De productie van pluripotente stamcellen van Mouse Vruchtwater cellen met behulp van een transposon System
February 28th, 2017
In deze studie genereren we geïnduceerde pluripotente stamcellen uit muis-vruchtwatercellen, met behulp van een niet-viraal transposonsysteem.
Het algemene doel van deze procedure is om muis amnionvochtcellen te isoleren en herprogrammeren met behulp van een transposon-systeem. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het gemakkelijk uit te voeren is. In een therapeutische omgeving kunnen cellen van menselijke zieke foetussen worden gedifferentieerd naar cellen van belang voor medicijntesten of weefselengineering, om een andere manier voor te bereiden om de patiëntspecifieke therapie vóór de bevalling te geven.
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over programmering. Het transposon-systeem is efficiënt in verschillende celtypen. Het is geschikter voor een klinische aanpak in vergelijking met virale vectoren en maakt de productie van oxino-vrije IPS-cellen mogelijk.
Om met de isolatie te beginnen, reinig de buikwand van de moeder met 70 procent ethanol. Gebruik schaar om een midline laparotomie uit te voeren, door de lengte van de buikwand in te snijden om toegang te krijgen tot de buikholte. Gebruik een tang om de baarmoeder bloot te leggen en snijd deze vervolgens af met schaar, zorg ervoor dat u de foetale membranen niet beschadigt. Verzamel de foetussen in een 100 millimeter schaal gevuld met steriel 1xPBS en zet op ijs. Plaats de schaal onder een stereomicroscoop met 10x vergroting en houd de baarmoeder vast met een tang terwijl u de baarmoederwand verwijdert met schaar.
Pak de placenta van één foetus met de fijne punttang en verplaats deze naar een schone 100 millimeter schaal. Verwijder hier voorzichtig de dooierzak. Vernietig de amnion met de tang en gebruik een insulinespuit om 30 microliters amnionvocht te verzamelen.
Breng het vocht over naar een 15 milliliter kegelvormige fles. Herhaal dit proces voor elke foetus, verzamel het vocht elke keer in dezelfde fles. Was vervolgens elke foetus met steriel 1xPBS aangevuld met één procent foetaal bovien serum en verzamel dit in de 15 milliliter kegelvormige buis samen met het amnionvocht.
Centrifugeer de buis gedurende vijf minuten bij 145 keer G en verwijder vervolgens onder een laminaire flowkap het supernatant. Breng de gepelletiseerde cellen weer op in twee milliliter amnionvochtcultuurmedium. Neem een zes welplaat bedekt met 0,1 procent gelatine die is behandeld met myomycin-C muis embryonale fibroblasten of MEF en zaai vervolgens twee milliliter cellen op de plaat.
Kweek de cellen bij 37 graden Celsius en vijf procent koolstofdioxide, ververs het medium om de dag. Continueer het kweken gedurende zeven dagen totdat de cellen klaar zijn voor transfectie. Om te beginnen met transfectie, meng in een 1,5 millimeter microcentrifugebuis één microgram transposon-plasmide met 0,5 microgram transposase-expressieplasmide en 0,5 microgram omgekeerde tetracycline transactivator-plasmide.
Verdun tot 100 microliters met d-man. Voeg acht microliters transfectie-reagens toe aan de microcentrifugebuis met het DNA. Incubeer deze mix gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
Neem de zes welplaat met muis AF-cellen, voeg druppelsgewijs 100 microliters van de transfectie-reagens DNA-mix toe per wel, verdeel door voorzichtig te schudden met een eindvolume van twee milliliter per wel. Laat de cellen 24 uur staan bij 37 graden Celsius in vijf procent koolstofdioxide. De volgende dag verwijdert u het kweekmedium en voedt u vervolgens elke celwel met twee milliliter vers iPS AF-medium aangevuld met een punt vijf microgram per milliliter doxycycline om de expressie van Yamanaka's factoren te induceren.
Voed de cellen dagelijks met vers dox-bevattend medium zonder passage vanaf dit punt. Observeer de cellen binnen 24 uur na de eerste doxycycline-behandeling onder de fluorescentiemicroscoop op mCherry-expressie en dagelijks vanaf dit punt voor kolonievorming. Zodra kolonievorming wordt waargenomen, pluk afzonderlijke kolonies in 50 microliters celkweekmedium.
Breng ze vervolgens achtereenvolgens over naar aparte wells van een 96 wel weefselkweekplaat met met mitomycin c behandelde MEF. De volgende dag voegt u 50 microliters trypsine toe aan elke wel en incubeert u gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius om de kolonies te dissociëren in enkele cellen. Na incubatie, pipetteer de vloeistof op en neer om de kolonies verder te dissociëren.
Breng 50 microliters van de trypsine-celmix over naar een nieuwe wel die inactieve MEF bevat en breng de cellen vervolgens terug naar de incubator. Wanneer de cellen 60 tot 70 procent confluentie bereiken, verdeel ze dan in een nieuwe wel van een 24 wel plaat en continueer vervolgens de incubatie bij kamertemperatuur. Zodra deze cellen 60 tot 70 procent confluentie bereiken, verplaats de cellen een tot twee in twee wells, één bevattende doxycycline en één zonder, om te verifiëren dat kolonies ook zullen groeien in afwezigheid van doxycycline.
Ga door met het onderhouden van de IPS AF-kolonies en doxycycline-onafhankelijk medium op inactieve MEF bij 37 graden Celsius in vijf procent koolstofdioxide. Ververs het medium dagelijks totdat de cellen klaar zijn voor kleuring, beeldvorming en RNA-extractie. Hier drukken de stabiele doxycycline-onafhankelijke geïnduceerde pluripotente muis amnionvocht GFP-positieve cellen de pluripotentiemarkers uit die vereist zijn om succesvolle herprogrammering te bevestigen.
RTPCR-analyse met behulp van R1 ES-cellen als controle toonde expressie van de geïnduceerde pluripotentiemarkers in aanwezigheid of afwezigheid van doxycycline. De expressie van het huishoudgen, beta twee microglobuline, werd ook waargenomen in alle drie de celtypen. Teratomen geïsoleerd uit muizen geïnjecteerd met de geïnduceerde pleuropotente cellen werden immunogeverfd.
Detectie van alfa foetaal eiwit, alfa gladde spieractine en beta drie tubuline in de massa's bevestigt celdifferentiatie in alle drie de kiembladen, ectoderm, mesoderm en endoderm. Verder bevestigt RTPCR-analyse van in vitro embryoïde lichaampjes en in vivo teratomacellen de expressie van kiemblaasspecifieke markergenen voor het mesoderm, endoderm en ectoderm
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie richt zich op het genereren van geïnduceerde pluripotente stamcellen uit muis-vruchtwatercellen met behulp van een niet-viraal gebaseerd transposon-systeem. De techniek is voordelig vanwege zijn gebruiksgemak en potentiële therapeutische toepassingen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Stamceldonderzoek
- Regeneratieve geneeskunde
- Transposon-technologie
Achtergrond
- Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) kunnen worden afgeleid van verschillende celtypen.
- Vruchtwatercellen bieden een niet-invasieve bron voor iPSC-generatie.
- Transposon-systemen bieden een veiliger alternatief voor virale vectoren.
- Deze methode kan patiëntspecifieke therapieën vóór de bevalling mogelijk maken.
Doel van het onderzoek
- Om muis-vruchtwatercellen te isoleren en te herprogrammeren.
- Om de efficiëntie van het transposon-systeem bij het genereren van iPSC's te onderzoeken.
- Om het potentieel voor therapeutische toepassingen in medicijntesten en weefselengineering te beoordelen.
Gebruikte methoden
- Isolatie van muis-vruchtwatercellen.
- Toepassing van een niet-viraal transposon-systeem voor herprogrammering.
- Karakterisering van gegenereerde iPSC's.
- Evaluatie van differentiatiepotentieel voor therapeutisch gebruik.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle generatie van iPSC's uit muis-vruchtwatercellen.
- Gedemonstreerde efficiëntie van het transposon-systeem over verschillende celtypen heen.
- Mogelijkheid voor klinische toepassingen in patiëntspecifieke therapieën.
- Productie van oxino-vrije iPSC's, wat de veiligheid voor therapeutisch gebruik verbetert.
Conclusies
- Het transposon-systeem is een haalbare methode voor het genereren van iPSC's.
- Deze benadering kan leiden tot vooruitgang in regeneratieve geneeskunde.
- Er is verder onderzoek nodig om het volledige therapeutische potentieel te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This transposon-based reprogramming method enables generation of patient-specific iPSCs from amniotic fluid, offering a non-viral, clinically translatable approach for prenatal disease modeling and therapeutic screening. By producing oxino-free iPSCs capable of trilineage differentiation, the technique supports early-stage target validation and mechanistic de-risking in regenerative medicine pipelines. Its simplicity and scalability position it as a reusable platform for discovery-stage workflows focused on congenital disorder therapeutics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of disease mechanisms using genetically matched human fetal cells for target hypothesis testing.
- Operational Value: Provides a renewable, patient-derived cellular system for validating target engagement in a disease-relevant context.
- Predictive Value: Supports preclinical confidence by generating isogenic controls from amniotic fluid-derived iPSCs for pathway analysis.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized iPSC lines suitable for high-content screening of compounds targeting developmental pathways.
- Quantitative Output: Enables measurable differentiation readouts across germ layers for dose-response and phenotypic profiling.
- Platform Reuse: Establishes a scalable, non-viral reprogramming system adaptable to multiple disease models and screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Disease Modeling: Facilitates creation of in vitro and in vivo teratoma models to assess differentiation potential and safety profiles.
- Translational Continuity: Bridges discovery to preclinical validation through consistent germ layer marker expression in embryoid bodies and teratomas.
- Risk Mitigation: Reduces biological variability by using clonal, doxycycline-independent iPSC lines for reproducible preclinical studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting target validation through disease-relevant cellular models and enabling lead identification via differentiation-based assays. It feeds into preclinical research by providing scalable, characterized iPSC sources for mechanistic studies and safety assessment. As a non-viral reprogramming platform, it offers enterprise-level reuse across multiple projects requiring patient-specific pluripotent cells.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification using amniotic fluid-derived iPSCs that reflect fetal genetic backgrounds.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible cell sources with quantifiable germ layer differentiation for compound evaluation.
- Analytics: Generates measurable outputs including germ layer-specific marker expression and teratoma formation for comparative analysis.
- Translational Research: Ensures continuity from in vitro embryoid bodies to in vivo teratoma models, validating differentiation capacity.
- Enterprise Reuse: Functions as a standardized, non-viral reprogramming capability applicable to diverse congenital disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances target validation confidence through disease-relevant, genetically matched iPSC models with demonstrated pluripotency.
- Operational Value: Offers a simple, non-viral workflow with high reproducibility and minimal biosafety constraints.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early biological de-risking of therapeutic targets in prenatal disease contexts.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of congenital disorder programs using patient-derived preclinical models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell culture, transfection, and pluripotency characterization.
- Dependent on access to amniotic fluid samples and appropriate feeder cell systems (MEF).
- Necessitates standardized doxycycline induction and withdrawal protocols for clonal line validation.
- Involves teratoma formation and germ layer staining for functional pluripotency confirmation.
- Limited by the availability of gestational samples and ethical considerations in fetal tissue use.
