Name: Langdurig High-Resolution intravitale microscopie in de long met een vacuüm gestabiliseerd Imaging Window (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Leer langdurige intravitale microscopie van de intacte long met een vacuüm gestabiliseerd beeldvenster. Deze methode maakt hoogresolutiebeeldvorming van enkele cellen mogelijk om stroma-tumorcelinteracties tijdens metastase te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd ondersteund door NIH-CA100324, Einstein National Cancer Institute's kankercentrum ondersteuningssubsidie P30CA013330, R01CA172451 aan JWP en het Integrated Imaging Program. Deze technologie werd ontwikkeld in het Gruss-Lipper Biophotonics Center en het Integrated Imaging Program aan het Albert Einstein College of Medicine. We erkennen de ondersteuning van deze centra in dit werk. De auteurs danken Mike Rottenkolber, Ricardo Ibagon en Anthony Leggiadro van de Einstein-machinewinkel voor hun bekwame en tijdige vakmanschap, het laboratorium van Matthew Krummel voor het genereus delen van hun raamontwerptekeningen, Kevin Elicieri en Jeremy Bredfeldt voor hun expertise in microscopie en hun versterkeraanbevelingen en Allison Harney en Bojana Gligorijevic voor informatieve discussies.

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hoge resolutie in vivo optische beeldvorming in combinatie met fluorescent gelabelde functionele labels zoals eiwitten en antilichamen dramatisch toegenomen ons begrip van de metastatische cascade. Het heeft directe visualisatie en kwantificatie van single-cell en sub-cellulaire parameters in tumorcellen, gastheercellen en hun micro-omgeving ingeschakeld. Deze beeldvorming binnen de primaire tumor leidt bijvoorbeeld tot de ontdekking van discrete micromilieu dat ondersteunen ofwel groei invasie of verspreiding ...

Hoge resolutie intravitale optische beeldvorming heeft bewezen cruciaal voor het begrijpen van vele biologische processen, waardoor eencellige en sub-cellulaire parameters worden gemeten en gekwantificeerd worden. In kankeronderzoek is intravitale beeldvorming van tumor en stromale cellen leidde tot de identificatie van verschillende micro-omgeving interacties 6-11 die alleen aanwezig in het intacte dier. Ontdekkingen over micro-omgevingen in verband met intravasation en de verspreiding van tumorcellen bij borstkanker met behulp van één enkele resolutie cell optische beeldvorming in vivo heeft zelfs geleid tot nieuwe markers voor prognose en respons op de behandeling bij borstkankerpatiënten 12-16. De beste imaging technologieën die beschikbaar zijn voor het bekijken van diep van binnen intact interne vitale organen zijn de klinische modaliteiten (MRI, PET, CT), die een prachtig uitzicht op het gehele orgaan te bieden en kunnen pathologieën openbaren nog voordat ze de klinische symptomen te produceren. Ze zijn niet in staat, hHof toevoegde, de vroegste stadia van metastase en de cellulaire mechanismen die progressie van de tumor te onthullen te wijten aan hun gebrek aan enkele resolutie cel. Tegen de tijd longmetastasen zichtbaar in deze modaliteiten, zijn ze goed ingeburgerd en prolifererende. Aangezien de schatting dat 90% van uitgezaaide tumorcellen die aankomen aan de long ofwel niet overleven 17 of aanvankelijk slapend blijven 18, en de waarneming dat ze veel eerder dan verwacht 19, het afbeelden van de eerste stappen van aankomst en overleving komen wordt cruciaal inzicht in het proces van gemetastaseerd zaaien en herhaling van tumorgroei op afgelegen plaatsen. Het uitvoeren van deze waarnemingen in de longen is echter zeer moeilijk gebleken; de meerderheid van beeldvormende studies ex vivo of explantaat preparaten 20-23, die op het oog in de longen op enkele tijdstippen te benut. Terwijl deze voorbereidingen te doen geven nuttige informatie, ze niet over een volledig begrip van de interacties, oorzaak en gevolg relaties en dynamiek die plaatsvinden tussen de verschillende onderdelen van de micro-omgeving te geven. Het ontbreken van een goede bloedsomloop (en de daarmee gepaard gaande verstoring van de homeostase) en de ontkoppeling van de rest van het immuunsysteem van het lichaam maakt het wensen de conclusies die deze voorbereidingen te genereren in intacte weefsel in vivo te valideren. Veel groepen hebben intravitale beeldvorming van de intacte long 2,4,5,24-33 met Wearn en Duits als eerste te chirurgisch bloot de pleura laag 24 en Terry als eerste een implanteerbare imaging venster 25 te gebruiken uitgevoerd. Hoge resolutie beeldvorming in de longen sterk belemmerd door voortdurende beweging van de long en verschillende technieken ontwikkeld om deze beperking te overwinnen. Wagner en Filley 27 bestudeerde de natuurlijke beweging van de hond longen ontwierpen hun chirurgische protocol om hun geïmplanteerde venster vinden over een relatief stilstaande regio, terwijl Wagner gebruikt vacuüm in zijn raam chirurgische voorbereiding op het weefsel 28 te immobiliseren. Sinds die tijd hebben een verscheidenheid aan technieken zijn gebruikt om het beeld van de long waaronder: bronchus vastklemmen, sequentiële apneu en gated imaging, overbemonsterde overname, lijmen van de long kwab en vacuüm 34. Elk van deze heeft zijn voordelen en nadelen en niemand techniek is superieur gebleken een andere 34. Bijvoorbeeld, bronchus klem- en apneu sequentieel af aan het normale gasuitwisseling in de longen en kunnen atelectase veroorzaken. Gated beeldvorming en oversampled overname hebben geen last van deze nadelen, maar vereisen high-speed of gespecialiseerde grafische apparatuur niet breed toegankelijk. Slot worden lijmen van de long en de vacuümtechniek voorkomen beide bovengenoemde nadelen, maar kan afschuifkracht geïnduceerd letsel vertonen als zorg niet taknl. De laatste jaren heeft het vacuümvenster geminiaturiseerd en aangepast voor gebruik in muizen met behulp van confocale microscopie en multi-4,5,33 en uitstekende hoge-resolutie afbeelding is bereikt 2. Tabel 1 vat deze rijke geschiedenis en toont welke papieren die nieuwe beschrijven ontwikkelingen in het gebruik van intravitale longbeeldvorming ramen. Dit protocol beschrijft het gebruik van verlengde time-lapse multiphoton intravitale microscopie om de afbeelding metastase in de live, intact long met de hoogst mogelijke resolutie subcellulaire. Beelden werden tot 12 uur met een multifoton microscoop met een hoge numerieke apertuur objectieflens en meerdere fotomultiplicatorbuis (PMT) detectoren. Transgene muismodellen worden gebruikt om fluorescent label inheemse macrofagen, samen met fluorescerende hoge gewicht dextran moleculaire en fluorescerend eiwit getransfecteerde tumorcellen (labelen het vaatstelsel en tumorcellen respectively). Hoewel de keuze van fluorescent gelabelde cellen maakt visualisatie van tumorcel-endotheelcel-macrofaag interacties en dynamiek dit protocol werken voor een stam van fluorescerende of niet-fluorescerende muis. Na de overname, wordt de resterende drift beweging (indien van toepassing) geëlimineerd met behulp van een Fiji plugin 35,36 en aangepaste macro&#39;s tijd het gemiddelde van de vasculaire kanaal te elimineren knipperen als gevolg van niet-gelabelde circulerende bloedcellen. Hoewel dit protocol is gericht op beeldvorming metastase, de technieken zijn toepasbaar op vele andere biologische processen waarneembaar met hoge resolutie eencellige beeldvorming in de long.

<table><tbody><tr><td>Nickel-Plated Brass Vacuum Regulator 1/8 NPT Female, w/ Gauge, 0 - 20" Hg Vacuum</td><td>McMaster Carr</td><td>4172K12&nbsp;</td><td>Vacuum Regulator</td></tr><tr><td>Brass Barbed Hose Fitting Adapter voor 1/4" Hose ID X 1/8" NPTF Male Pipe</td><td>McMaster Carr</td><td>5346K13</td><td>Vacuum Regulator Hose Adapter</td></tr><tr><td>Pyrex Brand Filtering Flasks met Tubulation; Hals gevormd voor rubber stopper No. 4; Capaciteit: 50 ml</td><td>Corning Life Sciences Glass</td><td>5360-50</td><td>Vacuum Flask</td></tr><tr><td>Ronde glazen deksels dikte #1.5, 0.16 - 0.19 mm 10 mm diameter. </td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>260368</td><td>Cover slips</td></tr><tr><td>Exel International wegwerp Safelet I.V. Catheters; 22 g x 1 inch. </td><td>Exel International</td><td>26746</td><td>Tracheal Catheter</td></tr><tr><td>PERMA-HAND zwarte gevlochten zijde hechtingen, ETHICON LIGAPAK Distributieriem Grootte 2-0</td><td>VWR</td><td>95056-992</td><td>String</td></tr><tr><td>Liquid Super Glue, Clear, 0.14 oz</td><td>Hendel Corp.</td><td>LOC1647358</td><td>Cyano-acrylate Glue</td></tr><tr><td>Tetramethylrhodamine isothiocyanate&ndash;Dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1287-500MG</td><td>155 kD Dextran</td></tr><tr><td>Laboratory Clear Tygon PVC Buizen, 1/16" ID, 1/8" OD, 1/32" Wanddikte, 25 ft. Lengte</td><td>McMaster Carr</td><td>5155T12</td><td>Thin Tubing &amp; Tubing for Luer</td></tr><tr><td>Scheurbestendige Polyethyleen Buizen, 1/8" ID, 1/4" OD, 1/16" Wanddikte, Wit, 50 ft. Lengte. </td><td>McMaster Carr</td><td>5181K24&nbsp;</td><td>Thick Tubing</td></tr><tr><td>Depilatoire Lotion</td><td>Nair</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Micro Medical Buizen 95 Durometer LDPE</td><td>Scientific Commodities Inc.</td><td>BB31695-PE/1</td><td>Tubing voor staartaderkatheter</td></tr><tr><td>30 G x 1 inch BD PrecisionGlide Naald</td><td>BD</td><td>305128</td><td>Naalden voor staartaderkatheter</td></tr><tr><td>Puritan Niet-steriele katoenen tips </td><td>Fisher Scientific</td><td>867WCNOGLUE</td><td></td></tr><tr><td>Clear Polycarbonate Barbed Tube Fitting, Reducing Straight voor 3/32" x 1/16" Tube ID</td><td>McMaster Carr</td><td>5117k51</td><td>Connectors tussen buizen</td></tr><tr><td>One-Hole Rubber Stoppers</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-135F</td><td>Stopper voor Vacuum Flask</td></tr><tr><td>SHARP Precision Barrier Tips, Voor P-100, 100 µl</td><td>Denville Scientific Inc.</td><td>P1125</td><td>Pipette Tip</td></tr><tr><td>Laboratory tape</td><td>Fisher Scientific</td><td>159015R</td><td></td></tr><tr><td>Puralube</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>008897</td><td>Oogzalf</td></tr><tr><td>Gemini Cautery Kit</td><td>Harvard Apparatus</td><td>726067</td><td>Cautery Pen</td></tr><tr><td>Graefe Micro Dissecting Forceps; Gekarteld; Licht gebogen; 0.8 mm Tip Breedte; 4" Lengte</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-5135&nbsp;</td><td>Forceps</td></tr><tr><td>Extra Fijn Micro Dissecting Schaar 4" Recht Snip/Snip 24 mm</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-5912</td><td>Snip Schaar</td></tr><tr><td>Micro Dissecting Schaar 4" Recht Bots/Bots</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-5980</td><td>Bots Schaar</td></tr><tr><td>Wipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666-A. </td><td>Harness</td></tr><tr><td>PhysioSuite System</td><td>Kent Scientific</td><td>PhysioSuite</td><td>Vitals Monitor</td></tr><tr><td>1 ml Spuit, Tuberculin Slip Tip</td><td>BD</td><td>309659</td><td>Syringe</td></tr><tr><td>Cyano acrylate</td><td>Staples</td><td>LOC1647358</td><td>Cover Slip Adhesive</td></tr><tr><td>Petroleum Jelly</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-086291</td><td>Water Barrier</td></tr><tr><td>Adapter Luer Cannulla 1.5 - 2.2 mm</td><td>Harvard Apparatus</td><td>734118</td><td>Catheter Connector</td></tr><tr><td>PhysioSuite MouseSTAT pulse oximeter</td><td>Kent Scientific</td><td></td><td>Pulse Oximeter</td></tr><tr><td>Isoethesia (isofluraan)</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>50033</td><td>250 ml</td></tr><tr><td>Oxygen</td><td>TechAir</td><td>OX TM</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>PVC Ball Valve, Push to Connect, 1/4 In</td><td>Grainger</td><td>3CGJ7</td><td>Vacuum Valve</td></tr><tr><td>Small Animal Ventilator</td><td>Harvard Apparatus</td><td>683</td><td>Alternatief verkrijgbaar bij Kent Scientific: MouseVent</td></tr><tr><td>OptiMEM Reduced Serum Medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31985062. </td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Transfectiereagens</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>MacBlue Tg(Csf1r*-GAL4/VP16,UAS-ECFP)1Hume/J Muizen</td><td>Jackson Laboratory</td><td>026051. </td><td></td></tr><tr><td>Multifoton Microscoop</td><td>Olympus</td><td>Fluoview FV1000</td><td>Alternatief voor op maat gebouwde scope</td></tr><tr><td>Environmental Enclosure</td><td>Precision Plastics</td><td>Chamber for FV1000</td><td>Alternatief voor op maat gebouwde behuizing</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190136</td><td></td></tr><tr><td>Laser Power Meter</td><td>Coherent</td><td>FieldMaxIITOP</td><td></td></tr><tr><td>Laser Power Meter Hoofd</td><td>Coherent</td><td>PM10</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3-Clover Fluorescent Protein Vector</td><td>Addgene</td><td>40259</td><td></td></tr><tr><td>G418 Sulfaat Selectieve Antibioticum</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10131027</td><td></td></tr><tr><td>MoFlo Fluorescent-Activate Cell Sorter&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>XDP</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin EDTA 1x</td><td>Corning</td><td>25-052-Cl</td><td></td></tr><tr><td>40 µm Mesh</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>96 Well Plate</td><td>Costar</td><td>3599</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Cultuur Dish</td><td>Corning</td><td>430196</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Cultuur Dish</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J Muis</td><td>Jackson Laboratory</td><td>000664. </td><td></td></tr><tr><td>Kim Wipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666-A. </td><td></td></tr></tbody></table>

langdurig high-resolution intravitale microscopie in de long met een vacuüm gestabiliseerd imaging window

Long-term High-Resolution Intravital Microscopy in the Lung with a Vacuum Stabilized Imaging Window

Metastase naar secundaire plaatsen, zoals de longen, lever en botten is een traumatische gebeurtenis met een sterftecijfer van ongeveer 90% 1. Van deze sites, de longen is het moeilijkst te bepalen middels intravitale optische beeldvorming door zijn afgesloten plaats binnen het lichaam, delicate aard en belangrijke rol bij het instandhouden juiste fysiologie. Hoewel klinische modaliteiten (positron emissie tomografie (PET), magnetische resonantie beeldvorming (MRI) en computertomografie (CT)) staat om invasieve afbeeldingen van dit weefsel zijn, missen zij de resolutie nodig zijn om de eerste zaaien te visualiseren met een enkele pixel bestaande uit bijna duizend cellen. Huidige modellen van uitgezaaide longkanker zaaien postulaat dat de gebeurtenissen vlak na aankomst een tumorcel zijn deterministische om te overleven en de verdere groei. Dit betekent dat real-time imaging intravitale gereedschappen met enkele cel resolutie 2 nodig om de fenotypen van het zaaien cel definiërenls en test deze modellen. Terwijl hoge resolutie optische beeldvorming van de longen werd uitgevoerd met behulp van verschillende ex vivo preparaten, deze experimenten zijn typisch één tijdpunt assays en zijn gevoelig voor artefacten en eventuele verkeerde conclusies vanwege de drastisch veranderde omgeving (temperatuur, overvloed, cytokines, etc. ) als gevolg van verwijdering uit de borstholte en de bloedsomloop 3. Recent onderzoek heeft aangetoond dat de time-lapse intravitale optische beeldvorming van het intacte long is mogelijk met een gestabiliseerde onderdruk beeldvormende venster 2,4,5 hebben echter typische belichtingstijden beperkt tot ongeveer 6 uur. Hier beschrijven we een protocol voor het uitvoeren van langdurige intravitale time-lapse beeldvorming van de long gebruikmaking dergelijk venster over een periode van 12 uur. De time-lapse beeldreeksen zo verkregen inschakelen visualisatie en kwantificering van cel-cel interacties, membraan dynamiek en vasculaire perfusie in de longen. Verder hebben we dEscribe een beeld verwerkingstechniek waarbij een ongekend duidelijk beeld van de long microvasculatuur geeft.

Het soort resultaten die kunnen worden bereikt met deze werkwijze tonen, geïnjecteerd E0771-LG tumorcellen gemerkt met de fluorescerende eiwit klaver in de staartader van muizen MacBlue 44 op verschillende tijdstippen voor de operatie. Na de operatie, werd 155 kD rhodamine gemerkt dextran geïnjecteerd IV ter gelegenheid van het vaatstelsel en de time-lapse imaging werd uitgevoerd. Wanneer beeldvorming muizen 24 uur ...

Dit protocol beschrijft het gebruik van multifotonmicroscopie om longtermijn, hoog-resolutie, enkelcellimago van de intacte long in real time uit te voeren met behulp van een vacuüm gestabiliseerd beeldvormingsvenster.

Langdurig High-Resolution intravitale microscopie in de long met een vacuüm gestabiliseerd Imaging Window

Metastasis to secondary sites such as the lung, liver and bone is a traumatic event with a mortality rate of approximately 90% 1. Of these sites, the lung ...

Het algemene doel van deze methode is om langdurige, hoge-resolutie, single-cell imaging van de intacte long uit te voeren met behulp van een vacuümgestabiliseerd beeldvenster. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het vakgebied van kankeronderzoek; zoals welke interacties er plaatsvinden tussen stroma- en tumorcellen tijdens de vroegste stappen van metastase. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de levende, intacte long theoretisch met een single-cell resolutie tot 12 uur lang gevisualiseerd kan worden.Begin met het vastknopen van een stuk 2-0 hechtdraad van drie inch aan een trachealkatheter, een kwart inch boven de bushing, met een dubbele knoop. Breng vervolgens oogzalf aan in de ogen van een geanestheseerde muis en gebruik ontharingscrème om het haar aan de linkerzijde van het dier te verwijderen, vanaf de middellijn van de borst tot een kwart van de rug en van de axilla tot net onder de ribbenkast. Verwijder alle overtollige lotion en steriliseer de blootgestelde huid met 70% ethanol.Intubeer vervolgens het dier. Knoop de 2-0 hechtdraad rond de snuit, onder de voortanden. Verplaats het dier naar het operatiegebied, waarbij u er zorg voor draagt dat de katheters niet verschuiven, en zet de ventilator aan.Sluit de ventilator aan op de trachea-katheter. Plak vervolgens de katheter op de snuit en de linker voorpoot aan de katheter. Nadat is bevestigd dat er geen reactie is op de teenknijptest, wordt met een scherp schaartje één vierkante centimeter huid boven de linker borstwand verwijderd.Til het mammaire vetkussentje op en cauteriseer alle blootliggende bloedvaten. Resecteer vervolgens het vetkussentje en verwijder de spierlaag tot aan de ribbenkast, waarbij u er zorg voor draagt de axillaire vene aan de basis van de voorpoot niet door te snijden. Gebruik een pincet om de zesde rib op te tillen.Houd vervolgens de scherpe schaar in een flauwe hoek van vijf graden en knip de rib vlakbij de rand van de opening in de huid door. Verwijder vier opeenvolgende ribben om de opening in de borstwand te verbreden, zodat de gehele longkwab bloot komt te liggen. Plaats de muis vervolgens voorzichtig op de opsteltafel van de microscoop.Vul de binnenkamer van het vacuümvenster met PBS terwijl het vacuüm uitgeschakeld is. Keer de muis om en positioneer de blootgestelde long boven het vacuümbeeldvormingsdekglasvenster. Zet het vacuüm langzaam aan.Plaats een fixatieharnas, gemaakt van dubbelgevouwen vloeipapier, twee keer over de borst van de muis en plak het harnas aan de objecttafelplaat. Bevestig vervolgens een pulsoximeter aan de poot van het dier. Plaats daarna de omgevingskamer op de tafel en schakel de verwarming in om de muis op fysiologische temperatuur te houden.Zodra het dier in positie is, brengt u de objectieflens met een numerieke apertuur van 25 bij 95 dicht bij het dekglas. Bekijk in de epifluorescentiemodus het fitzy-kanaal en stel het longweefsel scherp. Vul vervolgens een steriele spuit met 100 µL van de tumorcelsuspensie, verwijder de spuit met PBS uit de staartveneutcatheter en sluit de spuit met de tumorcellen aan.Injecteer de tumorcellen langzaam in de staartвена. Sluit vervolgens de PBS-spuit opnieuw aan op de staartvenacatheter en lokaliseer de tumorcellen in het longweefsel via het oculair van de microscoop. Vervang nu de PBS-spuit door een spuit gevuld met 100 µL rhodamine-dextran en injecteer het dextran langzaam in de muis via de staartcatheter.Volg de toediening van dextran op met een spoeling van 50 µL steriele PBS. Maak vervolgens beelden op elke van de eerder gelokaliseerde posities van de tumorcellen om de doorstroming en integriteit van de vasculatuur te visualiseren. Vierentwintig uur na injectie kunnen individuele tumorcellen worden gevisualiseerd terwijl ze interageren met macrofagen en monocyten binnen de vasculatuur.De stabiliteit van de beeldvorming is zodanig dat opeenvolgende Z-stacks van het veld kunnen worden verkregen en een driedimensionale reconstructie kan worden gegenereerd. Hier wordt een mozaïek van vijf bij vijf beeldvelden getoond, die een gezichtsveld van 890 micron beslaan, over 205 minuten, op 15 micron onder het oppervlak van de long van een enkele metastatische laesie, 12 dagen na injectie. Ondanks het grote gezichtsveld maakt de hoge resolutie van de onderliggende frames die het mozaïek vormen het mogelijk om subcellulaire gebeurtenissen vast te leggen, zoals de mitose van een enkele cel, zoals blijkt uit de chromosomale scheiding.Intravasculaire injectie van een fluorescent gelabeld dextran met een hoog molecuulgewicht resulteert in de labeling van het vasculaire lumen; ongelabelde circulerende erytrocyten en leukocyten kunnen het dextran echter occluderen. In de kleine capillairen van de long leidt deze occlusie tot een flikkering van het dextransignaal en een verlies aan definitie van de vasculaire grenzen. De hoge ruimtelijke stabiliteit die door dit protocol wordt geboden, maakt tijdmiddeling van het bloedkanaal mogelijk zonder vervaging, waardoor de tijdelijke occlusies worden hersteld.De overige signaalkanalen kunnen vervolgens over de vasculatuur worden gelegd om een duidelijk beeld van de vaatgrenzen te verkrijgen. Zodra de techniek onder de knie is, kan deze in ongeveer een uur worden voltooid mits correct uitgevoerd. Tijdens deze procedure is het belangrijk om er op te letten dat grote bloedvaten niet worden doorgesneden zonder deze eerst te cauteriseren en dat het longweefsel volledig ongemoeid wordt gelaten.Door deze procedure te volgen, kunnen de vroegste stadia van tumorcelverspreiding en proliferatie worden gevisualiseerd. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe intravitale beeldvorming in de intacte long kan worden uitgevoerd met een vacuümgestabiliseerd beeldvormingsvenster. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experiment.

long-term-high-resolution-intravital-microscopy-lung-with-vacuum

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

We laten zien, hoe twee-foton microscopie gebruikt voor de observatie van de dynamiek van neutrofiele granulocyten in de longen besmet terwijl ze fagocyteren pathogenen of produceren neutrofielen extracellulaire vallen (NET).

Directe observatie van fagocytose en de NET-vorming door neutrofielen in Infected longen met behulp van twee-foton microscopie

In this video, we describe the intravital imaging of a mouse pancreas through a stabilized window for long-term visualization of cellular dynamics.

Intravital Imaging: A Method for Cellular Level Observation of the Mouse Pancreas Through a Stabilized Imaging Window

Dit protocol beschrijft de intravital beeldvorming van transgene muizen uiting van cel-specifieke fluorescente markeringen. Intravital imaging biedt een niet-invasieve methode voor hoge resolutie waarnemingen in levende dieren met behulp van implanteerbare windows waardoor de microscopische visualisatie van de processen mogelijk is. Deze methode is vooral handig om longitudinale processen te bestuderen.

Intravital microscopie van Tumor-geassocieerde therapieën met behulp van geavanceerde dorsale huidplooien venster Chambers op transgene fluorescerende muizen

In vivo beeldvorming met hoge resolutie van de alvleesklier werd vergemakkelijkt met het pancreas intravital imaging venster.

Gestabiliseerde longitudinale in vivo cellulaire visualisatie van de alvleesklier in een murien model met een pancreas intravital imaging venster

Hier wordt een benadering gepresenteerd voor intravitale beeldvorming op lange termijn met behulp van optisch heldere, siliconen vensters die rechtstreeks op het weefsel / orgaan van belang en de huid kunnen worden gelijmd. Deze ramen zijn goedkoper en veelzijdiger dan andere die momenteel in het veld worden gebruikt, en de chirurgische inbrenging veroorzaakt beperkte ontsteking en leed voor de dieren.

Longitudinale intravitale beeldvorming door heldere siliconenvensters

Hier presenteren we een protocol voor de chirurgische implantatie van een permanent inwonend optisch venster voor de muriene thorax, dat een hoge resolutie, intravitale beeldvorming van de long mogelijk maakt. De duurzaamheid van het venster maakt het zeer geschikt voor de studie van dynamische cellulaire processen in de longen, vooral die welke langzaam evolueren, zoals gemetastaseerde progressie van verspreide tumorcellen.

Een permanent venster voor het onderzoeken van kankermetastase naar de longen

De rekrutering van leukocyten en bloedplaatjes vormt een essentieel onderdeel dat nodig is voor de effectieve groei van collaterale slagaders tijdens arteriogenese. Multifotonenmicroscopie is een efficiënt hulpmiddel voor het volgen van celdynamica met een hoge spatio-temporele resolutie in vivo en minder fototoxiciteit om leukocytenrekrutering en extravasatie tijdens arteriogenese te bestuderen.

Multifoton intravitale beeldvorming voor het monitoren van leukocytenrekrutering tijdens arteriogenese in een Murine Hindlimb-model

Dit protocol beschrijft een nieuw mammabeeldvormingsvenster met een vervangbaar deksel (R.MIW). Intravitale microscopie na implantatie van de R.MIW maakt longitudinale en meerdaagse beeldvorming van de gezonde en zieke borstklier mogelijk met een cellulaire resolutie tijdens de verschillende ontwikkelingsstadia.

Longitudinale intravitale microscopie met behulp van een mammabeeldvormingsvenster met vervangbaar deksel

Intravitale fluorescentiemicroscopie kan worden gebruikt om leukocyten-endotheelinteracties en capillaire perfusie in realtime te bestuderen. Dit protocol beschrijft methoden om deze parameters in de pulmonale microcirculatie in beeld te brengen en te kwantificeren met behulp van een vacuümgestabiliseerd longbeeldvormingssysteem.

Intravitale widefield fluorescentiemicroscopie van pulmonale microcirculatie bij experimenteel acuut longletsel met behulp van een vacuümgestabiliseerd beeldvormingssysteem

Hier presenteren we een protocol om de getransplanteerde linkerlong van de muis intravitaal in beeld te brengen met behulp van twee-fotonmicroscopie. Dit is een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van cellulaire dynamiek en interacties in real-time na longtransplantatie bij muizen.

Intravitale twee-fotonmicroscopie van de getransplanteerde muizenlong

Hier presenteren we een protocol voor intravitale beeldvorming van een verzwakte, door BSL-2 goedgekeurde Mycobacterium tuberculosis. Spanning in de muislong met behulp van een permanent longvenster. Deze benadering maakt longitudinale, enkelcelresolutie-analyse mogelijk van vroege interacties tussen gastheer en pathogeen, waaronder bacillaire lokalisatie, vasculaire dynamiek en opname van macrofagen binnen dezelfde longmicroomgeving.

Intravitale beeldvorming van verzwakte auxotrofe mycobacterium tuberculosis in muislong tijdens vroege intravasculaire infectie

Leer langdurige intravitale microscopie van de intacte long met een vacuüm gestabiliseerd beeldvenster. Deze methode maakt hoogresolutiebeeldvorming van enkele cellen mogelijk om stroma-tumorcelinteracties tijdens metastase te bestuderen.

Langdurig High-Resolution intravitale microscopie in de long met een vacuüm gestabiliseerd Imaging Window

Meer video's verkennen