Name: De productie van pluripotente stamcellen van Mouse Vruchtwater cellen met behulp van een transposon System (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Leer hoe je pluripotente stamcellen genereert uit muizen vruchtwatercellen met een transposon-systeem. Deze niet-virale methode biedt een veilige aanpak voor regeneratieve geneeskunde en patiëntspecifieke therapieën.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door CARIPARO Foundation Grant nummer 13/04 en Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Città della Speranza Grant nummer 10/02. Martina Piccoli, Chiara Franzin en Michela Pozzobon worden gefinancierd door Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Città della Speranza. Enrica Bertin wordt gefinancierd door CARIPARO Foundation Grant nummer 13/04. Paolo De Coppi wordt gefinancierd door Great Ormond Street Hospital Children's Charity.

Alle procedures waren in overeenstemming met de Italiaanse wetgeving. Murine AF monsters werden geoogst van zwangere muizen op 13,5 dagen na coïtum (DPC) van C57BL / 6-Tg (UBC-GFP) 30Scha / J muizen geroepen GFP. 1. Transposon Production OPMERKING: Transposon expressievectoren werden gegenereerd onder toepassing van standaard kloneringswerkwijzen. Het plasmide DNA voor transfectie muis AF-cellen werd bereid onder toepassing van commerciële kits. <ol><li> Meng 10 ng plasmide DNA met 50 pl DH5a bacteriën in een 1,5 ml microcentrifugebuis. Incubeer de microcentrifugebuis op ijs gedurende 20 min. </li><li> Hitteschok bij 42 ° C gedurende 40 sec. </li><li> Plaats microcentrifugebuis op ijs gedurende 2 minuten. </li><li> Voeg 250 pl voorverwarmde (37 ° C) lysogenie bouillon (LB) bouillon. Schudden (300 rpm) bij 37 ° C gedurende 30 minuten. </li><li> Verspreid 30 pi van elke transformatie op LB-platen met 0,1 mg / ml ampicilline. Platen laten drogen en incuberen omgekeerd bij 37 ° C overnight. </li><li> De volgende dag, in de middag, kies 3 kolonies, met behulp van steriele 200 pl tips, uit elke transformatie en overzetten naar 0,1 mg / ml LB amp. </li><li> Schudden (300 rpm) bacteriën overnacht bij 37 ° C. </li><li> Voor plasmidezuivering gebruiken commerciële kits. De plasmiden bij -20 ° C. </li></ol> 2. muis embryonale fibroblast (MEF) Cultuur <ol><li> Coating van de 6-well platen met 0,1% gelatine <ol><li> Coat platen onder de motorkap toevoegen van 1 ml steriel 0,1% gelatine aan alle zes putjes. Laat de gelatine polymeriseren de incubator (37 ° C) gedurende 1 uur. </li><li> Gooi het overtollige, en droog de platen gedurende 1 uur. </li><li> Met parafilm te verzegelen en opslag platen bij kamertemperatuur. </li></ol></li><li> Inactivatie van MEF met mitomycine C <ol><li> Dooi een flacon van 4 x 10 6 MEF cellen met een 37 ° C bad. </li><li> Zaad MEF in de kap op een petrischaaltje (150 mm) met MEF medium. </li><li> Cultiveren cellen bij 37 ° C en 5% CO2. </li><li> (LET) Voeg mitomycine C (5 mg / ml) wanneer de cellen confluent. </li><li> Plaats cellen in een incubator (37 ° C en 5% CO2) gedurende 3 uur. </li><li> Verwijder medium met mitomycine C. Was de cellen drie keer met 1x fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS). </li><li> Voeg 2 ml van de commerciële trypsine en plaats cellen in de 37 ° C incubator gedurende 5 min. Daarna voeg 18 ml medium blokkeren de trypsine reactie te stoppen. </li><li> Tel de cellen met een Burker kamer volgens het protocol van de fabrikant. </li><li> Centrifugeer cellen bij 145 xg gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant. </li><li> Seed 60.000 cellen / cm2 geïnactiveerde MEF op 0,1% gelatine beklede platen. </li><li> Cultiveren cellen gedurende 24 uur bij 37 ° C en 5% CO 2, voor het zaaien AF en / of iPS-AF cellen. </li></ol></li></ol> 3. Mouse AF Cell Isolation <ol><li> Opzetten getimede paringen en check vaginale plugs na 24 uur co-housing. </li><li> Observeer tot 13,5 dpc en offeren zwangere dam door middel van cervicale dislocatie. </li><li> Reinig de buikwand van het dier met behulp 70% ethanol. </li><li> Met een schaar, voeren een middellijn laparotomie incisie de lengte van de buikwand om toegang tot de buikholte krijgen. </li><li> Expose de baarmoeder met behulp van een tang. Verwijder de baarmoeder met een schaar en overbrengen in een 100 mm petrischaal gevuld met steriele 1x PBS op ijs geplaatst. </li><li> Gebruik een stereomicroscoop om de AF te halen bij 10x vergroting. </li><li> Houd de baarmoeder met een tang en verwijder de baarmoederwand met een schaar. Wees voorzichtig om schade aan de vruchtvliezen en de daaruit voortvloeiende vruchtwater lekkage te voorkomen. </li><li> Verzamel foetussen in een 100 mm petrischaal gevuld met steriele 1x PBS en plaats op ijs. </li><li> Pak de placenta van een foetus met een fijne punt pincet en plaats in een schone 100 mm petrischaal. </li><li> Verwijder de dooierzak met behulp van fijne punt pincet. </li><li&gt; Breek de amnion met behulp van fijne punt pincet en het verzamelen van 30 ul van AF voor elke foetus met behulp van een insulinespuit in een 15 ml conische flacon. </li><li> Na AF verzamelen, was elke foetus met steriele 1x PBS aangevuld met 1% foetaal runderserum (FBS) en verzamelen in de 15 ml conische buis met de AF. </li><li> Centrifugeer AF bij 145 xg gedurende 5 minuten. Verwijder de bovenstaande vloeistof onder de motorkap en het zaad van de gepelleteerde AF cellen. </li></ol> 4. Mouse AF Cell Culture <ol><li> Het zaaien van de muis AF Cells <ol><li> Eén dag voor het zaaien Bereid een 0,1% gelatine bedekte 6-well plaat met mitomycine C behandelde MEF. </li><li> Na AF collectie, zaad van de cellen verkregen uit een vruchtwaterpunctie (ongeveer 1 x 10 7 cellen verkregen uit 6 foetussen) op de mitotisch geïnactiveerde MEF met behulp van AF kweekmedium. </li><li> Cultiveren cellen bij 37 ° C en 5% CO 2, waarbij het medium elke andere dag. </li><li> Na 7 dagen cultuur, transfect AF cellen na de hieronder beschreven procedure. </li></ol></li></ol> 5. Transfectie, iPS-AF Cell Generation en Cultuur OPMERKING: Mouse AF-cellen werden getransfecteerd met de PB-tetO2-IRES-OKMS transposon plasmide, tezamen met een transposase expressieplasmide (mPBase) en met de omgekeerde tetracycline transactivator (PB-CAG-rtTA) transposon plasmide. Alle plasmiden werden verstrekt door professor Andras Nagy 33. <ol><li> Meng 1 ug PB-tetO2-IRES-OKMS met 0,5 ug mPBase en 0,5 ug PB-CAG-rtTA (Totaal DNA: 2 ug) in een 1,5 ml microcentrifugebuis. </li><li> Verdun het DNA 100 ul serumvrij medium (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium - DMEM). </li><li> Voeg 8 pi van het transfectiereagens (bijvoorbeeld FUGENE) (in een verhouding van plasmide-DNA: transfectiemiddel van 2 ug (DNA) aan 8 pl transfectiemiddel) in de 1,5 ml microcentrifugebuis met DNA. </li><li> Incubeer transfectiereagens / DNA mengsel gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Druppelsgewijs 100 ul van het transfectiereagens / DNA mengsel per putje van een 6-well plaat met muis AF cellen en distribueren door voorzichtig zwenken, met een eindvolume van 2 ml / putje. Laat gedurende 24 uur. </li><li> De dag na, induceren de expressie van de factoren Yamanaka&#39;s (Oct4, Klf4, cMYC, Sox2) van het voeden van de cellen met vers iPS-AF medium gesupplementeerd met 1,5 ug / ml doxycycline (2 ml medium per putje). </li><li> Voeden cellen elke dag, zonder passage, met verse-DOX bevattend medium (handhaven cellen in media, aangevuld met doxycycline tot punt 5.13). </li><li> Acht cellen binnen 24 uur voor mCherry expressie en dagelijks voor kolonievorming (kolonies verschijnen meestal tussen 20 en 30 dagen na transfectie). </li><li> Een dag voor kolonie plukken, bereiden een 96-well weefselkweek plaat met mitomycine C behandelde MEF. </li><li> Pick enkele kolonies in 50 ul volume usinga 200 pi pipet, en zet ze achter elkaar in een 96-wells plaat in afzonderlijke putjes. </li><li> De dag erna dissociëren elke kolonie in enkele cellen door toevoeging van 50 ul van de commerciële trypsine en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 ° C. </li><li> Pipet op en neer om de kolonie te splitsen. </li><li> Overdracht 50 pi van trypsine met de gedissocieerde kolonie in een nieuwe put met geïnactiveerde MEF op een 0,1% gelatine beklede 96 well-plaat gevuld met 100 pl vers iPS-AF medium aangevuld met doxycycline. </li><li> Wanneer cellen 60-70% confluentie bereikt, gesplitst in een putje van een 24-wells plaat. </li><li> Wanneer cellen 60-70% confluentie bereikt, gesplitst 1: 2 tot twee putten, een met doxycycline en andere zonder doxycycline, om te controleren of kolonies ook in de toestand zonder doxycycline. </li><li> Doorgaan met iPS-AF-klonen, doxycycline onafhankelijk te handhaven, op geïnactiveerd MEF in de iPS-AF medium. </li><li> Cultiveren cellen bij 37 ° C en 5% CO 2 DVDsanging medium dagelijks. </li></ol> 6. alkalische fosfatase Staining <ol><li> Voeren alkalische fosfatase kleuring volgens het protocol van de fabrikant wanneer er de verschijning van doxycycline onafhankelijke iPS-AF cellen. </li></ol> 7. Immunofluorescentie <ol><li> Wanneer er het verschijnen van doxycycline onafhankelijke iPS-AF cellen, zaad 150.000 cellen / cm2 op een putje van een 24-wells plaat met geïnactiveerde MEF en kweken cellen gedurende 48 uur bij 37 ° C en 5% CO2. </li><li> (NB) Bevestig de cellen door toevoeging van 300 pl per putje van 4% paraformaldehyde (PFA) gedurende 15 min bij kamertemperatuur. </li><li> Voeg 300 ul van 0,1% NP-40 te permeabilize cellen. </li><li> Spoel de cellen met 300 ul 0,1% PBS-Tween 20. </li><li> Voeg 300 ul van de blokkerende buffer (10% paardenserum in 1x PBS) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. </li><li> Gebruik de volgende primaire antilichamen: Oct4 (1:80), Sox2 (1:80), Klf4 (1:80), Nanog (1:100) en SSEA1 (1:80). Verdun SSEA1 met 1% runderserumalbumine (BSA), 10% normaal geit serum, 0,3 M glycine in 0,1% PBS-Tween-20. Verdun alle andere antilichamen met 10% paardenserum in 1x PBS. </li><li> Incubeer antilichamen overnacht bij 4 ° C. </li><li> Spoelen met 300 pi 0,1% PBS-Tween-20. </li><li> Gebruik de secundaire antilichamen verdund in 10% paardenserum in 1x PBS: alexa594-geconjugeerd geit anti-muis IgG (1: 200), alexa594 geconjugeerd kip anti-geit IgG (1: 200), alexa594 geconjugeerd kip anti-konijn IgG (1: 200), Alexa568-geconjugeerd geiten anti-muis IgM (1: 200). Incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur geroerd. </li><li> Spoel met 1x PBS. </li><li> Vlek kernen met Hoechst-oplossing (1: 10.000) in 1x PBS. </li></ol> 8. In vitro celdifferentiatie <ol><li> Om opknoping druppel embryo lichamen (EB&#39;s) vormen, kweken enkele druppels (2000 cellen / 20 ul) op het deksel van de petrischalen, met het differentiatiemedium. </li><li> Incubeer de gerechten bij 37 ° Cen 5% CO2 gedurende 4 dagen. </li><li> Transfer EBS in 100 mm bacteriële-grade gerechten in de suspensie cultuur gedurende 3 dagen in differentiatie medium. </li><li> Plate EBS in 24 goed platen bekleed met basaal membraan matrix (1:10 verdund in DMEM) voor nog eens 14 dagen. </li><li> Voor immunofluorescentie analyses gebruikt primaire antilichamen: T (1: 100), αfp (1: 200) en Tubb3 (1: 500) 37. </li></ol> 9. In Vivo Teratoma Formation <ol><li> Injecteer 100 ui van 1 x PBS bevattende 1 x 10 6 cellen iPS-AF in de spier van de achterpoot van RAG2 - / - γc - / - muizen. </li><li> Offer muizen door middel van cervicale dislocatie 6 weken na cel injectie. </li><li> Verwijder de tumormassa&#39;s, verschillen in grootte, het achterbeen van de muizen voor de volgende analyses. </li><li> Snijd 7-10 pm dikke dwarsdoorsneden van de isopentaan bevroren tumor met behulp van een cryostaat. </li><li> Voor Haematoxyline eend Eosine (HE) Stain: <ol><li> Kleuren met HE het tumorweefsel preparaat zij na protocol van de fabrikant. </li></ol></li><li> Voor immunoperoxidase Stain: <ol><li> Fix teratoma secties met 4% PFA gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Permeabilize met 0,1% Triton X-100. </li></ol></li><li> Incubeer met de volgende antilichamen: Tubb3 (1: 100), αfp (01:50) en αSMA (1: 100) verdund in 1% BSA in 1x PBS. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C (voor Tubb3) of overnacht bij 4 ° C (voor andere antilichamen). </li><li> Blok peroxidase gebruik 100% methanol gedurende 20 min. </li><li> Incubeer gedurende 45 minuten bij 37 ° C met secundair antilichaam anti-muis HRP-geconjugeerd (1: 150). </li><li> Spoel met 1x PBS. </li><li> Incubeer met peroxidase (HRP) substraat (zie Materialen tabel) gedurende 5 min. </li><li> Spoel met leidingwater gedurende 5 minuten. </li><li> Vlek met Haematoxyline QS 9 sec. </li><li> Spoelen met kraanwater. </li></ol&gt; 10. RNA-extractie uit cellen <ol><li> Gebruik commerciële RNA extractie kit volgens de aanbevolen protocol van de fabrikant. </li></ol> 11. RNA-extractie uit Teratoma <ol><li> Homogeniseer de teratoma met behulp van een vijzel en vloeibare stikstof om te voorkomen dat het ontdooien van het monster. </li><li> Weeg 25 mg van het weefsel. </li><li> Voeg 1 ml commercieel reagens voor RNA extractie en 200 ui chloroform. </li><li> Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 min. </li><li> Centrifugeer bij 13.000 xg en 4 ° C gedurende 15 minuten. </li><li> Breng de heldere supernatant naar een nieuwe buis. </li><li> Te zuiveren het RNA gebruiken commerciële RNA extractie kit volgens het protocol van de fabrikant. </li></ol> 12. Reverse transcriptie-polymerase kettingreactie Analyse <ol><li> Synthetiseren de eerste streng cDNA met behulp van een reverse transcriptase voor reverse transcriptie (RT) -polymerase kettingreactie (PCR) en oligo (dT) according het protocol van de fabrikant, tot 50 ng / ul cDNA te verkrijgen. Verdun cDNA met RNase-vrij water in een concentratie van 10 ng / ul. </li><li> RT-PCR uit te voeren met het DNA polymerase volgens het protocol van de fabrikant, gebruikmakend van 1 ng / ul cDNA. </li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De voor het induceren van pluripotentie verkrijgen werkwijze is relevant voor mobiele klinische veiligheid met betrekking tot langdurige transplantatie. Tegenwoordig zijn er verscheidene werkwijzen geschikt voor de herprogrammering. Onder de niet-integrerende methoden, het Sendai virus (SeV) vector een RNA virus dat grote hoeveelheden eiwitten kan produceren zonder integratie in de kern van de geïnfecteerde cellen 40 en een strategie om iPS cellen te verkrijgen zijn. SeV vectoren zou een aantrekk...

Prenatale diagnostiek is een belangrijk klinisch hulpmiddel om genetische ziekten (dwz chromosomale afwijkingen, monogenetische of polygenetische / multifactoriële aandoeningen) en aangeboren afwijkingen (dwz hernia diafragmatica, cystic long laesies, exomphalos, gastroschisis) te evalueren. Vruchtwater (AF) cellen zijn eenvoudig te verkrijgen van routinematig geplande procedures tijdens het tweede trimester van de zwangerschap (dwz vruchtwaterpunctie en amnioreduction) of keizersneden 1, 2. De beschikbaarheid van AF cellen van prenatale en neonatale patiënten geeft de mogelijkheid om deze bron regeneratieve medicijnen en verscheidene onderzoekers onderzochten de mogelijkheid om verschillende weefselbeschadigingen of ziekten met een stamcelpopulatie geïsoleerd uit AF 3, 4, 5, 6 behandel, 7, 8, 9, 10, 11, 12. Zich gemakkelijk verkrijgen AF cellen van zieke patiënten in een tijdvenster waarin de ziekte is vaak stilstaat, opent de weg naar het idee van deze cel bron voor herprogrammering doeleinden. Inderdaad zou geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen afkomstig van AF cellen worden gedifferentieerd in de cellen van belang in vitro drug tests of weefselengineering, teneinde een adequate patiënt-specifieke therapie bereiden voor de bevalling. Vele studies hebben reeds werd aangetoond dat AF cellen te herprogrammeren en onderverdeeld in een groot aantal celtypes 13, 14, 15, 16, 17 &lt;/ sup&gt;, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27. Sinds de ontdekking van Takahashi en Yamanaka 28 van reprogrammed somatische cellen door de geforceerde expressie van vier transcriptiefactoren (Oct4, Sox2, cMYC en Klf4), is er vooruitgang geboekt op het gebied van de herprogrammering. Gezien de verschillende werkwijzen kunnen onderscheiden tussen virale en niet-virale benaderingen. De eerste verwacht dat het gebruik van virale vectoren (retrovirussen en lentivirussen), die een hoge efficiëntie, maar meestal onvolledige onderdrukking van de retrovirale transgen met zowel het gevolg van een gedeeltelijk geherprogrammeerd cellijn en het risico van zijninsertiemutagenese 29, 30, 31. De niet-virale werkwijze gebruikt verschillende strategieën: bijvoorbeeld plasmiden, vectoren, mRNA, eiwit, transposons. De afleiding van iPS-cellen vrij van transgene sequenties heeft tot doel de mogelijke schadelijke effecten van lekkende transgenexpressie en insertiemutagenese omzeilen. Van alle hierboven vermelde niet-virale strategie, de piggyBac (PB) transposon / transposase vereist alleen de omgekeerde terminale herhalingen flankeren een transgen en tijdelijke expressie van het transposase enzym katalyseren invoeging of excisie gebeurtenissen 32. Het voordeel bij het gebruik van transposons boven andere werkwijzen voor iPS celgeneratie is de mogelijkheid om vectorvrije iPS cellen met een niet-virale vector benadering dezelfde efficiëntie van retrovirale vectoren toont. Dit kan door trace-less excisie van het transposon geïntegreerde codering voor de reprogramming factoren naar aanleiding van een nieuwe tijdelijke expressie van de transposase in de iPS-cellen 33. Aangezien PB efficiënt in verschillende celtypes 34, 35, 36, 37, is meer geschikt voor een klinische benadering met betrekking tot virale vectoren, en maakt de productie van xeno-vrije iPS cellen strijd met de huidige virusproductie protocollen die xenobiotische gebruiken voorwaarden, wordt dit systeem gebruikt om iPS cellen te verkrijgen uit muizen AF. Hier stellen we een gedetailleerd protocol volgende reeds gepubliceerde werk om de productie van pluripotente iPS klonen van muizen AF-cellen (iPS-AF-cellen) 38 te tonen.

<table><tbody><tr><td>100 mm Bacterial-grade Petri Dishes&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>351029</td><td>Voor in vitro differentiatie</td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td>Voor muis AF, iPS-AF cellen en differentiatiemedium</td></tr><tr><td>Alexa568-conjugated goat anti-mouse IgM&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21043</td><td>Secundaire antilichaam (immunofluorescence)</td></tr><tr><td>Alexa594-conjugated chicken anti-goat IgG&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21468</td><td>Secundaire antilichaam (immunofluorescence)</td></tr><tr><td>Alexa594-conjugated chicken anti-rabbit IgG&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21442</td><td>Secundaire antilichaam (immunofluorescence)</td></tr><tr><td>Alexa594-conjugated goat anti-mouse IgG&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11005</td><td>Secundaire antilichaam (immunofluorescence)</td></tr><tr><td>Alkaline Fosfatase kit&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>85L1</td><td>Alkaline Fosfatase&nbsp; kleuring</td></tr><tr><td>Ampicilline</td><td>Sigma</td><td>A0166</td><td>Voor bacteriële selectie</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumine&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td>BSA, voor blokkeringsoplossing. Verdund in PBS 1x</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma</td><td>C2432</td><td>Voor RNA extractie</td></tr><tr><td>DH5&alpha; cellen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18265-017</td><td>Bacteriën voor klonering procedure</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41965039</td><td>Voor MEF, muis AF, iPS-AF cellen en differentiatiemedium</td></tr><tr><td>Doxycycline&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D9891</td><td>Voor exogene factoren expressie</td></tr><tr><td>Microcentrifuge buizen (1,5 ml)&nbsp;</td><td>Sarstedt&nbsp;</td><td>72.706</td><td>Voor PB productie&nbsp;</td></tr><tr><td>ES FBS&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10439024</td><td>Voor muis AF, iPS-AF cellen en differentiatiemedium</td></tr><tr><td>FBS&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270106</td><td>Voor MEF medium</td></tr><tr><td>Fine point forceps</td><td>F.S.T</td><td>Dumont #5&nbsp;</td><td>AF isolatie</td></tr><tr><td>Gelatine</td><td>J.T.Baker</td><td>131</td><td>Gebruikt 0,1%, verdund in PBS 1x</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0718</td><td>Voor blokkeringsoplossing. Verdund in PBS 1x</td></tr><tr><td>Haematoxyline QS</td><td>Vector Laboratories</td><td>H3404</td><td>Nuclei detectie</td></tr><tr><td>HE&nbsp;</td><td>Bio-Optica</td><td>04-061010</td><td>Histologisch onderzoek van teratoma</td></tr><tr><td>Hoechst&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td>Nuclei detectie</td></tr><tr><td>Paarden Serum&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16050-122</td><td>Voor blokkeringsoplossing</td></tr><tr><td>HRP-conjugated goat anti-mouse IgG</td><td>SantaCruz</td><td>sc2005</td><td>Secundaire antilichaam (immunoperoxidase)</td></tr><tr><td>ImmPACT NovaRED&nbsp;</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK4805</td><td>Peroxidase substraat</td></tr><tr><td>Insulin spuit met naald (25 G)</td><td>Terumo</td><td>SS+01H25161</td><td>Amniocentese procedure</td></tr><tr><td>Klf4&nbsp;</td><td>SantaCruz</td><td>sc-20691</td><td>Konijn polyklonaal IgG</td></tr><tr><td>L-glutamine&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030</td><td>Voor muis AF, iPS-AF cellen en differentiatiemedium</td></tr><tr><td>LB bouillon (Lennox)</td><td>Sigma</td><td>L3022</td><td>Voor bacteriegroei</td></tr><tr><td>LIF&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>L5158</td><td>Voor muis AF en iPS-AF cellen medium</td></tr><tr><td>Matrigel&nbsp;</td><td>BD</td><td>354234</td><td>Voor in vitro differentiatie. Verdund 1:10 in DMEM</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma</td><td>32213</td><td>Peroxidase blokkering</td></tr><tr><td>MULTIWELL 24 wel plaat</td><td>BD Falcon</td><td>353047</td><td>Voor in vitro differentiatie</td></tr><tr><td>MULTIWELL 6 wel plaat</td><td>BD Falcon</td><td>353046</td><td>Voor MEF, muis AF en iPS-AF cellen cultuur</td></tr><tr><td>Nanog&nbsp;</td><td>ReproCELL</td><td>RCAB0002P-F</td><td>Konijn polyklonaal IgG</td></tr><tr><td>Niet-essentiële aminozuren&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td>Voor muis AF, iPS-AF cellen en differentiatiemedium</td></tr><tr><td>Normal Goat Serum</td><td>Vector Laboratories</td><td>S2000</td><td>Voor blokkeringsoplossing. Verdund in PBS 1x</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma</td><td>12087-87-0</td><td>Voor cel permeabilisatie. Verdund in PBS 1x</td></tr><tr><td>Oct4</td><td>SantaCruz</td><td>sc-5279</td><td>Muis monoklonaal IgG2b</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oligo (dT)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18418012</td><td>Voor RT-PCR</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (oplossing)</td><td>Sigma</td><td>441244</td><td>PFA, fixatie, verdund in PBS</td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14200-067</td><td>D-PBS, vrij van Ca2+/Mg2+. Verdund met steriel water om PBS 1x te verkrijgen</td></tr><tr><td>Penicilline - Streptomycine&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15070063</td><td>Voor MEF, muis AF, iPS-AF cellen en differentiatiemedium</td></tr><tr><td>Petri Dish (150 mm)</td><td>BD Falcon</td><td>353025</td><td>Voor MEF cultuur, weefsel cultuur</td></tr><tr><td>PiggyBac transposase expressie plasmid&nbsp;</td><td>Verstrekt door professor Andras Nagy laboratorium</td><td>-</td><td>mPBase</td></tr><tr><td>PiggyBac-tetO2-IRES-OKMS transposon plasmid</td><td>Verstrekt door professor Andras Nagy laboratorium</td><td>-</td><td>PB-tetO2-IRES-OKMS</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Maxiprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>12663</td><td>Voor plasmiden zuivering</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>Voor plasmiden zuivering</td></tr><tr><td>Reverse tetracycline transactivator transposon plasmid&nbsp;</td><td>Verstrekt door professor Andras Nagy laboratorium</td><td>-</td><td>rtTA</td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td>Voor RNA extractie</td></tr><tr><td>Sox2&nbsp;</td><td>SantaCruz</td><td>sc-17320</td><td>Geit polyklonaal IgG</td></tr><tr><td>SSEA1&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab1

de productie van pluripotente stamcellen van mouse vruchtwater cellen met behulp van een transposon system

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) worden gegenereerd uit muis- en menselijke somatische cellen door geforceerde expressie van gedefinieerde transcriptiefactoren met behulp van verschillende methoden. Hier hebben we iPS-cellen geproduceerd uit muis-amniotische vloeistofcellen, met behulp van een niet-viraal gebaseerd transposonsysteem. Alle verkregen iPS-cellijnen vertoonden kenmerken van pluripotente cellen, inclusief het vermogen om zich te differentiëren naar derivaten van alle drie de kiembladen in vitro en in vivo. Deze strategie opent de mogelijkheid om cellen van zieke foetussen te gebruiken om nieuwe therapieën voor geboorteafwijkingen te ontwikkelen.

De capaciteit van herprogrammering evalueren, werden muizen AF cellen verzameld uit foetussen van GFP muizen. Cellen werden getransfecteerd met de cirkelvormige transposon plasmide PB-tetO2-IRES-OKMS, waarbij de Yamanaka factoren (Oct4, Sox2, cMYC en Klf4) gerelateerd aan de mCherry fluorescerend eiwit in een doxycycline-induceerbare wijze tot expressie brengt, en omgekeerde tetracycline transactivator (PB- CAG-rtTA) plasmiden met het transposase expressieplasmide (mPBase). Muis AF-celle...

In deze studie genereren we geïnduceerde pluripotente stamcellen uit muis-vruchtwatercellen, met behulp van een niet-viraal transposonsysteem.

De productie van pluripotente stamcellen van Mouse Vruchtwater cellen met behulp van een transposon System

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Het algemene doel van deze procedure is om muis amnionvochtcellen te isoleren en herprogrammeren met behulp van een transposon-systeem. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het gemakkelijk uit te voeren is. In een therapeutische omgeving kunnen cellen van menselijke zieke foetussen worden gedifferentieerd naar cellen van belang voor medicijntesten of weefselengineering, om een andere manier voor te bereiden om de patiëntspecifieke therapie vóór de bevalling te geven.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over programmering. Het transposon-systeem is efficiënt in verschillende celtypen. Het is geschikter voor een klinische aanpak in vergelijking met virale vectoren en maakt de productie van oxino-vrije IPS-cellen mogelijk.Om met de isolatie te beginnen, reinig de buikwand van de moeder met 70 procent ethanol. Gebruik schaar om een midline laparotomie uit te voeren, door de lengte van de buikwand in te snijden om toegang te krijgen tot de buikholte. Gebruik een tang om de baarmoeder bloot te leggen en snijd deze vervolgens af met schaar, zorg ervoor dat u de foetale membranen niet beschadigt. Verzamel de foetussen in een 100 millimeter schaal gevuld met steriel 1xPBS en zet op ijs. Plaats de schaal onder een stereomicroscoop met 10x vergroting en houd de baarmoeder vast met een tang terwijl u de baarmoederwand verwijdert met schaar.Pak de placenta van één foetus met de fijne punttang en verplaats deze naar een schone 100 millimeter schaal. Verwijder hier voorzichtig de dooierzak. Vernietig de amnion met de tang en gebruik een insulinespuit om 30 microliters amnionvocht te verzamelen.Breng het vocht over naar een 15 milliliter kegelvormige fles. Herhaal dit proces voor elke foetus, verzamel het vocht elke keer in dezelfde fles. Was vervolgens elke foetus met steriel 1xPBS aangevuld met één procent foetaal bovien serum en verzamel dit in de 15 milliliter kegelvormige buis samen met het amnionvocht.Centrifugeer de buis gedurende vijf minuten bij 145 keer G en verwijder vervolgens onder een laminaire flowkap het supernatant. Breng de gepelletiseerde cellen weer op in twee milliliter amnionvochtcultuurmedium. Neem een zes welplaat bedekt met 0,1 procent gelatine die is behandeld met myomycin-C muis embryonale fibroblasten of MEF en zaai vervolgens twee milliliter cellen op de plaat.Kweek de cellen bij 37 graden Celsius en vijf procent koolstofdioxide, ververs het medium om de dag. Continueer het kweken gedurende zeven dagen totdat de cellen klaar zijn voor transfectie. Om te beginnen met transfectie, meng in een 1,5 millimeter microcentrifugebuis één microgram transposon-plasmide met 0,5 microgram transposase-expressieplasmide en 0,5 microgram omgekeerde tetracycline transactivator-plasmide.Verdun tot 100 microliters met d-man. Voeg acht microliters transfectie-reagens toe aan de microcentrifugebuis met het DNA. Incubeer deze mix gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.Neem de zes welplaat met muis AF-cellen, voeg druppelsgewijs 100 microliters van de transfectie-reagens DNA-mix toe per wel, verdeel door voorzichtig te schudden met een eindvolume van twee milliliter per wel. Laat de cellen 24 uur staan bij 37 graden Celsius in vijf procent koolstofdioxide. De volgende dag verwijdert u het kweekmedium en voedt u vervolgens elke celwel met twee milliliter vers iPS AF-medium aangevuld met een punt vijf microgram per milliliter doxycycline om de expressie van Yamanaka's factoren te induceren.Voed de cellen dagelijks met vers dox-bevattend medium zonder passage vanaf dit punt. Observeer de cellen binnen 24 uur na de eerste doxycycline-behandeling onder de fluorescentiemicroscoop op mCherry-expressie en dagelijks vanaf dit punt voor kolonievorming. Zodra kolonievorming wordt waargenomen, pluk afzonderlijke kolonies in 50 microliters celkweekmedium.Breng ze vervolgens achtereenvolgens over naar aparte wells van een 96 wel weefselkweekplaat met met mitomycin c behandelde MEF. De volgende dag voegt u 50 microliters trypsine toe aan elke wel en incubeert u gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius om de kolonies te dissociëren in enkele cellen. Na incubatie, pipetteer de vloeistof op en neer om de kolonies verder te dissociëren.Breng 50 microliters van de trypsine-celmix over naar een nieuwe wel die inactieve MEF bevat en breng de cellen vervolgens terug naar de incubator. Wanneer de cellen 60 tot 70 procent confluentie bereiken, verdeel ze dan in een nieuwe wel van een 24 wel plaat en continueer vervolgens de incubatie bij kamertemperatuur. Zodra deze cellen 60 tot 70 procent confluentie bereiken, verplaats de cellen een tot twee in twee wells, één bevattende doxycycline en één zonder, om te verifiëren dat kolonies ook zullen groeien in afwezigheid van doxycycline.Ga door met het onderhouden van de IPS AF-kolonies en doxycycline-onafhankelijk medium op inactieve MEF bij 37 graden Celsius in vijf procent koolstofdioxide. Ververs het medium dagelijks totdat de cellen klaar zijn voor kleuring, beeldvorming en RNA-extractie. Hier drukken de stabiele doxycycline-onafhankelijke geïnduceerde pluripotente muis amnionvocht GFP-positieve cellen de pluripotentiemarkers uit die vereist zijn om succesvolle herprogrammering te bevestigen.RTPCR-analyse met behulp van R1 ES-cellen als controle toonde expressie van de geïnduceerde pluripotentiemarkers in aanwezigheid of afwezigheid van doxycycline. De expressie van het huishoudgen, beta twee microglobuline, werd ook waargenomen in alle drie de celtypen. Teratomen geïsoleerd uit muizen geïnjecteerd met de geïnduceerde pleuropotente cellen werden immunogeverfd.Detectie van alfa foetaal eiwit, alfa gladde spieractine en beta drie tubuline in de massa's bevestigt celdifferentiatie in alle drie de kiembladen, ectoderm, mesoderm en endoderm. Verder bevestigt RTPCR-analyse van in vitro embryoïde lichaampjes en in vivo teratomacellen de expressie van kiemblaasspecifieke markergenen voor het mesoderm, endoderm en ectoderm

the-production-pluripotent-stem-cells-from-mouse-amniotic-fluid-cells

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Deze video toont de procedure voor het genereren van geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van induceerbare lentivirus die uitdrukken Oct4, Sox2, c-Myc en Klf4.

Het genereren van iPS Cellen van MEF door gedwongen Expressie van Sox-2, okt-4, c-Myc en Klf4

De Stemgent Dox Induceerbare Mouse TF lentivirus Set kan herprogrammeren muis embryonale fibroblasten (MEF) om geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen. Hier hebben we het protocol voor DOX-induceerbare expressie van muis herprogrammering transcriptiefactoren Oct4 te tonen, om Sox2, Klf4 en c-Myc genereren iPS kolonies die uitdrukken gemeenschappelijke MES pluripotentie markers.

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen door herprogrammeren embryonale fibroblasten van muizen met een vier transcriptiefactor, Doxycycline Induceerbare Lentivirale transductiesysteem

Het genereren van geïnduceerde pluripotente stamcellen (IPSC) lijnen produceert lijnen van verschillende ontwikkelingspotentieel, zelfs als ze passeren standaard tests voor pluripotentie. Hier beschrijven we een protocol muizen volledig zijn verkregen uit iPSCs die de iPSC lijnen gedefinieerd als hebbende full pluripotentie...

Generatie van Muizen Afgeleid van geïnduceerde pluripotente stamcellen

Hier laten we een eenvoudige en effectieve protocol voor het genereren van menselijke iPSCs 3-4 ml van perifeer bloed met een lentivirale vector herprogrammering. Herprogrammering van direct beschikbare bloedcellen belooft om het gebruik van IPSC technologie te versnellen door het toegankelijk voor een breder onderzoeksgemeenschap.

Generatie van de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen uit perifeer bloed Met behulp van de STEMCCA lentivirale vector

Muis embryonale fibroblasten kunnen met lage efficiëntie worden gereprogrammeerd tot geïnduceerde pluripotente stamcellen door de geforceerde expressie van transcriptiefactoren Oct-4, Sox-2, Klf-4, c-Myc. De zeldzame tussenproducten van de herprogrammeringsreactie worden via FACS geïsoleerd door middel van labeling met antilichamen tegen celoppervlaktemarkers Thy-1.2, Ssea-1 en Epcam.

Celoppervlaktemerker Mediated Zuivering van iPS Cell Intermediates van een Herprogrammeerbare muismodel

Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) vormen een bron van patiënt-specifieke weefsels voor klinische toepassingen en fundamenteel onderzoek. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor humane perifere bloed mononucleaire cellen (PBMNCs) die van bevroren buffy coats in viraal-vrije iPSCs met niet-integrerende episomale plasmiden herprogrammeren.

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen van Frozen Buffy Coats behulp van niet-integrerende Episomaal plasmiden

Dit protocol beschrijft een gedetailleerde methode voor efficiënte generatie van integratievrije iPSC's uit menselijke volwassen perifere bloedcellen. Met behulp van vier oriP/EBNA-gebaseerde episomale vectoren om de herprogrammeringsfactoren, KLF4, MYC, BCL-XL, of OCT4 en SOX2 tot expressie te brengen, kunnen duizenden iPSC-kolonies worden verkregen uit 1 mL perifeer bloed.

Generatie van Integratie-free geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke perifere mononucleaire bloedcellen behulp Episomaal Vectors

Dit protocol beschrijft de herprogrammering van de primaire vruchtwater vloeistof en membraan mesenchymale stamcellen in geïnduceerde pluripotente stamcellen met gebruikmaking van een niet-integratie van episomal in volledig chemisch gedefinieerde voorwaarden. Procedures van extractie, cultuur, herprogrammering en karakterisering van de resulterende geïnduceerde pluripotente stamcellen door strenge methoden zijn gedetailleerd.

Herprogrammering van de primaire vruchtwater en membraan cellen pluripotent in Xeno-vrij voorwaarden

Hier beschrijven we een gedetailleerde methode voor naadloze genbewerking in menselijke pluripotente stamcellen met behulp van een piggyBac-gebaseerd donorplasmide en de Cas9-nickasemutant. Tweepuntsmutaties werden geïntroduceerd in exon 8 van de hepatocytaire alfafactor 4 alfa (HNF4α) locus in menselijke embryonale stamcellen (hESCs).

Introductie van puntmutaties in menselijke pluripotente stamcellen met behulp van naadloze genoombewerking

We presenteren hier een methode die het gebruik van chemische epigenetische wissing combineert met mechanosensing-gerelateerde signalen om efficiënt pluripotente cellen van zoogdieren te genereren, zonder de noodzaak van gentransfectie of retrovirale vectoren. Deze strategie is daarom veelbelovend voor translationele geneeskunde en vertegenwoordigt een opmerkelijke vooruitgang in stamcelorganoïde technologie.

Een strategie in twee stappen die epigenetische modificatie en biomechanische signalen combineert om pluripotente cellen van zoogdieren te genereren

Leer hoe je pluripotente stamcellen genereert uit muizen vruchtwatercellen met een transposon-systeem. Deze niet-virale methode biedt een veilige aanpak voor regeneratieve geneeskunde en patiëntspecifieke therapieën.

De productie van pluripotente stamcellen van Mouse Vruchtwater cellen met behulp van een transposon System

Meer video's verkennen