden oude muis gekleurd met calcein blue en gefotografeerd voor geaccumuleerd mineraal, zichtbaar in het wit, en mineralisatielabels, zichtbaar in het groen en rood in de eerste imaging-ronde. De coupes werden vervolgens gefotografeerd voor TRAP-activiteit, zichtbaar in het geel in de tweede ronde, en AP-activiteit, zichtbaar in het rood in de derde imaging-ronde.Ten slotte werden de coupes in de vierde ronde gekleurd met toluidineblauw. De referentiemarkers werden tijdens elke beeldrond, inclusief de chromogene ronde, gefotografeerd en werden uitgelijnd met behulp van de aangepaste software. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in minder tijd worden uitgevoerd dan nodig is voor de decalcificatie van een typisch specimen.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u beelden met een hoge inhoud en hoge kwaliteit van gemineraliseerde weefsels kunt produceren, waarvan we hopen dat ze breder kunnen worden toegepast door de musculoskeletale gemeenschap.

high-throughput-multi-image-cryohistology-of-mineralized-tissues

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Er wordt een strategie gepresenteerd om histologisch data in het beenmerg kwantitatief te analyseren. Confocale microscopie van fluorescent gelabelde cellen in weefselsecties resulteert in 2-dimensionale beelden, die automatisch worden geanalyseerd. Co-lokalisatieanalyses van verschillende celtypen worden vergeleken met gegevens van gesimuleerde beelden, waardoor kwantitatieve informatie over cellulaire interacties wordt verkregen.

Geautomatiseerde kwantificering van hematopoietische cellen - stromale cel interacties in histologische afbeeldingen van ontkalkte Bone

Dit werk presenteert een nieuw verwerkings- en beeldprotocol voor dikke, driedimensionale weefsel doorsnede analyse die de volledige exploitatie van confocale beeldvormingsmodaliteiten mogelijk maakt. Dit protocol behoudt de antigeniciteit en vertegenwoordigt een robuust systeem om huidhistologie en mogelijk andere weefstypen te analyseren.

Horizontale gehele berging: Een nieuw verwerkings- en beeldprotocol voor dikke, driedimensionale weefsel dwarsdoorsneden van de huid

Dit protocol is gericht op specifieke cellen in weefsels voor beeldvorming op de nanoschaal resolutie met behulp van een Scannende Elektronen Microscoop (SEM). Groot aantal seriële secties uit biologisch materiaal hars-embedded zijn eerste beeld in een lichte Microscoop te identificeren van het doel, waarna in een hiërarchische wijze in de SEM.

Multimodale hiërarchische beeldvorming van seriële secties voor het vinden van specifieke cellulaire doelen binnen grote Volumes

Hier presenteren we een protocol voor het combineren van twee monster verwerkingstechnieken, hogedruk bevriezing en magnetron-bijgewoonde monster verwerking, gevolgd door minimaal hars inbedding voor het verkrijgen van gegevens met een gerichte ion beam scannende elektronen microscoop (FIB-SEM). Dit is aangetoond door middel van een muis nervus monster en Caenorhabditis elegans.

Bereiding van de biologische monsters door hogedruk bevriezing, magnetron-bijgewoonde contrastverbetering, en minimale hars inbedding voor Volume Imaging

Deze methode beschrijft het gebruik van het R26R-Confetti (Confetti) muismodel om gemineraliseerde weefsels te bestuderen, die alle stappen van de fokstrategie naar het beeld acquirements bedekken. Inbegrepen is een algemeen protocol dat kan worden toegepast op alle zachte weefsels en een gemodificeerd protocol dat kan worden toegepast op gemineraliseerde weefsels.

Klonale genetische tracing met de confetti muis om gemineraliseerde weefsels te bestuderen

We beschrijven een snelle kleuringsmethode om multispectrale beeldvorming op bevroren weefsels uit te voeren.

Een snelle methode voor multispectrale fluorescentiebeeldvorming van bevroren weefselsecties

Dit protocol presenteert een uitgebreide pijplijn voor het analyseren van monsters die zijn verkregen uit menselijke harten die de microscopische en macroscopische schaal overspannen.

Pijplijn voor driedimensionale anatomische studie op meerdere schaal van het menselijk hart

De combinatie van iteratief-bleken-extends-multiplexity (IBEX) en een commerciële nucleotide-labelingtest (Click-iT EdU) maakt de detectie en categorisatie van delende celtypen mogelijk in zeer dynamische processen in gefixeerde ingevroren muizenweefselsecties. Bovendien biedt een nieuwe open-source beeldverwerkingspijplijn beeldacquisitie en -analyse met hoge doorvoer.

High-throughput beeldvormings- en analyseworkflow voor het evalueren van fenotypes en proliferatietoestanden van huidcellen in weefselmonsters

Het netvlies vertoont een complexe ruimtelijke organisatie over zijn laminaire structuur. Moderne ruimtelijke transcriptomics en sequencingtechnieken vereisen weefselcoupes &lt; 20 μm dik, waardoor hun toepasbaarheid voor retinaal onderzoek wordt beperkt. Deze vers ingevroren cryosectiemethode produceert dunne delen van het netvlies van de muis met behoud van vlakke ruimtelijke relaties, waardoor uitgebreide moleculaire kartering over laminae mogelijk is.

En gezicht Cryosectie van het netvlies van de muis voor hoogdimensionale ruimtelijke moleculaire analyse

Dit protocol omvat een stapsgewijze workflow voor verkalkte vasculaire monsters: weefselbehandeling, decalcificatie, RNA-validatie, detectie van calcificatieniveaus en strategieën voor het selecteren van interessegebieden op de Nanostring GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP). Het doel is om een uitgebreide methode te presenteren voor het behouden van vasculaire weefselmorfologie en RNA voor betrouwbare ruimtelijke transcriptomische analyse.

Voorbereiding en verwerking van verkalkte slagader met geconserveerde morfologie en RNA voor digitale ruimtelijke profilering

Dit protocol standaardiseert cryo-elektrontomografie (cryo-ET) voor dik weefsel door hogedrukbevriezing (HPF) te integreren met de wafelmethode, cryogene focus ion beam (cryo-FIB) lift-out en dosissymmetrische, parallelle acquisitie, waardoor uniform dunne lamellen en gevitrificeerde monsters worden opgeleverd voor reproduceerbare in situ-analyse in de hippocampus van de muis.

Cryo-elektrontomografie workflow voor dik weefsel aangetoond bij de muishippocampus

Leer een high-throughput cryohistologieplatform voor gemineraliseerde weefsels. Deze methode combineert meerdere fluorescente signalen in één preparaat voor efficiënte, observer-onafhankelijke analyse door musculoskeletale biologen.

High-throughput, Multi-Beeld Cryohistology gemineraliseerde weefsels

Meer video's verkennen