Name: Patch Clamp Registratie van Starburst amacrine Cellen in een flat-mount voorbereiding van Deafferentated Mouse Retina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Leer whole-cell patch clamp registratie van binnenste retinale neuronen in een flat-mount muizenretina. Deze methode behoudt verticale en laterale verbindingen voor onderzoek naar neuronale diversiteit en synaptische circuits.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken Joung Jang en Xin Guan voor technische assistentie. We danken Dr. Rory McQuiston van de Virginia Commonwealth University voor het opzetten van onze eerste patch clamp rig en adviezen over experimentele procedures. We danken Dr. Samuel Wu voor suggesties over voltage clamp opname. Het werk wordt ondersteund door NIH-grants EY013811, EY022228 en een vision core grant EY002520. C-KC is de Alice R. McPherson Retina Research Foundation Endowed Chair aan het Baylor College of Medicine.

Ethische goedkeuring - procedures waarbij proefdieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de regels en voorschriften van de National Institutes of Health richtlijnen voor proefdieren, zoals goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik commissie van Baylor College of Medicine. 1. Externe en interne Solutions <ol><li> Gebruik oplossing zoogdieren Ringer&#39;s tijdens netvlies dissectie en als externe oplossing in de daaropvolgende elektrofysiologische opname. Bereid de zoogdieren Ringer&#39;s oplossing van 10x stockoplossing (zonder calcium) op de dag van opname en voeg CaCl2 druppelsgewijze na 15 min carbogenation (95% O2 en 5% CO2). De uiteindelijke 1x oplossing bevat (in mM): 120 NaCl, 5 KCI, 25 NaHCO3, 0,8 Na 2 HPO 4, 0,1 NaH 2PO 4, 2 CaCl2, 1 MgSO 4 en 10 D-glucose. </li><li> Gebruik twee interne oplossingen voor SAC oscillaties karakteriseren. Proefhet nut van bereide oplossingen langdurige whole-cell patch clamp on volwassen muis RGC en bewaar de geverifieerde batches in 500 gl aliquots bij -20 ° C tot gebruik. <ol><li> Voor het opnemen membraanpotentiaal oscillatie gebruik een basis van kalium interne oplossing die (in mM) bevat: 125 K-gluconaat, 8 NaCl, 4 ATP-Mg, 0,5 Li-GTP, 5 EGTA, 10 HEPES en 0,2% biocytine (w / v). Stel de pH tot 7,3 met KOH. </li><li> Voor het opnemen van prikkelende en remmende postsynaptische stromingen, gebruik een cesium gebaseerde interne oplossing die bevat (in mM): 100 Cs-methaansulfonaat, 8 NaCl, 4 ATP-Mg, 0,5 Li-GTP, 5 EGTA, 10 HEPES en 0,2% biocytine ( w / v). Stel de pH tot 7,3 met CsOH. </li></ol></li></ol> 2. Voorbereiding van de Dag van de Recording <ol><li> Om een ​​nitrocellulose membraan met open gaten voor te bereiden, met de hand het membraan punch met een aangepaste puncher gemaakt van een afgestompte 16 G injectienaald en plat het membraan tussen twee schone glazen platen. Voor een groot-mount netvlies, maakt een centrale opening 0,2 mm in diameter en omgeven door 4 grotere gaten die 1-1,2 mm. </li><li> Om een ​​aangepaste opvulling filament voor het laden van interne oplossing in elektrodes te maken, smelt een 10 ul pipet tip in het midden en zachtjes verlengen de gesmolten gedeelte totdat het afkoelt en verhardt. Vlak voor het gebruik, gebruik dan een schone scheermesje om het filament trimmen totdat het is iets langer dan de patch pipetten. </li><li> Trek patch pipetten in een programmeerbare trekker van borosilicaatglas buis met een interne filament. Vervaardiging van de micropipetten op de dag van het experiment en direct gebruiken. LET OP: Voor het opnemen SBZ, gebruiken we de volgende puller instelling: warmte: 484; Trek: 0; snelheid: 25; vertragingstijd: 1; druk: 400 en een helling 462. De waarde van OD en ID van de boorsilicaat buizen 1,65 mm en 1,0 mm werden. Weerstand van de pipetten wordt 10-14 MQ. </li><li> Eén uur voor weefsel oogst, ontdooien een buis van de interne oplossing shaking het op een vortex gedurende&gt; 30 min. </li></ol> 3. Retina Dissection <ol><li> Verdoven het dier met 4% isofluraan in zuurstof, totdat het dier responsiviteit verliest aan een teen knijpen. Offer het dier door cervicale dislocatie. </li><li> Snijd beide oogappels van de oogzenuwen op 1-2 mm van de oogzenuw hoofden met rechte wees iris schaar. </li><li> Rol de ogen op een schone papieren handdoek om bloed te verwijderen en vervolgens dompel ze in carbogenated zoogdieren Ringer&#39;s oplossing. Punch een gat op de limbus met een 23 G naald en halveren de oogbollen door te snijden langs de limbus met micro-schaar. Verwijder het hoornvlies en de lens met behulp van fijne pincet. <ol><li> Voor het netvlies whole-mount, zachtjes schil de gehele retina van de gepigmenteerde epitheel met fijn pincet en maak vier 1,5-2 mm orthogonale bezuinigingen van de rand in de richting van de oogzenuw hoofd. </li></ol></li><li> Dompel een geperforeerd nitrocellulosemembraan in de schaal en voorzichtig sleep het netvlies over het metde GCL kant naar boven. Plaats de oogzenuw hoofd in het gat in het midden bij de voorbereiding van een hele-mount netvlies. Breng de membraan met het netvlies in een andere schone gerecht. Voorzichtig plat het netvlies met een fijn penseel te lijken op een Maltezer kruis en leg alle vier de randen over de gaten. <ol><li> Als een deel van het netvlies is tegelijkertijd te onderzoeken, snijd elke oogschelp bereid uit stap 3.3 in 3-4 stukken met een scheermesje met de gepigmenteerde epitheel bevestigd blijft. Bescherm de ongebruikte stukken uit het licht in carbogenated externe oplossing en gebruik ze binnen 12 uur. </li></ol></li><li> Dep de nitrocellulose membraan met een stuk droog filter papier en verwijder het glasvocht en innerlijke beperkende membraan met een tang en een kwast. </li><li> Zorg ervoor dat alle retinale randen volledig op voordat het overbrengen van de constructie in de opname kamer met een afgesloten glazen deksel slip op de bodem zijn bevestigd aan het membraan. Zet het membraan met vacuüm vet om het deksel slip en rehydrate het netvlies met de externe oplossing. Wees voorzichtig niet te vangen eventuele luchtbellen onder de montage. </li><li> Stel de kamer op het podium van een rechtopstaande microscoop. Perfuseren de kamer met warm (34-35 ° C) carbogenated externe oplossing met een snelheid van ~ 3 ml per min. </li><li> Onderzoek de retina onder een 10x objectief, en dan gebruik maken van een 60x water-immersie lens GCL en INL neuronen onder differentieel interferentie contrast (DIC) en / of epifluorescentie te zien. To-tdTomato uitdrukken SBZ visualiseren, gebruik maken van een witte LED-lichtbron in combinatie met een excitatie filter van 554 nm en een emissie filter van 581 nm. </li></ol> 4. Whole-cell Patch Clamp Opnemen van Flat-mount Retina <ol><li> Filter de interne oplossing door een spuit filter in de aangepaste opvulling gloeidraad. </li><li> Steek de gloeidraad in een vers getapt micropipet en afzien van de interne oplossing in de buurt van de top tot de oplossing omvat de elektrode draad zilver voor&gt;5 mm. Bevestig de micropipet op een elektrodehouder met een zuig- paal, waardoor de druk binnen de elektrode kan worden aangepast door duwen of trekken van de zuiger van een buis verbonden 10 ml plastic spuit. </li><li> Vind de pipet in het kader van de doelstelling en breng het naar beneden tot ~ 100 micrometer boven het netvlies. Onder de huidige-volger mode (I = 0), gebruiken DC offset aan de permanente gelijkspanning signaal nul. Meet de pipet weerstand onder de huidige klem (I Klem) modus door het injecteren van vaste amplitude vierkante golf stromen door de pipet terwijl het in het bad en neutraliseren het verschil door de rToegang tot knop. Gebruik de lezing over de rToegang tot knop om pipet weerstand te berekenen door de wet van Ohm. </li><li> Langzaam breng de elektrode ~ 10 urn boven de retina. Toepassen positieve druk aan de elektrode. Kijk naar de reflectie verandering in de buurt van de pipet tip als het het netvlies benadert. Snel maar voorzichtig te dwingen de pipet in de GCL en vermindering van de positieve pressure onmiddellijk. </li><li> Verplaats de pipet in de richting van een gelabelde neuron. Vermijd contact opneemt met andere neuronen, bloedvaten en eindvoetjes van astrocyten van Muller cellen. Toepassen positieve druk indien nodig elektrode verstopping te voorkomen. </li><li> Plaats de pipet tip in de buurt van de middellijn van een gelabelde neuron totdat er een kuiltje zichtbaar is. Laat de positieve druk en laat de plasmamembraan om terug te stuiteren op de pipet tip. </li><li> Toepassen 20 tot 120 pA negatieve stromen aan de pipet om de vorming van een giga-ohm afdichting helpen. Breng een zachte zuigkracht eventueel naar de plasmamembraan te trekken in de pipet. Wacht 5 minuten na afdichting formatie de celmembraan scheuren. Hierdoor kan de gemorste interne oplossing kon worden gekeerd door superfusie. Scheuren van het membraan door een zachte zuigkracht. </li><li> Na het breken van de vliezen en terwijl in de huidige klem modus te schakelen op de brug balans en aan te passen met behulp van de rToegang tot knop. OPMERKING: Voor een kleine cel, zoals de SAC, slechts geringe aanpassing nodig is, indien van toepassing. Alterntief, opnemen prikkelende en remmende postsynaptische stromingen in het voltage clamp-modus (V Clamp) door het vasthouden van de cel op omkering potentieel van chloride (ongeveer -75 mV) en glutamaat (ongeveer 0 mV), respectievelijk. Controleer en stel pipet positie als dat nodig is om af en toe een retina en / of micromanipulator drift tegemoet te komen. </li><li> Om membraanpotentiaal of stroomverandering voor verse, opnemen, tijdens en na de farmacologische behandeling, bereiden synaptische blokkers (bijv CNQX, AP5, picrotoxine, tubocurarine, etc.) en kanaal modulatoren (bijvoorbeeld flupirtine, dopamine, meclofenaminezuur, etc.) de dag van het experiment uit bevroren voorraden. Verdun de drugs met de oplossing carbogenated Ringer&#39;s. Pas hen in een ladingsgewijze manier door perfusie. </li><li> Na de opname, verwijder voorzichtig de pipet uit de soma. Breng de assemblage van de kamer naar een schone schotel. Los te maken en opnieuw te bevestigen het netvlies naar een andere afgeplat nitrocellulosemembraan zonder geperforeerd holes naar retina vlakheid te garanderen tijdens fixatie. </li><li> Bevestig de retina door onderdompeling in 4% paraformaldehyde gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het netvlies van het nitrocellulose membraan en spoel het uitgebreid met 1x PBS. Tonen de morfologie van de cellen opgenomen door O / N kleuring met kleurstof-geconjugeerd streptavidine verdund in 1x PBS met 0,4% Triton X-100 bij 4 ° C 14. Monteer de retina in antifade medium en observeer opgenomen cellen met behulp van een scanning confocale microscoop. OPMERKING: Procedures waarbij paraformaldehyde, dat is vluchtig en giftig, moeten worden uitgevoerd in een ontwerp-kamer voor de veiligheid. </li></ol>

<ol><li>Choi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+bursting+of+AII+amacrine+cells+underlies+oscillations+in+the+rd1+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Intrinsic bursting of AII amacrine cells underlies oscillations in the rd1 mouse retina.</a> J Neurophysiol. 112 (6), 1491-1504 (2014).</li>
<li>Gregg, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nyctalopin+expression+in+retinal+bipolar+cells+restores+visual+function+in+a+mouse+model+of+complete+X-linked+congenital+stationary+night+blindness%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Nyctalopin expression in retinal bipolar cells restores visual function in a mouse model of complete X-linked congenital stationary night blindness.</a> J Neurophysiol. 98 (5), 3023-3033 (2007).</li>
<li>Hellmer, C. B., Ichinose, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recording+light-evoked+postsynaptic+responses+in+neurons+in+dark-adapted%2C+mouse+retinal+slice+preparations+using+patch+clamp+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Recording light-evoked postsynaptic responses in neurons in dark-adapted, mouse retinal slice preparations using patch clamp techniques.</a> J Vis Exp. (96), (2015).</li>
<li>Tu, H. Y., Bang, A., McQuiston, A. R., Chiao, C. C., Chen, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+dendritic+branching+in+direction+selective+retinal+ganglion+cells+in+nob1+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Increased dendritic branching in direction selective retinal ganglion cells in nob1 mice.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (13), (2014).</li>
<li>Tu, H. Y., Chen, Y. J., Chiao, C. C., McQuiston, A. R., Chen, C. K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhythmic+membrane+potential+fluctuations+of+cholinergic+amacrine+cells+in+mice+lacking+ERG+b-waves%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Rhythmic membrane potential fluctuations of cholinergic amacrine cells in mice lacking ERG b-waves.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (7), (2015).</li>
<li>Demas, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Failure+to+maintain+eye-specific+segregation+in+nob%2C+a+mutant+with+abnormally+patterned+retinal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Failure to maintain eye-specific segregation in nob, a mutant with abnormally patterned retinal activity.</a> Neuron. 50 (2), 247-259 (2006).</li>
<li>Tu, H. Y., Chen, Y. J., McQuiston, A. R., Chiao, C. C., Chen, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Retinal+Oscillation+Mechanism+in+an+Autosomal+Dominant+Photoreceptor+Degeneration+Mouse+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A Novel Retinal Oscillation Mechanism in an Autosomal Dominant Photoreceptor Degeneration Mouse Model.</a> Front Cell Neurosci. 9, 513(2015).</li>
<li>Borowska, J., Trenholm, S., Awatramani, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intrinsic+neural+oscillator+in+the+degenerating+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">An intrinsic neural oscillator in the degenerating mouse retina.</a> J Neurosci. 31 (13), 5000-5012 (2011).</li>
<li>Margolis, D. J., Detwiler, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+origin+of+spontaneous+ganglion+cell+spike+activity+in+animal+models+of+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Cellular origin of spontaneous ganglion cell spike activity in animal models of retinitis pigmentosa.</a> J Ophthalmol. , (2011).</li>
<li>Stasheff, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+sustained+spontaneous+hyperactivity+and+temporary+preservation+of+OFF+responses+in+ganglion+cells+of+the+retinal+degeneration+%28rd1%29+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Emergence of sustained spontaneous hyperactivity and temporary preservation of OFF responses in ganglion cells of the retinal degeneration (rd1) mouse.</a> J Neurophysiol. 99 (3), 1408-1421 (2008).</li>
<li>Trenholm, S., Awatramani, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+of+spontaneous+activity+in+the+degenerating+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Origins of spontaneous activity in the degenerating retina.</a> Front Cell Neurosci. 9, 277(2015).</li>
<li>Trenholm, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+oscillatory+activity+arising+within+the+electrically+coupled+AII+amacrine-ON+cone+bipolar+cell+network+is+driven+by+voltage-gated+Na%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intrinsic oscillatory activity arising within the electrically coupled AII amacrine-ON cone bipolar cell network is driven by voltage-gated Na+ channels.</a> J Physiol. 590 (Pt 10), 2501-2517 (2012).</li>
<li>Chen, C. K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-autonomous+changes+in+displaced+cholinergic+amacrine+cells+lacking+Gbeta5%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Cell-autonomous changes in displaced cholinergic amacrine cells lacking Gbeta5.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (7), (2015).</li>
<li>O'Brien, B. J., Isayama, T., Richardson, R., Berson, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+physiological+properties+of+cat+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intrinsic physiological properties of cat retinal ganglion cells.</a> J Physiol. 538 (Pt 3), 787-802 (2002).</li>
<li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Unconventional+Glutamatergic+Circuit+in+the+Retina+Formed+by+vGluT3+Amacrine+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">An Unconventional Glutamatergic Circuit in the Retina Formed by vGluT3 Amacrine Cells.</a> Neuron. 84 (4), 708-715 (2014).</li>
<li>Hoggarth, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+wiring+of+distinct+amacrine+cells+in+the+directionally+selective+retinal+circuit+permits+independent+coding+of+direction+and+size%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Specific wiring of distinct amacrine cells in the directionally selective retinal circuit permits independent coding of direction and size.</a> Neuron. 86 (1), 276-291 (2015).</li>
<li>Margolis, D. J., Gartland, A. J., Singer, J. H., Detwiler, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+oscillations+drive+correlated+spiking+of+ON+and+OFF+ganglion+cells+in+the+rd1+mouse+model+of+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Network oscillations drive correlated spiking of ON and OFF ganglion cells in the rd1 mouse model of retinal degeneration.</a> PLoS One. 9 (1), e86253(2014).</li>
<li>Schmidt, T. M., Kofuji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+isolated+retinal+preparation+to+record+light+response+from+genetically+labeled+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">An isolated retinal preparation to record light response from genetically labeled retinal ganglion cells.</a> J Vis Exp. (47), (2011).</li>
<li>Ivanova, E., Yee, C. W., Sagdullaev, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+phosphorylation+of+Cx36+gap+junctions+in+the+AII+amacrine+cells+of+RD+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Increased phosphorylation of Cx36 gap junctions in the AII amacrine cells of RD retina.</a> Front Cell Neurosci. 9, 390(2015).</li>
<li>Enoki, R., Koizumi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+of+horizontally+sliced+preparation+of+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A method of horizontally sliced preparation of the retina.</a> Methods Mol Biol. 935, 201-205 (2013).</li>
<li>Akrouh, A., Kerschensteiner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+and+function+of+three+VIP-expressing+amacrine+cell+types+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Morphology and function of three VIP-expressing amacrine cell types in the mouse retina.</a> J Neurophysiol. 114 (4), 2431-2438 (2015).</li>
<li>Wei, W., Elstrott, J., Feller, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+targeted+recording+of+GFP-expressing+neurons+for+light+responses+and+live-cell+imaging+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Two-photon targeted recording of GFP-expressing neurons for light responses and live-cell imaging in the mouse retina.</a> Nat Protoc. 5 (7), 1347-1352 (2010).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Veel labs hebben opgenomen van GCL neuronen in de flat-mount voorbereiding 15-18, maar onze procedures maken het mogelijk opnemen van INL neuronen. Hierbij bieden wij benadrukken verschillende stappen die essentieel zijn voor een succesvolle routine opnamen. De frisheid en vlakheid van de retina zijn belangrijk voor het binnendringen met een opname pipet. In dit opzicht is de stevige bevestiging van het netvlies aan de geperforeerde nitrocellulosemembraan voorop en wordt bereikt d...

Als een gemakkelijk toegankelijk deel van het centrale zenuwstelsel, is het netvlies al decennia lang een nuttig model in neurowetenschappelijke studies. Genetische markering van neuronen heeft een gedetailleerde karakterisering van synaptische verbindingen in het netvlies mogelijk gemaakt. Met veel beschikbare methodologieën om functie en morfologie van retinale neuronen te onderzoeken, is de patch clamp-opnametechniek instrumenteel geweest in ons huidige begrip van verticaal overgedragen signalen in het netvlies. Deze signalen ontstaan door fotonabsorptie in fotoreceptoren en worden naar de visuele centra in de hersenen gestuurd via spiking van retinale ganglioncellen (RGC's). Ondanks een grote hoeveelheid kennis die tot dusver is verzameld, blijft de neurale diversiteit in gevasculariseerd zoogdiernetvlies onopgelost en belemmert het volledige begrip van retinale circuits die normaal zicht dienen. Dit komt deels omdat de meeste opnames werden uitgevoerd op retinale plakjes om laterale circuitintegriteit in te ruilen voor toegang tot meer proximale retinale neuronen1-3. Om een uitgebreid beeld te krijgen van hoe het netvlies visuele signalen verwerkt, is het wenselijk om neuronen in flat-mounts op te nemen waarin laterale verbindingen, groot en klein, beter kunnen worden bewaard.
Wanneer synaptische transmissie van fotoreceptoren naar bipolaire cellen wordt onderbroken door een defecte metabotropische glutamaatreceptor 6 (mGluR6) signaalroute in depolariserende bipolaire cellen4-6 of eenvoudigweg als gevolg van verlies van fotoreceptoren in gedegenereerde netvliezen7-10, vertonen veel RGC's oscillerende activiteiten. Deze oscillaties ontstaan uit meerdere bronnen, maar degene die gaap-junctiekoppeling tussen AII amacrine cellen (AII-AC's) en depolariserende kegeltjes bipolaire cellen (DCBC's) betreft, heeft de meeste aandacht gekregen en is daarom het best begrepen1,7,11. We hebben een andere bron gevonden, die aanhoudt onder farmacologische blokkade van het eerder genoemde AII-AC/DCBC netwerk en de oscillatie van OFF-type SAC's in RhoΔCTA en Nob muizen met deafferentatie van het netvlies7,8,12 aandrijft. Hier beschrijven we ons protocol voor het voorbereiden van retinale flat-mounts voor INL-neuronopname. Deze aanpak gebruikt commerciële muizenlijnen (Jax stocknr. 006410 en 007905) om cholinerge retinale neuronen te markeren door expressie van fluorescent eiwit (tdTomato) dat identificeerbaar is onder een fluorescente microscoop uitgerust met contrastversterkende optica. Sommige experimentele resultaten verkregen via deze aanpak zijn eerder gerapporteerd4,5,7,13.

<table><tbody><tr><td>Fixed-stage fluorescent microscope with DIC</td><td>Olympus</td><td>BX51-WI</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulators</td><td>Sutter</td><td>MP-225</td><td></td></tr><tr><td>Patch clamp amplifier</td><td>A-M System</td><td>AM2400</td><td></td></tr><tr><td>AD converter</td><td>National Instrument</td><td>NI-USB-6221</td><td></td></tr><tr><td>Heater controller</td><td>Warner Instrument</td><td>TC-324B</td><td></td></tr><tr><td>Inline heater</td><td>Warner Instrument</td><td>SC-20</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic pump</td><td>Rainin</td><td>Dynamax</td><td></td></tr><tr><td>pipette puller</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Glass tube with filament</td><td>King Precision Glass</td><td>Aangepast</td><td></td></tr><tr><td>Stimulator</td><td>A.M.P.I.</td><td>Master-8</td><td></td></tr><tr><td>Biocytin</td><td>Sigma</td><td>B4261</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S6191</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher</td><td>BP328-1</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S0876</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S5011</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M1880</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Sigma</td><td>G6152</td><td></td></tr><tr><td>K-gluconate</td><td>Sigma</td><td>G4500</td><td></td></tr><tr><td>ATP-Mg</td><td>Sigma</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>Li-GTP</td><td>Sigma</td><td>G5884</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E0396</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma</td><td>P5958</td><td></td></tr><tr><td>Cs-methanesulfonate</td><td>Sigma</td><td>C1426</td><td></td></tr><tr><td>CsOH</td><td>Sigma</td><td>232041</td><td></td></tr><tr><td>Syringe filter</td><td>Nalgene</td><td>171</td><td></td></tr><tr><td>1 ml syringe</td><td>Rainin</td><td>17013002</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu;l pipette tip</td><td>Genesee Scientific</td><td>24-130RL</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-488</td><td>ThermoFisher</td><td>S-11223</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Lonza</td><td>17-517Q</td><td></td></tr></tbody></table>

patch clamp registratie van starburst amacrine cellen in een flat-mount voorbereiding van deafferentated mouse retina

Patch Clamp Recording of Starburst Amacrine Cells in a Flat-mount Preparation of Deafferentated Mouse Retina

De zoogdierretina is een gelaagd weefsel bestaat uit meerdere neuronale types. Om te begrijpen hoe de visuele signalen binnen haar ingewikkelde synaptische netwerk worden verwerkt, zijn elektrofysiologische opnames vaak gebruikt om verbindingen tussen individuele neuronen te bestuderen. We hebben een flatscreen-mount voorbereiding voor patch clamp opname van genetisch gemarkeerde neuronen in zowel GCL (ganglion cellaag) en INL (innerlijke nucleaire layer) van de muis netvliezen geoptimaliseerd. Opnemen INL neuronen in flat-mounts wordt bevoordeeld ten opzichte van plakken omdat zowel de verticale en laterale verbindingen worden bewaard in het voormalige configuratie, waardoor het netvlies circuits met grote laterale componenten worden bestudeerd. We hebben deze procedure gebruikt om de reacties van de mirror-partnered neuronen in netvliezen te vergelijken, zoals de cholinerge starburst amacrine cellen (SBZ).

Representatieve opnamen van AAN- en UIT-type SAC een deafferentated muis netvlies weergegeven in figuur 1. Cholinerge cellen in zowel GCL en INL betrouwbaar kan worden geïdentificeerd door tdTomato fluorescentie en gericht voor whole-cell patch clamp opnamen bij DIC (Figuur 1A) om trilling van hun membraan potentials (boven de sporen) en de synaptische stromingen die het te drijven (onderste sporen, figuur 1B) te onthullen. Remmende en p...

Dit protocol laat zien hoe whole-cell patch clamp opname uit te voeren op het netvlies neuronen uit een flat-mount voorbereiding.

Patch Clamp Registratie van Starburst amacrine Cellen in een flat-mount voorbereiding van Deafferentated Mouse Retina

The mammalian retina is a layered tissue composed of multiple neuronal types. To understand how visual signals are processed within its intricate synaptic ...

Het algemene doel van deze procedure is het uitvoeren van whole-cell patch clamp registraties van neuronen in de binnenlaag van de retina in een flat-mount preparaat van de muisretina. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen de retina-neurobiologie, zoals de diversiteit van neuronen en hun synaptische verbindingen onder normale en pathologische omstandigheden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat zowel de verticale als de laterale verbindingen behouden blijven, waardoor retina-circuits met grote laterale componenten bestudeerd kunnen worden.Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite ondervinden, omdat het netvlies een dun, fragiel weefsel is dat met grote zorg en geduld moet worden behandeld. Oefening is echter de beste manier om dit onder de knie te krijgen. Om deze procedure te starten, rolt u de muizenoogbollen in een schoon papieren handdoekje om eventueel bloed te verwijderen.Dompel ze vervolgens onder in de met carbogeen verzadigde mammaliaanse Ringer-oplossing. Maak daarna met een naald van 23 gauge een gaatje in de limbus en halveer de oogbollen door langs de limbus te knippen met microscharen. Verwijder vervolgens het hoornvlies en de lens met een fijne pincet.Voor een retinal whole-mount wordt de gehele retina voorzichtig met fijne pincetten van het gepigmenteerde epitheel gepeld, waarna vier orthogonale sneden van 1,5 tot twee millimeter worden gemaakt vanaf de rand in richting van de kop van de oogzenuw. Dompel vervolgens een uitgestanste nitrocellulosemembraan in de schaal en trek de retina er voorzichtig overheen met de GCL-zijde naar boven. Plaats vervolgens de kop van de oogzenuw in het centergat bij het voorbereiden van een whole-mount retina.Breng vervolgens het membraan met de retina over naar een ander schoon schaaltje. Vlak de retina voorzichtig uit in de vorm van een Maltese kruis met een fijn schilderspenseel en leg alle vier de randen over de gaten. Dep het nitrocellulosemembraan droog met een stuk droog filterpapier en verwijder het glasachtig lichaam en het innerlijke limiterende membraan met een pincet en een schilderspenseel.Zorg ervoor dat alle randen van het netvlies volledig aan het membraan zijn gehecht voordat de assemblage wordt overgebracht naar de registratiekamer met een afgesloten glazen dekglas aan de onderzijde. Bevestig het membraan aan het dekglas met vacuümvet en rehydrateer het netvlies met de externe oplossing. Let erop dat er geen luchtbellen onder de assemblage worden ingesloten.Plaats vervolgens de kamer op de tafel van een rechtopstaande microscoop. Spoel de kamer door met externe oplossing met carbogeen bij 34 graden Celsius met een stroomsnelheid van ongeveer drie milliliter per minuut. Onderzoek de retina eerst onder een 10x objectief.Gebruik vervolgens een 60x waterimmersie-objectief om GCL- en INL-neuronen te bekijken onder DIC en de epifluorescente instelling. Om tdTomato-expresserende SAC's te visualiseren, gebruikt u een witte LED-lichtbron in combinatie met een excitatiefilter van 554 nanometers en een emissiefilter van 581 nanometers. Filter bij deze procedure de interne oplossing via een spuitfilter in de op maat gemaakte backfill-filament.Plaats vervolgens het filament in een vers getrokken micropipet en breng de interne oplossing aan nabij de tip, totdat de oplossing de zilverdraad-elektrode over een afstand van meer dan vijf millimeter bedekt. Bevestig daarna de micropipet aan een elektrodehouder met een zuigkoppeling, waardoor de druk in de elektrode kan worden geregeld door de zuiger van een aangesloten plastic spuit van 10 milliliter in of uit te duwen. Positioneer vervolgens de pipet onder het objectief en breng deze naar een hoogte van ongeveer 100 micrometer boven het netvlies.Gebruik bij de huidige follower-modus de DC-offset om het constante DC-voltage-signaal op nul te stellen. Meet de pipetweerstand in de current-clamp-modus door vierkantgolven met een vaste amplitude door de pipet te injecteren terwijl deze zich in het bad bevindt. Neutraliseer het verschil door aan de Raccess-knop te draaien en gebruik de waarde op deze knop om de pipetweerstand te berekenen.Breng de elektrode daarna langzaam tot ongeveer 10 micrometers boven het netvlies. Oefen positieve druk uit op de elektrode. Observeer vervolgens hoe de reflectie bij de pipetpunt verandert naarmate deze het netvlies nadert.Duw de pipet snel maar voorzichtig in de GCL en verminder onmiddellijk de positieve druk. Beweeg de pipet naar een gelabeld neuron en vermijd contact met andere neuronen, bloedvaten en eindvoetjes van Müllercellen. Oefen indien nodig meer positieve druk uit om verstopping van de elektrode te voorkomen.Positioneer vervolgens de pipetpunt dicht bij het gelabelde neuron totdat er een kuiltje zichtbaar is. Laat daarna de positieve druk los en zorg dat het plasmamembraan terugveert tegen de pipetpunt. Pas negatieve stromingen van 20 tot 120 picoamps toe op de pipet om de vorming van een gigaohm-seal te bevorderen.Het is belangrijk om het celmembraan terug te laten veren na het lossen van de positieve druk, omdat een uitstekende natuurlijke afdichting tussen het membraan en de pipetopening essentieel is om de celmorfologie na de opname te behouden. Pas indien nodig een lichte zuiging toe om het plasmamembraan in de pipet te trekken. Wacht vijf minuten na de vorming van de afdichting voordat het celmembraan wordt doorbroken, zodat de gemorste interne oplossing door superfusie kan worden afgevoerd.Nadat het membraan is doorgebroken en terwijl men zich in de current clamp-modus bevindt, wordt de bridge balance ingeschakeld en ingesteld met de Raccess-knop. Registreer de excitatoire en inhibitoire postsynaptische stromingen in de voltage clamp-modus door de cel op omkeerpotentialen vast te houden. Verwijder na de registratie voorzichtig de pipet uit het soma.Breng het preparaat over van de kamer naar een schone schaal. Detacheer vervolgens de retina en bevestig deze opnieuw op een ander vlak nitrocellulosemembraan zonder gaten te ponsen, om de vlakheid van de retina tijdens de fixatie te waarborgen. Het weefsel is nu klaar voor kleuring.Deze afbeeldingen tonen aan dat cholinerge cellen in zowel de GCL als de INL betrouwbaar kunnen worden geïdentificeerd via tdTomato-fluorescentie en kunnen worden getarget voor whole-cell patch clamp-registraties onder DIC. De oscillatie van hun membraanpotentialen kan worden aangetoond met current clamp-registratie, en de oscillatie gedreven door de inhiberende en exciterende synaptische stromen wordt onthuld door de cellen respectievelijk op nul millivolt en negatief 75 millivolt vast te houden onder voltage clamp-condities. Hier wijst de histologische karakterisering van de geregistreerde cellen na het experiment op de typische dendritische morfologie van SAC en de stratificatieniveaus in de IPL.Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de retina-membraanassemblage zorgvuldig en nauwkeurig in de registratiekamer moet worden vastgezet en gerehydrateerd zonder luchtbellen eronder op te sluiten, om een registreerbaar monster te verkrijgen. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals dual-patch clamp-registraties, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals of de oscillaties van de doelwit-meervoudige cellen door dezelfde synaptische mechanismen worden aangestuurd. Na de ontwikkeling effent deze techniek de weg voor onderzoekers in het veld van de retina-neurobiologie om de synchroniciteit van oscillaties tussen naburige retina-neuronen in retina's met fotoreceptor-degeneratie te onderzoeken.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u het glasachtig lichaam verwijdert en een retinal flat-mount voorbereidt voor gerichte grootschalige patchclamp-registratie van neuronen in de binnenste retina.

patch-clamp-recording-starburst-amacrine-cells-flat-mount-preparation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Hier beschrijven we een procedure voor het genereren van donker aangepaste plakjes van de muis netvlies voor elektrofysiologische opnames.

Patch Clamp Opnamen van Mouse Retinal Neuronen in een donker aangepaste Slice Voorbereiding

Dit artikel geeft een beschrijving van hoe te ontleden en op te nemen van de geïsoleerde netvlies voorbereiding in de muis. In het bijzonder beschrijven we hoe de reacties aan het licht opnemen van een fluorescent gelabelde ganglion cel populatie en vervolgens te identificeren en analyseren van de morfologie.

Een geïsoleerde Retinale Voorbereiding op Light Response Opnemen van genetisch Labeled retinale ganglioncellen

We beschrijven een relatief eenvoudige methode van transretinal electroretinogram (ERG) opnamen voor het verkrijgen van staafjes en kegeltjes photoresponses uit intacte muis netvlies. Deze aanpak maakt gebruik van het blok van synaptische transmissie van fotoreceptoren hun lichte reacties te isoleren en hen te registreren met behulp van elektroden veld geplaatst over de geïsoleerde platte gemonteerde netvlies.

Transretinal ERG Opnames van Mouse Retina: staafjes en kegeltjes Photoresponses

Dit artikel geeft de registratie van de individuele cellen van fluorescent gelabelde neuronale populaties in het intacte muis netvlies. Door het gebruik van twee-foton excitatie infrarood transgenetically gelabelde cellen waren gericht voor patch-clamp opnamen om hun licht te antwoorden, receptieve veld eigenschappen, en morfologie studie.

Elektrofysiologische karakterisatie van GFP-uitdrukken celpopulaties in de Intact Retina

This video demonstrates a whole-cell patch-clamp technique for electrophysiological recording from a flat-mount mouse retina. A thin glass pipette with an electrode is used to approach starburst amacrine cells (SACs) within the retina. After forming a seal, suction is applied to rupture the membrane and form the whole-cell patch-clamp configuration. Finally, the flow of ions through the SAC synaptic receptors is measured using the configuration.

Establishing a Whole-Cell Patch Clamp for Electrophysiological Recording from a Flat-Mount Mouse Retina

This video demonstrates the recording of light-evoked post-synaptic responses in a dark-adapted mouse retinal tissue slice preparation. The retinal slice is placed in a recording chamber, and a recording pipette is used to establish electrical continuity with a retinal ganglion cell. Light pulses are applied to generate excitatory post-synaptic potentials in the ganglion cells, which are recorded by the pipette.

Light-Evoked Postsynaptic Responses in Neurons of Mouse Retinal Slices

Deze video artikel illustreert de set-up, de procedures te cellichamen patchen en hoe u dynamische clamp opnames implementeren van ganglioncellen in zijn geheel-mount muis retinae. Deze techniek maakt het onderzoek de exacte rol prikkelende en remmende synaptische inputs, en hun relatieve omvang en timing neuronale spiking.

Uitvoering Dynamic Klem met Synaptic en kunstmatige geleidingen Mouse in retinale ganglioncellen

We zullen demonstreren hoe retinale plakjes van het muizenoog worden bereid en lichtreacties in retinale neuronen worden opgenomen. De hele procedure wordt uitgevoerd in donker-aangepaste omstandigheden.

Opname Light-evoked Postsynaptische Reacties in Neuronen in Dark-aangepaste, Mouse retinale Slice Voorbereidingen Gebruik Patch Clamp technieken

We beschrijven een protocol om Ca 2+ dynamiek in de axon terminals van de kegel fotoreceptoren met behulp van een ex-vivo slice voorbereiding van de muis netvlies controleren. Dit protocol maakt uitgebreide studies van de kegel Ca 2+ signalering in een belangrijke zoogdieren modelsysteem, de muis.

Imaging Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dynamiek in Cone fotoreceptorcellen Axon Terminals van de Mouse Retina

We ontwikkelden een horizontale slice voorbereiding van de zoogdierretina volwassene met het vlak van snijden parallel aan het netvliesoppervlak. Dendritische gebied van nonradially georiënteerde retinale neuronen werden niet afgekapt, waardoor de studie van de signaalverwerking met patch-klem en beeldvormende technieken.

Voorbereiding van de Horizontale Schijfjes van Adult Mouse Retina voor elektrofysiologisch onderzoek

Dit werk presenteert een alternatief flatmount retina-preparaat waarbij de verwijdering van fotoreceptorcellichamen een snellere verspreiding van antilichamen en verbeterde patchpipettoegang tot binnenste retinale neuronen mogelijk maakt voor immunohistochemie, in situ hybridisatie en elektrofysiologische experimenten.

Split Retina als een verbeterde flatmount-voorbereiding voor het bestuderen van neuronen in de binnenste nucleaire laag in het netvlies van gewervelde dieren

Leer whole-cell patch clamp registratie van binnenste retinale neuronen in een flat-mount muizenretina. Deze methode behoudt verticale en laterale verbindingen voor onderzoek naar neuronale diversiteit en synaptische circuits.

Patch Clamp Registratie van Starburst amacrine Cellen in een flat-mount voorbereiding van Deafferentated Mouse Retina

Meer video's verkennen