Name: Colorimetrische Detectie van bacteriën met behulp van lakmoesproef (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Leer een eenvoudige kleurmetrische detectiemethode voor E. coli met behulp van een RNA-cleavende DNAzyme gekoppeld aan een ureasesignaalplatform. Deze techniek biedt snelle, specifieke resultaten voor point-of-care diagnostiek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De financiering voor dit onderzoeksproject werd verstrekt door de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) via een Discovery Grant aan YL.

1. Bereiding van reagentia en buffers <ol><li> 0,5 M ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) <ol><li> In een 2 L beker, voeg 186,1 g EDTA tot 800 ml gedeïoniseerd-gedestilleerd water (DDH 2 O). Stel de pH van de oplossing op 8,0 met behulp NaOH pellets. Voeg DDH 2 O tot een eindvolume van 1,0 L en breng de oplossing een autoclaveerbare glazen fles voor autoclaaf en bewaar bij 4 ° C. </li></ol></li><li> 10 × Tris-boraat EDTA (10x TBE) <ol><li> In een 4 L kunststof beker, voeg 432 g Tris-base, 200 g boorzuur, 80 ml ​​0,5 M EDTA (pH 8,0) en DDH 2 O tot een eindvolume van 4 L. Mix met een roerstaafje totdat alle componenten opgelost. Breng de oplossing 1 L glazen flessen voor autoclaaf en bewaar bij 4 ° C. </li></ol></li><li> 10% Denaturing Polyacrylamide Stock <ol><li> In een 4 L plastic beker, voeg 1681,7 g ureum, 400 ml 10x TBE, 1 liter van 40% acrylamide / bisacrylamide (29: 1) oplossing en DDH 2 O tot de fspronkelijke volume 4 L. Meng met behulp van een roerstaafje totdat het ureum wordt opgelost. Breng de oplossing 1 L amberkleurige glazen flessen en bewaar bij 4 ° C. </li></ol></li><li> 2x Gel laadbuffer (2x GLB) <ol><li> In een 200 ml bekerglas, voeg 44 g ureum, 8 g sucrose, 10 mg broomfenol blauw, 10 mg xyleencyanol FF, 400 ui 10% natriumdodecylsulfaat en 4 ml 10 x TBE. Voeg DDH 2 O tot een eindvolume van 40 ml en los de bestanddelen met milde verwarming bij 50 ° C onder mengen met een magnetische roerstaaf. Breng 1 ml aliquot 1,5 ml microfuge buizen en bewaar bij 4 ° C. OPMERKING: Voor gebruik vereist momentane verhitting op 90 ° C om alle vaste stof opnieuw op te lossen. </li></ol></li><li> 1 M Tris-hydrochloride (Tris-HCl) (pH 7,5) <ol><li> In een glazen fles, voeg 12,1 g Tris-base en 70 ml DDH 2 O en meng totdat de vaste stof is opgelost. Op pH 7,5 onder toepassing van 1 M zoutzuur (HCl). Voeg DDH 2 O tot een eindvolume van 100 ml autoclaaf en store bij 4 ° C </li></ol></li><li> 5 M natriumchloride (NaCl) <ol><li> In een glazen fles, los 58,4 g NaCl in 150 ml van DDH 2 O. Stel het volume tot 200 ml met DDH 2 O. Bewaren bij 4 ° C. </li></ol></li><li> DNA Elution Buffer <ol><li> In een glazen fles, meng 2,0 ml 1 M Tris-HCl (pH 7,5), 8,0 ml van 5 M NaCl en 0,4 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0). Stel het volume tot 200 ml met DDH 2 O, autoclaaf en bewaar bij 4 ° C. </li></ol></li><li> 1 M 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethaansulfonzuur (HEPES) (pH 7,4) <ol><li> In een glazen fles, los 2,38 g HEPES in 80 ml ​​DDH 2 O. Op pH 7,4 onder toepassing van 5 N NaOH en voeg DDH 2 O tot een eindvolume van 100 ml. </li></ol></li><li> 1 M magnesiumchloride (MgCl2) <ol><li> In een glazen fles, voeg 2,03 g MgCl 6H 2 O 2 en breng het volume op 100 ml met DDH 2 O. </li></ol></li><li> Reaction Buffer (RB) <ol><li&gt; In een 50 ml conische buis, voeg 50 ul van 1 M HEPES (pH 7,4), 1,5 ml van 5 M NaCl, 0,75 ml 1 M MgCl2 en 5 ul Tween-20. Voeg DDH 2 O tot een eindvolume van 50 ml. Meng de oplossing en filtreer in een conische buis met een injectiespuit aangedreven filter (0,22 pm) en bewaar bij 4 ° C tot gebruik. </li></ol></li><li> Binding Buffer (BB) <ol><li> In een 50 ml conische buis, voeg 500 ul van 1 M Tris-HCl (pH 7,5), 8,8 g NaCl, 50 pl 1 M MgCl2 en 5 ul Tween 20. Voeg DDH 2 O tot een eindvolume van 50 ml. Meng de oplossing en filtreer in een conische buis met een injectiespuit aangedreven filter (0,22 pm) en bewaar bij 4 ° C tot gebruik. </li></ol></li><li> Substrate Solution (SS) <ol><li> In een 50 ml conische buis, voeg 5,8 g NaCl, 3 ml 1 M MgCl2, 1,5 g ureum en 40 ml DDH 2 O. Stel de pH van de oplossing op 5,0 onder toepassing van 10 mM HCl. Omdat de oplossing niet wordt gebufferd, aan te passen pH met behulp van HClvoorzichtig door de toevoeging van kleine hoeveelheden HCl. Voeg DDH 2 O tot een eindvolume van 50 ml. </li><li> Meng de oplossing en filtreer in een conische buis met een injectiespuit aangedreven filter (0,22 pm) en bewaar bij 4 ° C tot gebruik. </li></ol></li><li> Luria Bertani (LB) bouillon <ol><li> In een beker, los 20,0 g LB poeder in 1 L van DDH 2 O. Transfer naar een glazen fles, autoclaaf, en bewaar bij 4 ° C. </li></ol></li><li> 1,5% LB agar <ol><li> In een 250 ml kolf, voeg 1,5 g agar en 100 ml LB-bouillon. Autoclaaf en bewaar bij 4 ° C. </li></ol></li><li> agarplaten <ol><li> Los het LB agar in een magnetron en koel de oplossing tot -50 ° C. Giet de oplossing in petrischalen, waardoor ~ 5 platen en laten stollen. </li></ol></li></ol> 2. Synthese en zuivering van E. coli- responsieve DNAzym EC1 <ol><li> Synthese van EC1 door Template Mediated enzymatische Ligatie <ol><li> Zuiver commercially gesynthetiseerde oligonucleotiden BS1, DE1 en T1 (sequenties gegeven in tabel 1) met 10% denaturerende polyacrylamidegelelektroforese (dPAGE) volgens standaardprotocollen. </li><li> Bereid een 100 uM voorraad BS1, DE1, en T1. Bewaren bij -20 ° C tot gebruik. </li><li> In een 1,5 ml microfugebuis, voeg 38,5 ul van DDH 2 O, 5 pl DE1 en 5 ui 10 x T4 polynucleotide kinase reactiebuffer geleverd met enzym leverancier (500 mM Tris-HCl (pH 7,6), 100 mM MgCl2, 50 mM dithiothreïtol (DTT), 1,0 mM spermidine). </li><li> Voeg 1 pl adenosine trifosfaat (ATP) (100 mM). Voeg 5 eenheden T4 polynucleotidekinase (10 U / pl). Meng door voorzichtig pipetteren het reactiemengsel. </li><li> Incubeer de reactie bij 37 ° C gedurende 30 minuten. </li><li> Schrik de reactie af door verwarming tot 90 ° C gedurende 5 minuten. </li><li> Voeg 118 ul van DDH 2 O, 5 pl BS1 en 5 ui T1. Verwarm de reactie op 90 ° C gedurende 2 min en daarna afkoelen tot kamertemperatuur gedurende 10 min. </li><li> Voeg 20 ul van 10 x T4 DNA ligase reactiebuffer geleverd door de leverancier enzym (400 mM Tris-HCl (pH 7,8), 100 mM MgCl2, 100 mM DTT, 5 mM ATP). Voeg 10 eenheden T4 DNA ligase (5 U / pl) en meng voorzichtig door pipetteren. </li><li> Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 uur. </li><li> Voeg 20 pl 3 M natriumacetaat (NaOAc) (pH 5,2), 500 ul koude 100% ethanol. Meng de oplossing door vortexen en plaatst de buis in een -20 ° C vriezer gedurende 30 minuten. </li><li> Centrifugeer de microfuge bij 20.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C. Verwijder de bovenstaande vloeistof voorzichtig door pipetteren. </li><li> Was de pellet met koude 70% ethanol en centrifugeer opnieuw bij 20.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Opnieuw verwijder het supernatant en droog de pellet onder vacuüm gedurende 10 min. </li><li> Resuspendeer de DNA met 15 ul van DDH 2 O en voeg dan 15 ul van 2x GLB. </li><li> Vortex krachtig en verhit tot 90 ° C2 min. Zuiver het volledige DNA met 10% dPAGE zoals hieronder beschreven. </li></ol></li><li> Opstellen 10% dPAGE <ol><li> Clean twee glasplaten (een vol bord en een getande), twee 0,75 mm dik spacers, en een 12-well kam. Leg één glasplaat op een vlakke ondergrond met twee afstandhouders aan elke kant en de schuine plaat op de top. Clip de twee platen samen met behulp van de vier clips van de leverancier. </li><li> In een 150 ml plastic beker, giet 40 ml 10% dPAGE, 40 gl tetramethylethyleendiamine (TEMED) en 400 gl 10% ammoniumpersulfaat (APS). Meng de componenten en giet de oplossing tussen de platen langzaam. </li><li> Plaats de kam en laat de gel gedurende 10 minuten polymeriseren. Zodra de gel is gepolymeriseerd, langzaam verwijderen van de kam en spoel de putten met DDH 2 O. </li><li> Monteer de platen op de gel-elektroforese apparaat. Gebruik een metalen plaat om warmte gegenereerd om oververhitting te voorkomen verdrijven. </li><li> Giet 1x TBE op de bovenste en onderste kamersen zorgen dat de putjes goed ondergedompeld in de buffer. Spoel de putjes met 1x TBE met behulp van een pipet of spuit. </li><li> Stel het apparaat te draaien op 35 mA en pre-run voor 15 minuten vóór het laden samples. </li></ol></li><li> Elutie van Geligeerd EC1 van 10% dPAGE <ol><li> Na stap 2.2.6, voert u de gel op 35 mA totdat de onderste kleurstof (broomfenolblauw) de bodem van het glas plaat is gekomen. Dit duurt ongeveer 1,5 uur duren. Schakel de stroom uit en verwijder de platen uit het apparaat. </li><li> Leg de platen op een paar vellen papier handdoeken en zorgvuldig de afstandhouders verwijderen uit de glasplaten. Verwijder voorzichtig de bovenste glasplaat en wikkel de gel met plasticfolie. </li><li> Flip de gel over naar de tweede glasplaat te verwijderen en behandel met plastic omslag opnieuw. Zorg ervoor dat de rimpels van de plastic verpakking te vermijden. </li><li> Visualiseer de geligeerde product met behulp van UV-shadowing (260 nm), die zal produceren 4 verschillende DNA-banden (Volledig geligeerde EC1, DE1, BS1 en T1). </li><li&gt; Accijnzen de bovenste band (EC1) met een steriel scheermesje en transfer naar een 1,5 ml microfugebuis. Plet de gel met een steriele pipet (200 ul tip grootte) tot deze overgaat in een fijne pasta. Voeg 550 ul van DNA elutiebuffer, hebben betrekking op de buis met aluminiumfolie om de embedded fluorofoor te beschermen, en schud gedurende 15 min. </li><li> Centrifugeer de geloplossing bij 20.000 xg gedurende 5 min voorzichtig overdracht 400 ul van de supernatant aan een andere 1,5 ml microfugebuis. Vermijd het onttrekken gel stukken tijdens pipetteren. </li><li> De microfuge buis met de supernatant overgebracht voeg 40 pl 3 M NaOAc (pH 5,2) en 1,0 ml koude 100% ethanol. Meng de oplossing door vortexen en plaatst de buis in een -20 ° C vriezer gedurende 30 minuten. </li><li> Centrifugeer de microfuge bij 20.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C. Verwijder de bovenstaande vloeistof voorzichtig door pipetteren. </li><li> Was de pellet met koude 70% ethanol en centrifugeer opnieuw bij 20.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Nogmaals, verwijder desupernatant en droog de pellet onder vacuüm gedurende 10 min. </li><li> Bepaal de concentratie van EC1 door het meten van UV-absorptie bij 260 nm. Wordt 10 uM voorraad- en bewaar het monster bij -20 ° C tot gebruik. </li></ol></li></ol> 3. Conjugatie van urease DNA <ol><li> Bereiding van succinimidyl 4- (N-maleïmidomethyl) cyclohexaan-1-carboxylaat (SMCC) Stock <ol><li> Los 1 mg SMCC in 676 ui DMSO. Vortex en plaats op ijs tot gebruik. </li></ol></li><li> Bereiding van urease Stock <ol><li> Los 1 mg urease in 1 ml 1 x PBS (zonder Mg2 + of Ca2 +). Plaats op ijs tot gebruik. LET OP: De gekristalliseerde urease is traag om op te lossen en voorzichtig mengen is nodig om denaturatie te voorkomen. </li></ol></li><li> Synthese urease-DNA (UrDNA) <ol><li> Voeg 10 ul van 100 uM LD1 een 2,5 ml microfugebuis. Voeg 140 ul van DDH 2 O, 40 ui 10X PBS en vortex. </li><li> Voeg 80,5 ul van SMCC stock, 159,5 pl DMSO, vortex, en in het kort centrifuge met behulp van een benchtop centrifuge. </li><li> Incubeer bij 37 ° C gedurende 60 minuten. Vermijd condensatie onder de microfuge dop. </li><li> Voeg 200 ul van 1 x PBS, 60 gl 3 M NaOAc (pH 5,2) en 1,5 ml koude 100% ethanol. Meng de oplossing door vortexen en incuberen bij -20 ° C gedurende 30 minuten. </li><li> Centrifugeer de oplossing bij 20.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en droog de pellet onder vacuüm. Vermijd over-drogen. </li><li> De gedroogde pellet voeg 400 pl urease voorraad en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 uur. </li><li> Transfer 200 ul van ruwe conjugaat een voorgewassen 100K MWCO centrifugale filterkolom. Centrifugeer de kolom bij 14.000 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Draagt ​​de resterende 200 pl van ruwe conjugaat aan de kolom en centrifugeer bij 14.000 xg gedurende 5 minuten. Verwijder de kolom en plaats hem ondersteboven in een nieuwe 2,0 ml microfugebuis ( &quot;collectie tube&quot;). </li><li> CENTRIFUGE de verzamelbuis (met omgekeerde kolom) bij 1000 g gedurende 2 min. Verwijder de verzamelbuis en voeg 30 ul van 1 x PBS om de centrifugale kolom membraan wassen extra terugwinning van conjugaten. </li><li> Opnieuw keren de kolom en zet terug in de verzamelbuis. Centrifugeer de verzamelbuis (met omgekeerde kolom) bij 1000 g gedurende 2 min. Verwijder en gooi de kolom. </li><li> Bewaar de UrDNA bij 4 ° C tot gebruik. </li></ol></li></ol> 4. Montage van de EC1 en UrDNA op Magnetic Beads <ol><li> Meng de magnetische bead (MB) stock goed en breng 100 ui MB suspensie tot een 1,5 ml microfugebuis. Plaats de microfugebuis op een magnetische rek houder voor het isoleren van de MB. </li><li> Verwijder het supernatant door pipetteren en voeg 150 ul bindingsbuffer (BB) naar de buis. Haal de buis uit de houder en tik voorzichtig de tube naar MB mengen om een ​​homogene oplossing. Vermijd spatten van de schorsing van de top van de buis of pet. Als dit gebeurt, gebruik dan een benchtop centrifuge kort draaien de rest terug naar de opschorting. </li><li> Herhaal stap 4.2 nog twee keer. </li><li> Aan deze suspensie voeg 10 ul van 10 uM EC1. Zorgvuldig mengen door te tikken op de buis. </li><li> Incubeer de oplossing met milde schudden gedurende 30 minuten. Tik de buis om de 2-3 minuten om het neerslaan van de MB te voorkomen. </li><li> Plaats de microfugebuis terug op de magnetische rek aan de MB te isoleren en verwijder het supernatant door pipetteren. Was de MB driemaal met 150 ui BB (zoals beschreven in stap 4.2). </li><li> Zodra het wassen is voltooid, schorten de MB in een totaal van 150 ul van BB. Aan deze oplossing, voeg 15 ul UrDNA en verwarm de oplossing tot 45 ° C gedurende 2 minuten. Koel de oplossing af tot kamertemperatuur en incubeer gedurende 2 uur. </li><li> Plaats de microfugebuis terug op de magnetische rek aan de MB te isoleren en verwijder het supernatant door pipetteren. </li><li> Voeg 100 ul van de reactie buffer (RB). Verwijder tHij microfugebuisje uit de magnetische rek en voorzichtig resuspendeer de MB. </li><li> Was de MB meer drie keer, herhaalt u stap 4.9. OPMERKING: De gewassen supernatant kan snel worden getest om te bepalen of gehybridiseerde UrDNA aanhoudt, hetgeen kan leiden tot een vals positief signaal. De test kan worden uitgevoerd door het toevoegen van 10 ui 50 mM ureum en 10 pl 0,04% fenolrood aan het wassop. Blijf de MB wassen totdat de wasoplossing een kleurverandering veroorzaakt. De 100 gl suspensie wordt opgeslagen bij 4 ° C tot gebruik. </li></ol> 5. Bereiding van bacteriële cellen 20 <ol><li> Kweken E. coli van Voorraden <ol><li> Plate E. coli K12 (MG1655) op LB agarplaten uit een glycerol voorraad onder een vlam of in een biologisch veiligheidskabinet. </li><li> Met behulp van een steriele pipet tip, zachtjes aanraken de glycerol voorraad en licht streak het oppervlak van een agarplaat om te voorkomen dat aanprikken van de LB-agar. </li><li> Keren de weggeschotenplaat en incubeer bij 37 ° C gedurende 14 uur. </li><li> Verzegel de plaat met Parafilm en bewaar bij 4 ° C gedurende maximaal 3 weken. </li></ol></li><li> Kweken E. coli for Cell Counting <ol><li> In een steriele 14 ml cultuur buis, afzien van 2 ml LB-bouillon. </li><li> Met behulp van een steriele pipet tip, kies een enkele kolonie van de uitgestreken agarplaat bereid in stap 5.1 en over te dragen aan de cultuur buis. </li><li> Incubeer de kweek bij 37 ° C en schudden bij 230 rpm gedurende 14 uur. </li><li> Serieel verdunnen de bacteriecultuur in 10-voudige intervallen. </li><li> Voor elk verdund monster gelijkmatig plaat vijf 100 ul aliquots op afzonderlijke LB agarplaten. De platen om en incubeer bij 37 ° C gedurende 14 uur. </li><li> Tel de cellen van elk monster met het gemiddelde celconcentratie van elke verdunning te verkrijgen. LET OP: 10 7 cellen worden vaak gebruikt voor het opzetten van een verwijzing lakmoesproef voor E. coli als dit niveau van E. coli kan een snelle kleur chan triggerenge. Toch kan een goed uitgevoerde lakmoesproef detecteren vanaf 500 cellen, zoals besproken bij de Resultaten. </li></ol></li><li> Het voorbereiden van E. coli cellen voor het testen <ol><li> Voor een gewenste celsuspensie overdracht 1 ml van gekweekte bouillon aan een 1,5 ml microfugebuis. </li><li> Centrifugeer de cellen bij 6000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Verwijder voorzichtig de bovenstaande vloeistof zonder de cel pellet. </li><li> Voeg 10 ul reactiebuffer aan de cel pellet en resuspendeer de cellen. Ultrasone trillingen de celsuspensie gedurende 5 minuten. Breng de celsuspensie een ijs doos voor 5 min. </li><li> Ultrasone trillingen de celsuspensie gedurende nog 5 min. </li><li> Centrifugeer de celsuspensie bij 13.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Met de bovenstaande vloeistof te testen (10 ui). </li></ol></li></ol> 6. lakmoesproef <ol><li> In een 1,5 ml microfugebuis, voorwas de buis door het toevoegen en vortexen 100 gl reactiebuffer (RB) in de microfugebuis engooi de buffer. </li><li> Overdracht 15 ul van geassembleerde EC1 (protocol 4) aan de gewassen microfugebuis. </li><li> Was de magnetische korrels door het plaatsen van de microfugebuis op een magnetisch rek. Verwijder het supernatant door pipetteren. Verwijder de microfuge buis uit het rek, voeg 100 pl RB en voorzichtig resuspendeer de magnetische korrels. </li><li> Was de MB meer twee keer door het herhalen van stap 6.3. </li><li> Plaats de microfugebuis terug op de magnetische rek, de bovenstaande vloeistof en voeg de 10 ul E. coli monster bereid uit stap 5.3. </li><li> Meng het monster en magnetische bolletjes zorgvuldig door zachtjes tikken op de microfugebuis. </li><li> Incubeer het reactiemengsel bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. </li><li> Aan het reactiemengsel, voeg 90 ul van DDH 2 O en plaats de microcentrifugebuis op een magnetisch rek. </li><li> Na ongeveer 3 minuten van magnetische scheiding, zorgvuldig overdracht 85 ul van de supernatant aan een 0,5 ml microfugebuis. Trek de supernatant langzaam naarvoorkomen dat het verzamelen van alle magnetische bolletjes. </li><li> Om het bovenstaande microfugebuis voeg 15 pl 0,04% fenolrood, en 100 pl substraatoplossing. </li><li> Maak een foto op specifieke tijdstippen om kleurverandering te nemen. OPMERKING: De verandering van de pH kan ook worden geanalyseerd met een pH-meter met een micro-elektrode. Het uitgangsmateriaal moet ongeveer pH 5,2-5,5 is (de oplossing is geel). Indien niet, kan de oplossing worden ingesteld door toevoeging van 1 mM acetaat buffer pH 5,0). </li></ol>

<ol><li>Daar, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Top+ten+biotechnologies+for+improving+health+in+developing+countries%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Top ten biotechnologies for improving health in developing countries.</a> Nat. Genet. 32, 229-232 (2002).</li>
<li>Newman, J. D., Turner, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Home+blood+glucose+biosensors%3A+a+commercial+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Home blood glucose biosensors: a commercial perspective.</a> Biosens. Bioelectron. 20, 2435-2453 (2005).</li>
<li>Turner, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosensors%3A+sense+and+sensibility%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Biosensors: sense and sensibility.</a> Chem. Soc. Rev. 42, 3184-3196 (2013).</li>
<li>Tram, K., Kanda, P., Salena, B. J., Huan, S. Y., Li, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+Bacterial+Detection+by+DNAzymes+into+a+Litmus+Test%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Translating Bacterial Detection by DNAzymes into a Litmus Test.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 53, 12799-12802 (2014).</li>
<li>Ali, M. M., Aguirre, S. D., Lazim, H., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorogenic+DNAzyme+probes+as+bacterial+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Fluorogenic DNAzyme probes as bacterial indicators.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 50, 3751-3754 (2011).</li>
<li>Schlosser, K., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biologically+inspired+synthetic+enzymes+made+from+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Biologically inspired synthetic enzymes made from DNA.</a> Chem. Biol. 16, 311-322 (2009).</li>
<li>Tuerk, C., Gold, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evolution+of+ligand+by+exponential+enrichment%3A+RNA+ligands+to+bacteriophage+T4+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic evolution of ligand by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> Science. 249, 505-510 (1990).</li>
<li>Ellington, A. D., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+of+RNA+molecules+that+bind+specific+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands.</a> Nature. 346, 818-822 (1990).</li>
<li>Breaker, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+catalytic+DNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Making catalytic DNAs.</a> Science. 290, 2095-2096 (2000).</li>
<li>Liu, J., Cao, Z., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+nucleic+acid+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Functional nucleic acid sensors.</a> Chem. Rev. 109, 1948-1998 (2009).</li>
<li>Navani, N. K., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+aptamers+and+enzymes+as+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid aptamers and enzymes as sensors.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 10, 272-281 (2006).</li>
<li>Li, J., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+sensitive+and+selective+catalytic+DNA+biosensor+for+lead+ions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">A highly sensitive and selective catalytic DNA biosensor for lead ions.</a> J. Am. Chem. Soc. 122, 10466-10467 (2000).</li>
<li>Liu, J., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+colorimetric+lead+biosensor+using+DNAzyme-directed+assembly+of+gold+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">A colorimetric lead biosensor using DNAzyme-directed assembly of gold nanoparticles.</a> J. Am. Chem. Soc. 125, 6642-6643 (2003).</li>
<li>Liu, Z., Mei, S. H. J., Brennan, J. D., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assemblage+of+signaling+DNA+enzymes+with+intriguing+metal+specificity+and+pH+dependence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Assemblage of signaling DNA enzymes with intriguing metal specificity and pH dependence.</a> J. Am. Chem. Soc. 125, 7539-7545 (2003).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+catalytic+beacon+sensor+for+uranium+with+parts-per-trillion+sensitivity+and+millionfold+selectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">A catalytic beacon sensor for uranium with parts-per-trillion sensitivity and millionfold selectivity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 2056-2061 (2007).</li>
<li>Huang, P. J., Vazin, M., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+of+a+new+lanthanide-dependent+DNAzyme+for+ratiometric+sensing+lanthanides%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">In vitro selection of a new lanthanide-dependent DNAzyme for ratiometric sensing lanthanides.</a> Anal. Chem. 86, 9993-9999 (2014).</li>
<li>Chiuman, W., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+fluorescent+sensors+engineered+with+catalytic+DNA+%27MgZ%27+based+on+a+non-classic+allosteric+design%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Simple fluorescent sensors engineered with catalytic DNA 'MgZ' based on a non-classic allosteric design.</a> PLoS One. 2, e1224(2007).</li>
<li>Xiang, Y., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+personal+glucose+meters+and+functional+DNA+sensors+to+quantify+a+variety+of+analytical+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem%22%5BJournal%5D)">Using personal glucose meters and functional DNA sensors to quantify a variety of analytical targets.</a> Nat. Chem. 3, 697-703 (2011).</li>
<li>Aguirre, S. D., Ali, M. M., Salena, B. J., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+DNA+enzyme-based+fluorescent+assay+for+bacterial+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">A sensitive DNA enzyme-based fluorescent assay for bacterial detection.</a> Biomolecules. 3, 563-577 (2013).</li>
<li>Aguirre, S. D., Ali, M. M., Kanda, P., Li, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Bacteria+Using+Fluorogenic+DNAzymes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes.</a> J. Vis. Exp. (63), e3961(2012).</li>
<li>Shen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+catalytic+DNA+activated+by+a+specific+strain+of+bacterial+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">A catalytic DNA activated by a specific strain of bacterial pathogen.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 54, (2015).</li>
<li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+specific+recognition+of+breast+tumors+by+an+RNA-cleaving+fluorogenic+DNAzyme+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Highly specific recognition of breast tumors by an RNA-cleaving fluorogenic DNAzyme probe.</a> Anal. Chem. 87, 569-577 (2015).</li>
<li>Sumner, J. B., Hand, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoelectric+point+of+crystalline+urease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Isoelectric point of crystalline urease.</a> J. Am. Chem. Soc. 51, 1255-1260 (1929).</li>
<li>Karplus, P. A., Pearson, M., Hausinger, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((70+Years+of+crystalline+urease%3A+What+have+we+learned%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">70 Years of crystalline urease: What have we learned.</a> Acc. Chem. Res. 30, 330-337 (1997).</li>
<li>Omiccioli, E., Amagliani, G., Brandi, G., Magnani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+platform+for+Real-Time+PCR+detection+of+Salmonella+spp.%2C+Listeria+monocytogenes+and+Escherichia+coli+O157+in+milk%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A new platform for Real-Time PCR detection of Salmonella spp., Listeria monocytogenes and Escherichia coli O157 in milk.</a> Food Microbiol. 26, 615-622 (2009).</li>
<li>Cui, S., Schroeder, C. M., Zhang, D. Y., Meng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+sample+preparation+method+for+PCR-based+detection+of+Escherichia+coli+O157%3AH7+in+ground+beef%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid sample preparation method for PCR-based detection of Escherichia coli O157:H7 in ground beef.</a> J. Appl. Microbiol. 95, 129-134 (2003).</li>
<li>Ibekwe, A. M., Watt, P. M., Grieve, C. M., Sharma, V. K., Lyons, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+fluorogenic+real-time+PCR+for+detection+and+quantification+of+Escherichia+coli+O157%3AH7+in+dairy+wastewater+wetlands%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multiplex fluorogenic real-time PCR for detection and quantification of Escherichia coli O157:H7 in dairy wastewater wetlands.</a> Appl. Environ. Microbiol. 68, 4853-4862 (2002).</li>
<li>Strachan, N. J., Ogden, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+microsphere+coagulation+ELISA+for+Escherichia+coli+O157%3AH7+using+Russell%27s+viper+venom%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">A sensitive microsphere coagulation ELISA for Escherichia coli O157:H7 using Russell's viper venom.</a> FEMS Microbiol Lett. 186, 79-84 (2000).</li>
<li>de Boer, E., Beumer, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodology+for+detection+and+typing+of+foodborne+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Food+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Methodology for detection and typing of foodborne microorganisms.</a> Int. J. Food Microbiol. 50, 119-130 (1999).</li>
<li>Gracias, K. S., McKillip, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+conventional+detection+and+enumeration+methods+for+pathogenic+bacteria+in+food%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A review of conventional detection and enumeration methods for pathogenic bacteria in food.</a> Can. J. Microbiol. 50, 883-890 (2004).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De vertaling van de werking van de RNA-splitsingsactiviteit van een bacterie-reagerend DNAzym een lakmoesproef wordt mogelijk gemaakt door het gebruik van urease en magnetische scheiding, zoals blijkt uit figuur 1. Hoewel de demonstratie van de gemodificeerde lakmoesproef voor bacteriële detectie uitgevoerd met E. coli afhankelijke RNA-klieven DNAzym, 5,19,20 het ontwerp kan worden over het algemeen uitgeschoven-RNA klieven DNAzym. Gezien de grote beschikbaarheid van RNA splitsende D...

Bacteriele pathogeen zijn een van de belangrijkste oorzaken van wereldwijde morbiditeit en mortaliteit. Uitbraken van ziekenhuisinfecties, door voedsel overgebrachte ziekteverwekkers en bacteriële verontreinigingen in het milieu vormen ernstige en voortdurende bedreigingen voor de volksgezondheid en veiligheid. Om deze uitbraken te voorkomen, zijn effectieve hulpmiddelen nodig die de detectie van pathogeen op tijd mogelijk maken onder verschillende omstandigheden. Eenvoudige maar nog steeds effectieve tests die draagbaar en kosteneffectief zijn, worden zeer gewaardeerd, vooral in regio's die vatbaar zijn voor uitbraken maar zich geen dure testfaciliteiten kunnen veroorloven.1-3 Hoewel er een veelvoud aan methoden bestaat om bacteriën te detecteren, zijn veel van hen niet geschikt als screening- of on-site testhulpmiddelen omdat ze lange testtijden, dure instrumenten en gecompliceerde testprocedures vereisen.
Colorimetrische tests zijn bijzonder aantrekkelijk voor punt-van-zorg of veldtoepassingen, omdat kleurveranderingen gemakkelijk met het blote oog kunnen worden gedetecteerd. De lakmoestest voor pH is eenvoudig, snel en effectief. Hoewel het een zeer oude technologie is, wordt het vandaag de dag nog steeds veel gebruikt vanwege de eenvoud en effectiviteit. Verrassend genoeg is deze eenvoudige test nog nooit gewijzigd om de detectie van andere analyten te bereiken voordat we onlangs een aanpak ontwikkelden om deze test voor E. coli-testen aan te passen.4
De uitgebreide lakmoestest voor E. coli maakt gebruik van drie extra componenten: een E. coli-geactiveerd RNA-klevend DNAzyme (EC1), 5 urease en magnetische kralen. DNAzymes verwijzen naar synthetische enkelstrengs DNA-moleculen met katalytische activiteit.6 Ze kunnen worden geïsoleerd uit willekeurige DNA-sequentiepools met behulp van in vitro selectie.7,8 Ze zijn zeer stabiel en kunnen kosteneffectief worden geproduceerd met behulp van hoogwaardige geautomatiseerde DNA-synthese.9 Om deze redenen zijn DNAzymes, met name RNA-klevende DNAzymes, op grote schaal onderzocht voor biosensing-toepassingen.6,10,11 RNA-klevende DNAzyme-sensoren zijn ontwikkeld om metaalionen te detecteren,12-16 kleine moleculen,17,18 bacteriële pathogeen5,19-21 en kankercellen.22 Gezien de grote beschikbaarheid van doel-geïnduceerde RNA-klevende DNAzymes, kan elk onderzoek dat een DNAzyme gebruikt, mogelijk worden uitgebreid om een ​​diverse reeks analyten te detecteren.
Urease is gekozen vanwege zijn vermogen om ureum te hydrolyseren tot ammoniak,23,24 wat resulteert in een pH-verhoging. Urease is ook zeer efficiënt, stabiel en geschikt voor conjugatie met andere biomoleculen. Daarom postuleerden we dat een conjugaat van een RNA-klevende DNAzyme met urease het gebruik van de lakmoestest zou toestaan ​​voor de detectie van andere doelen.5
De werking van het RNA-klevende DNAzyme wordt overgebracht naar de urease-gemedieerde pH-verhoging door het gebruik van magnetische kralen die geïmmobiliseerd zijn met het DNAzyme-ureumconjugaat. Omdat de activiteit van het onderzochte DNAzyme strikt afhankelijk is van E. coli, zal de aanwezigheid van deze bacterie in de testoplossing resulteren in de afgifte van urease uit de magnetische kralen naar de oplossing, die vervolgens wordt genomen en gebruikt om ureum te hydrolyseren in een reporteroplossing die een pH-gevoelige kleurstof bevat. Het uiteindelijke resultaat van deze procedure is een kleurverandering die gemakkelijk kan worden gemeld door de kleurstof of pH-papier.

<table><tbody><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>VWR AMRESCO</td><td>0105</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide (NaOH) pellets</td><td>BIO BASIC CANADA INC.</td><td>SB6789</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>VWR AMRESCO</td><td>0497</td><td></td></tr><tr><td>Boric acid</td><td>AMRESCO</td><td>0588</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>VWR AMRESCO</td><td>M123</td><td></td></tr><tr><td>40% acrylamide/bisacrylamide (29:1) solution</td><td>BIO BASIC CANADA INC.</td><td>A0007</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Bioshop Canada inc.</td><td>SUC507</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol blue</td><td>Bioshop Canada inc.</td><td>BRO777</td><td></td></tr><tr><td>Xylenecyanol FF</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>X-4126</td><td></td></tr><tr><td>10% sodium dodecyl sulfate</td><td>Bioshop Canada inc.</td><td>SDS001</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric Acid (HCl)</td><td>CALEDON LABORATORIES LTD</td><td>6026</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride (NaCl)</td><td>Bioshop Canada inc.</td><td>SOD001</td><td></td></tr><tr><td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td><td>Bioshop Canada inc.</td><td>HEP001</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Chloride (II) hexahydrate</td><td>VWR AMRESCO</td><td>0288</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Bioshop Canada inc.</td><td>TW508</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine Triphospahte (ATP)</td><td>AMRESCO</td><td>0220</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Acetate trihydrate (NaOAc)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>S8625</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Commercial Alcohols</td><td>P016EAAN</td><td></td></tr><tr><td>Tetramethyleneethylenediamine (TEMED)</td><td>AMRESCO</td><td>0761</td><td></td></tr><tr><td>10% Ammonium persulfate (APS)</td><td>BIO BASIC CANADA INC.</td><td>AB0072</td><td></td></tr><tr><td>Succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC)</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>22360</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>CALEDON LABORATORIES</td><td>803540</td><td></td></tr><tr><td>Urease</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>U0251</td><td></td></tr><tr><td>1x Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>70011-069</td><td></td></tr><tr><td>0.04% Phenol red</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P3532</td><td></td></tr><tr><td>10x T4 polynucleotide kinase reaction buffer</td><td>Lucigen</td><td>30061-1</td><td></td></tr><tr><td>10x T4 DNA ligase reaction buffer</td><td>Bio Basics Canada</td><td>B1122-B</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligase (5 U/&#956;l)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>B1122</td><td></td></tr><tr><td>Luria Bertani (LB) Broth</td><td>AMRESCO</td><td>J106</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>AMRESCO</td><td>J637</td><td></td></tr><tr><td>T4 polynucleotide kinase (10 U/&#956;l)</td><td>Lucigen</td><td>30061-1</td><td></td></tr><tr><td>E. coli K12 (MG1655)</td><td>ATCC</td><td>ATCC700926</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>392187</td><td></td></tr><tr><td>Glass plates</td><td>CBS scientific</td><td>ngp-250nr</td><td></td></tr><tr><td>0.75 mm thick spacers</td><td>CBS scientific</td><td>VGS-0725r</td><td></td></tr><tr><td>12-well comb</td><td>CBS scientific</td><td>VGC-7512</td><td></td></tr><tr><td>UV Lamp</td><td>UVP</td><td>95-0017-09</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer (NanoVue)</td><td>GE Healthcare</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Metal plate</td><td>CBS scientific</td><td>CPA165-250</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>VWR International</td><td>58816-123</td><td></td></tr><tr><td>Gel electrophoresis apparatus</td><td>CBS scientific</td><td>ASG-250</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>VWR International</td><td>25384-342</td><td></td></tr><tr><td>100 kDa MWCO centrifugal filters</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC510024</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic Bead (BioMag)</td><td>Bangs Laboratories Inc</td><td>BM568</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic Seperation Rack</td><td>New England BioLabs</td><td>S1506S</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge tubes</td><td>Sarstedt</td><td>72.69</td><td></td></tr><tr><td>Syringe filter (0.22 &#956;m)</td><td>VWR International</td><td>28145-501</td><td></td></tr><tr><td>14 ml culture tube</td><td>VWR International</td><td>60818-725</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture incubator</td><td>Eppendorf Scientific</td><td>M13520000</td><td></td></tr><tr><td>Branson Ultrasonic cleaner</td><td>Branson</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Camera (Canon Powershot G11)</td><td>Canon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>50 ml conical tube</td><td>VWR International</td><td>89004-364</td><td></td></tr></tbody></table>

colorimetrische detectie van bacteriën met behulp van lakmoesproef

Colorimetric Detection of Bacteria Using Litmus Test

Er is een toenemende vraag naar eenvoudige maar nog steeds effectieve methoden die kunnen worden gebruikt om specifieke pathogenen te detecteren voor toepassingen op locatie of in het veld. Dergelijke methoden moeten gebruiksvriendelijk zijn en betrouwbare resultaten opleveren die gemakkelijk kunnen worden geïnterpreteerd door zowel specialisten als niet-professionals. De lakmoesproef voor pH is eenvoudig, snel en effectief omdat het de pH van een testmonster rapporteert via een eenvoudige kleurverandering. We hebben een aanpak ontwikkeld om gebruik te maken van de lakmoesproef voor bacteriedetectie. De methode maakt gebruik van een bacteriespecifiek RNA-splitsend DNAzyme om twee functies te bereiken: het herkennen van een bepaalde bacterie en het bieden van een mechanisme om de activiteit van urease te controleren. Door het gebruik van magnetische kralen geïmmobiliseerd met een DNAzyme-urease-conjugaat, wordt de aanwezigheid van bacteriën in een testmonster doorgegeven aan de afgifte van urease van de kralen naar de oplossing. De vrijgekomen urease wordt overgebracht naar een testoplossing om ureum te hydrolyseren tot ammoniak, wat resulteert in een pH-verhoging die kan worden gevisualiseerd met behulp van de klassieke lakmoesproef.

Het principe van de bacteriële lakmoesproef wordt toegelicht in figuur 1 de test gebruikt drie belangrijke materialen. Een RNA-splitsende DNAzym dat wordt geactiveerd door een specifieke bacterie, urease en magnetische korrels. De DNAzym wordt gebruikt als element moleculaire herkenning voor de specifieke detectie van een bacterie van belang te bereiken. Urease en magnetische korrels worden gebruikt om signaaltransductie van de RNA-splitsingsactiviteit van het DNAzym ber...

We beschrijven een protocol voor colorimetrische detectie van E. coli met behulp van een gemodificeerde lakmoestest die gebruikmaakt van een RNA-splitsend DNAzyme, urease en magnetische kralen.

Colorimetrische Detectie van bacteriën met behulp van lakmoesproef

There are increasing demands for simple but still effective methods that can be used to detect specific pathogens for point-of-care or field applications. ...

Het algemene doel van dit experiment is om een eenvoudige, gemodificeerde lakmustest voor de detectie van bacteriën te demonstreren. Deze methode beschrijft hoe een door E.coli geactiveerd RNA-splitsend DNA-enzym gekoppeld kan worden aan een op urease gebaseerd signaaloverdrachtsplatform om een kleurverandering te genereren als reactie op E.coli. De twee belangrijkste voordelen van deze techniek zijn de eenvoud van de test en de toepasbaarheid op andere analyt-responsieve RNA-splitsende DNA-enzymen.De procedure wordt gedemonstreerd door Seperh Manchehry en Dingran Chang, promovendi uit het laboratorium van Dr. Yingfu Li aan de McMaster University. Nadat de reagentia en buffers volgens het tekstprotocol zijn voorbereid, wordt een stamoplossing van succinimidyl 4-cyclohexaan-1-carboxylaat, of SMCC, gemaakt door één milligram SMCC op te lossen in 676 µL DMSO. Vortex en bewaar op ijs tot gebruik.Los één milligram urease op in een milliliter 1x PBS en plaats dit op ijs tot gebruik. Om urease-DNA, of UrDNA, te synthetiseren, voegt u 10 µL van 100 µM LD1 toe aan een microcentrifugeebuisje van 2,5 ml. Voeg vervolgens 140 µL dubbel gedestilleerd water en 40 µL 10x PBS toe en vortex.Voeg vervolgens 80,5 µL SMCC-stock en 159,5 µL DMSO toe. Vortex vervolgens opnieuw en centrifugeer kort in een benchtop-centrifuge. Incubeer de reactie 60 minuten bij 37 °C in een incubator of een heatblock.Voeg na de incubatie 200 µL 1x PBS, 60 µL 3 M natriumacetaat en 1,5 mL koude 100% ethanol toe aan de buis. Meng door middel van vortexen en incubeer de reactie bij -20 °C gedurende 30 minuten. Centrifugeer de oplossing bij 20.000 ×g en 4 °C gedurende 20 minuten.Verwijder vervolgens het supernatant en droog de pellet onder vacuüm. Voeg 400 µL urease-stock toe aan de gedroogde pellet en incubeer dit 5 uur bij kamertemperatuur. Breng 200 µL van het ruwe conjugaat over naar een vooraf gewassen centrifugale filterkolom met een molecuulgewichtsafsnijding van 100.000.Centrifugeer de kolom bij 14,000 ×g gedurende vijf minuten. Overbreng de resterende 200 µL ruw conjugaat naar de kolom en centrifugeer bij 14,000 ×g gedurende vijf minuten. Verwijder vervolgens de kolom en plaats deze ondersteboven in een nieuwe microcentrifugebuis van 2 mL.Centrifugeer de omgekeerde kolom en buis bij 1.000 ×g gedurende twee minuten. Voeg na het verwijderen van de opvangbuis 30 µL 1x PBS toe aan de centrifugekolom om het membraan te wassen voor extra herstel van conjugaten. Keer de kolom opnieuw om en plaats deze terug in de opvangbuis.Centrifugeer de kolom bij 1,000 ×g gedurende twee minuten. Verwijder de kolom en gooi deze weg. Bewaar het UrDNA bij vier graden Celsius tot gebruik.Om een E.coli-geactiveerd RNA-splitsend DNAzym, of EC1, en UrDNA op magnetische kralen te assembleren, mengt u de voorraad magnetische kralen goed en brengt u 100 µL van de kralensuspensie over in een 1,5 mL microcentrifugebuisje. Plaats het buisje vervolgens in een magnetische rekhouder om de kralen te isoleren. Verwijder het supernatant met een pipet en voeg 150 µL bindingsbuffer, of BB, toe aan het buisje.Verwijder de buis uit de houder en tik voorzichtig tegen de buis om de beads opnieuw te suspenderen tot een homogene oplossing. Nadat de BB-was nog twee keer is herhaald terwijl de beads in suspensie zijn met BB, voegt u 10 µL van 10 µM EC1 toe. Meng voorzichtig door tegen de buis te tikken.Incubeer de oplossing gedurende 30 minuten onder matig schudden. Tik elke twee tot drie minuten tegen de buis om aggregatie van de beads te voorkomen. Plaats de microcentrifugebuis vervolgens terug op het magnetische rek om de beads te isoleren en verwijder het supernatant met een pipet.Was de kralen vervolgens drie keer met 150 µL BB. Wanneer het wassen is voltooid, worden de kralen gesuspendeerd in in totaal 150 µL BB. Voeg 15 µL UrDNA aan deze oplossing toe en verhit het monster gedurende twee minuten bij 45 °C, koel de oplossing vervolgens af tot kamertemperatuur en incubeer deze gedurende twee uur. Plaats de microcentrifugebuis terug op het magnetische rek om de kralen te isoleren en verwijder het supernatant via pipetteren.Voeg 100 µL reactiebuffer, of RB, toe, haal de buis vervolgens uit het magnetische rek en resuspendeer de beads voorzichtig. Nadat de E.coli-cellen volgens het tekstprotocol zijn voorbereid, wordt een microcentrifugebuis van 1,5 mL gepre-gewassen door 100 µL RB toe te voegen en te vortexen. Gooi vervolgens de buffer weg. Voeg 15 µL geassembleerde EC1 toe aan de gewassen buis, plaats de buis op het magnetische rek en aspireer het supernatant.Haal de buis uit het rek, voeg 100 µL RB toe en resuspendeer de magnetische beads zorgvuldig. Nadat de beads nog twee keer met RB zijn gewassen en de RB is verwijderd, voegt u 10 µL van het E.coli-monster toe aan de buis en mengt u de inhoud voorzichtig door op de buis te tikken. Incubeer de reactie vervolgens gedurende één uur bij kamertemperatuur.Voeg na de incubatie 90 µL dubbel gedestilleerd water toe en plaats de buis in het magnetische rek. Na ongeveer drie minuten magnetische scheiding wordt 85 µL van het supernatant voorzichtig overgebracht naar een microcentrifugebuis van 0,5 mL. Het is zeer belangrijk om de oplossing voorzichtig te pipetteren zonder magnetische beads op te nemen.Deze kraaltjes zijn geladen met urease en zullen een fout-positief signaal genereren. Voeg 15 µL 0,04% fenolrood en 100 µL substraatoplossing toe. Neem vervolgens op specifieke tijdsintervallen foto's om een kleurverandering vast te leggen.De beginset van de lakmustest moet geel zijn, wat duidt op een pH-waarde van de oplossing onder 5,5. Indien nodig kan de begin-pH van de lakmustest worden aangepast met een zwakke buffer, zoals een één millimolaire natriumacetaatbuffer bij pH vijf. Deze figuur toont de resultaten van de bacteriële lakmustest, waarbij E.coli-geactiveerd RNA-splitsend DNAzyme EC1 werd gebruikt als DNAzyme en Fenolrood werd gebruikt als pH-indicator.Zoals aangetoond door het uitblijven van een kleurverandering bij afwezigheid van E.coli, is EC1 zeer specifiek en vertoont het minimale activiteit tegenover andere bacteriën. De intensiteit van de kleurverandering is afhankelijk van zowel het aantal gebruikte E.coli-cellen in de DNAzyme-activatiestap als de tijd die wordt toegestaan voor de ureumhydrolyse-stap. Meer E.coli-cellen leiden tot een sterkere kleurverandering, en een langere tijd voor de ureumhydrolyse maakt de detectie van een kleiner aantal cellen mogelijk.Deze grafiek toont de pH-verandering zoals gemonitord met een hand pH-meter. De aanwezigheid van 10⁷ E.coli-cellen resulteerde in een geleidelijke stijging van de pH met drie eenheden binnen 10 minuten. In tegenstelling hiermee veroorzaakte de afwezigheid van E.coli onder dezelfde omstandigheden geen detecteerbare pH-veranderingen.Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in twee uur worden voltooid als deze correct wordt uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat urease zeer actief is, en dat onvoldoende wassen of contaminatie zal leiden tot een fout-positief resultaat. Na het volgen van deze procedure kan deze methode worden toegepast om te testen op E.coli onder relevantere omstandigheden, zoals bij het testen van de kwaliteit van oppervlaktewater.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van het gebruik van een eenvoudige lakmustest voor het testen op E.coli. Vergeet niet dat deze test kan worden gebruikt om pathogene E.coli te detecteren, wat extreem gevaarlijk is. U moet een biosafety-training volgen voordat u enige van de tests voor pathogene bacteriën uitvoert.

colorimetric-detection-of-bacteria-using-litmus-test

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een eenvoudige methode voor de identificatie van de prioritaire bacteriële pathogenen is het gebruik van genetisch gemanipuleerd reporter faag. Deze verslaggever faag, die specifiek zijn voor hun specifieke gastheer soorten, zijn in staat om snel transduceren een lichtgevend signaal naar aanleiding van gastheercellen. Hierin beschrijven we het gebruik van de reporter faag voor de detectie...

&#39;Bioluminescent&#39; Reporter Faag voor de detectie van categorie A bacteriële pathogenen

We hebben onlangs melding gemaakt van een nieuwe benadering voor het genereren van fluorogene DNAzyme probes die kan worden toegepast op het opzetten van een eenvoudige, "mix-and-lezen" TL-test voor bacteriële detectie. Deze speciale DNA probes katalyseren de splitsing van een chromofoor gemodificeerde DNA-RNA chimère substraat in aanwezigheid van ruwe extracellulaire mengsel (CEM) door een bepaald bacterie, waardoor vertaling bacteriële detectie in fluorescentiesignaal generatie. In dit...

Detectie van bacteriën met behulp van fluorogene DNAzymes

We beschrijven een elektrochemische sensor bepalingsmethode voor snelle bacteriële detectie en identificatie. De bepaling omvat een sensor-array gefunctionaliseerd met DNA oligonucleotide capture probes voor ribosomaal RNA (rRNA) species-specifieke sequenties. Sandwich hybridisatie van doelwit rRNA met de invangingsprobe en een mierikswortel peroxidase-linked DNA-oligonucleotide probe detector produceert een meetbare amperometrisch stroom.

Bacteriële Detection &amp; Identification gebruiken elektrochemische sensoren

This video describes a colorimetric assay for lactate measurement in cell lysates by using the lactate dehydrogenase enzyme. This enzyme converts lactate into pyruvate, along with the conversion of NAD to NADH that reacts with tetrazolium dyes and gives a colored product that can be measured spectrophotometrically to quantitate the lactate.

Colorimetric Assay for Quantification of Lactate in Test Samples

This video demonstrates a colorimetric E. coli detection method, involving an E. coli biomarker activating a DNAzyme, leading to cleavage of RNA linkage and detachment of a DNAzyme-urease conjugate. A subsequent colorimetric assay detects the E. coli biomarker through ammonia-induced pH changes.

Colorimetric Detection of a Bacterial Biomarker Using a Modified Litmus Test

Source:Rhea Kang1, Gabby Mora1, Sherry Dunbar11Luminex, A DiaSorin Company, Austin.This video demonstrates multiplexed quantitative bacterial detection employing carboxylated magnetic polystyrene microspheres dyed into distinct sets. The procedure encompasses the formation of bead-bacteria complexes, magnetic separation, and flow-based analysis, enabling precise and simultaneous quantification of multiple bacteria in the same reaction well.

Multiplexed Quantitative Bacterial Detection using Dye-Labeled Magnetic Microspheres

Centraal in het gebied van bacteriële pathogenese is de mogelijkheid om te bepalen of en hoe microben overleven na blootstelling aan eukaryotische cellen. Dit artikel beschrijft protocollen voor het gebruik van fluorescerende kleurstoffen die de levensvatbaarheid van individuele bacteriën in en gekoppeld aan gastheercellen onthullen.

Fluorescentiemicroscopiemethodes voor het bepalen van de levensvatbaarheid van bacteriën in Associatie met zoogdiercellen

Unlike die gezien eukaryoten, er een gebrek aan studies die details membraan depolarisatie en ionenconcentratie veranderingen in bacteriën, vooral als hun kleine formaat maakt conventionele meetmethoden moeilijk. Hier hebben we detail protocollen voor toezicht op dergelijke gebeurtenissen in de grote Gram-positieve ziekteverwekker Streptococcus pneumoniae met behulp van fluorescentie technieken.

Monitoring Veranderingen in Membrane Polariteit, Membraan Integriteit, en intracellulaire Ion concentraties in<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Het gebruik van fluorescente kleurstoffen

Een protocol dat geïntegreerde concentratie, verrijking en eindpuntkleurmeting voor de detectie van door voedsel overgedragen ziekteverwekkers in grote volumes landbouwwater presenteert, wordt hier gepresenteerd. Het water wordt gefilterd door middel van Modified Moore Swabs (MMS), verrijkt met selectieve of niet-selectieve media, en de detectie wordt uitgevoerd met behulp van op papier gebaseerde analytische apparaten (µPAD) ingebed met bacteriële-indicatieve kleurmetingssubstraten.

Colorimetrische Papier-gebaseerde detectie van<em&gt; Escherichia coli</em&gt;,<em&gt; Salmonella</em&gt; Spp. En<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Van grote volumes of Agricultural Water

Hier presenteren we een protocol om bacteriële motiliteit te detecteren op basis van een kleurreactie. De belangrijkste voordelen van deze methode zijn dat deze gemakkelijk te evalueren en nauwkeuriger is en geen gespecialiseerde apparatuur vereist.

Bacteriële beweeglijkheid visualiseren op basis van een kleurreactie

Leer een eenvoudige kleurmetrische detectiemethode voor E. coli met behulp van een RNA-cleavende DNAzyme gekoppeld aan een ureasesignaalplatform. Deze techniek biedt snelle, specifieke resultaten voor point-of-care diagnostiek.

Colorimetrische Detectie van bacteriën met behulp van lakmoesproef

Meer video's verkennen