Name: Rapid Overname van 3D-beelden met behulp van hoge-resolutie episcopische Microscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Leer hoe je hoge-resolutie 3D-beelden van muizenembryo's maakt met episcopische microscopie. Deze methode maakt gedetailleerde morfometrische analyse van embryonale ontwikkeling mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken Drs. Yichen Huang, Chunming Guo en Zhenfang Zhou voor hun technische ondersteuning. Dit onderzoek werd gefinancierd door NIH/NIDDK (1R01DK091645-01A1, XL) en American Heart Association (AHA, 13GRNT16950006, XL).

Alle dieren gebruik worden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite aan de Boston Children&#39;s Hospital. 1. Monstervoorbereiding <ol><li> Timed paring <ol><li> Plaats een C57Bl6 wild type man en een vrouw samen in dezelfde kooi. </li><li> Controleer voor de vorming van een paring stekker begin volgende ochtend. De paring stekker (aka, vaginaal of copulatie stekker) is een geharde gelatine-achtige afzetting dat blokkeert de vagina. </li><li> Stel de stekker datum als embryonale dag 0,5 (e0.5). </li></ol></li><li> Isolatie van muizenembryo&#39;s <ol><li> Euthanaseren zwangere vrouwtjes door CO 2 stikken. </li><li> Zet muizen liggende op een absorberend kussen en spuit buikstreek met 70% ethanol. </li><li> Til de huid en maakt een eerste 5 mm incisie in het caudale buikstreek met behulp van chirurgische schaar. Snijd en verwijder de buikhuid om de interne organen volledig bloot </li><li> Snijd de buurt vagina om de gehele baarmoeder verwijderen. </li><li> Knip tussen implantatie bezienswaardigheden langs de baarmoeder hoorn. Elk segment of conceptus zou slechts één embryo binnen te hebben. </li><li> Houd de baarmoeder segmenten 1x ijskoude fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). </li></ol></li><li> embryo dissectie <ol><li> Plaats elke conceptie in een aparte schaal met ijskoud PBS onder een stereoscoop. </li><li> Verwijder de baarmoeder weefsels, placenta en vruchtvliezen sequentieel met behulp van fijne ontleden tang. </li><li> Breng de ontleed embryo naar een 50 ml buis met 1x ijskoud PBS met een grote overdracht pipet. Vermijd het oppakken van embryo rechtstreeks met een tang om weefselschade te minimaliseren. </li></ol></li><li> bevestiging <ol><li> Bevestig de embryo ontleed in 10% neutraal gebufferde formaline oplossing bij 4 ° C gedurende meer dan 24 uur met ten minste 10 monstervolumes fixatief. </li></ol></li><li> voorbehandeling <ol><li> Bereid de Clearing Oplossing: 4M ureum, 10% glycerol, 4% natriumdodecylsulfaat (SDS) in dubbel gedestilleerd water. </li><li> Vervang het fixeermiddel met de Clearing Solution. </li><li> Voorzichtig zwenken het monster op een rocker bij kamertemperatuur gedurende 1-2 weken. Ruil de Clearing Solution eenmaal op de tweede en de derde dag. Het monster wordt langzaam helder en doorzichtig. </li><li> Vervang de Clearing Solution met 10% formaline en laat op een rocker voor 2 dagen. </li></ol></li><li> uitdroging <ol><li> Was de voorbehandelde monsters met 1x PBS 3 maal gedurende 5 minuten elk. </li><li> Dehydrateren monsters in een oplopende reeks ethanol bij kamertemperatuur op een zachte rocker. Voor E15.5 embryo Gebruik een oplopende ethanolreeks zoals 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% en 100% ethanol, 2 uur elke stap. Voor oudere embryo&#39;s, de incubatietijd te worden verhoogd. </li></ol></li><li> kleuring <ol><li> Bereid kleuring Oplossing: voeg 0,1375 gram Eosine Y Disodium Salt en 0,0275 gram Acridineoranje hemi (zinkchloride) zout aan 50 ml 100% ethanol. Roer gedurende 2 uur. Filter met een papieren filter. Bewaar bij kamertemperatuur en licht te vermijden door het bedekken met aluminiumfolie. </li><li> Transfer monster tot het kleuroplossing gedurende 1 uur. </li><li> Vervang met verse kleuroplossing en vlek &#39;s nachts. </li></ol></li><li> infiltratie <ol><li> Bereid Infiltratie Oplossing: combineer 100 ml van oplossing A van JB-4 inbedding kit, 1,25 g katalysator C, 0,275 g eosine Y dinatriumzout en 0,055 g Acridineoranje hemi (zinkchloride) zout. Roer te mengen (200 rpm) in een ijsemmer gedurende 2 uur, en vervolgens filteren met de filter papier. </li><li> Bewaar de Infiltration oplossing bij 4 ° C en licht te vermijden door het bedekken met aluminiumfolie. </li><li> Breng de embryo infiltratie oplossing: kleuroplossing (1: 1), en incuberen gedurende ten minste 3 uur op een rocker bij 4 ° C. </li><li> Breng de embryo&#39;s infiltratie oplossing en incubeer gedurende 3 uurr op een rocker in een koude kamer. </li><li> Vervang Infiltratie oplossing eenmaal per dag, en laat in een koude kamer op een zachte rocker nog drie dagen. </li></ol></li></ol> 2. Embedding <ol><li> Houd Oplossing B en Infiltration Solution op ijs. </li><li> Maak Embedding Solution (1:25 van de oplossing B en Infiltration Solution) onmiddellijk voor het inbedden. </li><li> Orient het model in een inbedding mal en giet koud Embedding Oplossing in de inbedding mal voorzichtig. Re-oriënteren met een pin als dat nodig is. </li><li> Gebruik een pen om te onderzoeken of de Embedding Solution is gestold. Duw het monster blok, en trim deze indien nodig. </li><li> Heroriënteren het monster blok met de aparte vorm van een kruis oriëntatie te verkrijgen. </li><li> Liep blokhouder bovenop de matrijs insluiten. Giet Embedding Oplossing in de mal totdat de schimmel en het blok houder worden overspoeld door insluiten Solution. </li><li> Houd het monster in een secundaire container en laat hetop ijs gedurende 3-4 uur in een zuurkast. </li><li> Bewaar de gestolde monsters in een 4 ° C. </li><li> Afpellen de inbedding mal. Zet het blok onder de stereomicroscoop met schuine verlichting om de positie van het model in het blok te inspecteren. Op het blok gezicht, mark rasterlijnen rond het monster. </li><li> Trim het blok om de toegang hoeveelheid te verwijderen van het inbedden van materiaal met behulp van de gemarkeerde rasterlijnen als gevonden. </li></ol> 3. Image Acquisition <ol><li> Klem het monster blok aan het microtoom en het verkrijgen van een vers gesneden oppervlak. Stel coupedikte (bv e9.5-10.5, 1,5 micrometer, e11.5-12.5, 2,0 micrometer, e13.5-15.5, 2,5 micrometer, E16.5-ouder, 3 pm). Houd het monster / blok aan de uitgangspositie van de microtoom. </li><li> Monteer de stereo zoom microscoop horizontaal tegenover het blok oppervlak van het monster. </li><li> Zet de computer en de microscoop, en beginnen met het beeld acquisitie software. </li><li> Visualiseren en de focus van de optiek om het blok-faceonder de &quot;live view&quot; -modus van imaging software. </li><li> Lijn microscoop en microtoom indien nodig opdat het blok-face is in het centrum van zoeker. </li><li> Stel de zoom in zodat het hele blok-gezicht is in de zoeker. </li><li> Kies groen fluorescerend eiwit (GFP) filter (excitatie 470 ± 20 nm, dichroic 495 nm, emissie 525 ± 25 nm) en te heroriënteren indien nodig. </li><li> Meet en stel de belichtingstijd handmatig (bijvoorbeeld, 80-400 mini sec). </li><li> Acquire beelden van het blok-face na elke vers gesneden en afbeeldingen automatisch op te slaan, indien mogelijk. </li><li> Record belangrijke parameters zoals resolutie, coupedikte en zoom. </li><li> Na het afronden van het gehele monster, export en converteren van alle beeldbestanden naar JPEG-formaat indien nodig. </li><li> Omkeren alle originele beelden met behulp van een imaging processing software, en de helderheid en het contrast aan te passen. </li><li> Bewaar alle bewerkte beelden in een aparte map. </li></ol> 4. 3Dvisualisatie <ol><li> Upload alle bewerkte beelden naar een 3D-visualisatie software volgens de instructies. </li><li> Input-resolutie en coupedikte om alle beelden te volumetrische gegevens (dwz, voxel grootte) converteren en opslaan van de 3D-bestand. </li><li> Lijn alle foto&#39;s met behulp van de automatische modus. Stel afzonderlijke beelden handmatig indien nodig. </li><li> Sla de uitgelijnde afbeelding voor een nieuwe bestandsnaam. </li><li> Analyseer morfometrische kenmerken van het model met behulp van de 3D-visualisatie software. </li></ol>

<ol><li>Gregg, C. L., Butcher, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+in+vivo+imaging+of+embryonic+development%3A+opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Quantitative in vivo imaging of embryonic development: opportunities and challenges.</a> Differentiation. 84, 149-162 (2012).</li>
<li>Liu, X., Tobita, K., Francis, R. J., Lo, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+techniques+for+visualizing+and+phenotyping+congenital+heart+defects+in+murine+models%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+defects+Res+C%22%5BJournal%5D)">Imaging techniques for visualizing and phenotyping congenital heart defects in murine models.</a> Birth defects Res C. 99, 93-105 (2013).</li>
<li>Norris, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+coming+of+age%3A+advanced+imaging+technologies+for+characterising+the+developing+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">A coming of age: advanced imaging technologies for characterising the developing mouse.</a> Trends Genet. 29, 700-711 (2013).</li>
<li>Weninger, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotyping+structural+abnormalities+in+mouse+embryos+using+high-resolution+episcopic+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+model+mech%22%5BJournal%5D)">Phenotyping structural abnormalities in mouse embryos using high-resolution episcopic microscopy.</a> Dis model mech. 7, 1143-1152 (2014).</li>
<li>Mohun, T. J., Weninger, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Episcopic+three-dimensional+imaging+of+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+protoc%22%5BJournal%5D)">Episcopic three-dimensional imaging of embryos.</a> Cold Spring Harb protoc. , 641-646 (2012).</li>
<li>Sizarov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+and+molecular+analysis+of+the+arterial+pole+of+the+developing+human+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anat%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional and molecular analysis of the arterial pole of the developing human heart.</a> J Anat. 220, 336-349 (2012).</li>
<li>Anderson, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+and+abnormal+development+of+the+intrapericardial+arterial+trunks+in+humans+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Normal and abnormal development of the intrapericardial arterial trunks in humans and mice.</a> Cardiovasc Res. 95, 108-115 (2012).</li>
<li>Huang, Y. C., Chen, F., Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clarification+of+mammalian+cloacal+morphogenesis+using+high-resolution+episcopic+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Clarification of mammalian cloacal morphogenesis using high-resolution episcopic microscopy.</a> Dev Biol. 409, 106-113 (2016).</li>
<li>Mohun, T. J., Weninger, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embedding+embryos+for+episcopic+fluorescence+image+capturing+%28EFIC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+protoc%22%5BJournal%5D)">Embedding embryos for episcopic fluorescence image capturing (EFIC).</a> Cold Spring Harb protoc. , 675-677 (2012).</li>
<li>Weninger, W. J., Mohun, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+analysis+of+molecular+signals+with+episcopic+imaging+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+mol+biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional analysis of molecular signals with episcopic imaging techniques.</a> Methods mol biol. 411, 35-46 (2007).</li>
<li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clarifying+Tissue+Clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162, 246-257 (2015).</li>
<li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scale%3A+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157, 726-739 (2014).</li>
<li>Mohun, T. J., Weninger, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+volume+data+by+episcopic+three-dimensional+imaging+of+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of volume data by episcopic three-dimensional imaging of embryos.</a> Cold Spring Harb protoc. , 681-682 (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier presenteren we een gemodificeerd protocol gebruikt routine laboratoriumapparatuur serial HREM op die compatibel zijn voor een snelle 3D visualisatie en morfometrische analyse van complexe structuren te verkrijgen. Omdat de beelden met hoge resolutie direct uit het blok gezicht in plaats van afzonderlijke secties worden genomen, worden de fijne morfologische kenmerken bewaard gebleven en snel digitaal gereconstrueerd in een 3D-visualisatie programma. 3D beeldvorming biedt belangrijke voo...

Het ontstaan van 3D-beeldvormingstechnologieën heeft de mogelijkheid geopend voor systemische analyse van gedetailleerde morfologische kenmerken tijdens de ontwikkeling van de foetus. Er is nu een verscheidenheid aan 3D-beeldvormingsmodaliteiten beschikbaar, waaronder micro-magnetische resonantiebeeldvorming (micro-MRI), micro-computertomografie, hoogfrequente echografie, optische coherentietomografie, optische projectietomografie en episcopische microscopie1-4. Elke modaliteit heeft zijn eigen unieke kenmerken in resolutie, contrast, snelheid, kosten, in utero mogelijkheid en beschikbaarheid.
Episcopische fluorescentiebeeldopname (EFIC) en hoog-resolutie episcopische microscopie (HREM) zijn episcopische microscopie beeldvormingsmethoden4. Hier worden hoog-resolutie seriële beelden continu vastgelegd vanaf het blokoppervlak in plaats van weefselsecties. De resulterende beelden weerspiegelen getrouw gedetailleerde morfologische kenmerken met minimale of geen weefselvervorming. De verkregen volumetrische gegevens worden gemakkelijk omgezet in hoog-resolutie 3D-beelden die geschikt zijn voor nauwkeurige morfometrische analyse. Vanwege de relatief lage kosten en hoge resolutie, zijn HREM en EPIC de superieure alternatieven geworden voor systemische beoordeling van muismodellen van menselijke geboorteafwijkingen2,4-8.
Zowel EFIC- als HREM-methoden vereisen dat monsters worden ingebed in het geschikte medium. EFIC detecteert autofluorescentie die wordt uitgezonden door het ingebedde weefsel. Hierdoor is het beperkt tot monsters die hoge niveaus van autofluorescentie uitstoten, maar niet tot die met relatief zwakke autofluorescentie zoals embryo's in een vroeg stadium9. Om de afhankelijkheid van autofluorescentie te overwinnen, worden monsters gekleurd met een fluorescerende kleurstof zoals eosine voor HREM-beeldvorming. De keuze van kleurstoffen en kleurmethoden maakt HREM ook geschikter om moleculaire signalen te detecteren in de context van weefselarchitectuur en morfologie4,10.
In dit artikel presenteren we een verbeterd HREM-protocol dat geschikt is voor volledige beoordeling van muis-embryo's in een later stadium. Om de kleuring te vergemakkelijken, voegen we een voorbehandelingsstap toe om de weefselpenetratie te verhogen, waardoor HREM-beeldvorming van oudere muis-embryo's mogelijk wordt.

<table><tbody><tr><td>Muizen</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>C57BL6</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl Alcohol</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>111000200</td><td>200 Proof, Absolute, ACS/USP/Kosher Grade</td></tr><tr><td>Formalin</td><td>Sigma</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma</td><td>U5128</td><td>Clearing Solution</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher scientific</td><td>G33-4</td><td>Clearing Solution</td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate</td><td>Invitrogen</td><td>15525-017</td><td>Clearing Solution</td></tr><tr><td>Eosin Y Disodium Salt</td><td>Fisher scientific</td><td>BP241925</td><td>Infiltration Solution</td></tr><tr><td>Acridine Orange hemi (zinc chloride) salt</td><td>Sigma</td><td>A6014</td><td>Infiltration Solution</td></tr><tr><td>Whatman papier</td><td>GE</td><td>3030-153</td><td></td></tr><tr><td>JB-4 Inbedding Kit - Solution A</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>0226A-800</td><td>Infiltration Solution</td></tr><tr><td>JB-4 Inbedding Kit - Solution B</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>0226B-30</td><td>Embedding Solution</td></tr><tr><td>JB-4&nbsp;Inbedding Kit - Catalyst</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>02618-12</td><td>Infiltration Solution</td></tr><tr><td>Inbedding Molds</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>23185-1</td><td>16 x 8 mm</td></tr><tr><td>Peel-A-Way Sharp Embedding Molds</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>18986-1</td><td>22 mm x 22 mm vierkant, afgesneden tot 12 mm x 12 mm</td></tr><tr><td>JB-4&nbsp;Plastic Block Holders</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>15899</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Graduated Transfer Pipes</td><td>VWR</td><td>414004-014</td><td></td></tr><tr><td>Petrl Dish</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td>Embryo dissectie</td></tr><tr><td>Forceps Inox Tip</td><td>&nbsp;ROBOZ</td><td>RS-5015</td><td>Embryo dissectie</td></tr><tr><td>Graefe Tissue Forcep</td><td>&nbsp;ROBOZ</td><td>RS-5153</td><td>Embryo dissectie</td></tr><tr><td>Delicate Operating Scissor</td><td>&nbsp;ROBOZ</td><td>RS-6700</td><td>Embryo dissectie</td></tr><tr><td>14 ml Polypropylene Round-Bottom Tubes</td><td>Falcon</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Polypropylene Conical Tubes</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Ice Bucket</td><td>Magic Touch Iceware International Corp.</td><td>R19-343</td><td></td></tr><tr><td>100 ml (3.4 oz.) Antistatic Polystyrene Weigh Boats</td><td>VWR</td><td>89106-766</td><td></td></tr><tr><td>330 ml (11.2 oz.) Antistatic Polystyrene Weigh Boats</td><td>VWR</td><td>89106-770</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>MP Biomedicals</td><td>102892</td><td>PBS Solution</td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Sigma</td><td>P0662</td><td>PBS Solution</td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td>PBS Solution</td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic heptahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9390</td><td>PBS Solution</td></tr><tr><td>Digital Camera</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>C11440-10C</td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica</td><td>RM2265</td><td></td></tr><tr><td>Illuminator</td><td>Carl Zeiss</td><td>HXP 200C</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence Stereo Zoom Microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td>Axio Zoom.V16</td><td></td></tr><tr><td>Stereo Microscope</td><td>Olympus</td><td>SZX16</td><td></td></tr><tr><td>Fiber Optic Light Source</td><td>Leica</td><td>KL 1500 LCD</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Microtome Blade</td><td>VWR</td><td>95057-832</td><td></td></tr><tr><td>Single Edge Dispenser</td><td>Personna</td><td>62-0330-0000</td><td></td></tr><tr><td>ZEN</td><td>Carl Zeiss</td><td>pro 2012</td><td></td></tr><tr><td>Photoshop</td><td>Adobe</td><td>CS6 v13.0</td><td></td></tr><tr><td>Amira 3D Software</td><td>Visage Imaging</td><td>5.4</td><td></td></tr><tr><td>Computer</td><td>Dell T7600, 2x900GB SAS hard drive en 64 GB DDR3 RDIMM geheugen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rocking Platform Shakers</td><td>VWR</td><td>40000-304</td><td></td></tr><tr><td>Standard Hot Plate Stirrer</td><td>VWR</td><td>12365-382</td><td></td></tr><tr><td>Analytical Balance</td><td>Mettler Toledo</td><td>AB54-S</td><td></td></tr></tbody></table>

rapid overname van 3d-beelden met behulp van hoge-resolutie episcopische microscopie

Rapid Acquisition of 3D Images Using High-resolution Episcopic Microscopy

High-resolution episcopische microscopische (HREM) technologie maakt een snelle verwerving van hoogwaardige digitale volumetrische en driedimensionale (3D) morfometrische gegevens mogelijk. Hier beschrijven we het gedetailleerde protocol om de volledige muisembryo te beeldhouwen. Het protocol bestaat uit vier hoofdgedeelten: monstervoorbereiding, inbedding, beeldverwerving en ten slotte 3D-visualisatie. De technologie vereist dat monsters worden gekleurd met een fluorescerende kleurstof, wat problematisch kan zijn voor grote of dichte monsters. Om deze beperking te overwinnen, hebben we het bestaande protocol verbeterd om de penetratie van de kleurstof in het weefsel te verbeteren door het monster voor te behandelen met een oplossing die ureum en natriumdodecylsulfaat bevat. Het protocol gebruikt alleen routinelaboratoriumapparatuur en reagentia voor eenvoudige aanpassing in standaardlaboratoriumomgevingen. We laten zien dat de resulterende hoogwaardige 3D-beelden de gedetailleerde morfologische kenmerken van de inwendige organen van muisembryo's getrouw nabootsen, waardoor morfometrische analyses mogelijk worden. Samen presenteren we een gedetailleerd en verbeterd protocol dat standaard laboratoriumapparatuur gebruikt om hoogwaardige 3D-beelden van kleine en grote monsters te verkrijgen.

We hebben hoge kwaliteit HREM beelden van muizenembryo&#39;s tussen E9.5 en E13.5 8 gerapporteerd. Beeldkwaliteit van de late gefaseerde embryo echter aanzienlijk aangetast door de beperkte penetratie van de fluorescente kleurstof eosine. Om de kleuring efficiëntie te verhogen, hebben we verschillende voorbehandeling methoden die compatibel zijn met fluorescerende beeldvorming 11 zijn getest. In het bijzonder werden de E15.5 muis embryo&#39;s behandeld met SCA / e A...

We beschrijven een gedetailleerd protocol met behulp van hoog-resolutie episcopische microscopie om driedimensionale (3D) beelden van muis-embryo's te verkrijgen. Dit verbeterde protocol maakt gebruik van een gemodificeerde weefselvoorbereidingsmethode om de penetratie van de fluorescente kleurstof te verbeteren, waardoor morfometrische analyse van zowel kleine als grote specimen mogelijk wordt gemaakt.

Rapid Overname van 3D-beelden met behulp van hoge-resolutie episcopische Microscopie

High-resolution episcopic microscopic (HREM) technology enables rapid acquisition of high-resolution digital volumetric and three-dimensional (3D) ...

Het algemene doel van dit protocol is om snel digitale 3D-beelden met een hoge resolutie van biologische monsters te verkrijgen met behulp van standaard laboratoriumapparatuur. Deze methode kan cruciale vragen in het veld van de ontwikkelingsbiologie beantwoorden door de visualisatie en dynamiek van complexe morfologische kenmerken. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat er standaard laboratoriumapparatuur wordt gebruikt en dat er minimale voorafgaande ervaring vereist is.De procedure zal worden gedemonstreerd door Jungang Huang, een promovendus uit mijn laboratorium. Vervang na dissectie en fixatie van het embryo, zoals beschreven in het tekstprotocol, het fixatief door een opklaaringsoplossing en roteer het preparaat voorzichtig op een schudplateau bij kamertemperatuur gedurende één tot twee weken. Breng het preparaat aan het einde van de incubatie over naar 10% formaline en laat dit nog twee dagen op het schudplateau staan.Was op de derde dag het monster drie keer gedurende vijf minuten in PBS. Dehydrateer de monsters vervolgens in een oplopende ethanolreeks bij kamertemperatuur, op een zachte rocker gedurende twee uur per concentratie. Na de dehydratie met 100% ethanol wordt het preparaat gedurende één uur overgebracht naar de kleuringsoplossing, beschermd tegen licht.Vervang vervolgens de oplossing door verse kleuringsvloeistof voor de overnachtelijke labeling van het preparaat. Dompel het monster de volgende ochtend gedurende ten minste drie uur in een mengsel van vers bereide infiltratie- en kleuringsvloeistoffen in een volumeverhouding van één op één, op een rocker bij vier graden Celsius. Na afloop van de incubatie wordt het embryo overgebracht naar infiltratievloeistof voor een verdere incubatie van drie uur op de rocker.Vervang vervolgens het supernatant door verse infiltratieoplossing voor nog drie dagen schudden bij vier graden Celsius. Orienteer op de vierde dag het embryo in een inbeddingsvorm en plaats de vorm op ijs. Meng oplossing B met de infiltratieoplossing en dompel de vorm vervolgens voorzichtig onder in koude inbeddingsoplossing bij vier graden Celsius.Gebruik na ongeveer drie uur een pipetpunt om te bevestigen dat de oplossing is gestold en duw het specimen uit de mal. Trim eventueel overtollig inbeddingsmateriaal en heroriënteer het specimenblok vervolgens in een nieuwe mal in een kruislingse oriëntatie. Plaats daarna de gehele opstelling op ijs in een zuurkast.Voeg voorzichtig inbeddingsvloeistof toe aan de nieuwe mal totdat de mal ondergedompeld is. Plaats vervolgens een blokhouder bovenop de mal. Pel na drie tot vier uur de inbeddingsmal eraf en plaats het blok onder een stereomicroscoop met schuine belichting om de positie van het specimen binnen het blok te bepalen.Trek op het blokoppervlak rasterlijnen rond het monster en gebruik deze lijnen als leidraad voor het trimmen van overtollig inbeddingsmateriaal. Om het monster te filmen, klem dan eerst het blok in een microtoom en maak een nieuwe snede van het oppervlak van het monster. Plaats vervolgens een stereozoommicroscoop horizontaal tegenover het blokoppervlak van het monster en schakel de microscoop en de bijbehorende computer in.Start vervolgens de software voor beeldacquisitie en gebruik de live-viewmodus in de beeldgevingssoftware om de optiek op het blokoppervlak te focussen. Lijn de microscoop en het microtoom naar behoefte uit, zodat het blokoppervlak zich in het midden van het vizier bevindt. Een van de meest kritische stappen van deze procedure is het maken van beelden bij de vaste beginpositie van het microtoom.Pas de zoom aan om er zeker van te zijn dat het gehele blokoppervlak zich binnen het vizier bevindt. Selecteer vervolgens het filter voor groen fluorescent proteïne. Ga over tot het voorsnijden van het blok totdat het weefsel van het specimen zichtbaar is, en stel de scherpte van het beeld indien nodig opnieuw in.Nadat de belichtingstijd handmatig is gemeten en ingesteld, worden er na elke nieuwe snede afbeeldingen van het blokoppervlak vastgelegd en opgeslagen, waarbij de belangrijkste parameters voor beeldacquisitie worden genoteerd. Aan het einde van de imagingsessie worden alle afbeeldingsbestanden geëxporteerd en geconverteerd naar het JPEG-formaat. Gebruik vervolgens de geschikte software voor beeldverwerking om alle originele afbeeldingen te inverteren en pas indien nodig de helderheid en het contrast van de afbeeldingen aan. Upload alle bewerkte afbeeldingen naar een 3D-visualisatiesoftware, volgens de instructies.Lijn alle afbeeldingen uit met behulp van de automatische modus en toon de 3D- en 2D-resultaten. In deze representatieve afbeelding van een whole-mount oppervlaktebeeld van een muizenembryo van embryonale dag 15.5, geprepareerd en gefotografeerd zoals zojuist gedemonstreerd, kunnen de gedetailleerde morfologische kenmerken van de huid, waaronder de snorharenkussens en ontwikkelende haarzakjes, worden waargenomen.Belangrijk is dat de resolutie van het virtuele doorsnedevisualisatie van een specimen van embryonale dag 15,5 dat met deze methode is afgebeeld, vergelijkbaar is met een standaard histologische doorsnede. Zodra men de procedure beheerst, kan het gehele proces na de voorbehandeling met de clearing-oplossing in één week worden voltooid, mits dit correct wordt uitgevoerd. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om eraan te denken de kleuringsoplossing tijdens de infiltratie- en inbeddingsstappen bij vier graden en beschermd tegen licht te bewaren.Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals schaalvergroting-kleuring, worden uitgevoerd om aanvullende vragen over de specifieke distributiepatronen van celtypen te beantwoorden. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe laboratoriumapparatuur wordt gebruikt om beelden met een hoge resolutie in 3D van biologische preparaten te verkrijgen voor hun morfometrische analyse. Vergeet niet dat werken met fixatie-, kleur- en infiltratiesoluties uiterst gevaarlijk kan zijn, en dat voorzorgsmaatregelen, zoals het werken in een zuurkast en het dragen van handschoenen, altijd moeten worden getroffen tijdens het uitvoeren van deze procedure.

rapid-acquisition-3d-images-using-high-resolution-episcopic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Niet-destructieve volume visualisatie kan alleen worden bereikt door tomografische technieken, waarvan de meest efficiënte is de x-stralen micro gecomputeriseerde tomografie (CT).

Hoge resolutie 3D-beeldvorming van Ex-Vivo Biologische monsters door Micro CT

Autofagie is een alomtegenwoordige proces waarmee cellen om eiwitten en organellen degraderen en te recyclen. We passen geavanceerde fluorescentie microscopie te visualiseren en kwantificeren van de kleine, maar essentiële, fysieke veranderingen geassocieerd met de inductie van autofagie, waaronder de vorming en verspreiding van autofagosomen en lysosomen, en hun fusie in autolysosomes.

Kwantitatieve analyse van Autophagy met Advanced 3D Fluorescentiemicroscopie

Spatiotemporele informatie over dynamische eiwitten in levende cellen is cruciaal voor het begrijpen van de biologie. Een type superresolutiemicroscopie genaamd fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM) onthult unieke informatie over de cytokinetische Z-ring in bacteriën: zowel het kralenachtige uiterlijk als de snelle dynamica van FtsZ binnen de ring.

Super-resolution Imaging van de Cytokinetic Z Ring in levende bacteriën met behulp van Fast-3D Structured Illumination Microscopy (F3D-SIM)

Vierdimensionale (4D) beeldvorming wordt gebruikt om het gedrag en interacties tussen twee soorten endosomen in levende gewervelde zenuwuiteinden bestuderen. Beweging van deze kleine structuren wordt gekenmerkt in drie dimensies, waardoor de bevestiging van evenementen zoals endosome fusie en de exocytose.

Visualisatie van endosoom Dynamiek in woon zenuwuiteinden met vier-dimensionale Fluorescentie Imaging

We presenteren een protocol voor de toepassing van interferometrische Photoactivated Localization Microscopy (iPALM), een 3-dimensionale single-molecule lokalisatie super resolutie microscopie methode, aan de beeldvorming van het actine cytoskelet in hechtende zoogdiercellen. Deze aanpak maakt het mogelijk op basis van licht visualisatie van nanoschaal structurele kenmerken die anders onopgelost zouden blijven door middel van conventionele diffractie beperkt optische microscopie.

Driedimensionale Super resolutie microscopie van de F-actine filamenten door interferometrische Photoactivated Localization Microscopy (iPALM)

Wij bieden eenvoudige en robuuste protocollen voor het verwerken van biopsiemateriaal van verschillende soorten, embryo's van biomedische modelorganismen en monsters van andere organische weefsels om de digitale volumegegevensopwekking mogelijk te maken met de hoge resolutie episcopische microscopie methode.

Episcopische Microscopie met hoge resolutie (HREM) - Eenvoudige en robuuste protocollen voor het verwerken en visualiseren van organische materialen

Onlangs we toegewezen de driedimensionale (3D) ruimtelijke locaties van transportroutes voor verschillende eiwitten translocating binnen de primaire cilia in levende cellen. Hier leven de details van dit papier de experimentele opzet, het proces van biologische monsters en de data-analyses voor de 3D super resolutie fluorescentie imaging aanpak nieuw toegepast in primaire cilia.

Toepassing van snelle super resolutie snelheid microscopie in levende primaire Cilium

Dit protocol legt uit hoe u bacteriële samples voorbereidt en monit voor Live driedimensionale beeldvorming en hoe u de driedimensionale vorm van E. coli van die beelden reconstrueren.

Driedimensionale beeldvorming van bacteriële cellen voor nauwkeurige cellulaire representaties en precieze eiwit lokalisatie

Hier beschrijven we computationele hulpmiddelen en methoden die visualisatie en analyse van drie- en vierdimensionale beeldgegevens van muizenembryo's mogelijk maken in de context van axiale elongatie en segmentatie, verkregen door into optische projectietomografie en door live beeldvorming en whole-mount immunofluorescentiekleuring met behulp van multifotonenmicroscopie.

Drie- en vierdimensionale visualisatie- en analysebenaderingen om gewervelde axiale rek en segmentatie te bestuderen

Wanneer geïntegreerd met een kopplaat en een optisch ontwerp dat compatibel is met zowel enkelvoudige als twee-fotonmicroscopen, biedt de microprismalens een aanzienlijk voordeel bij het meten van neurale reacties in een verticale kolom onder verschillende omstandigheden, waaronder goed gecontroleerde experimenten in hoofdvaste toestanden of natuurlijke gedragstaken bij vrij bewegende dieren.

Langetermijnbeeldvorming van geïdentificeerde neurale populaties met behulp van microprisma's in vrij bewegende en met het hoofd gefixeerde dieren

Dit protocol beschrijft de geavanceerde beeldvormingstoepassingen en het beheer van gedeelde middelen van een laser-scannend confocaal microscoopsysteem, geïntegreerd met een multiplexed arraydetector voor hoogresolutie cellulaire en subcellulaire beeldvorming. De workflow maakt multimodale beeldvorming mogelijk van confocaal tot superresolutie (~120 nm) binnen één platform, waardoor visualisatie op nanoschaal toegankelijker wordt.

Superresolutie beeldvorming en gedeeld beheer: een protocol voor confocale microscopie met multiplexdetectie

Leer hoe je hoge-resolutie 3D-beelden van muizenembryo's maakt met episcopische microscopie. Deze methode maakt gedetailleerde morfometrische analyse van embryonale ontwikkeling mogelijk.

Rapid Overname van 3D-beelden met behulp van hoge-resolutie episcopische Microscopie

Meer video's verkennen