Rapid Overname van 3D-beelden met behulp van hoge-resolutie episcopische Microscopie

Het algemene doel van dit protocol is om snel hoge resolutie 3D digitale beelden van biologische monsters te verwerven met behulp van standaard laboratoriumapparatuur. Deze methode kan sleutelvragen beantwoorden op het gebied van ontwikkelingsbiologie door de visualisatie en de dynamische aspecten van complexe morfologische kenmerken. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat het standaard laboratoriumapparatuur gebruikt en minimale voorafgaande ervaring vereist.

De procedure zal worden gedemonstreerd door Jungang Huang, een afgestudeerde student uit mijn lab. Na de dissectie en fixatie van het embryo zoals beschreven in de tekstprotocol, vervang de fixeervloeistof met clearing oplossing en draai het monster zachtjes op een rocker bij kamertemperatuur gedurende één tot twee weken. Aan het einde van de incubatie, breng het monster over naar 10% formaline en laat het nog twee dagen op de rocker staan.

Op de derde dag, was het monster in PBS voor drie vijf minuten wasbeurten. Daarna dehydrateer de monsters in een oplopende ethanolreeks bij kamertemperatuur, op een zachte rocker gedurende twee uur voor elke concentratie. Na de 100% ethanol dehydratie, breng het monster over naar kleuroplossing voor een uur, beschermd tegen licht.

Vervolgens, vervang de oplossing met verse kleuroplossing voor overnacht labeling van het monster. De volgende ochtend, dompel het monster in een een op een volume op volume mengsel van vers bereide infiltratie en kleuroplossing gedurende minimaal drie uur op een rocker bij vier graden Celsius. Aan het einde van de incubatie, breng het embryo over in infiltratie oplossing voor nog eens drie uur rokkende incubatie.

Vervolgens vervang de supernatant met verse infiltratie oplossing voor nog drie dagen van rokken bij vier graden Celsius. Op de vierde dag, richt het embryo in een inbeddingsvorm en plaats de vorm op ijs. Meng oplossing B met de infiltratie oplossing en dompel de vorm vervolgens voorzichtig in koude inbeddingsoplossing bij vier graden Celsius.

Na ongeveer drie uur, gebruik een tip om te bevestigen dat de oplossing is gestold en duw het monster uit de vorm. Trim overtollig inbeddingsmateriaal, en oriënteer de monsterblok opnieuw in een nieuwe vorm in een kruisorientatie. Plaats vervolgens de hele opstelling op ijs in een afzuigkap.

Voeg voorzichtig inbeddingsoplossing toe aan de nieuwe vorm totdat de vorm is ondergedompeld. Plaats vervolgens een blokhouder op de bovenkant van de vorm. Na drie tot vier uur, verwijder de inbeddingsvorm en plaats de blok onder een stereomicroscoop met schuine verlichting om de positie van het monster in de blok te bepalen.

Op het blokoppervlak, markeer rasterlijnen rond het monster en gebruik de lijnen als richtlijnen om overtollig inbeddingsmateriaal weg te snijden. Om het monster te beeldvormen, klemmen eerst de blok aan een microtoom en verkrijg een verse oppervlaktesnede van het monster. Monteer vervolgens een stereo zoom microscoop horizontaal tegenover het blokoppervlak van het monster en zet de microscoop en de bijbehorende computer aan.

Start vervolgens de beeldacquisitie software en gebruik de live view modus in beeldvormingssoftware om de optica op het blokoppervlak te focussen. Lijn de microscoop en microtoom uit zoals nodig, zodat het blokoppervlak in het centrum van de zoeker staat. Een van de meest cruciale stappen van deze procedure is het verkrijgen van beelden op de vaste thuispositie van de microtoom.

Pas de zoom aan om ervoor te zorgen dat het hele blokoppervlak binnen de zoeker valt. Selecteer vervolgens de groen fluorescente eiwit filter. Ga door met het voorsnijden van de blok totdat het monstersweefsel verschijnt en focus het beeld opnieuw indien nodig.

Na het meten en handmatig instellen van de belichtingstijd, verwerf en sla beelden van het blokoppervlak op na elke verse snede, en noteer de belangrijke beeldverwerving parameters. Aan het einde van de beeldsessie, exporteer en converteer alle beeldbestanden naar JPEG formaat en gebruik de juiste beeldverwerkingssoftware om alle originele beelden te inverteren, de helderheid en het contrast van de beelden aan te passen zoals nodig. Upload alle verwerkte beelden naar een 3D visualisatie software, volgens de instructies.

Lign alle beelden met behulp van de automatische modus en toon de 3D en 2D resultaten. In deze representatieve afbeelding van een volledige montage oppervlakteweergave van een embryonale dag 15,5 muis embryo dat is voorbereid en beeldvormd zoals zojuist is aangetoond. De gedetailleerde morfologische kenmerken van de huid, inclusief de snorharen en zich ontwikkelende haarzakjes, kunnen worden waargenomen.

Belangrijk is dat de resolutie van de virtuele sectieweergave van een embryonale dag 15,5 specimen, beeldvormd door deze methode, vergelijkbaar is met een standaard histologische sectie. Eens de hele procedure onder de knie is, kan de voorbehandeling met de clearing oplossing in één week worden voltooid, als het correct wordt uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden de kleuroplossing beschermd te houden tegen licht bij vier graden tijdens de infiltratie en inbeddingsstap.

Na dit protocol, kunnen andere methoden, zoals schaalkleuring, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden over de specifieke distributiepatronen van celtypen. Na het bekijken van deze video, zou je een goed begrip moeten hebben van hoe je laboratoriumapparatuur kunt gebruiken om hoge resolutie 3D beelden van biologische monsters te verkrijgen voor hun morfometrische analyse. Vergeet niet dat het werken met fixeer-, kleur- en infiltratieoplossingen uiterst gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen zoals het werken in een afzuigkap en het dragen van handschoenen altijd moeten worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure.