Een

Het algemene doel van dit experiment is om de gevolgen voor de integriteit en permeabiliteit van endotheelcellen te bestuderen bij interactie met geactiveerde T-cellen. Deze methode helpt bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de neuro-immunologie, zoals de vraag hoe de directe interactie tussen T-cellen en endotheelcellen de integriteit en permeabiliteit van de bloed-hersenbarrière beïnvloedt. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een geautomatiseerde, real-time beoordeling van de barrièrefunctie mogelijk maakt bij gerichte modulatie van de interactie tussen T-cellen en endotheelcellen.

De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie van auto-immuunziekten van het centraal zenuwstelsel (CZS), omdat het inzicht biedt in de door T-cellen gemedieerde doorbraak van de bloed-hersenbarrière, een cruciale stap in de pathogenese van dergelijke ziekten. Deze methode richt zich op de eigenschappen van de bloed-hersenbarrière bij muizen tijdens EAE. Echter kan deze ook worden toegepast op modellen van de bloed-hersenbarrière van ratten of mensen, alsof op studies naar andere auto-immuunziekten van het CZS.

Over het algemeen kunnen personen die nieuw zijn aan deze methode problemen ondervinden vanwege mogelijke moeilijkheden met de optimale timing van de gecombineerde primaire endotheelcelkweek en T-celactivatie. We hebben deze methode oorspronkelijk ontwikkeld toen we de effecten van verschillende T-celactivatieniveaus op de eigenschappen van de bloed-hersenbarrière tijdens EAE, een diermodel voor multiple sclerose, wilden onderzoeken. Een visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien het opzetten van co-kweken van T-cellen en endotheelcellen moeilijk aan te leren is, omdat initiële variaties in T tussen wells kunnen leiden tot daaropvolgende misrepresentaties van de resultaten.

Om deze procedure te starten, worden de permeabele inserts op dag vijf na de MBMEC-isolatie geprecoat met 80 µL MBMEC-coatingsoplossing per insert. Incubeer deze gedurende drie uur bij 37 °C en 5% CO2. Na het verwijderen van de MBMEC-coatingsoplossing uit de inserts worden de MBMEC's gewassen door twee milliliter PBS op kamertemperatuur aan elke put toe te voegen, dit na één minuut af te zuigen en deze procedure vervolgens nogmaals te herhalen.

Voeg vervolgens 0,05% Trypsin EDTA toe in een hoeveelheid van 300 µL per well en laat dit vijf tot tien minuten incuberen. Voeg daarna twee milliliter MBMEC-medium toe aan elke well om de trypsinisatie te stoppen. Draag vervolgens de verzamelde cellen over naar een centrifugebuis van 15 milliliter en centrifugeer het monster 8 minuten bij 700 ×g bij vier graden Celsius.

Gooi na acht minuten het supernatant weg en resuspendeer de cellen in één milliliter MBMEC-medium zonder puromycine. Meng 90 microliter 0,04% trypaanblauw om de cellen te tellen. Pipetteer 10 microliter van de celsuspensie van het mengsel tussen het dekglas en de hemocytometer.

Zaai vervolgens 2 × 10⁴ cellen per insert. Voeg 810 µL MBMEC-medium toe aan het onderste compartiment van elke put en plaats de plaat met inserts in de incubator tot men klaar is om over te gaan tot de TEER-meting. Om CD4-positieve T-cellen te stimuleren, wordt een ronde-bodem 96-well plaat gedurende drie uur bij 37 °C geprecoat met gezuiverd anti-muis CD3-antilichaam in de gewenste eindconcentratie.

Was na het isoleren van de T-cellen de vooraf gecoate plaat tweemaal met PBS. Voeg vervolgens gezuiverd anti-CD28-antilichaam toe aan de geïsoleerde T-cellen tot de gewenste eindconcentratie en meng dit goed. Zaai daarna de T-cellen uit en laat ze gedurende twee tot drie dagen bij 37 °C incuberen.

Om de TEER-meting op te stellen, plaatst u de 24-wellmodule van het TEER-instrument in de laminaire flowkast. Verwijder de deksels en plaats de inserts met MBMEC's met behulp van een pincet in het instrument. Pipetteer vervolgens 810 µL van het verse medium in het onderste compartiment van de module wells, waarbij u dit voorzichtig tussen de insert en de wand van de module well toevoegt.

Sluit daarna de deksels en plaats het instrument in de incubator. Verbind het instrument met de computer. Zet vervolgens de instrumentcontroller aan en open de software.

Selecteer in het pop-upvenster de vakjes "New Measurement", "Check show TER" en "show Ccl". Druk vervolgens op start. Selecteer na voltooiing van de eerste meting "check all wells" in het tabblad Results om alle TEER- en Ccl-waarden te bekijken.

Sla het bestand vervolgens op. Kies daarna het tijdstip om MBMEC's met T-cellen te co-cultureren op het moment dat Ccl stabiel is en lager is dan één microfarad per vierkante centimeter en TEER zijn maximale niveau heeft bereikt. Controleer zorgvuldig de absolute TEER- en Ccl-waarden en sluit de wells uit waarin MBMEC's geen voldoende confluente monolagen hebben gevormd door deze wells uit te vinken.

Groepeer de rest van de wells door met de rechtermuisknop op de wells te klikken en "add well to new average well" te selecteren. Geef de groep een naam in het pop-upvenster en herhaal dit voor alle individuele wells die gegroepeerd moeten worden. Controleer vervolgens alle gemiddelde wells om te bevestigen dat ze allemaal dezelfde begincondities hebben vóór de co-cultuur. Druk in het tabblad experiment op pauze.

Koppel het instrument los en haal het uit de incubator. Verwijder vervolgens de deksels in de laminaire flow-kast. Verwijder daarna een deel van het medium uit de insert in het bovenste putcompartiment.

Voeg T-cellen toe aan de MBMECs door voorzichtig 150 µL medium te pipetteren. Maak vervolgens de verbinding met het instrument opnieuw en druk op 'meetinstelling hervatten'. Druk na 24 uur op 'stop' in het experimenttabblad en sla het bestand op.

Hier is de spoelvormige morfologie te zien in de immunofluorescentiekleuring van PECAM-1 en Cldn-5 vijf dagen na de isolatie van MBMEC's. Hier zijn de TEER- en Ccl-waarden vóór en na het groeperen van individuele wells voorafgaand aan de toevoeging van T-cellen. De blauwe curve wordt niet voor het experiment gebruikt, aangezien de MBMEC's in deze well geen TEER hebben ontwikkeld die net zo hoog is als in andere wells.

In dit experiment werden 35 tot 55 specifieke CD4-positieve T-cellen gedurende vijf dagen op een antigenspecifieke wijze gestimuleerd. Naive T-cellen en de pro-inflammatoire cytokinen interferon gamma en TNF-alpha dienden respectievelijk als negatieve en positieve controle. Hierbij werden T-cellen gestimuleerd met dezelfde hoeveelheid anti-CD3- en anti-CD28-antilichamen, waarbij de cellen die drie dagen waren gekweekt een grotere neiging tot barrièreverstoring vertoonden in vergelijking met de T-cellen die slechts twee dagen waren gekweekt.

De resultaten laten hier zien dat gestimuleerde T-cellen, maar niet hun supernatanten, aanzienlijke schade aan de MBMEC's veroorzaakten, wat aangeeft dat het directe contact tussen T-cellen en MBMEC's cruciaal is voor de verstoring van de barrière. Aan de andere kant zorgde het toevoegen van granzym B-remmer twee aan de T-celcultuur voor een grotere herstel van de MBMEC-integriteit, wat erop wijst dat het cytolytische molecuul een belangrijke rol speelt bij het veroorzaken van MBMEC-schade en de daaropvolgende afname in TEER. Zodra de methode onder knie is, kan dit experiment in 12 dagen worden voltooid mits correct uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om het juiste tijdstip te kiezen voor het opzetten van de co-cultuur van T-cellen en endotheelcellen.

Na deze procedure kunnen andere assays worden toegepast, zoals immunofluorescentiemicroscopie, flowcytometrie en waarschijnlijkheidsassays. Om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals: Hoe beïnvloedt deze interactie de expressie van tight junction-moleculen, de permeabiliteit en de mate van T-celtransmigratie? Na de ontwikkeling van deze techniek kregen onderzoekers op het gebied van de neuro-immunologie de mogelijkheid om auto-immuunziekten van het CZS bij muizen te bestuderen.

Na het bekijken van deze video zou u een goed beeld moeten hebben van hoe u de directe effecten tussen geactiveerde T-cellen en endotheelcellen kunt beoordelen met betrekking tot de integriteit en permeabiliteit van de bloed-hersenbarrière.