Langdurig High-Resolution intravitale microscopie in de long met een vacuüm gestabiliseerd Imaging Window

Het algemene doel van deze methode is om langdurige, hoge-resolutie, single-cell imaging van de intacte long uit te voeren met behulp van een vacuümgestabiliseerd beeldvenster. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het vakgebied van kankeronderzoek; zoals welke interacties er plaatsvinden tussen stroma- en tumorcellen tijdens de vroegste stappen van metastase. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de levende, intacte long theoretisch met een single-cell resolutie tot 12 uur lang gevisualiseerd kan worden.

Begin met het vastknopen van een stuk 2-0 hechtdraad van drie inch aan een trachealkatheter, een kwart inch boven de bushing, met een dubbele knoop. Breng vervolgens oogzalf aan in de ogen van een geanestheseerde muis en gebruik ontharingscrème om het haar aan de linkerzijde van het dier te verwijderen, vanaf de middellijn van de borst tot een kwart van de rug en van de axilla tot net onder de ribbenkast. Verwijder alle overtollige lotion en steriliseer de blootgestelde huid met 70% ethanol.

Intubeer vervolgens het dier. Knoop de 2-0 hechtdraad rond de snuit, onder de voortanden. Verplaats het dier naar het operatiegebied, waarbij u er zorg voor draagt dat de katheters niet verschuiven, en zet de ventilator aan.

Sluit de ventilator aan op de trachea-katheter. Plak vervolgens de katheter op de snuit en de linker voorpoot aan de katheter. Nadat is bevestigd dat er geen reactie is op de teenknijptest, wordt met een scherp schaartje één vierkante centimeter huid boven de linker borstwand verwijderd.

Til het mammaire vetkussentje op en cauteriseer alle blootliggende bloedvaten. Resecteer vervolgens het vetkussentje en verwijder de spierlaag tot aan de ribbenkast, waarbij u er zorg voor draagt de axillaire vene aan de basis van de voorpoot niet door te snijden. Gebruik een pincet om de zesde rib op te tillen.

Houd vervolgens de scherpe schaar in een flauwe hoek van vijf graden en knip de rib vlakbij de rand van de opening in de huid door. Verwijder vier opeenvolgende ribben om de opening in de borstwand te verbreden, zodat de gehele longkwab bloot komt te liggen. Plaats de muis vervolgens voorzichtig op de opsteltafel van de microscoop.

Vul de binnenkamer van het vacuümvenster met PBS terwijl het vacuüm uitgeschakeld is. Keer de muis om en positioneer de blootgestelde long boven het vacuümbeeldvormingsdekglasvenster. Zet het vacuüm langzaam aan.

Plaats een fixatieharnas, gemaakt van dubbelgevouwen vloeipapier, twee keer over de borst van de muis en plak het harnas aan de objecttafelplaat. Bevestig vervolgens een pulsoximeter aan de poot van het dier. Plaats daarna de omgevingskamer op de tafel en schakel de verwarming in om de muis op fysiologische temperatuur te houden.

Zodra het dier in positie is, brengt u de objectieflens met een numerieke apertuur van 25 bij 95 dicht bij het dekglas. Bekijk in de epifluorescentiemodus het fitzy-kanaal en stel het longweefsel scherp. Vul vervolgens een steriele spuit met 100 µL van de tumorcelsuspensie, verwijder de spuit met PBS uit de staartveneutcatheter en sluit de spuit met de tumorcellen aan.

Injecteer de tumorcellen langzaam in de staartвена. Sluit vervolgens de PBS-spuit opnieuw aan op de staartvenacatheter en lokaliseer de tumorcellen in het longweefsel via het oculair van de microscoop. Vervang nu de PBS-spuit door een spuit gevuld met 100 µL rhodamine-dextran en injecteer het dextran langzaam in de muis via de staartcatheter.

Volg de toediening van dextran op met een spoeling van 50 µL steriele PBS. Maak vervolgens beelden op elke van de eerder gelokaliseerde posities van de tumorcellen om de doorstroming en integriteit van de vasculatuur te visualiseren. Vierentwintig uur na injectie kunnen individuele tumorcellen worden gevisualiseerd terwijl ze interageren met macrofagen en monocyten binnen de vasculatuur.

De stabiliteit van de beeldvorming is zodanig dat opeenvolgende Z-stacks van het veld kunnen worden verkregen en een driedimensionale reconstructie kan worden gegenereerd. Hier wordt een mozaïek van vijf bij vijf beeldvelden getoond, die een gezichtsveld van 890 micron beslaan, over 205 minuten, op 15 micron onder het oppervlak van de long van een enkele metastatische laesie, 12 dagen na injectie. Ondanks het grote gezichtsveld maakt de hoge resolutie van de onderliggende frames die het mozaïek vormen het mogelijk om subcellulaire gebeurtenissen vast te leggen, zoals de mitose van een enkele cel, zoals blijkt uit de chromosomale scheiding.

Intravasculaire injectie van een fluorescent gelabeld dextran met een hoog molecuulgewicht resulteert in de labeling van het vasculaire lumen; ongelabelde circulerende erytrocyten en leukocyten kunnen het dextran echter occluderen. In de kleine capillairen van de long leidt deze occlusie tot een flikkering van het dextransignaal en een verlies aan definitie van de vasculaire grenzen. De hoge ruimtelijke stabiliteit die door dit protocol wordt geboden, maakt tijdmiddeling van het bloedkanaal mogelijk zonder vervaging, waardoor de tijdelijke occlusies worden hersteld.

De overige signaalkanalen kunnen vervolgens over de vasculatuur worden gelegd om een duidelijk beeld van de vaatgrenzen te verkrijgen. Zodra de techniek onder de knie is, kan deze in ongeveer een uur worden voltooid mits correct uitgevoerd. Tijdens deze procedure is het belangrijk om er op te letten dat grote bloedvaten niet worden doorgesneden zonder deze eerst te cauteriseren en dat het longweefsel volledig ongemoeid wordt gelaten.

Door deze procedure te volgen, kunnen de vroegste stadia van tumorcelverspreiding en proliferatie worden gevisualiseerd. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe intravitale beeldvorming in de intacte long kan worden uitgevoerd met een vacuümgestabiliseerd beeldvormingsvenster. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experiment.