Fabriceren van afbreekbaar Thermoresponsive Hydrogels op meerdere lengte schalen via reactieve extrusie, Microfluidics, zelf-assemblage en Electrospinning
16 april 2018
Protocollen zijn beschreven voor de fabrikatie van afbreekbaar thermoresponsive hydrogels op basis van het hydrazon cross-linking van polymere oligomeren op de schaal van de bulk, microscale, en nanoscale, de laatste voorbereiding van zowel de nanofibers als de gel nanodeeltjes.
Het algemene doel van dit protocol is om afbreekbare versies van thermoresponsieve hydrogels te fabriceren met gecontroleerde lengte- en vormschalen en -geometrieën. Deze methode kan helpen bij het aanpakken van belangrijke uitdagingen in het scenario van biomedische materialen, zoals het vergemakkelijken van langdurige, minimaal invasieve lokale geneesmiddelafgifte, het creëren van responsieve scaffolds voor weefselengineering, of het ontwerpen van gerichte nanotherapieën. Het belangrijkste voordeel van onze techniek is een snelle omgekeerde biohydrazoonchemie die ons in staat stelt de grootte en vorm van de afbreekbare hydrogels te controleren door de menggeometrie van de polymeervoorloper te veranderen.
Deze flexibiliteit stelt ons in staat om foliumgels, microgels, nanogels en nanovezels allemaal met hetzelfde uitgangsmateriaal te fabriceren. Bereid eerst ongeveer twee milliliter hydrazide en aldehyde-gefunctionaliseerde thermoresponsieve voorloperpolymeeroplossingen voor met concentraties tussen vijf en 40% gewicht en 10 millimolair fosfaatgebufferd zoutoplossing. Gebruik enkele cilinders om de voorloperpolymeeroplossingen in afzonderlijke cilinders van een 2,5 milliliter, 1:1 dubbelcilinderspuit te laden.
Verbind vervolgens een 1,5 inch statische menger aan een 2,5 milliliter 1:1 dubbelcilinderspuit. Bevestig indien gewenst een 18 gauge of 20 gauge 1,5 inch naald aan de statische menger. Snijd vervolgens een stuk zacht siliconenrubber van de gewenste dikte.
Een stuk ongeveer zo groot als een standaard microscoopglas. Gebruik een ponsset om ten minste één gat van de gewenste vorm in het siliconenrubbersjabloon te ponsen. Plaats het siliconenrubbersjabloon op een schone glazen plaat, en zorg ervoor dat alle gaten door het glas worden ondersteund.
Druk het sjabloon voorzichtig tegen de plaat om het op zijn plaats te fixeren. Siliconenrubber kan ook worden gebruikt als ondergrond om een goede adhesieve eigenschap van het substraat te garanderen. Co-extrudeer de hydrazide en aldehyde gefunctionaliseerde polymeeroplossingen door de statische menger in de putjes van de mal totdat de putjes volledig zijn gevuld.
Dek de mal af met een tweede schone, glazen plaat en wacht tot de geleertijd is verstreken. Verwijder vervolgens de bovenste plaat en gebruik een spatel om de hydrogels van de siliconenrubbermal te scheiden. Til de mal van de plaat om de hydrogels te recupereren.
Voor de procedure een microfluïdische chip fabriceren voor de microdeelgeneratie. Synthetiseer hydrazide en aldehyde gefunctionaliseerd poly NIPAM. Om te beginnen, bereid twee milliliter van elk 6% gewichtsoplossingen van hydrazide en aldehyde gefunctionaliseerd poly NIPAM in gedeïoniseerd water voor.
Laad de polymeervoorloperoplossingen in afzonderlijke vijf milliliter spuiten. Bereid vervolgens 150 milliliter van een 1% gewichtsoplossing van sorbitan monooleaat in zware paraffine olie. Laad deze oplossing in twee standaard 60 milliliter spuiten.
Monteer de vier spuiten in afzonderlijke infuuspompjes. Verbind vervolgens een 45 centimeter lengte van siliconenslang aan de uitlaat van de microfluïdische chip. Plaats het uiteinde van de uitlaatslang in een afvalinische.
Verbind de polymeeroplossingsspuiten aan de polymeerinlaatkanalen op de microfluïdische chip met 30 centimeter lengte van siliconenslang. Verbind een paraffineoplosningspuit aan het stroomopwaartse oolinlaatkanaal met siliconenslang. Verbind de andere oliespuit aan beide stroomafwaartse oolinlaatkanalen met behulp van siliconenslang en een U-vormige spuitslangverbinding.
Stel de stromingssnelheden van de pompen uitgerust met oliespuiten in op tussen 1,1 en 5,5 milliliter per uur. Laat olie gedurende ten minste 30 minuten door de microfluïdische chip stromen om de chip te primen en om te bevestigen dat de chip defectvrij is. Lever vervolgens beide polymeeroplossingen tegelijkertijd aan de geprimede chip met 0,3 mL per uur.
Laat het stromen van polymeer en olie gedurende 30 minuten tot een uur gelijkmatig zijn. Om voortijdige gelering van de voorloperpolymeren bij de microfluïdische spuitmond te voorkomen, is het essentieel om de slang zorgvuldig te primen en het stromen van polymeer exact tegelijkertijd te starten om terugstroming in een van de polymeerreservoirs te voorkomen. Zodra uniforme gelmicrodeeltjes zich vormen bij de spuitmond van de microfluïdische chip, verzamel de deeltjes in een plastic centrifugeerbuis met een actieve magnetische roerstaaf.
Stop de spuitpompen en de roermotor wanneer de olie is verbruikt. Zodra de gelmicrodeeltjes in de buis zijn bezonken, giet de paraffine olie met een pipet af. Voeg voor elke 5 mL microdeeltjes 10 milliliter pentaan toe aan de kolf.
Meng de emulsie krachtig gedurende ongeveer een minuut. Laat de deeltjes een tot twee uur bezinken voordat u het pentaan met een pipet afgiet. Herhaal deze pentaanwassing minimaal vijf keer.
Breng de gewassen gelmicrodeeltjes over naar een kleine glazen scintillatieviaal. Resuspendeer de deeltjes in één tot twee milliliter gedeïoniseerd water. Bereid voor het begin van deze procedure vijf milliliter van elk van 1% oplossingen van hydrazide en aldehyde-gefunctionaliseerd poly NIPAM in gedeïoniseerd water voor.
Verwarm vijf milliliter van de hydrazide-gefunctionaliseerde poly NIPAM-oplossing tot 70 graden Celsius onder roeren. Controleer de oplossing terwijl deze troebel wordt en bevestig dat er geen zichtbaar neerslag ontstaat. Voeg vervolgens 0,25 milliliter van de aldehyde-gefunctionaliseerde poly NIPAM-oplossing druppelsgewijs toe aan de verwarmde hydrazide-gefunctionaliseerde poly NIPAM-oplossing gedurende vijf tot 10 seconden.
Roer het mengsel gedurende 15 minuten bij 70 graden Celsius. Verwijder vervolgens het mengsel uit het oliebad en laat het over nacht afkoelen tot kamertemperatuur om de nanogels voor zuivering te verkrijgen. Plaats het nano gelmengsel in een 3500 kilodalton moleculair gewicht cut-off dialyse membraan.
Dialyseer de nanogels zes keer over zes uur cycli tegen ge
Overzicht
Dit artikel presenteert protocollen voor de vervaardiging van afbreekbare thermoresponsieve hydrogels met behulp van hydrazon-crosslinking. De methoden maken de creatie van hydrogels mogelijk op bulk-, micro- en nanoschaal, inclusief gel-nanodeeltjes en nanovezels.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Biomedische materialen
- Fabricage van hydrogelen
- Tissue engineering
Achtergrond
- Thermoresponsieve hydrogelen hebben toepassingen in geneesmiddelentoediening en weefselsteigers.
- Het beheersen van de grootte en vorm van hydrogelen is cruciaal voor hun functionaliteit.
- Hydrazon-crosslinking biedt een veelzijdige methode voor de synthese van hydrogelen.
- De studie richt zich op uitdagingen bij het creëren van responsieve materialen voor biomedisch gebruik.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een methode voor het fabriceren van afbreekbare thermoresponsieve hydrogels.
- Het mogelijk maken van gecontroleerde geometrieën en lengteschalen voor diverse toepassingen.
- Het faciliteren van de creatie van responsieve scaffolds en gerichte nanotherapeutica.
Gebruikte methoden
- Bereiding van hydrazide- en aldehyde-gefunctionaliseerde polymeeroplossingen.
- Gebruik van een dubbele spuit en een statische mengkamer voor co-extrusie.
- Fabricage van een microfluïdische chip voor de generatie van microdeeltjes.
- Dialyse voor de purificatie van nanogels.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle fabricage van foliumgels, microgels, nanogels en nanovezels.
- Aantoonbare controle over de grootte en vorm van de hydrogel door menging van polymeerprecursoren.
- Vestiging van een betrouwbare methode voor het produceren van uniforme gelmicrodeeltjes.
- Effectieve verwijdering van niet-gecrosslinkte polymeren uit nanogels.
Conclusies
- De gepresenteerde protocollen maken veelzijdige hydrogel-fabricage mogelijk voor biomedische toepassingen.
- Hydrazon-crosslinking is een veelbelovende benadering voor het creëren van responsieve materialen.
- Toekomstige toepassingen kunnen geavanceerde systemen voor geneesmiddelentoediening en scaffolds voor tissue engineering omvatten.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Dit protocol maakt de fabricage mogelijk van afbreekbare thermoresponsieve hydrogels over meerdere lengteschalen, waarmee een belangrijke translationele barrière in de ontwikkeling van slimme materialen wordt weggenomen: het gebrek aan biologisch relevante afbraak in conventionele thermoresponsieve polymeren. Door renale klaring mogelijk te maken via hydrolytisch afbreekbare hydrazon-crosslinks, ondersteunt deze methode de translatie van thermoresponsieve hydrogels voor toepassingen die een gecontroleerde verblijftijd vereisen, zoals metabolisme-gereguleerde geneesmiddelentoediening en transiënte weefselsteigers. De aanpak biedt een veelzijdig platform voor het genereren van hydrogels met instelbare grootte, vorm en afbraakkinetiek, wat de preklinische evaluatie van responsieve materialen onder fysiologisch relevante omstandigheden faciliteert.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door afbreekbare, stimulus-responsieve scaffolds te bieden die dynamische condities van de extracellulaire matrix nabootsen.
- Operationele waarde: Ondersteunt functionele targetvalidatie via instelbare hydrogeldegradatie, waardoor de targetbinding over gedefinieerde tijdsintervallen kan worden beoordeeld.
- Predictieve waarde: Verbetert de identificatie van lead-verbindingen door evaluatie van drug-release-kinetiek en cellulaire responsen in degradatie-competente omgevingen mogelijk te maken.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid voor analyse: Produceert uniforme hydrogel-microdeeltjes en nanogels die geschikt zijn voor high-throughput screening van verbindingvrijgave en cellulaire opname.
- Kwantitatieve output: Maakt meting mogelijk van degradatie-afhankelijke veranderingen in hydrogel-zwelling, maaswijdte en drugdiffusie als functionele read-outs.
- Reproduceerbaarheid: Microfluïdische en electrospinning-methoden bieden schaalbare, gestandaardiseerde productie van afbreekbare hydrogel-deeltjes met een gecontroleerde grootteverdeling.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Ziekterelateerd systeem: Genereert thermogevoelige hydrogels die degraderen tot oligomere precursoren onder de renale filtratiedrempel, wat de evaluatie van klaring en biocompatibiliteit ondersteunt.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen ontdekking en preklinisch werk door degradeerbare scaffolds te leveren die de thermogevoelige functie behouden en tegelijkertijd veiligheidsbeoordeling mogelijk maken via herstel van degradatieproducten.
- Mechanische risicoreductie: Maakt beoordeling mogelijk van hydrogel-gemedieerde geneesmiddelentoediening en weefselregeneratie onder omstandigheden waarbij de klaring van het materiaal fysiologische eliminatieroutes nabootst.
Integratie van pipeline en workflow
De methode is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van vroege targetvalidatie tot lead-optimalisatie en preklinische ontwikkeling, en biedt afbreekbare hydrogelplatforms die kunnen worden aangepast voor screening, formulering en mechanistische studies.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing door spatiotemporele controle over de presentatie van bioactieve stoffen mogelijk te maken via temperatuur- en degradatiegevoelige hydrogels.
- Screening: Levert gestandaardiseerde hydrogel-microdeeltjes en nanovezels voor consistente screening van verbindingen en analyse van cellulaire respons.
- Analytics: Biedt kwantitatieve read-outs over degradatiekinetiek, zwelgedrag en releaseprofielen, die inzicht geven in structuur-activiteit- en structuur-eigenschaprelaties.
- Translationeel Onderzoek: Maakt preklinische evaluatie van hydrogel-gebaseerde systemen mogelijk, waarbij degradatie tot klaarbare oligomeren het risico op langetermijnretentie vermindert.
- Enterprise Reuse: Vestigt een modulair platform dat toepasbaar is op diverse wateroplosbare polymeren, waardoor hergebruik mogelijk is binnen meerdere therapeutische gebieden en modaliteitsprogramma's.
Operationele en ondernemingsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen door evaluatie van slimme materialen in degradatie-competente, fysiologisch relevante contexten mogelijk te maken.
- Operationele waarde: Biedt gestandaardiseerde, schaalbare fabricage over verschillende lengteschalen (bulk, micro, nano) met behulp van gedeelde precursorchemie en aanpasbare apparatuur.
- Strategische waarde: Vermindert het risico op falen in een laat stadium door biocompatibiliteit en klaring vroeg in de ontwikkeling aan te pakken.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde vooruitgang door preklinische gegevens te genereren over degradatie, klaring en tijdelijke functionaliteit.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in polymeerchemie, hydrogeelvorming en de karakterisering van stimuli-responsieve materialen.
- Vereist toegang tot microfluïdische systemen, electrospinning-apparatuur en dialyse- of zuiveringsinfrastructuur voor de isolatie van nanogels.
- Vraagt om standaardisatie van de synthese en functionalisering van precursoren om reproduceerbare hydrazon-crosslinking en degradatieprofielen te garanderen.
- Omvat overwegingen voor aanpassing bij het toepassen van de methode op verschillende polymeren of bij het aanpassen van degradatiesnelheden via de stoichiometrie van de crosslinker.
- Bevat praktische beperkingen zoals gevoeligheid voor de geleringstijd, die moet worden afgestemd op de fabricagemethode om vroegtijdige of onvolledige netwerkvorming te voorkomen.
Veelgestelde vragen over biofarmaceutica
Chapters in this video
0:04
Title
0:49
Fabrication of Hydrazone-crosslinked Bulk Poly(Oligoethylene Glycol Methacrylate)(POEGMA) or Poly(N-Isopropylacrylamide) (PNIPAM) Hydrogels
2:41
Fabrication of Hydrazone-crosslinked PNIPAM Gel Microparticles via Reactive Microfluidics
6:18
Thermally-driven Reactive Self-assembly of Hydrazone-crosslinked PNIPAM Nanogels
7:34
Fabrication of Hydrazone- crosslinked POEGMA Nanofibers via Reactive Electrospinning
9:28
Results: Bulk, Microscale, and Nanoscale Thermoresponsive Hydrogels
11:17
Conclusion
