Name: De Multi-gefluoreerde galzuren en In Vivo Magnetic Resonance Imaging te meten Bile Acid Transport (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Leer hoe je multi-gefluoreerde galzuren en MRI gebruikt om galzuurtransport in levende dieren te meten. Deze methode identificeert patiënten met chronische diarree door galzuurmalabsorptie zonder ioniserende straling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health, National Institute of Diabetes en spijsvertering en Kidney Diseases (subsidie ​​nummers R21 DK093406 en T32 DK067872 te JP.R.) en een VA Merit Award (licentienummer 1BX002129 te JP.R.).

Het volgende protocol voldoet aan de richtlijnen van de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) aan de Universiteit van Maryland School of Medicine (IACUC Protocol # 0415011, goedgekeurd 18 juni 2015) goedgekeurd. 1. Gavaging Muizen met 19 F-gelabelde galzuren <ol><li> Maagsonde muizen met 150 mg / kg lichaamsgewicht 19F gemerkte galzuren. Vul een 1 ml spuit met de vereiste volume met 19F gemerkte galzuur voorraadoplossing [cholinezuur-trifluor-acetyl lysine (CA-lys-TFA, in 1: 1 polyethyleenglycol 400: Dulbecco&#39;s fosfaat gebufferde zoutoplossing) of cholylsarcosine- trifluor-N-methyl-aceetamide (CA-sar-TFMA, in 60% polyethyleenglycol 400 en 40% Dulbecco&#39;s fosfaat gebufferde saline] en voeg een 20-gauge 1,5 inch gebogen lamp getipt maag sondenaald Controleer de sondenaald. lang genoeg is om het niveau van xyphoid kraakbeen muis bereiken wanneer ingebracht in de slokdarm naar de naaf van de naald </li><li> stevig grasp het dier door de losse huid aan de achterkant van de nek tussen de duim en wijsvinger en gebruik de overblijvende vingers op de huid grijpen op de onderrug en staart. </li><li> Houd de muis rechtop en laat de maagsonde naald langs de zijkant en het dak van de mond in de slokdarm tot in het maag. Als weerstand wordt ondervonden in de keelholte, de positie van de naald tot het dier &#39;slikt&#39; het - niet duwen tegen de weerstand. </li><li> Als anesthesie is vereist voor maagsonde, plaatst u de muis in een glazen stolp met 5 ml isofluraan en sluiten. Wanneer de muis valt op zijn kant, wacht 7 sec, verwijdert u de muis en het uitvoeren van sondevoeding. Om personeel te beschermen tegen verdoving dampen, gebruik maken van de stolp alleen in een zuurkast. </li><li> Observeer het dier te herstellen van isofluraan in een paar minuten. OPMERKING: Aangezien isofluraan wordt gemetaboliseerd door de lever, een fluor signaal afkomstig uit intacte geneesmiddel of zijn metabolieten uitgescheiden in de galwegen en galblaas kan fluo verwarrenrine signalen van 19F-gemerkte galzuren 15. Een alternatief is om ketamine plus xylazine (zie paragraaf 3.1 voor doses) gebruiken. </li></ol> 2. Het oogsten van de galblaas, de lever en het bloed voor Bile Acid metingen met behulp van vloeistofchromatografie / massaspectrometrie <ol><li> Om maximale vulling galblaas, snelle muizen bereiken tenminste 6 uur vóór het verzamelen van organen. Bereid ketamine en xylazine in fosfaat gebufferde zoutoplossing (100 pl ketamine, xylazine 62,5 ul, 840 ul PBS). </li><li> Onder toepassing van een 1 ml steriele spuit injecteert een muis subcutaan 1 uur vóór orgaan oogsten met 15 ul / g lichaamsgewicht ketamine / xylazine oplossing (150 mg ketamine en xylazine 18 mg per kg lichaamsgewicht). </li><li> Een uur na het toedienen van ketamine / xylazine bevestigen adequate anesthesie door teen knijpen en plaats de verdoofde muis rugligging. </li><li> Gebruik 5 of 6 inch schaar om een ​​middellijn buikhuid incisie vanaf het schaambeen leveren aan de xyphoid en fine schaar (4 inch) tot de peritoneale bekleding gesneden en bloot buikorganen - niet het membraan doorboren. </li><li> Pak de xyphoid proces met een 5 inch klem en til terug over de borst tot aan de bovenste buikholte bloot te leggen. Gebruik een tang en een stomp voorwerp te ontleden en te bewegen de lever opzij, waardoor de galblaas. OPMERKING: de lever niet verscheuren en raak de galblaas als de voormalige zal ernstige bloeden veroorzaken en de laatste kan galblaas contractie en legen te stimuleren. </li><li> Plaats een 4-inch klem over de galbuis (figuur 3, gestippelde pijlen). Snijd het ligament bevestigen de superieure pool van de galblaas het membraan en beweeg de galblaas aan de rechterkant van de buik. </li></ol><img alt="figuur 3" src="/files/ftp_upload/54597/54597fig3.jpg" /> Figuur 3: Anatomische en Proton MRI Views van de Muis galblaas. Het linker paneel toont de blootgestelde mouse galblaas links van middellijn abdominale incisie. De klem grijpt de xyphoid proces. De-gal gevulde vasten galblaas wordt aangegeven door de grote pijl en geklemd galbuis door de gestippelde pijlen. [Inzet: uitgesneden intact galblaas met de gemeenschappelijke galweg geklemd. De liniaal is gemarkeerd in millimeter (mm).] Een hoge-resolutie proton density-gewogen MRI-beeld van het vasten muizen galblaas (pijl) De rechter paneel toont. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54597/54597fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <ol start="7"><li> Vóór het uitsnijden van de galblaas te voeren cardiale punctie, oogst bloed en exsanguinate het dier om euthanasie te controleren. LET OP: Het oogsten van de galblaas eerste kan de lever veroorzaken cardiovasculaire collaps en ontoereikende bloedmonster te verkrijgen (≥ 200 pi) verscheuren. </li><li> Maak de onderzijde van het membraan en linkeridentificeren het kloppen oppervlak van het hart. Op het punt van de maximale cardiale pulsatie doorboren het membraan en hart met een 23-gauge naald bevestigd aan een 1 ml spuit. <ol><li> Langzaam trekken de spuit tijdens het opzuigen. Wanneer het bloed begint aan de spuit te vullen, stop te trekken en te behouden zuigkracht te verzamelen 0,2-0,6 ml bloed. Voorzichtig draaien van de naald of deze intrekking enigszins kan herstellen stroming als het ophoudt. </li><li> Breng het bloed naar een 1,5-ml gehepariniseerde buis en centrifugeer bij 2000 xg gedurende 15 min. Precipiteren het plasma met vier delen acetonitril en centrifugeer bij 12.000 xg gedurende 10 min. Analyseer de bovenstaande door vloeistofchromatografie / massaspectrometrie (LC / MS / MS) 11-1312-1412-1412-1412-14. Indien nodig, bewaar de plasma bij -80 ° C voor de analyse. </li></ol></li><li> Met behulp van stompe dissectie, bevrijden de galblaas uit de lever. Doorsnijden van de galwegen onder de klem, te verwijderen en wegen van de galblaas, en plaats deze in een 1,5-ml microcentrifuge buis. Oogst de lever. </li><li> Homogeniseren ongeveer 100 mg van de lever en de hele galblaas op ijs in een size-21 glas tissue homogenisator. Extract met 75% acetonitril en 25% water (800 pl voor de lever, 300 pi voor galblaas) en gecentrifugeerd bij 12.000 xg gedurende 10 min. Verdun extracten als nodig is en te kwantificeren galzuur inhoud met behulp van LC / MS / MS 11-13. </li></ol> 3. Levende Animal Proton (1H) en Fluor (19 F) Magnetic Resonance Imaging <ol><li> Om maximale galblaas vullen, snel muizen te bereiken gedurende minstens 6 uur voor beeldvorming. Gebruik ketamine en xylazine, verdoven muizen om beweging in de MRI scanner voorkomen. Bereid een voorraadoplossing van ketamine plus xylazine in fosfaatgebufferde zoutoplossing (130 pl ketamine, xylazine 42,5 ul, 827 ul PBS). Eén uur voor MRI, gebruikt een 1 ml steriele spuit met een muis subcutaan geïnjecteerd met 5 ul / g lichaamsgewicht van deze oplossing (65 mg ketamine en 4,25 mg xylazine per kg lichaamsgewicht). Om te voorkomen droog onder narcose veterinaire zalf ogen van het dier. </li><li> Na inductie met ketamine / xylazine zoals hierboven, clip een 1,5 cm 2, op de linkeroever onderste helft van de muis buik met behulp van # 40 of fijner elektrische scheerkoppen. Na bont verwijdering, prep het gebied met 8-12% verdund jodium chirurgische scrub oplossing en spoel af met 70% alcohol - Herhaal beide stappen. Steek een 24-gauge met 0,75-inch naald / katheter subcutaan en tunnel in de buikholte. Controleer de katheter niet in de blindedarm of andere abdominale organen door terugtrekken van de zuiger - er mag geen bloed of fecaal materiaal in de katheter. </li><li> Verwijder de naald en laat de intraperitoneale katheter. Plaats de muis op een temperatuur-gecontroleerde thermische pad in de MRI-scanner dier kamer. </li><li> Bereid een 1 ml steriele spuit met ketamine en xylazine in fosfaatgebufferde zoutoplossing (1000 pl ketamine, xylazine 300 gl, 6700 pl PBS) en vul de gewenste lengte van 72 inch steriele buis. Sluit de intraperitoneale katheter naar de voorgevulde steriele buis en uit te breiden uit de buurt van de MRI-scanner. Handhaven anesthesie injecteren 50 ul van deze oplossing elke 20 min wanneer de muis vitale tekenen stabiel. OPMERKING: Voordat imaging, zorg ervoor dat er geen metalen in de buurt van de MRI-scanner. </li><li> Gebruik een 19 V / 1 H dual-tuned lineaire volume MRI spoel aan radiofrequente signalen op 300,283 MHz voor 1H en 282,524 MHz voor 19 F kernen zenden en ontvangen. <ol><li> Voer systeemkalibratie 11, 13 en dier lokalisatie met drie-slice (axiaal, mid-sagittale en coronale) scout beelden met behulp van een snelle lage hoek geschoten sequentie (Flash). Om het experiment te starten, klikt u op het &#39;stoplicht&#39; knop in het venster Scan Controle op de software-console. </li><li> Verwerven multislice 1H MR-beelden met behulp van een snelle overname met ontspanning te verbeterenment (zeldzaam) volgorde in het kruis het oog van het monster of het lichaam van het dier met herhalingstijd 2200 ms, echo tijd 8,9 msec, RARE factor 8, gezichtsveld 4 x 4 cm 2, slice dikte 1,0 mm, matrix grootte 266 x 266, in-plane resolutie van 150 x 150 pm 2, en het aantal gemiddelden 6. Om het experiment te starten, klikt u op het &#39;stoplicht&#39; knop in het venster Scan Controle op de software-console. </li><li> Acquire 19 F beelden met behulp van een Flash-sequentie in hetzelfde gebied van het 1H MRI met herhaling tijd 220 ms, flip hoek = 30 °, echo tijd 3,078 ms, matrix formaat 32 x 32, in-plane resolutie van 1,25 x 1,25 mm 2, slice dikte 4,0 mm, en het aantal gemiddelden 768. Om het experiment te starten, klikt u op de &#39;GOP&#39; (G o- O n- P ipeline) knop in het venster Spectrometer control Tool op de software-console. </li></ol></li><li> Na MRI, euthanaseren de muis met intraperitoneale injectieen van 15 ul / g lichaamsgewicht ketamine / xylazine oplossing (150 mg ketamine / xylazine 18 mg per kg lichaamsgewicht) gevolgd door hartpunctie voor leegbloeden. </li><li> Om een ​​muis uit narcose te herstellen, verwijdert u de intraperitoneale katheter maar het dier niet onbeheerd achter, totdat het voldoende bewustzijn borstligging handhaven herwint. </li><li> Meten 19F gemerkte galzuur concentraties van 11-13 orgaan oogst, onderhouden anesthesie met ketamine plus xylazine zoals hierboven beschreven. </li></ol>

<ol><li>Thomas, C., Pellicciari, R., Pruzanski, M., Auwerx, J., Schoonjans, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+bile-acid+signalling+for+metabolic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Targeting bile-acid signalling for metabolic diseases.</a> Nat Rev Drug Discov. 7, 678-693 (2008).</li>
<li>Vallim, T. Q., Edwards, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bile+acids+have+the+gall+to+function+as+hormones%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Bile acids have the gall to function as hormones.</a> Cell Metab. 10, 162-164 (2009).</li>
<li>Dawson, P. A., Karpen, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thematic+Review+Series%3A+Intestinal+Lipid+Metabolism%3A+New+Developments+and+Current+Insights+Intestinal+transport+and+metabolism+of+bile+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Thematic Review Series: Intestinal Lipid Metabolism: New Developments and Current Insights Intestinal transport and metabolism of bile acids.</a> Journal of Lipid Research. 56, 1085-1099 (2015).</li>
<li>Dawson, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+deletion+of+the+ileal+bile+acid+transporter+eliminates+enterohepatic+cycling+of+bile+acids+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Targeted deletion of the ileal bile acid transporter eliminates enterohepatic cycling of bile acids in mice.</a> J Biol Chem. 278, 33920-33927 (2003).</li>
<li>Pattni, S., Walters, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+understanding+of+bile+acid+malabsorption%5BTitle%5D)+AND+%22Br+Med+Bull%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the understanding of bile acid malabsorption.</a> Br Med Bull. 92, 79-93 (2009).</li>
<li>Walters, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+mechanism+for+bile+acid+diarrhea%3A+defective+feedback+inhibition+of+bile+acid+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">A new mechanism for bile acid diarrhea: defective feedback inhibition of bile acid biosynthesis.</a> Clin Gastroenterol Hepatol. 7, 1189-1194 (2009).</li>
<li>Hofmann, A. F., Mangelsdorf, D. J., Kliewer, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+diarrhea+due+to+excessive+bile+acid+synthesis+and+not+defective+ileal+transport%3A+a+new+syndrome+of+defective+fibroblast+growth+factor+19+release%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Chronic diarrhea due to excessive bile acid synthesis and not defective ileal transport: a new syndrome of defective fibroblast growth factor 19 release.</a> Clin Gastroenterol Hepatol. 7, 1151-1154 (2009).</li>
<li>Flynn, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deoxycholic+acid+promotes+the+growth+of+colonic+aberrant+crypt+foci%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Carcinog%22%5BJournal%5D)">Deoxycholic acid promotes the growth of colonic aberrant crypt foci.</a> Mol Carcinog. 46, 60-70 (2007).</li>
<li>Glinghammar, B., Rafter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carcinogenesis+in+the+colon%3A+interaction+between+luminal+factors+and+genetic+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cancer+Prev%22%5BJournal%5D)">Carcinogenesis in the colon: interaction between luminal factors and genetic factors.</a> Eur J Cancer Prev. 8, S87-S94 (1999).</li>
<li>Bernstein, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carcinogenicity+of+deoxycholate%2C+a+secondary+bile+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Carcinogenicity of deoxycholate, a secondary bile acid.</a> Arch Toxicol. 85, 863-871 (2011).</li>
<li>Zheng, X., Ekins, S., Raufman, J. P., Polli, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+models+for+drug+inhibition+of+the+human+apical+sodium-dependent+bile+acid+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharm%22%5BJournal%5D)">Computational models for drug inhibition of the human apical sodium-dependent bile acid transporter.</a> Mol Pharm. 6, 1591-1603 (2009).</li>
<li>Vivian, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+characterization+of+a+novel+fluorinated+magnetic+resonance+imaging+agent+for+functional+analysis+of+bile+Acid+transporter+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Design and characterization of a novel fluorinated magnetic resonance imaging agent for functional analysis of bile Acid transporter activity.</a> Pharm Res. 30, 1240-1251 (2013).</li>
<li>Vivian, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+evaluation+of+a+novel+trifluorinated+imaging+agent+for+assessment+of+bile+acid+transport+using+fluorine+magnetic+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Sci%22%5BJournal%5D)">Design and evaluation of a novel trifluorinated imaging agent for assessment of bile acid transport using fluorine magnetic resonance imaging.</a> J Pharm Sci. 103, 3782-3792 (2014).</li>
<li>Vivian, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+performance+of+a+novel+fluorinated+magnetic+resonance+imaging+agent+for+functional+analysis+of+bile+acid+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharm%22%5BJournal%5D)">In vivo performance of a novel fluorinated magnetic resonance imaging agent for functional analysis of bile acid transport.</a> Mol Pharm. 11, 1575-1582 (2014).</li>
<li>Raufman, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Magnetic+Resonance+Imaging+to+Detect+Biliary+Excretion+of+19F-Labeled+Drug+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metab+Dispos%22%5BJournal%5D)">In Vivo Magnetic Resonance Imaging to Detect Biliary Excretion of 19F-Labeled Drug in Mice.</a> Drug Metab Dispos. 39, 736-739 (2011).</li>
<li>Ridlon, J. M., Kang, D. J., Hylemon, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bile+salt+biotransformations+by+human+intestinal+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Bile salt biotransformations by human intestinal bacteria.</a> J Lipid Res. 47, 241-259 (2006).</li>
<li>Frisch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-methyl-11C%5Dcholylsarcosine%2C+a+novel+bile+acid+tracer+for+PET%2FCT+of+hepatic+excretory+function%3A+radiosynthesis+and+proof-of-concept+studies+in+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nucl+Med%22%5BJournal%5D)">N-methyl-11C]cholylsarcosine, a novel bile acid tracer for PET/CT of hepatic excretory function: radiosynthesis and proof-of-concept studies in pigs.</a> J Nucl Med. 53, 772-778 (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De synthese van CA-lys-TFA en CA-sar-TFMA en de in vitro analyse van hun vervoer met stabiel getransfecteerde Madin-Darby niercellen van honden expressie ASBT en humane embryonale niercellen tot expressie de natrium / taurocholaat co-transporterende polypeptide (NTCP) elders gedetailleerd 13,14. Hier ligt de nadruk op de orale toediening van MFBA via een maagsonde aan dieren, gevolgd door de oogst van de galblaas, lever en bloed voor de analyse van MFBA inhoud leven en, met name, de beeldvorming MFBA...

Naast hun klassieke rol als detergentia dat vet in de darm te vergemakkelijken, zijn galzuren ontwikkeld tot krachtige signaalmoleculen beïnvloeden meerdere organen naast die verband houden met de enterohepatische circulatie 1,2. Naast het controleren van hun eigen metabolisme, galzuren moduleren verschillende aspecten van gastrointestinale fysiologie (bijvoorbeeld darmmotiliteit en incretinehormoon productie, colon fysiologie en kanker gevoeligheid) en systemische effecten op de vasculaire tonus, glucose en lipidemetabolisme en energiegebruik. Hoewel sommige van deze effecten tot stand in de darm, weer om postprandiale veranderingen in systemische galzuur niveaus, zoals in obese patiënten of na gastric bypass operatie. De complexe metabolische werkingen van galzuren nieuwe technologie vereist dat gelijktijdige controle van galzuur niveaus in verschillende anatomische compartimenten toestaat, in het maagdarmkanaal en meta helderenbolic weefsels (lever, pancreas, skeletspier en vetweefsel). Het verkrijgen van een dergelijke temporele en ruimtelijke informatie vereist innovatieve techniek - in vivo beeldvorming met behulp van nieuwe galzuur tracers zoals hier beschreven is zo&#39;n nieuwe benadering. Galzuur samenstelling en distributie in anatomische compartimenten worden gereguleerd door factoren die hun lever synthese en ileale opname, met inbegrip van voeding, chirurgie, gebruik van antibiotica en de veranderingen in de darmflora te moduleren. Een belangrijke regulator van intestinale galzuur opname vanwege hun enterohepatische circulatie 3 (figuur 1) is de dunne apicale natrium-afhankelijke galzuur Transporter (ASBT; SLC10A2). Hoewel passieve absorptie optreedt gedurende de darmen, ASBT medieert opname van 95% van intestinale galzuren zodat normaal beperkt is morsen van galzuren in de ontlasting. ASBT-deficiënte (Slc10a2 - / -) muizen fecale galzuren en een verminderde gal aci toegenomend zwembad 4. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/54597/54597fig1.jpg" /> Figuur 1: enterohepatische circulatie van galzuren. Illustratie van enterohepatische circulatie waarbij galzuren worden in de lever gesynthetiseerd, uitgescheiden in de gal Boom, opgeslagen in de galblaas, vrij in de proximale dunne darm met maaltijden, en actief opgenomen via ASBT in de distale Ileum. Dat kleine hoeveelheden galzuren passief gehele darm geabsorbeerd worden ongeveer 95% van intestinale galzuren actief getransporteerd ASBT er nauwelijks (ongeveer 5%) verlies van de ontlasting die wordt gecompenseerd door een gelijke hoeveelheid nieuwe galzuur synthese de lever, waardoor het handhaven van een steady-state galzuren. De pijlen op de juiste identificatie van factoren die van invloed kunnen zijn autochtone en fluor gemerkte galzuur stabiliteit, met inbegrip van maagzuur, pancreas en intestinale slijmvlies enzymen, en, het meest importantly, hydrolytische enzymen vrijgegeven door Clostridium soorten die de distale dunne darm en dikke darm te koloniseren. (Gewijzigd met toestemming 16) <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54597/54597fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> Galzuur malabsorptie kan worden onderverdeeld in drie typen, elk toeneemt fecale dihydroxy galzuren, waardoor intermitterende of chronische diarree veroorzaken. Type 1 gevolg is van grove ileale pathologie (bv, resectie, de ziekte van Crohn) 5. Type 3 resultaten van cholecystectomie, vagotomie, coeliakie, bacteriële overgroei en pancreas insufficiëntie. Daarentegen mensen met primaire (type 2) galzuur malabsorptie vormen een enorme diagnostische uitdaging omdat ze geen dergelijke voorafgaande voorwaarden niet aannemelijk pathologie in het ileum niet. Derhalve wordt primair galzuur malabsorptie vaak verkeerd gediagnosticeerd als diarree-predominant prikkelbare darmsyndroom (IBS-D), misschien wel de meest voorkomende reden voor gastro-enterologie gerelateerde poliklinische bezoeken. Er wordt geschat dat een derde van de patiënten met IBS-D primair galzuur malabsorptie; in de VS, kan dit een paar miljoen mensen 5 vertegenwoordigen. Recente inzichten geven aan dat de primaire BAM is afgeleid van een verminderde feedback remming van de lever galzuursynthese door intestinale fibroblast groeifactor-19 (FGF19), niet van verminderde expressie of functie van ASBT. In primaire galzuren malabsorptie, lage plasmaspiegels van FGF19 niet af te sluiten hepatische galzuursynthese - de resulterende toename van intestinale galzuren verzadigd galzuur transporters, waaronder ASBT en augmented morsen van galzuren in de ontlasting veroorzaakt diarree 6 (Figuur 2). Deficiënte muizen in Fgf15 (muizen FGF19) hebben een uitgebreide galzuren en een verhoogde fecale galzuren 7. Figuur 2: Mechanismen van Intestinal Bile Acid Malabsorptie. Normaal, zoals getoond in panel A, ongeveer 95% van intestinale galzuren worden geabsorbeerd door actief transport in het distale ileum via ASBT. Wanneer ASBT expressie of activiteit wordt verminderd (paneel B), verminderde darm galzuur opname resulteert in verspilling van galzuren in de dikke darm. Met een verminderde FGF19 signalering (paneel C), het gebrek aan feedback remming van de lever galzuursynthese resulteert in verhoogde concentraties van intestinale galzuren dat ASBT transportcapaciteit met het morsen van galzuren in de dikke darm te overweldigen. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54597/54597fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie te bekijken dit figuur.</a> Op lange termijn, chronische verhoging in fecal gal acids kan colon neoplasie te promoten. Colon neoplasie komt voort uit progressieve mucosale dysplasie geassocieerd met somatische genmutaties, maar omgevingsfactoren die fecale galzuren kan versnellen en versterken dit proces te verhogen. Bij knaagdieren, verhoogde fecale galzuren hetzij als gevolg van exogene toediening of ASBT deficiëntie bevorderen colon dysplasie en tumorvorming 8-10. Met name provocerende bevindingen wijzen erop dat veel gebruikte drugs door de Food and Drug Administration (FDA) goedgekeurd krachtig remmen galzuur transport door ASBT in vitro 11. Als deze drugs, verminderen de dunne darm galzuur transport in vivo en het verhogen van fecale galzuur niveaus, zou de mogelijke impact op colon pathologie betrekking. Zelfs een kleine toename colon pathologie die aan het gebruik van een dergelijk geneesmiddel kan een belangrijk gezondheidsprobleem impact. Een toolkit die de plausibiliteit van deze in vitro bevindingen en epidemiologische ob kunnen beoordelenservations zou aanvullend onderzoek, met inbegrip van post-marketing onderzoek naar de veiligheid te bevorderen. Ondanks de noodzaak praktische assays identificeren mensen met galzuren malabsorptie ontbreken. Directe meting van fecale galzuren werd jaren geleden afgewezen als omslachtig, onpraktisch en onbetrouwbaar 5. Alternatieve benaderingen omvatten het meten van het behoud van een radioactief selenium gemerkt cholinezuur derivaten (75 SeHCAT) en plasmaniveaus van 7α-hydroxy-4-cholesten-3-on (C4), of een therapeutisch proces galzuur bindmiddelen. 75 SeHCAT testing beperkte beschikbaarheid in Europa en is niet FDA-goedgekeurd of beschikbaar is voor gebruik in de VS zelfs bescheiden blootstelling aan straling (0,26 mSv / 75 SeHCAT test) van diagnostische tests geeft aanleiding tot bezorgdheid, en bacteriële overgroei en gevorderde leverziekte kan 75 SeHCAT resultaten verwarren. C4 testen potentieel aantrekkelijk aangezien alleen plasma nodig is, maar het heeft lage positieve voorspellende valUE en testen is niet algemeen beschikbaar. Meten serumniveaus van FGF19 heeft dezelfde beperkingen. Veel clinici toevlucht nemen tot een therapeutisch proces van galzuursequestranten, maar deze benadering kan geen definitieve diagnose galzuur malabsorptie 5. Daarom werd een nieuwe benadering ontworpen om MRI galzuur transport en distributie in vivo meten met behulp innovatief multi-gefluoreerde galzuren (MFBA-MRI). MFBA met drie atomen van fluor (19 F), een stabiele isotoop van 100% natuurlijke abundantie, zijn eveneens getransporteerd naar natief galzuren 12, en kan worden gebruikt voor het visualiseren galzuur transport met een combinatie van proton (1H) en fluorine ( 19 F) MRI, een gevoelige, veilige methode zonder ioniserende straling blootstelling 13,14.

<table><tbody><tr><td>Duall size-21 all glass tissue grinder</td><td>Kimble Chase Life Science, Vineland, NJ</td><td>885351-0022</td><td></td></tr><tr><td>Bruker BioSpec 70/30USR Avance III 7T horizontal bore MR Scanner</td><td>Bruker Biospin MRI GmbH, Germany</td><td></td><td>Gebruik bijbehorende Paravision Version 5.1 software (zie stap 3.5)</td></tr><tr><td>Bruker 40 mm 19F/1H dual-tuned linerar volume coil</td><td>Bruker Biospin MRI GmbH, Germany</td><td></td><td>Gebruik bijbehorende Paravision Version 5.1 software (zie stap 3.5)</td></tr><tr><td>Waters Acquity UPLC System with Quadrupole Detector</td><td>Waters Corporation, Milford, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waters Acquity UPLC ethylene bridged hybrid C8 1.7 &mu;m 2.1 x 50 mm column</td><td>Waters Corporation, Milford, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gavage Needle</td><td>Braintree Scientific, INC.</td><td>N-010</td><td>20 G-1.5" gebogen 2.25 mm bol</td></tr><tr><td>2 Stainless Steel Hemostats&nbsp;</td><td>VWR</td><td>10755-018</td><td>4 en 5 inch, recht</td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>501090</td><td>Ketamin zetamine 100 mg/ml</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Akorn, Inc.</td><td></td><td>20 mg/ml</td></tr><tr><td>Intraperitoneal Catheter</td><td>Abbott</td><td>AbbocathTM-T.I.V. G720-A01 4535-42</td><td>24-G x 0.75"</td></tr></tbody></table>

de multi-gefluoreerde galzuren en<em&gt; in vivo</em&gt; magnetic resonance imaging te meten bile acid transport

Using Multi-fluorinated Bile Acids and In Vivo Magnetic Resonance Imaging to Measure Bile Acid Transport

Samen met hun traditionele rol als wasmiddelen die vetopname te vergemakkelijken, opkomende literatuur geeft aan dat galzuren krachtige signaalmoleculen die meerdere organen aantasten; ze moduleren darmmotiliteit en de productie van hormonen, en veranderen de vasculaire tonus, glucose metabolisme, vetstofwisseling en energiegebruik. Veranderingen in fecale galzuren kan de darm microbiome veranderen en bevorderen colon pathologie zoals cholerrheic diarree en darmkanker. Key regulatoren van fecale galzuur samenstelling van de dunne darm apicale natrium-afhankelijke Bile Acid Transporter (ASBT) en fibroblast groeifactor-19 (FGF19). Verminderde expressie en functie van ASBT vermindert intestinale galzuur-opname. Bovendien suggereren in vitro gegevens dat een aantal door de FDA goedgekeurde geneesmiddelen remmen ASBT functie. Deficiënte FGF19 vrijlating verhoogt de lever galzuursynthese en laat in de darmen tot een niveau dat ASBT overweldigen. Ofwel ASBT disfunctie of FGF19 tekort verhoogt feCAL galzuren en kan chronische diarree veroorzaken en colon neoplasie te promoten. Helaas, instrumenten voor het meten van galzuren malabsorptie en de acties van drugs op galzuur transport in vivo zijn beperkt. De complexe werkingen van galzuren begrijpen, zijn technieken vereist dat gelijktijdige controle van galzuren in de darm en metabole weefsels mogelijk. Daarom hebben we een innovatieve werkwijze voor galzuur transport in levende dieren te meten met behulp van een combinatie van proton (1H) en fluor (F 19) magnetische resonantie beeldvorming (MRI) vatten. Nieuwe tracers fluor (F 19) -gebaseerde levende dieren MRI werden gemaakt en getest, zowel in vitro als in vivo. Sterke punten van deze aanpak zijn het ontbreken van blootstelling aan ioniserende straling en translationeel potentieel voor klinisch onderzoek en praktijk.

Het gebruik van MFBA voor in vivo MRI &#39;zien&#39; galzuur transport in real time heeft een groot potentieel voor zowel onderzoek en klinisch gebruik. Bovendien is de hier beschreven resectie van de galblaas en biochemische analyse van de inhoud met behulp van vloeistofchromatografie en massaspectrometrie werkwijzen manier bevestigt imaging resultaten. Echter, de geldigheid van deze methoden vereist een nauwkeurige dosering, timing van de assays, en lokalisatie van de galblaas...

Tools om te diagnosticeren galzuurintermediairen malabsorptie en meet galzuur transport in vivo beperkt zijn. Een innovatieve aanpak in levende dieren wordt beschreven dat de gecombineerde proton (1H) plus fluor (19 F) magnetic resonance imaging gebruikt; Deze nieuwe methodologie heeft translationeel potentieel om te screenen op galzuurintermediairen malabsorptie in de klinische praktijk.

De Multi-gefluoreerde galzuren en<em&gt; In Vivo</em&gt; Magnetic Resonance Imaging te meten Bile Acid Transport

Along with their traditional role as detergents that facilitate fat absorption, emerging literature indicates that bile acids are potent signaling ...

Het algemene doel van deze procedure is om galzuren te labelen met natuurlijk voorkomend, niet-radioactief fluor voor het meten van hun concentratie in de galblaas via MRI, om zo het transport van galzuren in levende dieren te bestuderen. Deze aanpak biedt potentieel voor het identificeren van personen met chronische diarree die behandeld moeten worden voor galzuurmalabsorptie. De belangrijkste voordelen van deze methode zijn dat er geen blootstelling aan ioniserende straling nodig is en dat er een groot translationeel potentieel is voor zowel klinisch onderzoek als de medische praktijk.We kwamen voor het eerst op het idee voor deze methode toen we beseften dat er in de Verenigde Staten geen praktische klinische tests zijn voor het detecteren van een verstoord galzuurtransport in de darm. Begin met het vullen van een spuit van één milliliter met het juiste volume fluor-gelabelde galzuur-stockoplossing en bevestig een gebogen, bolvormige maagsonde-naald van 20-gauge en 1,5 inch. Gebruik vervolgens de duim en wijsvinger om de muis stevig vast te pakken bij de losse huid in de nek en de overige vingers om de huid op de onderrug en de staart vast te houden.Houd het dier rechtop en voer de sondeer-naald langs de zijkant en het gehemelte van de mond door in de slokdarm en verder naar de maag. Maak op het relevante experimentele eindpunt een mediane abdominale huidincisie van het schaambeen tot het xiphoïdeus, gevolgd door een overeenkomstige incisie door het peritoneale vlies om de abdominale organen bloot te leggen zonder het diafragma te doorboren. Gebruik vervolgens een klem van vijf inch om het xiphoïdeus op te tillen, waardoor de bovenste abdominale holte wordt blootgesteld.Disseceer en verschuif de lever met een pincet en een stomp instrument om de galblaas bloot te leggen. Plaats vervolgens een klem van vier inch over de gemeenschappelijke galgang en klem het ligament dat de superieure pool van de galblaas aan het diafragma bevestigt door, zodat de galblaas naar de rechterkant van de buikholte kan worden verschoven. Wees voorzichtig en klem de gemeenschappelijke galgang zo snel mogelijk na de laparotomie om laceratie van de lever of onbedoelde lediging van de galblaas te voorkomen.Na exsanguinatie wordt het geoogste bloed overgebracht naar een gehepariniseerde buis van 1,5 milliliter voor centrifugatie. Precipiteer het plasma met vier delen acetonitril en centrifugeer het bloedmonster opnieuw. Analyseer vervolgens het supernatant via vloeistofchromatografie en massaspectrometrie.Om de galblaas vrij te maken, wordt het omringende weefsel bot gedissekeerd, gevolgd door transectie van de gemeenschappelijke galgang onder de klem. Weeg de geoogste galblaas, plaats het weefsel vervolgens in een microcentrifugebuisje van 1,5 milliliter en verwijder de lever. Om de weefsels te extraheren, wordt 75% acetonitril en 25% water toegevoegd en wordt ongeveer 100 milligram van de lever en de volledige galblaas gehomogeniseerd in individuele glazen weefselhomogenisatoren van maat 21 op ijs.Overbreng de monsters naar een 1,5-ml Eppendorf-buis en centrifugeer deze. Verdun vervolgens de extracten naar behoren en kwantificeer de galzuurgehaltes met behulp van vloeistofchromatografie en massaspectrometrie. Reinig bij het juiste experimentele eindpunt de binnenzijde van de linker bovenpoot van de geanestheseerde muis en breng een 24-gauge 0,75-inch naaldkatheter subcutaan door de dij in de abdominale holte in.Verwijder de naald en laat de intraperitoneale katheter op zijn plaats. Verplaats de muis naar het dierenbed van de MRI-scanner en bevestig een temperatuurgecontroleerd warmtekussen. Verbind de katheter met een steriel slangetje van 72 inch en sluit het slangetje aan op een steriele spuit van 1 milliliter om de anesthesie gedurende de procedure in stand te houden.Nadat is bevestigd dat er geen metalen in de buurt van de scanner zijn, wordt een fluor-proton dubbel-afgestemde lineaire volumebasis MRI-spoel gebruikt om de radiofrequentiesignalen te zenden en te ontvangen. Gebruik vervolgens een fast low angle shot-sequentie om scalpbeelden van drie coupes te verkrijgen om het systeem te kalibreren en de positie van het dier te verifiëren. Om het experiment te starten, klikt u op de verkeerslichtknop om multi-slice proton magnetische resonantiebeelden te verkrijgen met de rapid acquisition with relaxation and enhancement-sequentie in het crossview van het monster.Klik tenslotte op de GOP-knop in het venster van de besturingssoftware van de spectrometer om fluorbeelden te verkrijgen met een tweede snelle sequence met een lage hoek in hetzelfde gebied. Met deze methode kan een zeer selectieve concentratie van gemultifluorineerd galzuur, of MFBA, in de galblaas worden gemeten die een factor duizend hoger ligt dan de niveaus die in de lever of het plasma zijn waargenomen, wat inconsistent is met de fysiologische niveaus van galzuren. Zoals verwacht bij de fysiologische kinetiek van de enterohepatische circulatie van galzuur, zijn de piekconcentraties van MFBA in de galblaas duidelijk zichtbaar vier tot zeven uur na orale toediening.Inderdaad, twee en een halve tot vier uur na orale toediening van MFBA via een sonde, worden fluor-signalen waargenomen die afkomstig lijken te zijn uit de gemeenschappelijke galgang, samen met een sterker signaal afkomstig uit de galblaas. Na zeven tot acht en een halve uur is het signaal van de gemeenschappelijke galgang niet langer detecteerbaar en neemt het fluor-signaal van de galblaas toe tot dezelfde intensiteit als het signaal afkomstig uit het aangrenzende MFBA-fantoom. Bij muizen die deficiënt zijn voor de apicale natriumafhankelijke galzuurtransporter, welke een verminderde intestinale opname van galzuren vertonen, treedt een ongeveer 22-voudige afname in de concentratie van MFBA op in vergelijking met gecontroleerde wild-type dieren.Inderdaad, terwijl er een robuust fluor-signaal wordt gedetecteerd in de galblazen van wild-type muizen, is er geen overeenkomstig fluor-signaal in dieren die deficiënt zijn voor de apicale natriumafhankelijke galzuurtransporter; dit bevestigt zowel dat MFBA op dezelfde wijze worden verwerkt als fysiologische galzuren, als dat MFBA MRI kan worden gebruikt om de belemmerde intestinale opname van galzuren te detecteren. Eenmaal beheerst en correct uitgevoerd, kunnen de laparotomie, bloedafname en de incisie van de galblaas en lever binnen 20 minuten worden voltooid. De signaalacquisitie tijdens de MRI zal anderhalf tot twee uur in beslag nemen.Na de ontwikkeling en commercialisering heeft deze techniek het potentieel om de weg vrij te maken voor het onderzoek naar de rol van het intestinale galzuurtransport bij fysiologie en ziekte, zowel bij kleine dieren als bij mensen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u vreemd-gelabelde galzuren aan kleine dieren moet toedienen en hoe u hun opname in de lever en galblaas moet meten via MRI of orgaanincisie.

using-multi-fluorinated-bile-acids-vivo-magnetic-resonance-imaging-to

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

We beschrijven een algemeen protocol voor in vivo cell tracking met MRI in een muismodel met ex vivo gemerkte cellen. Een typische protocol voor mobiele etikettering, beeldaanwinst verwerking en kwantificering is inbegrepen.

In vivo 19 F MRI voor mobiele Tracking

Hier beschrijven we een techniek om de mesenteriale lymfevat te canuleren bij ratten, wat de kwantificering van lipiden- en geneesmiddeltransport via het lymfestelsel mogelijk maakt na intestinale toediening. De techniek kan worden aangepast om mesenteriale lymfeconcentraties en/of transport van vocht, immuuncellen, peptiden, eiwitten en lipofiele moleculen te beoordelen.

De Mesenteriale Lymfe Duct gecanuleerde Rat Model: Toepassing op de beoordeling van Intestinal Lymfatische Drug Transport

We bieden een gedetailleerd protocol om galzuurdynamiek in levende cellen te bestuderen met behulp van een genetisch gecodeerde BAS FRET-sensor. Deze Galzuursensor vertegenwoordigt een uniek hulpmiddel om (regulatie van) galzuurtransport en FXR-activering in een breed scala aan celtypen te bestuderen.

Real-time monitoring van de intracellulaire Bile Acid Dynamics Met behulp van een genetisch gecodeerde FRET-gebaseerde Bile Acid Sensor

Doelgroepen gerichte sondes vertegenwoordigen een vernieuwend hulpmiddel voor het analyseren van de moleculaire mechanismen, zoals eiwituitdrukking in verschillende soorten ziekten (b.v., ontsteking, infectie en tumorvorming). In deze studie beschrijven we een kwantitatieve driedimensionale tomografische beoordeling van intestinale macrofaag infiltratie in een lymfkliertest model van colitis met F4/80-specifieke fluorescentie-gemedieerde tomografie.

Fluorescentie-gemedieerde tomografie voor de detectie en kwantificering van macrofaag-gerelateerde lymfkliertest darmontstekingen

De toegang van voedingsstoffen, microbiota metabolieten en medicijnen voor het verkeer wordt geregeld door de darm-bloed-barrière (GBB). Beschrijven we een directe methode voor het meten van de GBB permeabiliteit in vivo, die, in tegenstelling tot veelgebruikte indirecte methoden, wordt vrijwel niet beïnvloed door de functies van lever en nieren.

Een In Vivo -methode voor het uitrekenen van de Gut-bloed barrière en lever metabolisme van Microbiota producten

Dit protocol heeft tot doel in vivo myelineveranderingen (demyelinatie en remyelinatie) te monitoren door positronemissietomografie (PET) beeldvorming in een diermodel van multiple sclerose.

Positron Emissie Tomography Imaging voor In Vivo Meten van Myeline Inhoud in de Lysolecithine Rat Model van Multiple Sclerose

Met behulp van een dieet-geïnduceerde niet-alcoholische leververvetting (NAFLD) muismodel, beschrijven we het gebruik van nieuwe in vivo micro-computertomografie beeldvormingstechnieken als een niet-invasieve methode om de progressiestadia van NAFLD te beoordelen, voornamelijk gericht op het hepatische vasculaire netwerk vanwege de significante betrokkenheid bij NAFLD-gerelateerde leverontregeling.

Nieuwe in vivo micro-computertomografie beeldvormingstechnieken voor het beoordelen van de progressie van niet-alcoholische leververvetting

Hier beschrijven we een magnetische scheidings-geassisteerde homogenisatiemethode met hoge snelheid voor grootschalige productie van endosoom-afgeleide nanovesikels als een nieuw type exosoomnabootsers (EM's) die dezelfde biologische oorsprong en vergelijkbare structuur, morfologie en eiwitsamenstelling van inheemse extracellulaire blaasjes (EV's) delen.

Een magnetische scheidings-ondersteunde homogenisatiemethode met hoge snelheid voor grootschalige productie van endosoom-afgeleide blaasjes

Dit protocol gebruikt een meerkamerbed voor parallelle magnetische resonantiebeeldvorming (MRI) van maximaal vier dieren om pancreasadenocarcinoomtumoren te detecteren in genetisch gemodificeerde muismodellen. Dit multianimal MRI-protocol is snel en kosteneffectief voor het opsporen en meten van tumoren, wat de dierselectie voor preklinische studies en longitudinale monitoring van tumorgroei vergemakkelijkt.

Multianimal Magnetic Resonance Imaging voor tumormetingen in alvleesklierkanker muismodellen

Een nauwkeurige en praktische methode om de parameters te meten achtige stam in myocardiale weefsel is van grote klinische waarde, want het is aangetoond, dat de stam is een meer gevoelige en eerder marker voor contractiele dysfunctie dan de vaak gebruikte parameter EF.

Magnetic Resonance Afgeleide myocard Strain Assessment Met behulp van functie Tracking

Leer hoe je multi-gefluoreerde galzuren en MRI gebruikt om galzuurtransport in levende dieren te meten. Deze methode identificeert patiënten met chronische diarree door galzuurmalabsorptie zonder ioniserende straling.

De Multi-gefluoreerde galzuren en

Meer video's verkennen