Name: Een In Vitro Model van de bloed-hersen barrière met behulp van Impedantiespectroscopie: een focus op T-cel-endotheelcellen Interaction (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: Leer een in vitro model van de bloed-hersenbarrière met impedantiespectroscopie om T-cel-endotheelinteracties te bestuderen. Deze methode biedt real-time inzicht in barrièrefunctie voor neuro-immunologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We zijn dankbaar voor Annika Engbers en Frank Kurth voor hun uitstekende technische ondersteuning en Dr. Markus Schäfer (nanoAnalytics GmbH) voor nuttige discussies over TEER metingen. Dit werk werd ondersteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), SFB1009 project A03 HW en LK, CRC TR128, projecteert A08; Z1 en B01 LK en HW, en het Interdisciplinair Centrum voor Klinisch Onderzoek (Medische Faculteit van Münster) subsidie ​​nummer KL2 / 2015/14 naar LK.

Voor alle experimenten werden muizen gefokt en onder specifieke pathogeenvrije omstandigheden bij de centrale dierenverblijf van de Universiteit van Munster gehandhaafd volgens de Duitse richtlijnen voor dierverzorging. Alle experimenten werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van het dier experimentele ethische commissie en door de plaatselijke autoriteiten van Noord-Rijnland-Westfalen, Duitsland (LANUV, AZ 84-02.05.20.12.217) goedgekeurd. 1. MBMEC Isolatie en Cultuur LET OP: Isoleer MBMECs zoals eerder in detail 14 beschreven met de volgende wijzigingen: <ol><li> Sacrifice 20 volwassen C57BL / 6 muizen (6-8 weken oud) door CO 2 inademing en bevestigen hun dood door het vaststellen van hart- en ademstilstand. </li><li> Spoel de muis met 70% ethanol en onthoofden met behulp van een schaar; Verwijder de hoofdhuid met behulp van pincet en een schaar. Maak insnijdingen aan de linker- en rechterzijde van de schedel, vanaf het foramen magnum. Til de schedel van zijn staart kant en take van de hersenen met een tang. </li><li> Onder een laminaire stroming kap Gebruik steriele tang om de hersenen te plaatsen in een petrischaal en verwijder de hersenstam, het cerebellum en thalamus, die slechts de cortex. Opmerking: Het gebruik van een microscoop is niet nodig voor een van deze stappen. </li><li> Plaats de cortex op een stuk van steriele Western blotting papier en rol het voorzichtig met een pincet totdat hersenvliezen zijn niet meer zichtbaar. </li><li> Na mechanische en enzymatische digestie (volgens het protocol 14), verzamelen endotheelcellen van de dichtheidsgradiënt met een lange, steriele naald en een 5 ml plunjer. Endotheelcellen verschijnen als een duistere laag boven de rode ring met erytrocyten. Overdracht 20-25 ml van deze laag in een nieuwe 50 ml centrifugebuis; bijvullen van de buis met DMEM. </li><li> Na twee wassen 14, resuspendeer de cellen in 6 ml MBMEC medium dat Puromycine (4 ug / ml) en zaden ze op zes beklede putjes van een 24-puts plaat; laat ze in een tissueincubator bij 37 ° C en 5% CO 2 (hierna broedplaats vanaf hier) gedurende drie dagen. LET OP: Voor meer informatie over MBMEC coating oplossing, zie materialen tabel. </li><li> Verander het medium door toevoeging van 1 ml aan elk putje van vers medium zonder MBMEC Puromycine; zet de plaat weer bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende twee dagen. </li></ol> 2. Oogsten MBMECs <ol><li> Op dag vijf na MBMEC isolatie voorbekleding doorlatende inzetstukken met MBMEC bekledingsoplossing: voeg 80 ul oplossing per wisselplaat en laat ze bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 3 uur. </li><li> pipet voorzichtig uit de coating-oplossing en laat de inserts lucht drogen gedurende 30 min. Voeg 2 ml van kamertemperatuur (KT) PBS aan elk putje van de plaat met behulp MBMECs aan het medium was; herhaalt u deze stap. Voeg 0,05% trypsine-EDTA (300 gl per putje) en laat de plaat in de incubator gedurende 5-10 minuten. </li><li> Voeg 2 ml MBMEC medium aan elk putje stoppentrypsine. Breng de verzamelde cellen naar een 15 ml centrifugebuis en centrifugeer ze bij 700 xg gedurende 8 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 1 ml medium zonder MBMEC Puromycine. </li><li> Tel de cellen; meng 10 pl celsuspensie met 90 pi 0,04% trypan blauw (10x verdunning van cellen). Pipet 10 ul van deze mix tussen het glazen deksel en de cel telkamer (hemocytometer). Aantal Trypan Blue-vrije cellen in alle vier de kwadranten van de kamer (N) en het gemiddelde aantal getelde cellen (N &#39;) te bepalen als volgt: N = N / 4. </li><li> Bereken de celconcentratie (in 10 6 cellen / ml) met de volgende formule: C = N &#39;x 10 x 10 4, waarbij 4 10 wordt gegeven door de afmetingen van de hemocytometer en 10 is de verdunningsfactor stap 2,4. </li><li> Zaad 2 x 10 4 cellen in een volume van 260 gl per insert. Voeg 810 ul van MBMEC medium naar het onderste compartiment van elk putje. Plaats de plaat met inzetstukken in de couveuse tot klaar om verder te gaan met deel 4. OPMERKING: De volumes van de bovenste en onderste compartiment insert-specifieke en werken niet voor alle 24-well formaat. </li></ol> 3. CD4 + T Cell Isolatie en stimulatie <ol><li> CD4 + T Cell Isolation <ol><li> Offer een volwassen muis (6-8 weken oud) door CO 2 inademing en bevestig de dood door het vaststellen van hart- en ademstilstand. </li><li> Plaats de muis op zijn rug op een schone dissectie board en spoel het met 70% ethanol; Gebruik steriele schaar en een tang om het buikvlies te openen en verwijder de milt en lymfeklieren (lies, oksel, arm en baarmoederhalskanker); Breng tenslotte het weefsel in een 15 ml centrifugebuis met 5 ml PBS op ijs. </li><li> Onder de laminaire stroming kap, de overdracht van de weefsel door decanteren PBS met het weefsel in een 50 ml centrifugebuis met een 70 micrometer cel zeef op de top; homogeniserenhet weefsel door te drukken met 1 ml plunjer door de zeef. </li><li> Voeg 30 ml FACS buffer en centrifugeer in bij 500 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 10 ml van FACS-buffer. Filtreer de suspensie door een 40 um cel zeef, voeg 20 nog ml FACS-buffer aan de buis. </li><li> Centrifugeer bij 500 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 500 ui FACS-buffer. </li><li> Voeg 20 ul van muis CD4 magnetische microkralen, meng en incubeer gedurende 15 minuten bij 4 ° C. Voeg 25 ml FACS buffer en centrifugeer in bij 500 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. </li><li> Ondertussen plaats een LS scheidingskolom in de magneet en spoel met 3 ml van FACS-buffer. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 3 ml FACS-buffer. </li><li> cellen toevoegen aan de kolom. Was de kolom met 3 ml FACS buffer driemaal. Verwijder de kolom uit de magneet en plaats het op een nieuwe 15 ml Centrifugation buis. Voeg 5 ml FACS-buffer, spoel de gemerkte cellen met de kolom plunjer en Centrifugeer bij 500 xg gedurende 5 min 4 ° C. </li><li> Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 3 ml T-celmedium. Tel de cellen zoals is beschreven in 2,4 en zaden 1 x 10 5 cellen in 100 pl medium per well. </li></ol></li><li> CD4 + T cel stimulatie <ol><li> Polyklonale CD4 + T-cel stimulatie <ol><li> Voorbekleding een ronde bodem 96-well plaat met gezuiverd anti-muis CD3 antilichaam (kloon 145-2C11) in PBS, op een gewenste eindconcentratie. Bijvoorbeeld, een pre-coat volledige plaat met α-CD3 bij 1 ug / ml meng 10 pl van het antilichaam (stock concentratie = 0,5 mg / ml) met 5 ml PBS, vortex en voeg 50 ul van het mengsel tot elk putje met een multichannel pipet. </li><li> Laat de plaat in de incubator gedurende 3 uur. Na isoleren van de T-cellen, was de pre-beklede plaat tweemaal met PBS. Add gezuiverd anti-CD28-antilichaam (kloon37,51) van geïsoleerde T-cellen met een gewenste eindconcentratie (bijvoorbeeld bij 1 ug / ml); goed mengen. Zaad de T-cellen en laat ze in de incubator gedurende 2-3 dagen. </li></ol></li><li> Antigeenspecifieke CD4 + T-cel stimulatie met dendritische cellen (DCs) LET OP: Als DCs worden gebruikt als antigeen presenterende cellen (APC&#39;s), volg het protocol voor de T-cel isolatie, met deze uitzonderingen: <ol><li> Voordat het homogeniseren van de milt, injecteren met 1 ml collagenase type IA in PBS bij 0,5 mg / ml en overbrengen naar een 15 ml centrifugebuis. </li><li> Incubeer in het waterbad bij 37 ° C gedurende 15 minuten. Na wassen met PBS, resuspendeer de pellet in FACS buffer en voeg 20 ul van muis CD11c magnetische microkralen plaats van CD4 microkralen. </li><li> Gebruik een scheidingskolom MS en de passende hoeveelheden: Spoel de kolom met 1 ml FACS buffer; resuspendeer cellen in 1 ml FACS buffer en spoel de kolom met 1 ml FACS buffer driemaal. </li><li> Advertentied antigeen keuze naar DCs (bijvoorbeeld myeline oligodendrocyt glycoproteïne (MOG) aa 35-55 bij 20 ug / ml), mengen en zaad 5 x 10 4 cellen in 100 gl T celkweekmedium per 96-round-bottom goed. </li><li> Voeg 1 x 10 5 T-cellen in 100 gl T celkweekmedium per 96-rondbodem putjes aan het einde, zoals beschreven in het protocol voor T celisolatie. </li></ol></li><li> Antigeenspecifieke CD4 + T-cel stimulatie met B-cellen LET OP: Als B-cellen worden gebruikt als APC&#39;s, volgt het protocol voor T-cel isolatie, met deze uitzonderingen: <ol><li> Gebruik milt van transgene muizen waarvan B-cellen zijn antigeenspecifieke (bijv IgH MOG (Th) muizen, waarvan de B-cellen herkennen specifiek MOG 35-55). </li><li> Gebruik antigenspecifieke T-cellen (bijvoorbeeld van TCR MOG (2D2) muizen). Voeg 20 ul van muis CD19 magnetische microkralen plaats van CD4 microkralen. </li><li> Voeg het antigen van keuze om de B cells (bijvoorbeeld MOG 35-55 bij 20 ug / ml), mengen en zaad 5 x 10 4 cellen in 100 gl kweekmedium B-cel per 96-round-bottom putjes. </li><li> Voeg 1 x 10 5 T-cellen in 100 gl T celkweekmedium per 96-rondbodem putjes, zoals beschreven in het protocol voor T celisolatie. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. Opstellen en uitvoeren TEER Measurement <ol><li> Plaats de 24-well module van de TEER instrument onder de laminaire stroming kap. Verwijder de deksels en plaats wisselplaten met MBMECs in het instrument met behulp van een tang. </li><li> Pipetteer 810 ul vers medium aan het onderste compartiment van de module putten voorzichtig toevoegen tussen het inzetstuk en de wand van de module ook. </li><li> Sluit de deksels en zet het instrument in de incubator. Sluit het instrument op zijn computer; zet het instrument controller en de software opent. </li><li> Selecteer &#39;nieuwe meting&#39; in het pop-up venster. Check &#39;Toon TEER&#39; en &#39;Toon Ccl&#39; vakken; Druk vervolgens op &#39;start&#39;. Na het voltooien van de eerste meting, selecteer &#39;check alle putjes&#39; in het tabblad &#39;resultaten&#39; om alle TEER en Ccl waarden zien. </li><li> Sla het bestand op: Bestand&gt; Opslaan als&gt; &#39;de naam van het bestand&#39;. LET OP: Als TEER en Ccl continu worden gemeten op een geautomatiseerde manier, hun waarden te volgen over een periode van drie tot vijf dagen. Waarbij het medium is niet nodig, tenzij cellevensvatbaarheid niet optimaal zijn, zoals gevisualiseerd door een gebrek aan toename TEER. </li><li> Kies het tijdstip om samen cultuur MBMECs met T-cellen wanneer Ccl is stabiel en lager dan 1 uF / cm 2 en TEER heeft zijn maximum bereikt. </li><li> Inspecteer absolute TEER en Ccl waarden zijn exclusief de putten waarin MBMECs niet genoeg samenvloeiende monolagen hebben ontwikkeld door het vinkje dergelijke putten. </li><li> Groep de rest van de putten: klik met de rechtermuisknop op een goed en selecteer &#39;goed toe te voegen aan de nieuwe gemiddelde goed&#39;. Name in het pop-up venster; Doe hetzelfde voor alle afzonderlijke putjes worden gegroepeerd. </li><li> Controleer alle gemiddelde putten om te bevestigen dat ze allemaal dezelfde oorspronkelijke voorwaarden voor de co-cultuur. Als sommige hebben significant verschillende absolute waarden TEER TEER of hellingen, of de standaard fouten zijn te groot, opnieuw de groepering. LET OP: De optimale combinatie van waterputten biedt minimale variatie in TEER waarden, zowel binnen als tussen de experimentele groepen. </li><li> In het tabblad &#39;experiment&#39;, drukt u op &#39;pauze&#39;, de stekker uit het instrument en neem het uit de incubator. Verwijder de deksels onder de laminaire stroming kap. </li><li> Bereid vooraf geactiveerd en / of naïeve T-cellen, met of zonder specifieke cytokinen, antilichamen of andere stoffen, zoals gewenst: Bijvoorbeeld: mix gezuiverd NA / LE rat anti-muis IFN-γ-antilichaam (kloon XGM1.2) met voorbereide T cellen, bij 20 ug / ml per putje van de TEER instrument. NB: Als stoffen zoals granzyme B remmer gebruikt worden, zijn ze eenT OEGEVOEGDE naar T celkweek begin van T-cel stimulatie: bijvoorbeeld, Granzyme B Inhibitor II (Calbiochem) wordt gemengd met geïsoleerde T-cellen in een eindconcentratie van 10 uM in DMSO. Zie materialen en apparatuur voor meer details. </li><li> Verwijder een deel van het medium van de insert (het bovenste compartiment goed): bv, voorzichtig pipet uit 150 ul (het verwijderen van al het medium dient te worden vermeden omdat dit de MBMEC monolaag kunnen verstoren). </li><li> Voeg T-cellen aan MBMECs door voorzichtig pipetteren 150 ul medium dat 2 x 10 5 cellen / insert. LET OP: Bij het oogsten van pre-geactiveerde T-cellen, tellen alleen stralen, Trypan Blue-vrije cellen. </li><li> Sluit de deksels en zet het instrument terug naar de incubator. Sluit het instrument en druk op &#39;resume meting&#39;. Na 24 uur, drukt u op &#39;stop&#39; in het tabblad &#39;experiment&#39; en sla het bestand op (Bestand&gt; Opslaan). </li></ol> 5. De gegevens exporteren en statistische analyse <ol><li>Exporteer de resultaten door te kiezen voor Bestand&gt; Exporteren. </li><li> In het tabblad &quot;instellingen&quot; van het pop-up venster, selecteer &quot;.dot&quot; in de optie &quot;decimaalteken&quot; en &quot;tabulator&quot; in de optie &#39;veldscheidingsteken &quot;. </li><li> In het tabblad &quot;export resultaten&quot;, de naam van het bestand, laat U alle putten uit te voeren, en controleer de &quot;TEER&quot; en &quot;Ccl&quot; dozen in de &quot;kiest data&quot; optie. </li><li> Druk op &#39;gegevens exporteren&#39;, opent u het geëxporteerde bestand, en de gegevens te kopiëren naar een spreadsheet. </li><li> Normaliseren van de geëxporteerde gegevens (naargelang elk repliceren, met TEER en Ccl waarden voor elke run (meting)): Set TEER en Ccl waarden van het laatste tijdstip voor de co-cultuur tot 100% en wijzigt bijgevolg de waarden voor alle andere runs, ten opzichte van de &#39;100%&#39; run. </li><li> Kopiëren genormaliseerde gegevens naar een software naar keuze een grafiek te genereren met afzonderlijke putjes en tonen de standaardfout van het gemiddelde voor elke behandelingsgroep. </li><li> Perform Two-way ANOVA statistische test met een Bonferroni correctie voor meerdere vergelijkingen, met behulp van de statistische software van uw keuze. </li></ol>

I. Kuzmanov, A. M. Herrmann, S.G. Meuth, H. Wiendl en L. Klotz hebben niets te onthullen. H.-J. Galla is een wetenschappelijk adviseur van nanoAnalytics GmbH, de fabrikant van de geautomatiseerde celmonitor.

Verschillende stappen van het beschreven protocol zijn essentieel voor een geslaagd experiment. Tijdens de eerste MBMEC isolatie en kweek, is het cruciaal dat gewerkt wordt onder steriele omstandigheden zo veel mogelijk om de verontreiniging van de celkweek met schimmelsporen en bacteriën te voorkomen. Om een reincultuur van EC te verkrijgen, wordt aanbevolen een medium dat Puromycine voor de eerste drie dagen, die overleving van EC maakt, maar geen andere celtypen (met name pericyten) 41,42 gebruiken. Een an...

De bloed-hersenbarrière scheidt de systemische circulatie van het centrale zenuwstelsel (CNS) 1-3. Het voorziet in een fysieke barrière die het vrije verkeer van cellen en de verspreiding van in water oplosbare moleculen remt en beschermt de hersenen tegen pathogenen en potentieel schadelijke stoffen. Naast de barrièrefunctie de BBB maakt de overdracht van zuurstof en voedingsstoffen naar de hersenen parenchym waardoor de correcte werking van het neuronaal weefsel waarborgt. Functionele eigenschappen van de BBB wordt sterk gereguleerd door zijn cellulaire en acellulaire componenten, met zeer gespecialiseerde EC dat is haar belangrijkste structurele element. EC van de BBB wordt gekenmerkt door de aanwezigheid van tight junction (TJ) complexen, het gebrek aan fenestrations, pinocytose extreem lage activiteit en permanent actieve transportmechanismen. Andere componenten van de BBB de EC basaal membraan, pericytes het inbedden van het endotheel, astrocytaire end voeten en = bijbehorende parenchymal basaalmembraan ook bijdragen aan de ontwikkeling, instandhouding en functie van de BBB 2,4 - 6 en samen met neuronen en microglia, vormen de neurovasculaire eenheid (NVU) waardoor de correcte werking van het CZS 7 maakt - 9. In verschillende neurologische ziekten zoals neurodegeneratieve, ontstekings- of infectieziekten, is de functie van de BBB gecompromitteerde 2,5,10. Ontregeling van TJ complexen en moleculaire transportmechanismen leidt tot BBB permeabiliteit extravasatie van leukocyten, ontsteking en neuronale schade toe. Om BBB eigenschappen studeren onder dergelijke pathofysiologische omstandigheden, hebben verschillende in vitro BBB modellen vastgesteld 9,11,12. Samen hebben ze waardevolle inzichten in de veranderingen van de barrière integriteit, doorlaatbaarheid evenals transport mechanismen. Deze modellen maken gebruik endotheliale cellen van mens, muis, rat, varken of bschapen afkomst 13-18; primaire endotheliale cellen of cellijnen worden gekweekt hetzij als monocultuur of samen met pericyten en / of astrocyten om nauwer bootsen de BBB in vivo 19-25. De laatste jaren is het meten van transendotheliale elektrische weerstand (TEER) wordt een algemeen aanvaarde instrument om endotheliale barrière-eigenschappen 26,27 beoordelen. TEER weerspiegelt de impedantie op de ionenflux over de cel monolaag en de afname verschaft een gevoelige maatstaf van gecompromitteerde endotheliale barrière integriteit en derhalve verhoogde permeabiliteit. Diverse TEER meetsystemen zijn ontwikkeld, waaronder epitheliale Voltohmmeter (EVOM), elektrische cel-substraat Impedantie Sensing (ECIS), en real-time cell analyse 15,28 - 30. TEER weerspiegelt de weerstand tegen ion flux tussen aangrenzende EC (paracellulaire route) en is recht evenredig met debarrière integriteit. In impedantie spectroscopie 27,31, is complex totale impedantie (Z) gemeten, die meer informatie over de barrière integriteit door het meten van Ccl biedt. Ccl betreft de capacitieve stroom door het celmembraan (transcellulaire route): de cellaag fungeert als een condensator in het equivalente elektrische circuit, het scheiden van de lasten aan beide zijden van het membraan en is omgekeerd evenredig met de barrière integriteit. Wanneer geteeld op doorlatende inserts, EC hechten, vermenigvuldigen en verspreid over het microporeuze membraan. Dit weerstaat de achtergrond capacitieve stroom van het inzetstuk (die zelf werkt als een condensator) en leidt tot een afname van de capaciteit tot aan de minimale niveau bereikt. Dit wordt gevolgd door de instelling van TJ complexen die afdichting van de ruimte tussen aangrenzende EC. Dit beperkt de ion flux door de paracellulaire route en TEER verhoogt tot het zijn plateau bereikt. Onder ontstekingstoestanden, maar de endothelial barrière in het gedrang komt: TEER afneemt als TJ complexen krijgen verstoord en Ccl toeneemt naarmate de capacitieve component van het inzetstuk weer stijgt. Onze TEER meting maakt gebruik van de geautomatiseerde celbewaking 32 systeem: het volgt het principe van impedantie spectroscopie en breidt haar eerdere aanvragen. Hier beschrijven we een in vitro model BBB dat de studie van de barrière-eigenschappen, zoals de interactie van hersenen endotheel met immuuncellen mogelijk maakt; met name geactiveerde T-cellen. Zulke pathofysiologische aandoeningen zijn waargenomen bij auto-immuunziekten van het CZS, zoals multiple sclerose en diermodel experimentele autoimmune encefalomyelitis 33-37. Hier, een cruciale stap is de transmigratie van encefalitogene, myeline-specifieke T-cellen over de BBB. Dit wordt gevolgd door reactivering in de perivasculaire ruimte en het in het hersenparenchym, waar ze rekruteren andere immuuncellen en melijke ontsteking en daaropvolgende demyelinatie 1,35,38. Echter, de moleculaire mechanismen van de interactie tussen deze T-cellen en endotheelcellen, de hoofdbestanddelen van de BBB, zijn niet goed begrepen. Ons protocol is bedoeld om deze leemte op te vullen en geeft nieuwe inzichten in de gevolgen op endotheelcellen (dat wil zeggen, barrière integriteit en permeabiliteit) op hun directe contact en de complexe interactie met geactiveerde T-cellen. De hier beschreven protocol maakt gebruik van primaire muizenhersenen microvasculaire endotheliale cellen, gekweekt als een monolaag op permeabele inserts met microporeuze membranen. Endotheelcellen samen gekweekt met CD4 + T-cellen, die vooraf worden geactiveerd hetzij polyklonaal of een antigeen-specifieke wijze. Co-cultuur van MBMECs met pre-geactiveerde, maar niet naïeve T-cellen induceert een daling van TEER en een toename van Ccl die een kwantitatieve meting van de MBMEC dysfunctie en barrièrebeschadiging verschaft. de techniekis non-invasief: het gebruikt ingebouwde plaats van eetstokje elektroden, die belangrijke verstoring van de EC monolaag te voorkomen; het kan worden gebruikt om de barrièrefunctie te controleren zonder het gebruik van celmarkers. Het maakt continue metingen op een geautomatiseerde manier en maakt een onafhankelijke beoordeling van de twee barrière parameters (TEER en Ccl) tegelijkertijd in de tijd. De werkwijze is gevoelig genoeg om onderscheid te maken tussen verschillende T cel activering en werking van dergelijke T-cellen op EC. Het kan worden gebruikt in een breed scala aan functionele testen: verschillende cytokinen en / of chemokinen betrokken bij ontstekingsprocessen kunnen de co-cultuur van MBMECs en T-cellen worden toegevoegd; blokkerende antilichamen tegen celadhesie moleculen aan beide EG of T-cel zijde kan worden gebruikt; en inhibitoren van T-cel activatie merkers of hun cytolytische eigenschappen kunnen tijdens de T-cel priming of de co-kweek met EC&#39;s worden toegevoegd. De test is ook bruikbaar voor T-cel transmigratieassays, omdat het als een kwaliteitscontrole van de integriteit MBMEC monolaag voorafgaande aan de toevoeging van T-cellen kunnen dienen. Dit alles maakt deze methode een veelzijdig en betrouwbaar instrument om de BBB in vitro onderzoek, met een focus op het effect van geactiveerde T-cellen op monolaag integriteit EC. Dit is van bijzonder belang voor het begrijpen van de mechanismen van de BBB verstoring in de pathogenese van auto-immuunziekten, zoals MS en EAE diermodel, waarbij autoreactieve, encefalitogene T-cellen steek de BBB en ontsteking en neuronale schade.

<table><tbody><tr><td>cellZscope</td><td>nanoAnalytics GmbH</td><td>www.nanoanalytics.com</td><td>inclusief: 24-well Cell Module, Controller, PC met cellZscope software v2.2.2&nbsp;</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>www.thermoscientific.com</td><td>SORVALL RC 6+; rotor F21S-8x50y; voor MBMEC isolatie</td></tr><tr><td>flow cytometer</td><td>Beckman Coulter</td><td>www.beckmancoulter.com</td><td>voor analyse van T-cel transmigratie</td></tr><tr><td>FlowJo7.6.5 software</td><td>Tree Star</td><td>www.flowjo.com</td><td>voor analyse van T-cel transmigratie</td></tr><tr><td>Oak Ridge centrifuge tubes, PC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3118-0050</td><td>50 ml; voor MBMEC isolatie</td></tr><tr><td>Transwell membraan inserts - poriegrootte 0.4 &micro;m</td><td>Corning</td><td>3470</td><td>voor TEER meting als de belangrijkste uitlezing</td></tr><tr><td>Transwell membraan inserts - poriegrootte 3 &micro;m</td><td>Corning</td><td>3472</td><td>voor TEER meting als de kwaliteitscontrole vóór T-cel transmigratie assay</td></tr><tr><td>24-well celcultuurplaat</td><td>Greiner</td><td>650 180</td><td>platte bodem; voor MBMEC cultuur</td></tr><tr><td>96-well celcultuurplaat</td><td>Costar</td><td>3526</td><td>ronde bodem; voor immuuncel cultuur</td></tr><tr><td>QuadroMACS Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td>voor T-cel en B-cel isolatie; ondersteunt MACS LS kolommen</td></tr><tr><td>OctoMACS Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-109</td><td>voor dendritische cel isolatie; ondersteunt MACS MS kolommen</td></tr><tr><td>Neubauer tellingskamer</td><td>Marienfeld</td><td>MF-0640010</td><td>voor celtelling</td></tr><tr><td>Cel zeef, 70 &micro;m</td><td>Corning</td><td>352350</td><td>voor immuuncel isolatie</td></tr><tr><td>Cel zeef, 40 &micro;m</td><td>Corning</td><td>352340</td><td>voor immuuncel isolatie</td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td>voor immuuncel isolatie</td></tr><tr><td>MACS LS scheidingskolommen</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>voor T-cel en B-cel isolatie</td></tr><tr><td>MACS MS scheidingskolommen</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td>voor dendritische cel isolatie</td></tr><tr><td>Mouse CD4 MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-049-201</td><td>voor CD4+ T-cel isolatie</td></tr><tr><td>Mouse CD19 MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-052-201</td><td>voor B-cel isolatie</td></tr><tr><td>Mouse CD11c MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-052-001</td><td>voor dendritische cel isolatie</td></tr><tr><td>Collageen type IV uit menselijke placenta</td><td>Sigma</td><td>C5533</td><td>voor MBMEC coating oplossing</td></tr><tr><td>Fibronectine uit bovijn plasma</td><td>Sigma</td><td>F1141-5MG</td><td>voor MBMEC coating oplossing</td></tr><tr><td>Collagenase 2 (CSL2)</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td>voor MBMEC isolatie</td></tr><tr><td>Collagenase/Dispase (C/D)</td><td>Roche</td><td>11097113001</td><td>voor MBMEC isolatie</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>DN25</td><td>voor MBMEC isolatie</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F7524</td><td>voor MBMEC isolatie</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumine (BSA)</td><td>Amresco</td><td>0332-100G</td><td>voor MBMEC isolatie</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma</td><td>P1644-1L</td><td>voor MBMEC isolatie</td></tr><tr><td>DMEM (+ GlutaMAX)</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td>voor MBMEC isolatie en MBMEC cultuur medium</td></tr><tr><td>Penicilline/Streptomycine</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td>voor MBMEC isolatie en MBMEC cultuur medium</td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td>voor MBMEC en immuuncel isolatie</td></tr><tr><td>Heparine</td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td>voor MBMEC cultuur medium</td></tr><tr><td>Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)</td><td>PeproTech</td><td>100-18B</td><td>voor MBMEC cultuur medium</td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Sigma</td><td>P8833</td><td>voor MBMEC cultuur medium; alleen voor de eerste drie dagen</td></tr><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>voor het verzamelen van MBMECs</td></tr><tr><td>Collagenase Type IA</td><td>Sigma</td><td>C9891</td><td>voor dendritische cel isolatie</td></tr><tr><td>Trypan Blauw oplossing, 0.4%</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td>voor celtelling</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td>voor immuuncel isolatie</td></tr><tr><td>IMDM + 1% L-Glutamin</td><td>Gibco</td><td>21980-032</td><td>voor T-cel cultuur medium</td></tr><tr><td>X-VIVO 15</td><td>Lonza</td><td>BE04-418Q</td><td>bescherm tegen licht; voor B-cel cultuur medium</td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>31350-010</td><td>voor B-cel cultuur medium</td></tr><tr><td>L-Glutamine (100x Glutamax)</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>voor B-cel cultuur medium</td></tr><tr><td>muis MOG35&mdash;55 peptide</td><td>Biotrend</td><td>BP0328</td><td>voor antigeen-specifieke T-cel activering</td></tr><tr><td>gezuiverde anti-muis CD3 Ab</td><td>BioLegend</td><td>100302</td><td>clone 145-2C11; voor polyklonale T-cel activering</td></tr><tr><td>gezuiverde NA/LE anti-muis CD28 Ab</td><td>BD Pharmingen</td><td>553294</td><td>clone 37.51; voor polyklonale T-cel activering</td></tr><tr><td>Recombinant Murine IFN-&gamma;</td><td>PeproTech</td><td>315-05</td><td>voor T-cel transmigratie assays</td></tr><tr><td>Recombinant Murine TNF-&alpha;</td><td>PeproTech</td><td>315-01A</td><td>voor T-cel transmigratie assays</td></tr><tr><td>NA/LE gezuiverde anti-muis IFN-&gamma; antilichaam</td><td>BD Biosciences</td><td>554408</td><td>clone XMG1.2; aanbevolen eindconcentratie: 20 &micro;g/ml</td></tr><tr><td>Granzyme B Inhibitor II</td><td>Calbiochem</td><td>368055</td><td>aanbevolen eindconcentratie: 10 &micro;M</td></tr><tr><td>PE anti-muis CD4 antilichaam</td><td>Biolegend</td><td>116005</td><td>clone RM4-4; voor analyse van T-

een<em&gt; in vitro</em&gt; model van de bloed-hersen barrière met behulp van impedantiespectroscopie: een focus op t-cel-endotheelcellen interaction

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

De afbraak van de bloed-hersenbarrière (BBB) is een cruciale stap in de ontwikkeling van auto-immuunziekten zoals multiple sclerose (MS) en het diermodel experimentele auto-immuunencefalomyelitis (EAE). Dit proces wordt gekenmerkt door de transmigratie van geactiveerde T-cellen over hersendeelcelcellen (ECs), de belangrijkste bestanddelen van de BBB. De gevolgen voor de hersendeelcelfunctie na interactie met dergelijke T-cellen zijn echter grotendeels onbekend. Hier beschrijven we een test die de evaluatie mogelijk maakt van de functie van primaire muis hersendeelcelcellen uit microvaten (MBMEC) en de integriteit van de barrière tijdens de interactie met T-cellen in de loop van de tijd. De test maakt gebruik van impedantiecelspectroscopie, een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van de integriteit en permeabiliteit van EC-monolagen, door het meten van veranderingen in transendotheel elektrische weerstand (TEER) en cel laagcapaciteit (Ccl). In direct contact met EC's zijn gestimuleerde maar niet naïeve T-cellen in staat om EC-monolaagdisfunctie te induceren, zoals gevisualiseerd door een afname in TEER en een toename in Ccl. De test registreert veranderingen in de integriteit van de EC-monolaag op een continue en geautomatiseerde manier. Het is gevoelig genoeg om onderscheid te maken tussen verschillende sterktes van stimuli en niveaus van T-celactivatie en het maakt de onderzoeking mogelijk van de gevolgen van een gerichte modulatie van T-cel-EC-interactie met behulp van een breed scala aan stoffen zoals antilichamen, farmacologische reagentia en cytokinen. De techniek kan ook worden gebruikt als kwaliteitscontrole voor EC-integriteit in in vitro T-cel transmigratie tests. Deze toepassingen maken het een veelzijdig hulpmiddel voor het bestuderen van BBB-eigenschappen onder fysiologische en pathofysiologische omstandigheden.

Figuur 1 geeft een algemeen overzicht van de in vitro BBB model gebruikt om de interactie tussen T-cellen en endotheliale cellen te bestuderen. Het experiment bestaat uit drie belangrijke stappen. De eerste stap is de isolatie van primaire MBMECs van hersenen cortex en hun cultuur gedurende vijf dagen. Wanneer ze samenvloeiing bereiken in de celcultuur plaat, worden MBMECs getrypsiniseerd en opnieuw uitgezet op doorlatende inzetstukken, die vervolgens in de TEER...

Hier beschrijven we een in vitro muismodel van de bloed-hersenbarrière dat gebruik maakt van impedantiecelspectroscopie, met een focus op de gevolgen voor de integriteit en permeabiliteit van endotheelcellen na interactie met geactiveerde T-cellen.

Een<em&gt; In Vitro</em&gt; Model van de bloed-hersen barrière met behulp van Impedantiespectroscopie: een focus op T-cel-endotheelcellen Interaction

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal ...

Het algemene doel van dit experiment is om de gevolgen voor de integriteit en permeabiliteit van endotheelcellen te bestuderen bij interactie met geactiveerde T-cellen. Deze methode helpt bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de neuro-immunologie, zoals de vraag hoe de directe interactie tussen T-cellen en endotheelcellen de integriteit en permeabiliteit van de bloed-hersenbarrière beïnvloedt. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een geautomatiseerde, real-time beoordeling van de barrièrefunctie mogelijk maakt bij gerichte modulatie van de interactie tussen T-cellen en endotheelcellen.De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie van auto-immuunziekten van het centraal zenuwstelsel (CZS), omdat het inzicht biedt in de door T-cellen gemedieerde doorbraak van de bloed-hersenbarrière, een cruciale stap in de pathogenese van dergelijke ziekten. Deze methode richt zich op de eigenschappen van de bloed-hersenbarrière bij muizen tijdens EAE. Echter kan deze ook worden toegepast op modellen van de bloed-hersenbarrière van ratten of mensen, alsof op studies naar andere auto-immuunziekten van het CZS.Over het algemeen kunnen pers

an-vitro-model-blood-brain-barrier-using-impedance-spectroscopy-focus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

This video demonstrates a method for assessing transendothelial electrical resistance (TEER) in mouse brain microvascular endothelial cells in vitro. A high TEER value indicates intact endothelial cell junctions, while the addition of activated T cells lowers the TEER value, reflecting disruption of the junctional barrier.

Assessing Transendothelial Electrical Resistance in an In Vitro Blood-Brain Barrier Model

This video demonstrates an in vitro model to study pathogens crossing the blood-brain barrier (BBB). Microvascular endothelial cells, which express tight junctions, form an endothelial layer in the upper chamber, while neurons, astrocytes, and microglia represent the brain parenchyma in the lower chamber, separated by a porous membrane. Virus infection in the BBB model mimics the pathogen crossing from blood to the brain. Upon introducing a neurotropic virus, it crosses the BBB via...

An In Vitro Model for Studying Pathogen Crossing of the Blood-Brain Barrier and Brain Cell Infection

Oprichting van menselijke modellen van de bloed-hersenbarrière (BBB) ​​kan profiteren onderzoek naar hersenen voorwaarden in verband met BBB mislukking. We beschrijven hier een verbeterde techniek voor de bereiding van een contact BBB model dat coculturing menselijke astrocyten en brein endotheelcellen maakt aan de tegenovergestelde zijden van een poreus membraan.

Verbeterde werkwijze voor de bereiding van een Human-Cell gebaseerde, Contact Model van de bloed-hersenbarrière

Het doel van deze studie was om de reproduceerbaarheid van een in vitro BBB model met een syngene ratten co-kweek van endotheelcellen en astrocyten valideren. De endotheelcellen monolaag gepresenteerd hoge TEER en lage LY permeabiliteit. Expressie van specifieke eiwitten TJ, functionele reacties op ontstekingen en functionaliteit van vervoerders en receptoren werden beoordeeld.

Oprichting van een<em&gt; In Vitro</em&gt; Model van Rat bloed-hersenbarrière (BBB): een focus op BBB Ondoordringbaarheid en receptor-gemedieerd transport

Hier beschrijven we een menselijk bloed-hersenbarrière model dat het mogelijk maakt om de transmigratie van lymfocyten in het centrale zenuwstelsel in vitro te onderzoeken.

Analyse van lymfocyt extravasatie gebruik van een<em&gt; In Vitro</em&gt; Model van het menselijk bloed-hersenbarrière

Het doel van het protocol is te presenteren van een geoptimaliseerde procedure tot vaststelling van een in vitro bloed - hersenbarrière (BBB) model gebaseerd op primaire varkens endothelial hersencellen (pBECs). Het model toont hoge reproduceerbaarheid, hoge dichtheid, en is geschikt voor studies van vervoer en intracellulaire drugontdekking mensenhandel.

Verbeterde methode voor de vaststelling van een In Vitro bloed - hersenbarrière Model gebaseerd op varkens Endothelial hersencellen

Dit rapport biedt protocollen voor assemblage, celkweek en assays op het μSiM-platform voor de constructie van bloed-hersenbarrièremodellen.

Gebruik van het MicroSiM (μSiM) barrièreweefselplatform voor het modelleren van de bloed-hersenbarrière

De bloed-hersenbarrière (BBB) speelt een cruciale rol bij het in stand houden van een stabiele en gezonde hersenomgeving. BBB-disfunctie wordt in verband gebracht met veel neurologische aandoeningen. We hebben een 3D, stamcel-afgeleid model van de BBB ontwikkeld om cerebrovasculaire pathologie, BBB-integriteit te onderzoeken en hoe de BBB wordt veranderd door genetica en ziekte.

Reconstructie van de bloed-hersenbarrière in vitro om neurologische aandoeningen te modelleren en therapeutisch aan te pakken

Dit protocol beschrijft een betrouwbaar en efficiënt in vitro model van de bloedbarrière van de hersenen. De methode maakt gebruik van cerebrale vasculaire endotheelcellen bEnd.3 van muizen en meet de transmembraan elektrische weerstand.

Opname van functionele integriteit van barrière op bEnd.3 vasculaire endotheelcellen via detectie van transendotheliale elektrische weerstand

Hier demonstreren we de techniek van het gebruik van op impedantie gebaseerde biosensoren: ECIS en cellZscope, voor het meten van de sterkte van de endotheliale barrière van de hersenen. We beschrijven de voorbereiding en techniek van het toevoegen van verschillende stimuli aan een in vitro model van het hersenendotheel. We meten, registreren en geven een representatieve analyse van de bevindingen.

Het meten van veranderingen in de integriteit van de endotheliale barrière van de hersenen met twee op impedantie gebaseerde biosensoren als reactie op kankercellen en cytokines

Leer een in vitro model van de bloed-hersenbarrière met impedantiespectroscopie om T-cel-endotheelinteracties te bestuderen. Deze methode biedt real-time inzicht in barrièrefunctie voor neuro-immunologisch onderzoek.

Een In Vitro Model van de bloed-hersen barrière met behulp van Impedantiespectroscopie: een focus op T-cel-endotheelcellen Interaction (Video) | JoVE Journal

Een

Meer video's verkennen