Antilichaam Labeling met fluorescente kleurstoffen met behulp van magnetische Proteïne A en Proteïne G Beads

Het algemene doel van deze methode is om antilichamen te labelen met fluorescerende kleurstoffen vanuit gezuiverde monsters of direct vanuit het celmedium met behulp van magnetische proteïne A- of G-beads. Deze methode kan worden gebruikt om de labelingschemie te optimaliseren voor zelfs kleine hoeveelheden antilichamen in het celmedium, wat leidt tot een betere downstream toepassing van de antilichamen.

De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat de antilichamen geen zuivering vereisen, dat amine- of thiolchemie kan worden gebruikt en dat de methode geautomatiseerd of handmatig kan worden uitgevoerd. Begin met het gelijkmatig resuspenderen van de beads door voorzichtig te schudden. Voeg vervolgens 50 µL beads toe aan een microcentrifugebuisje van 1,5 mL.

Plaats de buis vervolgens in een magnetische standaard. Vervang na 10 seconden voorzichtig de bewaarbuffer door 250 µL antilichaam-bindingsbuffer en meng de beads goed. Vervang na nog eens 10 seconden de bindingsbuffer voorzichtig door één milliliter van het gewenste antilichaam.

Meng het monster vervolgens 60 minuten bij kamertemperatuur. Plaats de buisjes na afloop van de incubatie terug op de magneet en verwijder het supernatant wanneer de beads naar de zijkanten van het buisje zijn bewogen. Spoel daarna het mengsel van beads en antilichamen twee keer 10 seconden met telkens 250 microliters antibody-binding wash buffer.

Om de antilichamen te labelen met aminechemie, vervangt u na de tweede wasbeurt de wasbuffer door 100 µL amineconjugatiebuffer en voegt u 2,5 µL vers bereide amine-reactieve kleurstof toe per 100 µg antilichaam. Vortex het monster gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur om de beads tijdens het labelen in suspensie te houden. Plaats de buis vervolgens gedurende 10 seconden terug op de magneet en verwijder het supernatant.

Was de beads twee keer met antibody-binding wash buffer, zoals zojuist gedemonstreerd. Vervang vervolgens de wash buffer door 50 µL elution buffer en meng de beads gedurende vijf minuten. Plaats de buis gedurende 10 seconden terug op de magneet en breng het geëlueerde antilichaam over naar een nieuwe microcentrifugebuis die vijf µL neutralisatiebuffer bevat.

Elueer het antilichaam nogmaals, zoals zojuist gedemonstreerd, en verzamel de geëlueerde monsters. Meet vervolgens de absorbantie van het antilichaam-kleurstofconjugaat bij 280 nanometer en bij de lambda max van de kleurstof. Om de antilichamen te labelen met behulp van thiolchemie, vervangt u na de tweede wasbeurt de wasbuffer door 250 µL thiolconjugatiebuffer en mengt u de beads door voorzichtig te pipetteren.

Was de beads na 10 seconden twee keer met antibody-binding wash buffer. Vervang vervolgens de wash buffer door 100 µL thiol conjugation buffer en voeg DTT toe tot een eindconcentratie van 2,5 mM. Meng de beads gedurende nog eens 60 minuten.

Plaats de kraaltjes vervolgens gedurende 10 seconden terug op de magneet en verwijder de buffer. Voeg daarna 250 µL thiol-conjugatiebuffer toe aan de kraaltjes onder voorzichtig mengen. Was de kraaltjes na 10 seconden twee keer met antibody-binding wasbuffer, waarbij de tweede wasbeurt wordt vervangen door 100 µL verse thiol-conjugatiebuffer.

Voeg nu 2,5 µL vers bereide thiol-reactieve kleurstof toe per 100 µg antilichaam en meng de beads gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur. Plaats de buis aan het einde van de incubatie opnieuw 10 seconden op de magneet. Vervang vervolgens het supernatant door 250 µL verse thiol-conjugatiebuffer onder voorzichtig mengen.

Was de beads na 10 seconden twee keer. Vervang vervolgens de wasbuffer door 50 µL elutiebuffer en elueer het geconjugeerde antilichaam twee keer, zoals zojuist gedemonstreerd. Meet daarna de absorbentie van het antilichaam-kleurstofconjugaat bij 280 nm en bij de lambda max van de kleurstof.

De sterke affiniteit tussen de antilichamen en Proteïne G, de robuuste affiniteit van de magneet voor de beads en de optimalisatie van de methode voorafgaand aan de bead-zuivering leiden samen tot een nominaal verlies van antilichamen tijdens de labelingsreactie, zoals blijkt uit de efficiënte terugwinning van drie verschillende muizenantilichaam-isotypen na fluorescentie-dilabeling vergeleken met eenvoudige zuivering. Deze terugwinning is ook zichtbaar op Coomassie-gels, waarbij de lage niet-specifieke bindingseigenschappen van de magnetische Proteïne G-beads resulteren in de aanwezigheid van hooggezuiverde, fluorescentie-gedilabelde zware en lichte ketens. On-bead labelen met magnetische Proteïne A-beads is daarnaast compatibel met meerdere fluorescente kleurstoffen, wat resulteert in een hoge terugwinning en goede kleurstof-antilichaamverhoudingen.

Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in twee tot drie uur worden voltooid, mits correct uitgevoerd. Hierbij kunnen meerdere monsters handmatig worden verwerkt, of kan een geautomatiseerd platform worden gebruikt voor een hogere doorvoer. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de magnetische kralen te allen tijde in suspensie moeten blijven.

Kies het passende volume magnetische kraaltjes voor het monster. Optimaliseer vervolgens de hoeveelheid fluorescente kleurstof voor het betreffende antilichaam. Na deze procedure moeten de gelabelde antilichamen worden getest om de functionaliteit te bepalen met behulp van relevante biologische assays, zoals ELISA, FACS of celgebaseerde assays.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u gezuiverde en ongezuiverde antilichamen kunt labelen met fluorescente tags of andere kleine moleculen, zoalsbiotine of cytotoxische geneesmiddelen, met behulp van magnetische Protein A- of G-beads.