Detectie van de pH-afhankelijke activiteit van Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro en In Vivo

Het algemene doel van deze in vivo en in vitro chaperon-assays is om de pH-afhankelijke activiteit van de Escherichia coli chaperon HdeB onder zure pH-omstandigheden te karakteriseren. Zuur geactiveerde chaperonen hebben slechts één taak, ze moeten eiwitten beschermen tegen zuur geïnduceerde eiwituitvouwen en -afbraak. Deze functie is vooral belangrijk voor enterische bacteriën, die de zure omgeving van de maag moeten overleven als ze het darmkanaal met succes willen koloniseren.

De methoden die we hier presenteren, stellen je in staat om zuur geactiveerde chaperonen te identificeren en te karakteriseren, en de pH-omstandigheden te definiëren die leiden tot hun activering. Na het bekijken van deze video, zou je een goed begrip moeten hebben van hoe je de chaperonen, zoals HdeB in vitro en in vivo, karakteriseert, wat je helpt om het mechanisme van zijn activering te ontcijferen. Deze methoden zijn met succes toegepast voor andere zuurbeschermende chaperonen, zoals HDA, en kunnen verder worden aangepast om met andere chaperonen en/of stressomstandigheden te werken.

De invloed van gezuiverd HdeB op de aggregatie van thermisch uitsmijtend porcine mitochondriale malaatdehydrogenase bij verschillende pH-waarden wordt gemonitord. Gedialyseerd MDH bij vier graden Celsius overnacht tegen vier liter buffer C. Concentreer vervolgens het eiwit tot ongeveer 100 micromolair met behulp van centrifugale filtereenheden met een molecuulgewicht van 30 kilodalton. Om aggregaten te verwijderen, centrifugeer het eiwit gedurende 20 minuten bij 20.000 keer G bij vier graden Celsius.

Bepaal de MDH-concentratie door absorptie bij 280 nanomolair. Bereid vervolgens 50 microliter aliquots van MDH voor en vries de aliquots snel in voor opslag. Plaats een enkele milliliter kwarts cuvette in een fluorescerende spectrofotometer uitgerust met temperatuurgestuurde monsterhouders en roerders.

Stel de excitatie- en toelatingsgolflengte in op 350 nanometer. Voeg de geschikte volumes van voorverwarmde buffer D toe bij de gewenste pH-waarden in de cuvette. Het totale volume is 1.000 microliters.

Stel de temperatuur in de cuvettehouder in op 43 graden Celsius. Voeg 12,5 micromolair HdeB toe aan de buffer, gevolgd door de toevoeging van 0,5 micromolair MDH. Begin met het monitoren van lichtverstrooiing.

Incubeer de reactie gedurende 360 seconden om voldoende uitvouwen van MDH mogelijk te maken. Verhoog de pH tot zeven door een 0,16 tot 0,34 volume van twee molair ongebufferd dikaliumfosfaat toe te voegen, en blijf de lichtverstrooiing nog eens 440 seconden registreren. Analyseer de gegevens zoals beschreven in het tekstprotocol.

Transformeer het plasmide dat HdeB of de MD vector controle, PBAD 18, tot expressie, in stam BB7224 Delta RPOH met behulp van chemisch competente cellen. Deze stam is temperatuurgevoelig en moet worden gekweekt bij 30 graden Celsius. Na 45 seconden hitteschok bij 42 graden Celsius en vóór het plateren, incubeer de cellen bij 30 graden Celsius en 200 RPM.

Voer eenklonige streak outs uit van positieve klonen en incubeer overnacht bij 30 graden Celsius. Bereid een overnachtelijke cultuur in 50 milliliter LB met Ampicilline en kweek de cellen bij 200 RPM en 30 graden Celsius. Verdun overnachtelijke culturen 40-voudig in 25 milliliter LB met Ampicilline.

Laat de bacteriën groeien in aanwezigheid van 0,5% arabinose bij 30 graden Celsius en 200 RPM tot een optische dichtheid bij 600 nanometer, of OD 600 gelijk aan 1,0, om HDEB-eiwitexpressie te induceren. Voor de pH-verschuivingsexperimenten, gebruik LB met Ampicilline en arabinose om de cellen te verdunnen tot een OD 600 van 0,5. Pas aan tot de respectieve pH-waarden door geschikte volumes van vijf molair zoutzuur toe te voegen.

Na de aangegeven tijdstippen, neutraliseer de culturen door toevoeging van de juiste volumes van vijf molair natriumhydroxide. Monitor de groei van de geneutraliseerde culturen en vloeibare cultuur gedurende 12 uur bij 30 graden Celsius met behulp van OD-metingen. Om de pH-optimum van HdeB's chaperonactiviteit in vitro te onderzoeken, werd native MDH verdund in voorverwarmde buffer van de aangegeven pH in de aanwezigheid, of afwezigheid, van HdeB.

Na 360 seconden incubatie, werd aggregatie van MDH bij 43 graden Celsius geïnitieerd door neutralisatie. In aanwezigheid van HdeB, is het lichtverstrooiingssignaal significant verminderd bij neutralisatie vanaf pH vier, wat aangeeft dat HdeB de aggregatie van MDH voorkomt. Aggregatoringmetingen zijn zeer gevoelig voor veranderingen in temperatuur of bufferinhoud.

Om valse positieve resultaten te elimineren, werd de invloed van chaperonopslagbuffer op cliëntaggregatie onderzocht. De HdeB-opslagbuffer had geen effect op MDH-aggregatie. Om de effecten van HdeB in vivo te onderzoeken, werden pH-afhankelijke overlevingsassays uitgevoerd met behulp van de temperatuurgevoelige RPOH-deletiestam.

Deze stam mist de meeste chaperonen en is daarom gevoeliger voor verhoogde temperatuur, lage pH of geoxideerde stress. Overexpressie van de HdeB onder neutrale pH-omstandigheden vertoonde geen effect op de groeisnelheid van de stam, die vergelijkbaar goed groeide met de controlestam die de lege vector, PBAD 18, bevat. In tegenstelling daarmee, werden duidelijke verschillen gevonden in hun vermogen om de groei te hervatten na pH drie of pH vier behandelingen, waarbij de HdeB-overexpresserende stam reproduceerbaar verbeterde herstel van lage pH-behandeling vertoonde in vergelijking met de controlestam.

Eenmaal onder de knie, kan de zuivering in drie dagen worden uitgevoerd, de in vitro verstrooiingsassay in één dag, en de in vivo overlevingsassays in twee dagen als deze correct wordt uitgevoerd. Wanneer je deze experimenten uitvoert, zorg er dan voor dat je je experimentele ontwerp zorgvuldig overweegt, zowel met betrekking tot het type cliënteiwitten, hun concentraties, en de bufferomstandigheden die je gebruikt. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat