Name: Antilichaam Labeling met fluorescente kleurstoffen met behulp van magnetische Proteïne A en Proteïne G Beads (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Leer antilichamen labelen met fluorescente kleurstoffen via magnetische eiwit A/G-beads direct uit celmedium. Deze methode optimaliseert kleine hoeveelheden zuivering en ondersteunt handmatige en geautomatiseerde workflows.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

1. Antibody Capture naar High Capacity Magnetic Proteïne A of magnetische proteïne G Beads <ol><li> Gelijkmatig opnieuw te schorten magnetische korrels door zacht schudden. Houd de schorsing uniform wanneer aliquoting kralen. </li><li> Voeg 50 ul kraal slurry naar een 1,5 ml microcentrifugebuis. Plaats de magnetische standaard voor 10 sec. Verwijder de opslag buffer voorzichtig. </li><li> Voeg 250 gl antilichaam bindingsbuffer. </li><li> Mengen en in de magnetische standaard voor 10 sec. Verwijder de binding buffer voorzichtig. </li><li> Voeg 1,0 ml van het monster met 50-100 ug antilichaam aan de beads. De monsters kunnen worden gezuiverd antilichamen of antilichamen in celmedium. </li><li> Meng monster gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur met behulp van een vortex mixer of end-over-end mixer. </li><li> Plaats de buis in de magnetische stand gedurende 10 seconden en verwijder het supernatant. </li><li> Voeg 250 ul antilichaam binding / wasbuffer en meng. Plaats in de magnetische stand gedurende 10 seconden en verwijder binding / wasbuffer. Herhaal dit sTep voor een totaal van twee wassen. </li><li> Ga verder naar deel 2 te label antilichamen met behulp van amine chemie of hoofdstuk 3 tot en met label antilichamen met behulp van thiol chemie. </li></ol> 2. Antibody Labeling Met behulp van Amine Chemie <ol><li> conjugaat Antibody <ol><li> Voeg 100 gl buffer amine conjugatie aan de korrels. </li><li> Los het amine-reactieve fluorescerende kleurstoffen (AlexaFluor 532-SE) en 10 mg / ml door toevoeging van 100 gl dimethylsulfoxide (DMSO) om 1,0 mg kleurstof. Meng door vortexen. Maak deze oplossing vlak voor gebruik. </li><li> Voeg 2,5 ul van amine-reactieve kleurstof van 100 ug antilichaam. Noot: Typisch een 5-20 molaire overmaat reactieve kleurstof wordt aanbevolen. Echter hoeveelheid reactieve kleurstof toegevoegd aan het reactiemengsel moet empirisch worden geoptimaliseerd afhankelijk van de gewenste kleurstof antilichaam verhouding en intrinsieke eigenschappen antilichaam. </li><li> Meng monster gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur met behulp van een vortex mixer of end-over-end mixer. Zorg ervoor dat de kralen in suspensio blijvenn. </li><li> Plaats de buis in de magnetische stand gedurende 10 seconden en verwijder het supernatant. </li><li> Voeg 250 ul antilichaam binding / wasbuffer en meng. Plaats de magnetische standaard voor 10 sec. Verwijder en gooi binding / wasbuffer. Herhaal deze stap voor een totaal van twee wassen. </li></ol></li><li> antilichaam Recovery <ol><li> Voeg 50 ul elutiebuffer aan de korrels. </li><li> Meng gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur met behulp van een vortex mixer of end-over-end mixer. Zorg ervoor dat de parels in suspensie blijven. </li><li> Plaats buis in de magnetische stand voor 10 sec. Verwijder geëlueerde monster en overdracht naar een nieuwe micro-centrifugebuis met 5 pl neutralisatie buffer. </li><li> Herhaal dit proces nog een keer en het zwembad het geëlueerde monsters. </li><li> Kwantificeren het antilichaam concentratie en kleurstof-to-antilichaam-verhouding, zoals beschreven in hoofdstuk 4. </li></ol></li></ol> 3. Antibody Labeling Met behulp van thiol chemie <ol><li> antilichaam Reduction <ol><li> Voeg 250 ulvan thiol vervoeging buffer en mix. Plaats de buis in de magnetische stand voor 10 sec. Verwijder de buffer. Herhaal deze stap twee keer. </li><li> Voeg 100 ul van thiol vervoeging buffer. </li><li> Voeg dithiothreitol (DTT) tot een uiteindelijke concentratie van 2,5 mM. </li><li> Meng monster gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur met behulp van een vortex mixer of end-over-end mixer. Zorg ervoor dat de parels in suspensie blijven. </li><li> Plaats de buis in de magnetische stand voor 10 sec en gooi de buffer. </li><li> Voeg 250 gl thiol conjugatie buffer en meng. Plaats de buis in de magnetische stand voor 10 sec. Verwijder de buffer. Herhaal deze stap voor een totaal van twee wassen. </li><li> Voeg 100 ul van thiol vervoeging buffer. </li></ol></li><li> conjugaat Antibody <ol><li> Los het thiol-reactieve kleurstof bij 10 mg / ml door toevoeging van 100 ul DMSO 1,0 mg kleurstof. Meng door vortexen. Maak deze oplossing vlak voor gebruik. </li><li> Voeg 2,5 pl thiol-reactieve kleurstof van 100 ug antilichaam. Noot: Typisch een 5-20 molaire overmaat reactieve kleurstof wordt aanbevolen. Echter hoeveelheid reactieve kleurstof toegevoegd aan het reactiemengsel moet empirisch worden geoptimaliseerd afhankelijk van de gewenste kleurstof antilichaam verhouding en intrinsieke eigenschappen antilichaam. </li><li> Meng monster gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur met behulp van een vortex mixer of end-over-end mixer. Zorg ervoor dat de parels in suspensie blijven. </li><li> Plaats de buis in de magnetische stand voor 10 sec en verwijder supernatant. </li><li> Voeg 250 gl thiol conjugatie buffer en meng. Plaats de magnetische standaard voor 10 sec en verwijder de buffer. Herhaal deze stap voor een totaal van twee wassen. </li></ol></li><li> Elueer Antibody <ol><li> Voeg 50 ul elutiebuffer aan de korrels. </li><li> Meng gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur met behulp van een vortex mixer of end-over-end mixer. Zorg ervoor dat de parels in suspensie blijven. </li><li> Plaats buis in de magnetische stand voor 10 sec. Verwijder geëlueerde monster en overdracht naar een nieuwe micro-centrifugebuis bevattende 5 ui neutralization buffer. </li><li> Herhaal dit proces nog een keer en het zwembad het geëlueerde monsters. </li><li> Kwantificeren het antilichaam concentratie en kleurstof-to-antilichaam-verhouding, zoals beschreven in hoofdstuk 4. </li></ol></li></ol> 4. Bereken Dye-to-Antibody Ratio <ol><li> Meet de absorptie van het antilichaam-conjugaat kleurstof bij 280 nm (A280) en bij de Amax van de kleurstof (Amax). </li><li> Bereken het antilichaam concentratie: Antilichaam Concentratie (mg / ml) = A280 - (Amax x CF) / 1,4 waarbij CF = correctiefactor van de kleurstof (verstrekt door de fabrikant). </li><li> Bereken de kleurstof tot antilichaam verhouding: Dye-to-antilichaam verhouding (DAR) = (A max x 150.000) / Ab Concentratie (mg / ml) x ε kleurstof wanneer kleurstof ε = de extinctiecoëfficiënt van de kleurstof op zijn maximale absorptie en molecuulgewicht van antilichaam = 150.000 Da. </li></ol>

<ol><li>Colwill, K., Graslund, S. Renewable Binder Working Group. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+roadmap+to+generate+renewable+protein+binders+to+the+human+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A roadmap to generate renewable protein binders to the human proteome.</a> Nat Methods. 8 (7), 551-558 (2011).</li>
<li>Silverstein, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeled+antigens+and+antibodies%3A+the+evolution+of+magic+markers+and+magic+bullets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Labeled antigens and antibodies: the evolution of magic markers and magic bullets.</a> Nat Immunol. 5 (12), 1211-1217 (2004).</li>
<li>Day, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+modified+antibodies+as+diagnostic+imaging+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemically modified antibodies as diagnostic imaging agents.</a> Curr Opin Chem Biol. 14 (6), 803-809 (2010).</li>
<li>Cunningham, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+flow+cytometry+and+fluorescent+probes+for+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Overview of flow cytometry and fluorescent probes for flow cytometry.</a> Methods Mol Biol. 588, 319-326 (2010).</li>
<li>Eaton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+modern+quantitative+fluorescent+western+blotting+with+troubleshooting+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies.</a> J Vis Exp. (93), e52099(2014).</li>
<li>Dundas, C. M., Demonte, D., Park, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptavidin-biotin+technology%3A+improvements+and+innovations+in+chemical+and+biological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Streptavidin-biotin technology: improvements and innovations in chemical and biological applications.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 97 (21), 9343-9353 (2013).</li>
<li>Kraeber-Bodere, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radioimmunoconjugates+for+the+treatment+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Radioimmunoconjugates for the treatment of cancer.</a> Semin Oncol. 41 (5), 613-622 (2014).</li>
<li>Leal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-drug+conjugates%3A+an+emerging+modality+for+the+treatment+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Antibody-drug conjugates: an emerging modality for the treatment of cancer.</a> Ann N Y Acad Sci. 1321, 41-54 (2014).</li>
<li>Drachman, J. G., Senter, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-drug+conjugates%3A+the+chemistry+behind+empowering+antibodies+to+fight+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Hematology+Am+Soc+Hematol+Educ+Program%22%5BJournal%5D)">Antibody-drug conjugates: the chemistry behind empowering antibodies to fight cancer.</a> Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2013, 306-310 (2013).</li>
<li>Hermanson, G. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHermanson%2C+GT+%22Bioconjugate+Techniques%22">Bioconjugate Techniques</a>. , Academic Press. 380-382 (1996).</li>
<li>Shrestha, D., Bagosi, A., Szollosi, J., Jenei, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+the+three+different+fluorophore+antibody+conjugation+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">Comparative study of the three different fluorophore antibody conjugation strategies.</a> Anal Bioanal Chem. 404 (5), 1449-1463 (2012).</li>
<li>Vira, S., Mekhedov, E., Humphrey, G., Blank, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent-labeled+antibodies%3A+Balancing+functionality+and+degree+of+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Fluorescent-labeled antibodies: Balancing functionality and degree of labeling.</a> Anal Biochem. 402 (2), 146-150 (2010).</li>
<li>Isa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+system+to+identify+small+molecules+that+induce+internalization+and+degradation+of+HER2%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening system to identify small molecules that induce internalization and degradation of HER2.</a> ACS Chem Biol. 9 (10), 2237-2241 (2014).</li>
<li>Liao-Chan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+antibody+internalization+with+novel+monoclonal+antibodies+against+Alexa+fluorophores%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of antibody internalization with novel monoclonal antibodies against Alexa fluorophores.</a> PLoS One. 10 (4), e0124708(2015).</li>
<li>Riedl, T., van Boxtel, E., Bosch, M., Parren, P. W., Gerritsen, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+Screening+for+Internalizing+Antibodies+by+Homogeneous+Fluorescence+Imaging+of+a+pH-Activated+Probe%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">High-Throughput Screening for Internalizing Antibodies by Homogeneous Fluorescence Imaging of a pH-Activated Probe.</a> J Biomol Screen. 21 (1), 12-23 (2016).</li>
<li>Nath, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homogeneous+plate+based+antibody+internalization+assay+using+pH+sensor+fluorescent+dye%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Homogeneous plate based antibody internalization assay using pH sensor fluorescent dye.</a> J Immunol Methods. 431, 11-21 (2016).</li>
<li>Lundberg, E., Sundberg, M., Graslund, T., Uhlen, M., Svahn, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+reproducible+fluorescent+labeling+of+small+amounts+of+antibodies+on+solid+phase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel method for reproducible fluorescent labeling of small amounts of antibodies on solid phase.</a> J Immunol Methods. 322 (1-2), 40-49 (2007).</li>
<li>Strachan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid-phase+biotinylation+of+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Recognit%22%5BJournal%5D)">Solid-phase biotinylation of antibodies.</a> J Mol Recognit. 17 (3), 268-276 (2004).</li>
<li>Dezfouli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+bead+assisted+labeling+of+antibodies+at+nanogram+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Magnetic bead assisted labeling of antibodies at nanogram scale.</a> Proteomics. 14 (1), 14-18 (2014).</li>
<li>Nath, N., Godat, B., Benink, H., Urh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-bead+antibody-small+molecule+conjugation+using+high-capacity+magnetic+beads%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">On-bead antibody-small molecule conjugation using high-capacity magnetic beads.</a> J Immunol Methods. 426, 95-103 (2015).</li>
<li>Lund, L. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+variation+in+binding+of+Protein+A+and+Protein+G+to+immunoglobulin+type+G+by+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Recognit%22%5BJournal%5D)">Exploring variation in binding of Protein A and Protein G to immunoglobulin type G by isothermal titration calorimetry.</a> J Mol Recognit. 24 (6), 945-952 (2011).</li>
<li>Safarik, I., Safarikova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+techniques+for+the+isolation+and+purification+of+proteins+and+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Biomagn+Res+Technol%22%5BJournal%5D)">Magnetic techniques for the isolation and purification of proteins and peptides.</a> Biomagn Res Technol. 2 (1), 7(2004).</li>
<li>Flygare, J. A., Pillow, T. H., Aristoff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-drug+conjugates+for+the+treatment+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol+Drug+Des%22%5BJournal%5D)">Antibody-drug conjugates for the treatment of cancer.</a> Chem Biol Drug Des. 81 (1), 113-121 (2013).</li>
<li>Shen, B. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conjugation+site+modulates+the+in+vivo+stability+and+therapeutic+activity+of+antibody-drug+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Conjugation site modulates the in vivo stability and therapeutic activity of antibody-drug conjugates.</a> Nat Biotechnol. 30 (2), 184-189 (2012).</li>
<li>Acchione, M., Kwon, H., Jochheim, C. M., Atkins, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+linker+and+conjugation+chemistry+on+antigen+binding%2C+Fc+receptor+binding+and+thermal+stability+of+model+antibody-drug+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22MAbs%22%5BJournal%5D)">Impact of linker and conjugation chemistry on antigen binding, Fc receptor binding and thermal stability of model antibody-drug conjugates.</a> MAbs. 4 (3), 362-372 (2012).</li>
</ol>

Auteurs zijn werknemers van Promega Corporation.

Het doel van deze studie was om een ​​methode om antilichamen aanwezig in het celmedium bij lage concentraties label, met een verscheidenheid aan kleine moleculen te ontwikkelen. Een dergelijke werkwijze zal een groot aantal antilichamen, tijdens de vroege stadia van antilichaam ontdekking mogelijk, te voorzien van kleine moleculen en gezeefd onder toepassing van een biologisch relevante assay. Een dergelijke test is de receptor-gemedieerde internalisatie antilichaam assay waarbij internalisatie kan variëren tussen anti...

Antilichamen gelabeld met kleine moleculen zijn misschien de meest gebruikte reagentia in de biologie 1,2. Antilichamen gelabeld met fluorescente kleurstoffen en biotine worden veel gebruikt in de beeldvorming, immunoassays, flowcytometrie, Western blots, immuunprecipitatie en onder andere toepassingen 3-6. Radiogelabelde antilichamen 3,7 vinden veel toepassing bij beeldvorming en therapie, antilichamen gelabeld met cytotoxische geneesmiddelen (ADCs) bieden nieuwe mogelijkheden voor de behandeling van kanker, en twee ADCs zijn reeds goedgekeurd voor therapeutisch gebruik 8. Ondanks hun veelvuldig gebruik zijn de methoden voor het labelen van antilichamen verrassend ongewijzigd gebleven en meestal meerdere reacties te betrekken en ontzouting stappen 9-12. Oplossing methoden werken heel goed in gevallen waar slechts een paar antilichamen moeten worden geëtiketteerd en zijn verkrijgbaar in zeer gezuiverde vorm bij hoge concentratie en in voldoende volumes. Voor nieuwere toepassingen zoals ADC, is er eenmoeten antilichamen etiketteren vroeg stadium hybridoma zodat ze kunnen worden gescreend op biologisch relevante eigenschappen, bijvoorbeeld receptor-gemedieerde internalisatie antilichaam 13-16. Voor deze hybridoma stadium monstervolumes beperkt, antilichamen uitgedrukt bij lage concentraties en een aantal monsters zijn groot, dus oplossing gebaseerde labeling niet geschikt zijn. Ter vereenvoudiging en verbetering van de doorvoer van de traditionele labeling antilichamen gebaseerde methoden, hebben een aantal alternatieve benaderingen voorgesteld 17,18. Een benadering is niet-magnetische proteïne A gebruikt affiniteitskorrels verpakt in kleine kolommen antilichamen gevolgd door de labelingsreactie en elutie van gelabelde en gezuiverd eiwit vangen. Deze methode kan worden gebruikt om antilichamen direct labelen van cel media, is het gebruik van kolommen moeizaam. Een magnetische korrel gebaseerde werkwijze is recentelijk gerapporteerd dat 19 het gebruik van kolommen elimineert en verbetert de doorvoer maar doorde beperkte antilichaambinding capaciteit van de korrels konden alleen lage nanogram tot microgram hoeveelheden van de antilichamen worden gelabeld. We hebben onlangs ontwikkeld en gebruikt hoge capaciteit magnetische Proteïne A en Proteïne G parels (&gt; 20 mg humaan IgG / ml vaste korrels) antilichamen aanwezig in celmedium met 20 kleine moleculen te labelen. De hoge capaciteit van de korrels maakt tientallen tot honderden microgram antilichaam gemakkelijk worden gemerkt en de snelle respons van de magnetische kralen vereenvoudigt behandeling en verwerking van een groot aantal monsters in parallel. Het gebruik van fluorescerende kleurstoffen als surrogaat voor kleine moleculen, laten we zien dat de methode is compatibel met de etikettering chemie amine en thiol en biedt een hoge terugvorderingen van gemerkt en zeer zuiver antilichamen. Dit protocol en de bijbehorende video beschrijven on-bead etikettering van muizenantilichamen in de cel media met magnetische Proteïne A en Proteïne G parels. Het protocol isverdeeld in vier delen: Deel 1 beschrijft de verovering van antilichamen op de hiel van biologische monsters. Naar aanleiding van capture, wordt de etikettering van antilichamen met een fluorescerende kleurstof met behulp van amine chemie of met behulp van thiol chemie beschreven in rubriek 2 en deel 3, respectievelijk. Tenslotte worden in hoofdstuk 4 beschrijft de werkwijze voor de berekening van de antilichaamconcentratie en de kleurstof antilichaam verhouding.

<table><tbody><tr><td>Magne Protein A Beads</td><td>Promega Corporation</td><td>&nbsp;G8781</td><td></td></tr><tr><td>Magne Protein G Beads</td><td>Promega Corporation&nbsp;</td><td>&nbsp;G7471</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 532-SE (Succinimidyl Ester)</td><td>Life Technologies</td><td>A20001</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 532-ME (Malemide)</td><td>Life Technologies</td><td>A10255</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 647-ME (Maleimide)</td><td>Life Technologies</td><td>A20347</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein-ME (Maleimide)</td><td>Life Technologies</td><td>F-150</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic Stand</td><td>Promega</td><td>Z5332</td><td></td></tr></tbody></table>

antilichaam labeling met fluorescente kleurstoffen met behulp van magnetische proteïne a en proteïne g beads

Antibody Labeling with Fluorescent Dyes Using Magnetic Protein A and Protein G Beads

Antilichamen die zijn gemerkt met kleine moleculen zoals fluorescerende kleurstoffen, cytostatica en radioactieve tracers zijn essentiële instrumenten in het biomedisch onderzoek, immunodiagnostiek en meer recentelijk als therapeutische middelen. Traditionele methoden voor het labelen van antilichamen met kleine moleculen vereisen gezuiverde antilichamen bij relatief hoge concentratie, betrekking hebben op meerdere dialyse stappen en hebben beperkte verwerkingscapaciteit. Toch zijn er verschillende toepassingen, waaronder het gebied van antilichaam Drug Conjugaten (ADC), zullen profiteren van nieuwe methoden die de etikettering van antilichamen direct van cel media zal toestaan. Dergelijke werkwijzen kunnen toestaan ​​antilichamen worden gescreend in biologisch relevante assays, bijvoorbeeld, de receptor-gemedieerde internalisatie antilichaam assay bij ADCs. Hier beschrijven we een werkwijze (on-bead methode) die kenmerken van kleine hoeveelheden antilichamen maakt rechtstreeks uit celmedium. Deze aanpak maakt gebruik van een hoge capaciteit magnetische proteïne A en proteïne G affiniteit kralen om antilichamen te vangenuit de cel media gevolgd door merken met kleine moleculen met behulp van amine of thiol chemie en daaropvolgende elutie van gelabelde antilichamen. Het nemen van fluorescerende kleurstoffen als surrogaat voor kleine moleculen, tonen we de on-bead etikettering van drie verschillende muis antilichamen direct van cel media met behulp van zowel amine en thiol etikettering chemie. De hoge bindingsaffiniteit van antilichamen aan Proteïne A en Proteïne G zorgt voor een hoge terugwinning en hoge zuiverheid van de gelabelde antilichamen. Bovendien, het gebruik van magnetische korrels kunnen meerdere monsters handmatig worden gehanteerd, waardoor een aanzienlijke verbetering labeling doorvoer.

Een schema voor het labelen van antilichamen met kleine moleculen met behulp van hoge capaciteit magnetische Proteïne A en Proteïne G parels wordt getoond in figuur 1. Antilichamen gevangen op de magnetische proteïne G kralen kunnen met kleine moleculen worden gelabeld, bijvoorbeeld fluorescente kleurstoffen, met behulp van aminechemie welke labels primaire aminen met de lysine aminozuren of middels thiolchemie welke labels aan de gereduceerde thiolen in het scharniergeb...

De on-bead werkwijze voor het labelen van antilichamen met kleine moleculen maakt het kenmerken van een kleine hoeveelheid antilichamen rechtstreeks uit celmedium. Deze methode is geschikt amine en thiol chemie, en kan meerdere monsters tegelijkertijd, handmatig of met geautomatiseerde platforms.

Antilichaam Labeling met fluorescente kleurstoffen met behulp van magnetische Proteïne A en Proteïne G Beads

Antibodies labeled with small molecules like fluorescent dyes, cytotoxic drugs, and radioactive tracers are essential tools in biomedical research, ...

Het algemene doel van deze methode is om antilichamen te labelen met fluorescerende kleurstoffen vanuit gezuiverde monsters of direct vanuit het celmedium met behulp van magnetische proteïne A- of G-beads. Deze methode kan worden gebruikt om de labelingschemie te optimaliseren voor zelfs kleine hoeveelheden antilichamen in het celmedium, wat leidt tot een betere downstream toepassing van de antilichamen.De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat de antilichamen geen zuivering vereisen, dat amine- of thiolchemie kan worden gebruikt en dat de methode geautomatiseerd of handmatig kan worden uitgevoerd. Begin met het gelijkmatig resuspenderen van de beads door voorzichtig te schudden. Voeg vervolgens 50 µL beads toe aan een microcentrifugebuisje van 1,5 mL.Plaats de buis vervolgens in een magnetische standaard. Vervang na 10 seconden voorzichtig de bewaarbuffer door 250 µL antilichaam-bindingsbuffer en meng de beads goed. Vervang na nog eens 10 seconden de bindingsbuffer voorzichtig door één milliliter van het gewenste antilichaam.Meng het monster vervolgens 60 minuten bij kamertemperatuur. Plaats de buisjes na afloop van de incubatie terug op de magneet en verwijder het sup

antibody-labeling-with-fluorescent-dyes-using-magnetic-protein

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

De cel permeabele crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionaat)] stabiliseert van voorbijgaande aard en labiele...

Isolatie van labiele Multi-eiwit-complexen door In vivo Gecontroleerde Cellulaire Cross-Linking and Immuno-magnetische affiniteitschromatografie

This video demonstrates a method to detect the Cyanobacterial strains in an environmental sample using an antibody microarray chip. Samples carrying various bacteria interact with printed antibodies, and immunostaining with fluorophore-labeled anti-cyanobacterial-strain antibodies reveals the presence of specific cyanobacterial strains through fluorescence in distinct spots.

A Technique to Detect Cyanobacterial Strains Using an Antibody Microarray Chip

Source:Rhea Kang1, Gabby Mora1, Sherry Dunbar11Luminex, A DiaSorin Company, Austin.This video demonstrates multiplexed quantitative bacterial detection employing carboxylated magnetic polystyrene microspheres dyed into distinct sets. The procedure encompasses the formation of bead-bacteria complexes, magnetic separation, and flow-based analysis, enabling precise and simultaneous quantification of multiple bacteria in the same reaction well.

Multiplexed Quantitative Bacterial Detection using Dye-Labeled Magnetic Microspheres

We beschrijven een methode om eiwit label op het oppervlak van levende neuronen met een specifiek polyklonaal antilichaam tegen extracellulaire epitopen. Eiwit door het antilichaam gebonden op het celoppervlak en vervolgens geïnternaliseerd via endocytose kunnen worden onderscheiden van eiwitten nog op of verhandeld bij het oppervlak tijdens de incubatie.

Differentiële Labeling van Cell-oppervlak en Internalized Eiwitten na Antibody Voeden van Levende gekweekte neuronen

Elektronenspectroscopisch beeldvorming kan nucleïnezuur en eiwitten onderscheiden met een resolutie van nanometer. Het kan worden gecombineerd met het miniSOG-systeem, dat gelabelde eiwitten specifiek kan markeren in transmissie-elektronenmicroscopie-monsters. We illustreren het gebruik van deze technologieën met dubbelstrengsbreukreparatiefoci als voorbeeld.

Visualisatie van miniSOG Tagged DNA reparatie-eiwitten in combinatie met Electron spectroscopische beeldvorming (ESI)

Hier presenteren we een protocol om chemisch verkennende sondes op een specifieke plaats in een antilichaamfragment in te brengen door genetisch een azid-bevattend aminozuur in te bouwen en vervolgens het azid te koppelen aan een chemische sonde door spanningsgepromoveerde azid-alkyn cycloadditie (SPAAC).

Efficiënt en Site-specifiek antilichaam Labeling by-stam bevorderde azide-alkyn Cycloadditiereacties

Vertalen van ribosoom affiniteits zuivering (trap) maakt snelle en efficiënte isolatie van celtypespecifieke vertalen mRNA. Hier demonstreren we een methode die hydrodynamische staart-ader injectie combineert in een muismodel van lever repopulatie en val om het uitdrukkings Profiel van het herbevolkende hepatocyten te onderzoeken.

Celtype-specifieke genexpressie profilering in de muis lever

We introduceren hier een procedure om eiwit oligomeren en aggregatie in cellysaat en levende cellen te meten met behulp van fluorescentiecorrelatiespectroscopie.

Detectie van eiwitaggregatie met behulp van fluorescentiecorrelatiespectroscopie

Dit protocol beschrijft single-antibody labeling (SAL) om de nanoschaal ruimtelijke organisatie van plasmamembraaneiwitten op te lossen. Door cumulatieve antilichaam-epitoopinteracties op het niveau van één molecuul te benutten, brengt membraan SAL (mSAL) lokale epitoopverdelingen in kaart terwijl het tegelijkertijd het bindingsgedrag van antilichamen in de natuurlijke cellulaire omgeving vastlegt.

Single-molecule localisatiemicroscopie van membraaneiwitten met single-antibody labeling

We hebben een lentivirale vector die, bezit naast de Tat-responsieve LTR, de Rev-respons element (RRE) die reporter genexpressie kan reguleren in een HIV-1-Tat en Rev-afhankelijke manier. De vector maakt de specifieke detectie van HIV-replicatie in levende cellen via de expressie van GFP.

Specifieke markering van de HIV-1 positieve cellen met behulp van een Rev-afhankelijke lentivirale vector uitdrukken van de Green Fluorescent Protein

Leer antilichamen labelen met fluorescente kleurstoffen via magnetische eiwit A/G-beads direct uit celmedium. Deze methode optimaliseert kleine hoeveelheden zuivering en ondersteunt handmatige en geautomatiseerde workflows.

Antilichaam Labeling met fluorescente kleurstoffen met behulp van magnetische Proteïne A en Proteïne G Beads

Meer video's verkennen