Een High Throughput, multiplexverzending en Gerichte Proteomic CSF Assay te kwantificeren neurodegeneratieve Biomarkers en apolipoproteïne E isovormen Status

Het algemene doel van deze methode is om snel en betaalbaar meerdere biomarkers in het cerebrospinale vocht, of CSF, te kwantificeren om hun gebruik voor diagnose en behandelingsmonitoring te beoordelen. Dit is een nieuwe test die het ons mogelijk maakt om biomarkers te meten die voorheen niet gemeten konden worden. En we denken dat dit kan worden gebruikt voor diagnostische doeleinden en ook om onderscheid te maken tussen verschillende neurodegeneratieve ziekten en mogelijk ook prognostische informatie te geven.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze is ontworpen om snel, eenvoudig in monstervoorbereiding, zeer specifiek en kosteneffectief te zijn voor toepassing in de klinische laboratorium. De implicaties van deze techniek strekken zich uit naar therapie of diagnose, aangezien deze hoogwaardige test kan worden gebruikt in toekomstige klinische onderzoeken voor nieuwe therapieën bij neurodegeneratie. Deze methodologie kan ook worden toegepast op andere ziekten en weefsels, zoals urine voor nierziekten, plasma voor cardiomyopathie en cellen voor pluripotentie.

Om deze procedure te starten, suspendeer de gewenste synthetische peptiden in een stockconcentratie van één milligram per milliliter, volgens de instructies van de fabrikant. Bereid verdunningen van één op tien van het peptide vanuit de stockconcentratie en verzamel 1.000 picomolen van elk peptide in een laag-bindend microcentrifugebuisje. Droog het gepoolde peptidemonster in een SpeedVac concentrator.

Wanneer u klaar bent, bewaar het monster op min 20 graden Celsius. Verdeel vervolgens 100 microliter CSF in laag-bindende microcentrifugebuisjes. Lyofiliseer de CSF-monsters.

Suspendeer een aliquot van het gepoolde peptidemonster in een verteringsbuffer om concentraties van 10 en één picomol per microliter te verkrijgen. Spike vervolgens het gepoolde peptidemonster in de lyofilisaat van de 100-microliter aliquots van CSF, op nul, één, twee, vijf, 10 en 15 picomolaire concentraties. Voeg vervolgens 20 nanogram intact ongerelateerd eiwit toe als interne standaard en controle voor de verteringsefficiëntie van trypsine.

Voeg verteringsbuffer toe aan de CSF-aliquots tot een eindvolume van 20 microliter en vortex de monsters. Volg dit door de monsters per standaardprotocol te verteren door 1,5 microliter dithiothreitol toe te voegen en een uur bij kamertemperatuur te schudden. Voeg vervolgens drie microliter iodoacetamide toe aan de monsters en schud gedurende 45 minuten in het donker bij kamertemperatuur.

Voeg vervolgens 165 microliter dubbelgedestilleerd water toe. Voeg 10 microliter van een 0,1-microgram-per-microliter, sequentiegrad gewijzigde trypsinoplossing, gesuspendeerd in 50-millimolar ammoniumbicarbonaatbuffer toe aan de monsters. Incubeer de monsters in een waterbad bij 37 graden Celsius gedurende de nacht.

Stop vervolgens de vertering door de monsters in te vriezen. Na het ontdooien van de CSF-digesten op ijs, centrifugeer gedurende 10 minuten bij 16.000 keer g. Wanneer u klaar bent, breng 60 microliter van elk digest over naar een 300-microliter glazen inzetbuisje.

Gebruik een LC-MS systeem, uitgerust met een C18 UPLC kolom, en injecteer de hoogste concentratie van het standaardcurvepunt met een lineaire gradiënt van 10 minuten, van 1 tot 40% acetonitril. Zodra de run voltooid is, open het resulterende chromatogram in de software en noteer de retentietijd en de twee meest intense overgangen per peptide. Op basis van deze informatie, werk een eerder gemaakte multiple reaction monitoring, of MRM methode bij met getijde kanalen om peptiden te meten.

Om de gevoeligheid te behouden, houd elk kanaal met punten per piek groter dan acht en verblijftijd groter dan 0,01 seconden voor ten minste één overgang voor elk peptide. Voeg oplosmiddelvertragingen toe aan de MRM-methode door oplosmiddelvertragingen te selecteren in methodegebeurtenissen in het MS-methodebestand. Het is van cruciaal belang om de juiste piek correct te matchen in een korte HPLC-methode.

Dit kan worden gedaan door de gespikte peptiden in de matrix die worden gebruikt voor een standaardcurve te observeren en de meerdere overgangen tijdens de methodeontwikkeling. Controleer ten slotte handmatig de gegevensannotatie om de nauwkeurigheid te garanderen. Analyseer elk peptide en de verhouding tot een geschikte stabiel isotoop-gelabelde interne standaard.

Een chromatogram van de belangrijkste peptidemarkers uit de hoogwaardige CSF-test wordt hier getoond. De gegevens geven gestandaardiseerde verhoudingen tot de relevante stabiel isotoop-gelabelde interne standaard, die kunnen worden gebruikt om absolute CSF-concentraties te bepalen en statistisch te analyseren voor veranderingen in klinische monsters. Kwantificering van de 74 peptiden in deze CSF-test onthulde dat er 25 significant waren veranderd in de CSF van dementiepatiënten, en resultaten van dementiemarkers pro-orexin en YKL chitinase-3-achtig eiwit worden hier weergegeven.

ApoE4 is een bekende risicofactor voor de ziekte van Alzheimer en de detectie van ApoE-isovormen is gebaseerd op de detectie van de corresponderende peptiden voor de aminozuurveranderingen voor isovormen E2 en E4. Het piekpatroon dat voor elke isovormcombinatie wordt verwacht, wordt hier getoond. Zodra de methode is ingesteld, kan de test binnen een dag worden uitgevoerd als deze correct wordt uitgevoerd. Na de ontwikkeling van deze methode was het mogelijk om een nieuwe set biomarkers te meten met hoge analytische gevoeligheid en specificiteit, en dit zal het mogelijk maken voor onderzoekers om neurodegeneratieve ziekten op een nieuwe manier te beoordelen.

Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een MRM-test ontwerpt en optimaliseert voor gevoeligheid en specificiteit. Vergeet niet dat het werken met DTE, termite, mierenzuur en menselijk weefsel uiterst gevaarlijk kan zijn en voorzorgsmaatregelen, zoals het dragen van handschoenen, moeten worden toegepast tijdens deze procedure.