Colorimetrische Detectie van bacteriën met behulp van lakmoesproef

Het algemene doel van dit experiment is om een eenvoudige, gemodificeerde lakmustest voor de detectie van bacteriën te demonstreren. Deze methode beschrijft hoe een door E.coli geactiveerd RNA-splitsend DNA-enzym gekoppeld kan worden aan een op urease gebaseerd signaaloverdrachtsplatform om een kleurverandering te genereren als reactie op E.coli. De twee belangrijkste voordelen van deze techniek zijn de eenvoud van de test en de toepasbaarheid op andere analyt-responsieve RNA-splitsende DNA-enzymen.

De procedure wordt gedemonstreerd door Seperh Manchehry en Dingran Chang, promovendi uit het laboratorium van Dr. Yingfu Li aan de McMaster University. Nadat de reagentia en buffers volgens het tekstprotocol zijn voorbereid, wordt een stamoplossing van succinimidyl 4-cyclohexaan-1-carboxylaat, of SMCC, gemaakt door één milligram SMCC op te lossen in 676 µL DMSO. Vortex en bewaar op ijs tot gebruik.

Los één milligram urease op in een milliliter 1x PBS en plaats dit op ijs tot gebruik. Om urease-DNA, of UrDNA, te synthetiseren, voegt u 10 µL van 100 µM LD1 toe aan een microcentrifugeebuisje van 2,5 ml. Voeg vervolgens 140 µL dubbel gedestilleerd water en 40 µL 10x PBS toe en vortex.

Voeg vervolgens 80,5 µL SMCC-stock en 159,5 µL DMSO toe. Vortex vervolgens opnieuw en centrifugeer kort in een benchtop-centrifuge. Incubeer de reactie 60 minuten bij 37 °C in een incubator of een heatblock.

Voeg na de incubatie 200 µL 1x PBS, 60 µL 3 M natriumacetaat en 1,5 mL koude 100% ethanol toe aan de buis. Meng door middel van vortexen en incubeer de reactie bij -20 °C gedurende 30 minuten. Centrifugeer de oplossing bij 20.000 ×g en 4 °C gedurende 20 minuten.

Verwijder vervolgens het supernatant en droog de pellet onder vacuüm. Voeg 400 µL urease-stock toe aan de gedroogde pellet en incubeer dit 5 uur bij kamertemperatuur. Breng 200 µL van het ruwe conjugaat over naar een vooraf gewassen centrifugale filterkolom met een molecuulgewichtsafsnijding van 100.000.

Centrifugeer de kolom bij 14,000 ×g gedurende vijf minuten. Overbreng de resterende 200 µL ruw conjugaat naar de kolom en centrifugeer bij 14,000 ×g gedurende vijf minuten. Verwijder vervolgens de kolom en plaats deze ondersteboven in een nieuwe microcentrifugebuis van 2 mL.

Centrifugeer de omgekeerde kolom en buis bij 1.000 ×g gedurende twee minuten. Voeg na het verwijderen van de opvangbuis 30 µL 1x PBS toe aan de centrifugekolom om het membraan te wassen voor extra herstel van conjugaten. Keer de kolom opnieuw om en plaats deze terug in de opvangbuis.

Centrifugeer de kolom bij 1,000 ×g gedurende twee minuten. Verwijder de kolom en gooi deze weg. Bewaar het UrDNA bij vier graden Celsius tot gebruik.

Om een E.coli-geactiveerd RNA-splitsend DNAzym, of EC1, en UrDNA op magnetische kralen te assembleren, mengt u de voorraad magnetische kralen goed en brengt u 100 µL van de kralensuspensie over in een 1,5 mL microcentrifugebuisje. Plaats het buisje vervolgens in een magnetische rekhouder om de kralen te isoleren. Verwijder het supernatant met een pipet en voeg 150 µL bindingsbuffer, of BB, toe aan het buisje.

Verwijder de buis uit de houder en tik voorzichtig tegen de buis om de beads opnieuw te suspenderen tot een homogene oplossing. Nadat de BB-was nog twee keer is herhaald terwijl de beads in suspensie zijn met BB, voegt u 10 µL van 10 µM EC1 toe. Meng voorzichtig door tegen de buis te tikken.

Incubeer de oplossing gedurende 30 minuten onder matig schudden. Tik elke twee tot drie minuten tegen de buis om aggregatie van de beads te voorkomen. Plaats de microcentrifugebuis vervolgens terug op het magnetische rek om de beads te isoleren en verwijder het supernatant met een pipet.

Was de kralen vervolgens drie keer met 150 µL BB. Wanneer het wassen is voltooid, worden de kralen gesuspendeerd in in totaal 150 µL BB. Voeg 15 µL UrDNA aan deze oplossing toe en verhit het monster gedurende twee minuten bij 45 °C, koel de oplossing vervolgens af tot kamertemperatuur en incubeer deze gedurende twee uur. Plaats de microcentrifugebuis terug op het magnetische rek om de kralen te isoleren en verwijder het supernatant via pipetteren.

Voeg 100 µL reactiebuffer, of RB, toe, haal de buis vervolgens uit het magnetische rek en resuspendeer de beads voorzichtig. Nadat de E.coli-cellen volgens het tekstprotocol zijn voorbereid, wordt een microcentrifugebuis van 1,5 mL gepre-gewassen door 100 µL RB toe te voegen en te vortexen. Gooi vervolgens de buffer weg. Voeg 15 µL geassembleerde EC1 toe aan de gewassen buis, plaats de buis op het magnetische rek en aspireer het supernatant.

Haal de buis uit het rek, voeg 100 µL RB toe en resuspendeer de magnetische beads zorgvuldig. Nadat de beads nog twee keer met RB zijn gewassen en de RB is verwijderd, voegt u 10 µL van het E.coli-monster toe aan de buis en mengt u de inhoud voorzichtig door op de buis te tikken. Incubeer de reactie vervolgens gedurende één uur bij kamertemperatuur.

Voeg na de incubatie 90 µL dubbel gedestilleerd water toe en plaats de buis in het magnetische rek. Na ongeveer drie minuten magnetische scheiding wordt 85 µL van het supernatant voorzichtig overgebracht naar een microcentrifugebuis van 0,5 mL. Het is zeer belangrijk om de oplossing voorzichtig te pipetteren zonder magnetische beads op te nemen.

Deze kraaltjes zijn geladen met urease en zullen een fout-positief signaal genereren. Voeg 15 µL 0,04% fenolrood en 100 µL substraatoplossing toe. Neem vervolgens op specifieke tijdsintervallen foto's om een kleurverandering vast te leggen.

De beginset van de lakmustest moet geel zijn, wat duidt op een pH-waarde van de oplossing onder 5,5. Indien nodig kan de begin-pH van de lakmustest worden aangepast met een zwakke buffer, zoals een één millimolaire natriumacetaatbuffer bij pH vijf. Deze figuur toont de resultaten van de bacteriële lakmustest, waarbij E.coli-geactiveerd RNA-splitsend DNAzyme EC1 werd gebruikt als DNAzyme en Fenolrood werd gebruikt als pH-indicator.

Zoals aangetoond door het uitblijven van een kleurverandering bij afwezigheid van E.coli, is EC1 zeer specifiek en vertoont het minimale activiteit tegenover andere bacteriën. De intensiteit van de kleurverandering is afhankelijk van zowel het aantal gebruikte E.coli-cellen in de DNAzyme-activatiestap als de tijd die wordt toegestaan voor de ureumhydrolyse-stap. Meer E.coli-cellen leiden tot een sterkere kleurverandering, en een langere tijd voor de ureumhydrolyse maakt de detectie van een kleiner aantal cellen mogelijk.

Deze grafiek toont de pH-verandering zoals gemonitord met een hand pH-meter. De aanwezigheid van 10⁷ E.coli-cellen resulteerde in een geleidelijke stijging van de pH met drie eenheden binnen 10 minuten. In tegenstelling hiermee veroorzaakte de afwezigheid van E.coli onder dezelfde omstandigheden geen detecteerbare pH-veranderingen.

Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in twee uur worden voltooid als deze correct wordt uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat urease zeer actief is, en dat onvoldoende wassen of contaminatie zal leiden tot een fout-positief resultaat. Na het volgen van deze procedure kan deze methode worden toegepast om te testen op E.coli onder relevantere omstandigheden, zoals bij het testen van de kwaliteit van oppervlaktewater.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van het gebruik van een eenvoudige lakmustest voor het testen op E.coli. Vergeet niet dat deze test kan worden gebruikt om pathogene E.coli te detecteren, wat extreem gevaarlijk is. U moet een biosafety-training volgen voordat u enige van de tests voor pathogene bacteriën uitvoert.