Patch Clamp Registratie van Starburst amacrine Cellen in een flat-mount voorbereiding van Deafferentated Mouse Retina
13 oktober 2016
Dit protocol laat zien hoe whole-cell patch clamp opname uit te voeren op het netvlies neuronen uit een flat-mount voorbereiding.
Het algemene doel van deze procedure is om whole-cell patch clamp opnames uit te voeren van inner retinale neuronen in de flat-mount muisretina voorbereiding. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het veld van de retinale neurobiologie, zoals de diversiteit van neuronen, hun synaptische verbindingen onder normale en pathologische omstandigheden. Het grote voordeel van deze techniek is dat zowel de verticale als laterale verbindingen behouden blijven, waardoor de retinale circuits met grote laterale componenten kunnen worden bestudeerd.
Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn in deze methode worstelen omdat de retina een dun, delicaat weefsel is dat met grote zorgvuldigheid en geduld moet worden behandeld. Oefenen is echter de beste manier om het onder de knie te krijgen. Om met deze procedure te beginnen, rolt u de muizenoogbollen in een schone papieren handdoek om eventueel bloed te verwijderen.
Dompel ze vervolgens onder in de met carbogen verrijkte zoogdier Ringer-oplossing. Prik vervolgens een gat op de limbus met een 23-gauge naald en snijd de oogbollen door met microschaar in de richting van de limbus. Verwijder vervolgens de cornea en lens met behulp van een fijn pincet.
Voor de retinale whole-mount, pelt u voorzichtig de hele retina van het gepigmenteerde epitheel met een fijn pincet en maakt u vier orthogonale sneden van 1,5 tot twee millimeter vanaf de rand naar de optische zenuwkop. Dompel vervolgens een geponste nitrocellulosemembraan in het schaaltje en sleep de retina er voorzichtig overheen met de GCL-kant omhoog. Plaats vervolgens de optische zenuwkop in het middelste gat bij het voorbereiden van een whole-mount retina.
Breng vervolgens het membraan met de retina over in een ander schoon schaaltje. Maak de retina voorzichtig plat als een Maltezer kruis met een fijn penseel en leg alle vier de randen over de gaten. Dep het nitrocellulosemembraan af met een stuk droog filterpapier en verwijder het glasvocht en de innerlijke begrenzingsmembraan met een pincet en een penseel.
Zorg ervoor dat alle retinale randen volledig aan het membraan zijn bevestigd voordat u de assemblage overbrengt naar de opnamekamer met een afgedicht glazen deksel aan de onderkant. Bevestig het membraan aan het deksel met vacuümvet en rehydrateer de retina met de externe oplossing. Zorg ervoor dat u geen luchtbellen onder de assemblage laat zitten.
Plaats vervolgens de kamer op de tafel van een rechtopstaande microscoop. Besproei de kamer met 34 graden Celsius carbogenverrijkte externe oplossing met een snelheid van ongeveer drie milliliters per minuut. Onderzoek de retina eerst onder een 10x subjectief objectief.
Gebruik vervolgens een 60x waterimmersielens om GCL- en INL-neuronen te zien onder DIC en de epifluorescente instelling. Gebruik een witte LED-lichtbron in combinatie met een excitatiefilter van 554 nanometer en een emissiefilter van 581 nanometer om tdTomato expresserende SAC's te visualiseren. Filter in deze procedure de interne oplossing door een spuitfilter in het aangepaste achtervulfilament.
Breng vervolgens het filament in een vers getrokken micropipet en doseer de interne oplossing in de buurt van de punt totdat de oplossing het zilveren elektrodendraad meer dan vijf millimeter bedekt. Bevestig vervolgens de micropipet aan een elektrodehouder met een zuigpomp waardoor de druk in de elektrode kan worden aangepast door de plunjer van een buis te duwen of te trekken die is verbonden met een 10 ml plastic spuit. Zoek vervolgens de pipet onder het objectief en breng deze naar ongeveer 100 micrometer boven de retina.
Gebruik onder de huidige volgermodus DC-offset om het staande DC-voltagesignaal op nul te zetten. Meet de pipetweerstand onder de stroomklemmodus door vaste amplitude vierkante golfstromen door de pipet te injecteren terwijl deze zich in het bad bevindt. Neutraliseer het verschil door de Raccess-knop te draaien en gebruik de aflezing erop om de pipetweerstand te berekenen.
Breng vervolgens langzaam de elektrode naar ongeveer 10 micrometer boven de retina. Oefen positieve druk uit op de elektrode. Kijk vervolgens naar de verandering in de reflectie nabij de pipetpunt terwijl deze de retina nadert.
Dwing de pipet snel maar voorzichtig in de GCL en verlaag onmiddellijk de positieve druk. Beweeg de pipet naar een gelabeld neuron en vermijd contact met andere neuronen, bloedvaten en eindvoeten van Müller-cellen. Oefen, indien nodig, meer positieve druk uit om elektrode verstopping te voorkomen.
Positioneer vervolgens de pipetpunt nabij het gelabelde neuron totdat een kuiltje zichtbaar is. Laat vervolgens de positieve druk los en laat het plasmamembraan op de pipetpunt terugkaatsen. Breng 20 tot 120 picoampère negatieve stromen aan op de pipet om de vorming van een giga-ohm verzegeling te helpen.
Het is belangrijk om het celmembraan te laten terugkaatsen na het loslaten van de positieve druk, omdat een uitstekende verzegeling die op natuurlijke wijze tussen het membraan en de pipetopening is gevormd, belangrijk is om de celmorfologie na de opname te behouden. Breng indien nodig een zachte zuiging aan om het plasmamembraan in de pipet te trekken. Wacht vijf minuten na de verzegelingsvorming om het celmembraan te scheuren om de opname van de gemorst interne oplossing door superfusie mogelijk te maken.
Nadat het membraan is gescheurd en terwijl u in de stroomklemmodus bent, zet u de bridge balance aan en past u deze aan met behulp van de Raccess-knop. Neem de excitatoire en inhibitoire postsynaptische stromen op in de spanningsklemmodus door de cel op omkeringspotentialen vast te houden. Verwijder na de opname voorzichtig de pipet uit het soma.
Breng de assemblage over van de kamer naar een schoon schaaltje. Los vervolgens de retina los en bevestig deze opnieuw op een andere platte nitrocellulosemembraan zonder gaten te ponsen om de vlakheid van de retina tijdens de fixatie te garanderen. Het weefsel is nu klaar voor kleuring.
Deze afbeeldingen tonen aan dat cholinerge cellen in zowel GCL als INL betrouwbaar kunnen worden geïdentificeerd door tdTomato-fluorescentie en gericht voor whole-cell patch clamp opnames onder DIC. De oscillatie van hun membraanpotentialen kan
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol demonstreert hoe whole-cell patch clamp-registraties kunnen worden uitgevoerd op retinale neuronen vanuit een flat-mount preparaat. Deze methode is essentieel voor het bestuderen van de diversiteit van retinale neuronen en hun synaptische verbindingen.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Elektrofysiologie
- Retinale biologie
Achtergrond
- Whole-cell patch clamp-registratie is een techniek die wordt gebruikt om neuronale activiteit te bestuderen.
- Het netvlies bevat verschillende typen neuronen die verschillende rollen spelen bij de visuele verwerking.
- Het begrijpen van netvliescircuits is essentieel voor het aanpakken van visuele stoornissen.
- Deze methode behoudt zowel de verticale als de laterale verbindingen in het netvlies.
Doel van de studie
- Om de diversiteit van neuronen in de binnenste retina te onderzoeken.
- Om synaptische verbindingen onder normale en pathologische omstandigheden te analyseren.
- Om het begrip van de neurobiologie van de retina te vergroten.
Gebruikte methoden
- Preparatie van een flat-mount muisretina.
- Voorzichtige behandeling van delicaat retinaal weefsel.
- Toepassing van de whole-cell patch clamp-techniek.
- Registratie van neuronale activiteit voor analyse.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle registratie van neuronale activiteit van retinale neuronen.
- Inzichten in de synaptische verbindingen van verschillende neurontypes.
- Identificatie van verschillen in neuronaal gedrag onder verschillende omstandigheden.
- Vaststelling van een betrouwbaar protocol voor toekomstige studies.
Conclusies
- De whole-cell patch clamp-techniek is effectief voor het bestuderen van retina-neuronen.
- Deze methode maakt het mogelijk om de retina-circuiterie te behouden.
- Verder onderzoek kan voortbouwen op deze bevindingen om retina-aandoeningen te verkennen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie
Het behoud van zowel de verticale als laterale retinale circuits in flat-mount preparaten maakt elektrofysiologische analyse van neuronale connectiviteit met een hoge getrouwheid mogelijk, wat bijdraagt aan mechanistische risicoreductie in de vroege ontdekkingsfase. Whole-cell patch clamp registratie van genetisch gemarkeerde starburst amacrine cellen (SACs) biedt kwantitatieve inzichten in synaptische integratie en netwerkoscillaties, wat essentieel is voor targetvalidatie en functionele routeanalyse. Deze benadering verhoogt het voorspellend vertrouwen voor portfoliobeslissingen in R&D-pipelines die gericht zijn op neurobiologie.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt directe meting van synaptische stromen en oscillaties van het membraanpotentiaal in geïdentificeerde neuronale subtypen mogelijk.
- Ondersteunt functionele validatie van genetisch gedefinieerde targets binnen intacte retinaal circuits.
- Faciliteert mechanistische risicoreductie door behoud van de natuurlijke connectiviteit, waardoor ambiguïteit in padanalyse wordt verminderd.
- Levert kwantitatieve gegevens voor hypothese-gestuurd onderzoek naar neuronale diversiteit en connectiviteit.
Screening & Assayontwikkeling
- Stelt een reproduceerbaar platform vast voor het evalueren van de effecten van verbindingen op de synaptische transmissie in ziekterelevante systemen.
- Levert gestandaardiseerde, kwantitatieve elektrofysiologische output die geschikt is voor vergelijkingen tussen verschillende condities.
- Maakt assay-ontwikkeling mogelijk voor het screenen van modulatoren van neuronale exciteerbaarheid en synaptische integratie.
- Ondersteunt schaalbaarheid voor parallelle opnames en dual-patch configuraties.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij ziekte-relevante modellen door de studie van retina-circuits in zowel normale als pathologische toestanden mogelijk te maken.
- Zorgt voor continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door post hoc histologische karakterisering te ondersteunen.
- Faciliteert risico-gecorrigeerde vooruitgang door de functionele gevolgen van genetische of farmacologische perturbaties te onthullen.
- Maakt exploratie van netwerksynchronie en oscillatoir gedrag mogelijk dat relevant is voor neurodegeneratieve ziektemodellen.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode integreert op het snijvlak van vroege ontdekking en preklinisch onderzoek, waarbij targetvalidatie wordt verbonden met de ontwikkeling van functionele assays in neurobiologische pipelines.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetesten over neuronale connectiviteit en synaptische mechanismen in intact weefsel.
- Screening: Levert kwantitatieve, reproduceerbare resultaten voor het evalueren van farmacologische of genetische interventies.
- Analytics: Maakt meting mogelijk van excitatoire en inhibitoire postsynaptische stromen, oscillaties van het membraanpotentiaal en netwerksynchronisatie.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt mechanistische bevindingen met ziekte-relevante fenotypen in preklinische modellen.
- Enterprise Hergebruik: Biedt een herbruikbaar platform voor diverse neuronale subtypen en experimentele vraagstukken binnen het onderzoek naar het netvlies.
Operationele & bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij targetvalidatie en vermindert mechanistische ambiguïteit bij de analyse van neuronale circuits.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare en schaalbare elektrofysiologische workflows voor adoptie door verschillende teams.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen door kwantitatieve functionele gegevens te verschaffen over target-engagement en pathway-modulatie.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van neurobiologische assets mogelijk op basis van robuuste functionele validatie.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in de behandeling van delicate weefsels en geavanceerde elektrofysiologische technieken.
- Vereist gespecialiseerde instrumentatie, waaronder rechtopstaande microscopen, patchclamp-versterkers en fluorescentiebeeldvormingsmogelijkheden.
- Maakt standaardisatie tussen teams van weefselpreparatie- en registratieprotocollen noodzakelijk voor reproduceerbaarheid.
- Aanpasbaar aan diverse genetisch gemarkeerde neuronale populaties binnen het netvlies.
- Praktische beperkingen omvatten de fragiliteit van het weefsel en de noodzaak voor nauwkeurige omgevingscontrole tijdens de registraties.
