Extractie van structurele extracellulaire polymere stoffen van aërobe korrelslib

Het algemene doel van het volgende experiment is om een extractiemethode te tonen om structurele extracellulaire polymere stoffen of EPS te verkrijgen, uit bioschuimen, specifiek uit aerobe granulaire slib. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het gebied van granulaire slib te beantwoorden. Zoals het begrijpen van het granulationsproces, en het analyseren van de EPS samenstelling.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de aanwezigheid van gelvormende polymeren in EPS in korte tijd kan worden getest. Centrifugeer de granulaire slib bij 4.000 maal G en vier graden Celsius gedurende 20 minuten, en decanteer het supernatant. Verzamel de korrels in de pellet voor de extractie.

Verwarm 150 milliliter leidingwater voor in een 1.000 milliliter glazen beker op een magnetische roerder tot 80 graden Celsius. Breng drie gram korrels over in een 250 milliliter geschotste fles en vul de fles tot 50 milliliter met gedemineraliseerd water. Voeg 0,67 gram natriumcarbonaat decahydraat toe in de fles om een 0,5% gewicht per volume natriumcarbonaatconcentratie te verkrijgen.

Plaats de fles met het mengsel in het waterbad. Bedek de fles en de beker glazen afzonderlijk met aluminiumfolie, om verdamping te voorkomen. Roer het mengsel gedurende 35 minuten bij 400 RPM en 80 graden Celsius.

Breng het mengsel over in een 50 milliliter centrifugeerbuis. Centrifugeer de buis met het mengsel bij 4.000 maal G en vier graden Celsius gedurende 20 minuten. Verzamel het supernatant en gooi de pellet weg.

De dialysestap is optioneel om structurele EPS uit aerobe granulaire slib te verkrijgen. Maar het heeft verschillende voordelen die in het protocol worden beschreven. Pipetteer het supernatant in een dialysezak, met een moleculair gewichtsdoorsnede van 3.500 dalton, en dialyseer gedurende 24 uur tegen 1000 ml ultrapuur water.

Ververs het dialysewater na 12 uur om het effect van de dialyse te verbeteren. Breng het gedialyseerde extract over in een 250 ml glazen beker en roer de extractie langzaam bij 100 rpm en kamertemperatuur. Controleer constant de PH veranderingen met een PH elektrode, terwijl 1 molair zoutzuur wordt toegevoegd tot een eind PH van 2,2 05 om ale in de zure vorm te verkrijgen.

Na het aanpassen van de PH naar 2,2, breng het extract over in een 50 ml centrifugeerbuis, en centrifugeer bij 4000 maal G en vier graden Celsius, gedurende twintig minuten. Gooi het supernatant weg en verzamel de gel-achtige pellet. De gel-achtige pellet is ale in de zure vorm.

Om de natriumvorm van ale te verkrijgen, voeg langzaam 0,5 molair natriumhydroxide toe aan de gel, terwijl het mengsel langzaam wordt gemengd met een glazen stok met de hand tot PH 8,5 is bereikt. Gebruik een pasteur pipet om langzaam de natrium ale extract in een calciumchloride oplossing te druppelen. Als de geëxtraheerde EPS ionische hydrogel gel-vormende eigenschappen heeft, zullen er druppelvormige sferische pareltjes worden gevormd.

Alternatief, als de geëxtraheerde EPS geen ionische hydrogel gel-vormende eigenschappen heeft, zal het extract zich verspreiden in de calciumchloride oplossing. Bewaar de hydrogel pareltjes en de calciumchloride oplossing gedurende 30 minuten. Gebruik een lepel om de hydrogel pareltjes uit de calciumchloride oplossing te verwijderen en breng ze over naar een EDTA oplossing.

Bewaar de hydrogel pareltjes in 10 ml EDTA oplossing gedurende drie uur bij vier graden Celsius. Deze test demonstreert een voorbeeld van de stabiliteitstesten die in het protocol worden beschreven. Controleer of er zichtbare desintegratie van de pareltjes plaatsvindt tijdens deze opslag om te evalueren of de pareltjes deze omstandigheden kunnen weerstaan.

Als de extractie succesvol was, zal de aerobe granulaire slib solubiliseren na de alkalische extractiestap, en zal er een pellet worden verkregen na het aanzuren en centrifugeren van de geëxtraheerde EPS. Als de geëxtraheerde EPS structurele EPS zijn en het vermogen hebben om hydrogels met calcium ionen te vormen, zullen er gel pareltjes worden gevormd wanneer de geëxtraheerde EPS in de calciumoplossing worden gedruppeld. Als EPS die niet over deze gel-vormende eigenschappen beschikken worden geëxtraheerd, zal de EPS oplossing zich verspreiden in de calciumoplossing.

Na het bekijken van deze video, zou je in staat moeten zijn om de extractie van structurele EPS uit aerobe granulaire slib uit te voeren. Ook zou je in staat moeten zijn om het gel-vormende vermogen van de verkregen EPS met calcium ionen te testen. We kozen ervoor om deze extractiemethode te tonen om de invloed van de extractietechniek op de verkregen EPS uit aerobe granulaire slib te illustreren.

Daarnaast wilden we laten zien dat geen EPS extractietechniek universeel toepasbaar is.