Name: Studie van virale vectoren in een drie-dimensionale lever Model herbevolkt met de menselijke hepatocellulair carcinoom cellijn HepG2 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Leer hoe u een gerecellulariseerd levermodel met HepG2-cellen opbouwt voor virologisch onderzoek met virale vectoren. Deze methode vermindert dierproeven en verbetert de relevantie voor humane fysiologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken Bernd Krostitz voor technische assistentie, Radoslaw Kedzierski voor de eerste bijdragen aan het project, Erik Wade voor het corrigeren en nuttige opmerkingen, en Prof. Heike Walles voor het verstrekken van de bioreactor en het delen van haar waardevolle ervaring met orgaan-decellularisatie. We zijn ook dankbaar voor de financiering van het project en publicatie door de Technische Universiteit van Berlijn.

LET OP: RL verkregen ethische goedkeuring voor de explantatie van organen van de Landesamt für Gesundheit und Soziales (LaGeSo). Levers werden geëxplanteerd uit Wister ratten. De onderste vena cava en de poortader van de lever werden gecannuleerd met een 22 G canule. Werkwijzen voor het van cellen ontdoen van geëxplanteerde levers zijn eerder beschreven. 4,5 Het extracellulaire matrices die hier gebruikt werden verkregen door overmatige perfusie van een rattenlever met 1% natriumdeoxycholaat. 1. hercellularisatie van extracellulaire matrix (ECM) van een rattenlever <ol><li> Uitbreiding van de lever cellijn HepG2 <ol><li> Cultuur hepatocellulair carcinoom cellijn HepG2 in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium aangevuld met 10% foetaal kalfsserum, 2 mM glutamine en 2 mM penicilline en streptomycine, elk. </li><li> Zaad 1,5 x 10 7 cellen in T175 flessen en groeien de cellen bij 37 ° C en 5% CO 2 </sub&gt;. Oogst cellen na 4 dagen van behandeling met trypsine gedurende 5 minuten bij 37 ° C, 5% CO2. </li><li> Spin down de cellen bij 300 xg en resuspendeer ze in 4 ml PBS en tel de cellen met een Neubauer kamer onder een microscoop. Eén T175 fles zal ongeveer 4,5 x 10 7 cellen opleveren. LET OP: Zorg ervoor dat de cultuur bevat voldoende mobiele nummers voor hercellularisatie van de rat lever ECM met 6 x 10 8 HepG2 cellen per ECM (10 x 175 cm 2 cultuur kolven met 4-5 x 10 8 cellen elk). </li></ol></li></ol><img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/54633/54633fig1.jpg" /> Figuur 1. Bioreactor-systeem. A) Deze bioreactor systeem werd op maat gemaakt. Het handhaaft de orgaanmodellen bij 37 ° C en 5% CO2. De stroomsnelheden van de peristaltische pompen individueel regelbaar. B) De lever wordt in een groeikamer en sluitened aan de perfusie circuit, die bestaat uit een peristaltische pomp, een medium reservoir, een zeepbel val en een druksensor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54633/54633fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <ol start="2"><li> Hercellularisatie van de ECM <ol><li> Stel de bioreactor systeem, dat een lever perfusie kamer, een perfusie-systeem, een reservoir van medium en een zeepbel te houden. Steriliseer het bioreactorsysteem (121 ° C, 15 min). </li><li> Sluit het bioreactorsysteem met een peristaltische pomp en plaats deze in een incubator passende omstandigheden (37 ° C, 5% CO2). Plaats ontceld rattenlever scaffolds 8 in de leverperfusie kamer van het bioreactorsysteem (figuur 1). </li><li> Sluit de ader canule portal en vena cava met behulp van slangklemmen aan de perfusie-systeem. Equilibreren steiger met 150 ml RPMI medium (zoals beschreven in 1.1)dan 5 d met een stroomsnelheid van 1,25 ml / min. </li><li> Koppel de lever steiger van de media circuit en het enten van het schavot met 3 x 10 8 HepG2-cellen (in 5 ml) via de poortader met behulp van een 5 ml spuit, vermijd luchtbel vorming en laat de cellen naar de ECM herbevolken door ze te incuberen 1 uur in de steiger met de pomp uitgeschakeld. </li><li> Verhoog geleidelijk de stroomsnelheid door instelling van de pomp, beginnend met 1,25 ml / min gedurende 10 min; 2,5 ml / min gedurende 20 min en tenslotte 3,75 ml / min gedurende 30 min. </li><li> Herhaal de stappen 1.2.4-1.2.5 tot een totaal aantal cellen van 6 x 10 8 te bereiken. </li><li> Voer het bioreactorsysteem met een stroomsnelheid van 3,75 ml / min. Cultuur de recellularized rat lever voor 2 weken. OPMERKING: Vervang een derde van het medium door vers medium (50 ml) om de dag. Proef het kweekmedium fysiologische parameters, zoals lactaat dehydrogenase activiteit, de pH van mediummonsters en de concentratie van glucose en lactaat meten. </li></ol></li></ol> 2. Transductie van de Recellularized Rat Liver <ol start="1"><li> Grootschalige productie van AAV vectoren <ol><li> Produceren, zuiveren en kwantificeren van AAV-vectoren zoals eerder beschreven: 11 <ol><li> In het kort, de productie van AAV-vectoren in rolflessen en te zuiveren hen door iodixanol gradiënt centrifugeren. Resten iodixanol door filtratie over PD10 gelfiltratiekolommen. Bepaal de AAV vector concentratie qPCR gebruikmaking van genomisch DNA AAV als standaard. Opmerking: Het zelf-complementaire gepseudotypeerde AAV2 / 6 vector gebruikt in de onderhavige studie gecodeerd EmGFP als reporter transductie efficiëntie en een shRNA expressiecassette voor knockdown van een endogeen tot expressie gebracht gen (humaan cyclofiline B (hCycB), figuur 2) tonen . Zorg voor een voldoende hoeveelheid pseudo scAAV vectoren serotype 6 (2,7 x 10 13 AAV-vectoren per lever model). </li></ol></li></ol></li></ol><img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/54633/54633fig2.jpg" /> Figuur 2. Kaart van het zelf-complementaire gepseudotypeerde AAV2 / 6 vector gebruikt in de onderhavige studie. Het genoom bestaat uit de omgekeerde eindstandige herhalingen (ITR) van AAV2 en codeert EmGFP onder controle van de CMV promoter en een onder controle shRNA van een U6 promotor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54633/54633fig2large.jpg" target="_blank">klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <ol start="2"><li> Transductie van de lever Model <ol><li> Stel de AAV vector oplossing tot een eindconcentratie van 2,7 x 10 13 vector genoom in 5 ml door toevoeging van het desbetreffende volume PBS. </li><li> Koppel de lever van de media circuit door het verwijderen van de slang van de canule. Sluit een 5 ml spuit met de canule van de vena portae en injecteer totale AAV vector-oplossing (5 ml). LET OP: Optionally, voeg fenolrood (5 ug / ml) verspreiding van de AAV vector oplossing gehele lever volgen. </li><li> Incubeer gedurende 1 uur zonder pompen. Verhoog geleidelijk stroomsnelheid, beginnend met 1,25 ml / min gedurende 10 min; 2,5 ml / min gedurende 20 min en 3,75 ml / min gedurende 30 min. Cultuur de recellularized rat lever meer dan 6 dagen. OPMERKING: Vervang een derde van het medium, zoals aangegeven in OPMERKING onder 1.2.7 </li></ol></li></ol> 3. Beoordeling van de Recellularized getransduceerde Rat Liver <ol start="1"><li> Hematoxyline en eosine (HE) kleuring en immunohistochemische analyse <ol><li> Monsters te nemen (0,5 x 0,5 x 1,5-2 cm) van elkaar leverkwab met behulp van een scalpel. </li><li> Incubeer monsters (van 3.1.1) in 4% paraformaldehyde (PFA) + 4% sucrose oplossing 1,5 uur bij 4 ° C. (Let op: PFA is giftig en kankerverwekkend Altijd PFA binnen een zuurkast en draag geschikte beschermende kleding..) Was drie keer met PBS (1 min per wasbeurt stap) en incubeer bij 8%sucrose overnacht bij 4 ° C. </li><li> Giet de vaststelling medium in plastic cryomolds, plaatst de monsters in de vaststelling medium vrij van luchtbellen. Voeg vaststelling medium tot monster goed bedekt is. WINKEL ingebedde monsters bij -80 ° C tot verder gebruik. </li><li> Bereid cryo-secties (10 pm) met een cryotoom 12. Assess hercellularisatie door hematoxyline + eosinekleuring 8. Assess transductie efficiency door immunohistochemische kleuring voor het gen-van-belang (hier: EmGFP). </li></ol></li><li> Moleculair biologische monsters <ol><li> Elk monster leverkwab een biopsie pons (4 mm diameter). Isoleer totaal RNA, DNA en eiwitten volgens de instructies van de fabrikant voor de beoordeling van transgene expressie van EmGFP en hCycB knock down 8. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Chang, T. T., Hughes-Fulford, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolayer+and+spheroid+culture+of+human+liver+hepatocellular+carcinoma+cell+line+cells+demonstrate+distinct+global+gene+expression+patterns+and+functional+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Monolayer and spheroid culture of human liver hepatocellular carcinoma cell line cells demonstrate distinct global gene expression patterns and functional phenotypes.</a> Tissue Eng. Part A. 15 (3), 559-567 (2009).</li>
<li>Butler, D., Callaway, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scientists+in+the+dark+after+French+clinical+trial+proves+fatal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Scientists in the dark after French clinical trial proves fatal.</a> Nature. 529 (7586), 263-264 (2016).</li>
<li>Enger, P. O., Thorsen, F., Lonning, P. E., Bjerkvig, R., Hoover, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+viral+vectors+penetrate+human+solid+tumor+tissue+in+vivo+more+effectively+than+adenoviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated viral vectors penetrate human solid tumor tissue in vivo more effectively than adenoviral vectors.</a> Hum. Gene Ther. 13 (9), 1115-1125 (2002).</li>
<li>Uygun, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularization+and+recellularization+of+whole+livers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Decellularization and recellularization of whole livers.</a> J. Vis. Exp. (48), e2394(2011).</li>
<li>Hillebrandt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedure+for+Decellularization+of+Rat+Livers+in+an+Oscillating-pressure+Perfusion+Device%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device.</a> J. Vis. Exp. (102), e53029(2015).</li>
<li>Baptista, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+whole+organ+decellularization+for+the+generation+of+a+vascularized+liver+organoid%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid.</a> Hepatology. 53 (2), 604-617 (2011).</li>
<li>Yagi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human-scale+whole-organ+bioengineering+for+liver+transplantation%3A+a+regenerative+medicine+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Human-scale whole-organ bioengineering for liver transplantation: a regenerative medicine approach.</a> Cell Transplant. 22 (2), 231-242 (2013).</li>
<li>Wagner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+three-dimensional+humanized+liver+model+for+the+study+of+viral+gene+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Use of a three-dimensional humanized liver model for the study of viral gene vectors.</a> J. Biotechnol. 212, 134-143 (2015).</li>
<li>Kay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((State-of-the-art+gene-based+therapies%3A+the+road+ahead%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">State-of-the-art gene-based therapies: the road ahead.</a> Nat. Rev. Genet. 12 (5), 316-328 (2011).</li>
<li>Yla-Herttuala, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endgame%3A+glybera+finally+recommended+for+approval+as+the+first+gene+therapy+drug+in+the+European+union%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Endgame: glybera finally recommended for approval as the first gene therapy drug in the European union.</a> Mol. Ther. 20 (10), 1831-1832 (2012).</li>
<li>Wagner, A., Röhrs, V., Kedzierski, R., Fechner, H., Kurreck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+the+quantification+of+adeno-associated+virus+vectors+for+RNA+interference+applications+using+quantitative+polymerase+chain+reaction+and+purified+genomic+adeno-associated+virus+DNA+as+a+standard%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther.+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel method for the quantification of adeno-associated virus vectors for RNA interference applications using quantitative polymerase chain reaction and purified genomic adeno-associated virus DNA as a standard.</a> Hum. Gene Ther. Methods. 24 (6), 355-363 (2013).</li>
<li>Takagi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microdissected+region-specific+gene+expression+analysis+with+methacarn-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues+by+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Microdissected region-specific gene expression analysis with methacarn-fixed, paraffin-embedded tissues by real-time RT-PCR.</a> J. Histochem. Cytochem. 52 (7), 903-913 (2004).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De gereconstitueerde 3D levers hier omschreven een model om virale vectoren bestuderen in een gehumaniseerd systeem. Herbevolking van de ECM van een rattenlever met een menselijke hepatocellulaire carcinoma cellijn genereert een gevasculariseerde systeem dat de studie van grote biologische toelaat. Deze resultaten vormen een proof-of-concept dat het bereide lever model efficiënt kan worden getransduceerd met een virale vector. Voor de hier getoonde experimenten, elk leverkwab werd getransduceerd door de AAV vector. In sommige voorlopige experimenten, één lobben niet herbevolkt met cellen. Het is daarom belangrijk om te voorkomen dat celresten of andere componenten van het afsluitorgaan vaatstelsel. Om te testen of alle lobben kan worden geperfundeerd, kan een niet-toxische kleurstof zoals fenol rood worden doorgespoeld lever model. Een andere cruciale kwestie is het bijhouden van de lever steiger steriel. Terwijl de behandeling met ethanol of antibiotica is disadvantageous het vasculaire systeem, bestraling van de extracellulaire matrix met γ-straling houdt de vaten en gesteriliseerd het monster. Bovendien zal de omvang van geëxplanteerde lever verschillen, zodat het aantal cellen voor de hercellularisatie procedure en de herbevolking tijd mogelijk moeten worden aangepast om reproduceerbare resultaten te verkrijgen. De rat levers gebruikt in deze studie zijn relatief groot en vereisen grote hoeveelheden cellen en testreagentia (bijvoorbeeld AAV vectoren). Bovendien, de herbevolking procedure duurde meer dan twee weken. Dit beperkt het aantal herhalingen die kan met redelijke inspanning. We zetten momenteel het model muizenlevers, die slechts ongeveer een vijfde van het volume van rat lever zijn, die het gebruik van minder cellen en minder testreagentia. Hoewel proportionele afbouw van het aantal cellen lijkt redelijk, moet de exacte bedragen die moeten worden bepaald in furtproefjes. Een andere tekortkoming van dit model is het gebruik van de hepatocellulaire HepG2 cellijn. Experimenten zijn gaande om het gebruik van hepatocyten opzichte van geïnduceerde pluripotente stamcellen, die een fysiologisch relevanter voorbeeld kan dienen ontwikkelen. Bovendien is de lever uit meerdere celtypen naast de hepatocyten, bijvoorbeeld, Kupffer cellen en sinosoids. We nemen aan dat de verschillende celtypes hun natuurlijke omgevingen bevolken wanneer een ECM recellularized meerdere celtypen. De 3D-lever model combineert een aantal voordelen. Een groot nadeel van de conventionele in vivo modellen is dat dierlijke fysiologie verschilt wezenlijk van de menselijke fysiologie. Toxische bijwerkingen van de behandeling van een menselijke patiënt kan dus onopgemerkt blijven. Deze tekortkoming kan worden overwonnen door het reconstitueren van het 3D-model met menselijke lever cellen die nauwer bij de biologie van human patiënten. Het tweede voordeel van de lever model is haar bijdrage aan het welzijn van dieren. Hoewel dierlijke componenten vereist voor de reconstitutie experimenten, de benadering volgt nog steeds de doelstellingen van de 3R principe (vervanging, vermindering, verfijning) als overtollig dieren kunnen worden gebruikt die werden opgeofferd andere dierproeven, dwz dat geen extra dieren nodig en aanpak vermijdt volledig lijden van dieren die vaak gepaard gaat met in vivo experimenten. Sferoïden zijn een alternatief middel om cellulaire processen in 3D te bestuderen. Echter, sferoïden niet gevasculariseerd zodat grote en biologische stoffen niet diep in het binnenste van de structuur. Deze problemen zijn overwonnen met de gevasculariseerde lever 3D-model. In de hier beschreven experimenten werden AAV vectoren onderzocht, omdat ze behoren tot de meest veelbelovende kandidaten voor gentherapietoepassingen. Talrijke gen therapeutische benaderingen gericht op de lever te richten, bijvoorbeeld voor de behandeling van infecties met hepatitis virussen of alfa-1-antitrypsine-deficiëntie, kan de 3D lever worden gebruikt bij de werkwijze volgens deze AAV vector ontwikkeling. Het is natuurlijk ook geschikt voor de studie van andere hepatotrope virale vectoren, zoals adenovirale vectoren. Bovendien kan het worden gebruikt om infectieuze hepatitis virussen zoals hepatitis B of C virus bestuderen. Het kan bijvoorbeeld worden toegepast om nieuwe antivirale strategieën te ontwikkelen. Bovendien, 3D-orgel modellen vertegenwoordigen veelbelovende instrumenten om nieuwe cytostaticum therapieën voor de behandeling van kanker en toxicologisch onderzoek uit te voeren te ontwikkelen. Op de lange termijn, kan kunstmatige levers worden gebruikt in de regeneratieve geneeskunde als transplantaties. Bij elkaar genomen, het 3D-lever model biedt een breed scala aan toepassingen in infectie biologie en andere gebieden van het biomedisch onderzoek.

De meeste actuele biomedische onderzoeken zijn afhankelijk van een van twee benaderingen, hetzij tweedimensionale (2D) celkweekexperimenten of diermodellen, die van nature driedimensionaal (3D) zijn. Deze benaderingen hebben echter enkele ernstige nadelen. Er is aangetoond dat cellen die in 2D-kweek zijn gekweekt, verschillen in genexpressiepatronen en celfysiologie van die welke onder 3D-condities zijn gekweekt.1 Diermodellen, naast dat ze geassocieerd zijn met ethische bezwaren, modelleren vaak de menselijke fysiologie niet goed. Hoewel het ontbreken van duidelijke toxische effecten van een stof moet worden bevestigd in diermodellen voorafgaand aan de eerste dosering bij mensen, zijn er meerdere gevallen gedocumenteerd waarin ernstige, soms fatale, bijwerkingen zijn opgetreden in klinische onderzoeken.2
Om deze tekortkomingen te overwinnen, zijn gehumaniseerde 3D ex vivo orgaanmodellen belangrijke onderzoeksinstrumenten geworden. Wanneer onder geschikte omstandigheden gekweekt, assembleren cellen zichzelf in 3D-structuren die bekend staan als sferoïden. Deze sferoïden missen echter een vasculair systeem, wat de distributie van kleine moleculaire verbindingen, grote biologischen en virale vectoren beperkt. Adenovirale vectoren transduceerden bijvoorbeeld alleen de buitenste cellagen van sferoïden die zijn bereid uit humane glioblastomen.3 Een oplossing voor dit probleem is het gebruik van een orgaanmodel dat een vasculair systeem bevat. Hiertoe kan het orgaan van belang uit een dier worden geëxplanteerd en kunnen de dierlijke cellen worden vervangen door menselijke cellen. Er zijn verschillende methoden beschreven voor decellularisatie van dierlijke leveren door behandeling met detergentia of natriumcholaat.4-6 De resulterende extracellulaire matrix (ECM) herbergt cytokinen en groeifactoren die verschillende cellulaire processen reguleren.7 Het kan worden gebruikt als een schaal voor recellularisatie met menselijke cellen om een functioneel orgaanmodel te verkrijgen.
In een recent onderzoek hebben we een gehumaniseerd 3D-levermodel gebruikt om de distributie en transgenexpressie van een adeno-geassocieerd virus (AAV) vector te bestuderen.8 AAV-vectoren behoren tot de meest veelbelovende virale vectoren voor gentherapeutische toepassingen.9 De eerste, en tot nu toe enige, goedgekeurde gentherapeutische interventie in de westerse wereld gebruikt een AAV-vector voor de overdracht van lipoproteïne lipase.10

<table><tbody><tr><td>Incubator</td><td>Fraunhofer</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltische pomp</td><td>Fraunhofer</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Flens met groef</td><td>Duran</td><td>2439454</td><td>gewijzigd door gaffer</td></tr><tr><td>O-ring transparant</td><td>Duran</td><td>2922551</td><td></td></tr><tr><td>Snelsluiting</td><td>Duran</td><td>2907151</td><td></td></tr><tr><td>Vlakke flensdeksel</td><td>Duran</td><td>2429857</td><td>gewijzigd door gaffer</td></tr><tr><td>Schroefdraadbuis</td><td>Duran</td><td>2483802</td><td>gewijzigd door gaffer</td></tr><tr><td>Schroefdraadbuis</td><td>Duran</td><td>2483602</td><td>gewijzigd door gaffer</td></tr><tr><td>Siliconen afdichtring</td><td>Duran</td><td>2862012</td><td></td></tr><tr><td>Schroefdop</td><td>Duran</td><td>2924013</td><td></td></tr><tr><td>Schroefdop</td><td>Duran</td><td>2924008</td><td></td></tr><tr><td>Schroefdop met opening</td><td>Duran</td><td>2922709</td><td></td></tr><tr><td>Schroefdop met opening</td><td>Duran</td><td>2922705</td><td></td></tr><tr><td>Filter</td><td>Sarstedt</td><td>831,826,001</td><td></td></tr><tr><td>Siliconen slang</td><td>VWR</td><td>228-1500</td><td></td></tr><tr><td>Buisschakelaar</td><td>Ismatec</td><td>ISM556A</td><td></td></tr><tr><td>Biocompatibele slang</td><td>Ismatec</td><td>SC0736</td><td></td></tr><tr><td>T175 kweekkolven</td><td>Greiner bio-one</td><td>660 160</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>BioWest SAS (Th. Geyer)</td><td>L0501-500</td><td></td></tr><tr><td>glutamine</td><td>BioWest SAS (Th. Geyer)</td><td>X0551-100</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>BioWest SAS (Th. Geyer)</td><td>L0940-100</td><td></td></tr><tr><td>penicilline/streptomycine</td><td>BioWest SAS (Th. Geyer)</td><td>L0022-100</td><td></td></tr><tr><td>foetaal runder serum</td><td>cc pro</td><td>S-10-M</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T.</td><td>Weckert-Labortechnik</td><td>600001</td><td></td></tr><tr><td>HepG2</td><td>DSMZ</td><td>ACC 180</td><td></td></tr><tr><td>Cryomold 15 x 15 x 5 mm</td><td>Sakura</td><td>4566</td><td></td></tr><tr><td>Biopsie-punch 4 mm</td><td>pfm medical</td><td>48401</td><td></td></tr><tr><td>Nucleospin miRNA</td><td>Macherey & Nagel</td><td>740971.10</td><td></td></tr><tr><td>Nucleospin RNA/DNA bufferset</td><td>Macherey & Nagel</td><td>740944</td><td></td></tr></tbody></table>

studie van virale vectoren in een drie-dimensionale lever model herbevolkt met de menselijke hepatocellulair carcinoom cellijn hepg2

Study of Viral Vectors in a Three-dimensional Liver Model Repopulated with the Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line HepG2

Dit protocol beschrijft de vorming van een driedimensionaal (3D) ex vivo model lever en de toepassing ervan op het onderzoek en de ontwikkeling van virale vectorsystemen. Het model wordt verkregen door herbevolking de extracellulaire matrix van een gedecellulariseerde rattenlever met humane hepatocyten cellijn. Het model maakt studies in een gevasculariseerde 3D celsysteem vervangen potentieel schadelijke experimenten met levende dieren. Een ander voordeel is het gehumaniseerde aard van het model, dat dichter bij de menselijke fysiologie dan diermodellen. In deze studie demonstreren we de transductie van de lever model met een virale vector afkomstig van adeno-geassocieerde virussen (AAV vector). De perfusie circuit dat de 3D-lever-model levert met media biedt een eenvoudige manier om de vector toe te passen. Het systeem maakt controle van de belangrijkste metabolische parameters van de lever. Voor de uiteindelijke analyse, kunnen weefselmonsters worden genomen om de omvang van recellularizatie door histologische technieken. Verdeling van de virus vector en expressie van het transgen kan geleverd worden geanalyseerd door kwantitatieve PCR (qPCR), Western blotting en immunohistochemie. Talrijke toepassingen van de vector model in fundamenteel onderzoek en de ontwikkeling van gen-therapeutische toepassingen kunnen worden beoogd, inclusief de ontwikkeling van nieuwe antivirale therapieën, kankeronderzoek, en het onderzoek van virale vectoren en hun mogelijke bijwerkingen.

Voor de beoordeling van de omvang van hercellularisatie werden cryo-secties bereid van elke lob van elk recellularized lever model. De coupes werden daarna geanalyseerd met hematoxyline en eosine kleuring. Zoals te zien in figuur 3, elke lob van de drie levermodellen, aangeduid als TLM1, TLM2 (getransduceerde levermodellen 1 2) en Ctrl (control lever model dat recellularized, maar niet getransduceerd) werden herbevolkt met HepG2 cellen. Dit hepatocellulaire carcinoma cellijn werd vastgesteld op basis van het tumorweefsel van een 15-jarige Argentijnse jongen. Sommige delen van de lever modellen intensiever recellularized dan anderen. De redenen voor deze variaties nog worden vastgesteld. <img alt="figuur 3" src="/files/ftp_upload/54633/54633fig3.jpg" /> Figuur 3. hematoxyline en eosine kleuring van elk kwab van de drie geanalyseerde levermodellen TLM1 + 2:. Getransduceerd levermodel 1 en 2; Ctrl .: controle lever model dat werd recellularized maar niet getransduceerd. Schaal bar: 200 pm. (Re-bedrukt met toestemming van Ref. 8) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54633/54633fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> In de volgende stap wordt de transductie van de lever model werd beoordeeld. Hiervoor werd DNA bereid uit 28 punch biopsieën van elk van de lever modellen en de vector titer werd gekwantificeerd door qPCR. Gemiddeld 55 en 90 geïnternaliseerd vector genomen per cel (VG / cel) werden gemeten voor de twee getransduceerde lever modellen. Experimenten in 2D celkweek hebben aangetoond 30 VG / cel zijn voldoende voor een sterke transgenexpressie en RNAi-gemedieerde silencing. Productie van EmGFP werd geanalyseerd door RT-PCR en Western blotting. In feite, expressie van het werd gedetecteerd in 80-90% van de biopsieën op mRNA en eiwitniveaus respectievelijk.8 Om een volledig beeld van de transductie efficiëntie te verkrijgen, werden cryo-secties immunohistologisch geanalyseerd. Zoals te zien is in figuur 4, de gebieden van de lever model die met succes werden recellularized, zoals gevisualiseerd door DAPI kleuring, gaf sterke fluorescentiesignalen in de immunohistochemische analyse van EmGFP expressie. Zoals verwacht control lever model, niet behandeld met AAV vectoren geen EmGFP expressie vertonen. <img alt="figuur 4" src="/files/ftp_upload/54633/54633fig4.jpg" /> Figuur 4. Immunohistochemische analyse van expressie EmGFP Cellen die herbevolkt de levermodellen werden gevisualiseerd door DAPI kleuring (blauw).; EmGFP expressie werd gevisualiseerd door immunochemische kleuring (rood). TLM1 + 2: getransduceerde lever modellen 1 en 2; Ctrl .: controle lever model dat werd recellularized maar niet getransduceerd. Schaal bar: 200 pm. (Re-bedrukt met toestemmingvan Ref. 8.) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54633/54633fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> In een laatste proef AAV-gemedieerde knockdown van hCycB werd geanalyseerd met qRT-PCR. De knockdown van hCycB bleek te liggen tussen 70 en 90%, gemiddeld over alle kwabben van beide getransduceerde levermodellen (Figuur 5). <img alt="figuur 4" src="/files/ftp_upload/54633/54633fig5.jpg" /> Figuur 5.-RNAi-gemedieerde knockdown van hCycB in-AAV getransduceerde 3D-lever-modellen. Silencing van hCycB werd bepaald door qRT-PCR. Gemiddelde waarden en standaarddeviaties (SD) werden berekend voor alle monsters van elke getransduceerde 3D lever model (TLM1 en 2, respectievelijk) en genormaliseerd tot de gemiddelde waarde van de niet-getransduceerde control (Ctrl.). (Re-bedrukt met toestemming van Ref. 8.) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54633/54633fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

De recellulariseerde extracellulaire matrix van een decellulaire rattenlever kan worden gebruikt als een gehumaniseerd, driedimensionaal ex vivo model om de distributie en transgenexpressie van een virus of vireel vector te bestuderen.

Studie van virale vectoren in een drie-dimensionale lever Model herbevolkt met de menselijke hepatocellulair carcinoom cellijn HepG2

This protocol describes the generation of a three-dimensional (3D) ex vivo liver model and its application to the study and development of viral vector ...

Het algemene doel van deze procedure is het ontwikkelen van een driedimensionaal levermodel om virussen en virale vectoren te bestuderen. Deze methode maakt het mogelijk om biologische processen te bestuderen in een gevasculariseerd driedimensionaal systeem met menselijke cellen, waarvan de fysiologie verschilt van die van knaagdiercellen in een muis- of ratmodel. Bovendien is dit een stap ter verbetering van het dierenwelzijn, aangezien het experimenten met levende dieren vermijdt en op de lange termijn bedoeld is om dierlijke componenten volledig te vervangen.Hoewel we deze methode hebben ontwikkeld om virale vectoren voor gentransfer te bestuderen, kan deze ook worden toegepast bij de studie van infectieuze virale virussen en andere onderzoeksgebieden zoals kankeronderzoek. Viola Rohrs, een technicus uit mijn laboratorium, zal de procedure demonstreren. Om het dierenwelzijn te waarborgen, zijn voor de huidige studie alleen overtollige dieren gebruikt die waren geofferd voor andere dierproeven, d.w.z.Er waren geen extra dieren nodig voor het verkrijgen van de leversteigers. Begin eerst met het expanderen van de hepatische cellijn Hep G2. Zaai 15 miljoen cellen uit in T175-flessen in 30 milliliters medium dat 10% foetaal kalfsserum en twee millimoles glutamine, penicilline en streptomycine bevat. Gebruik na vier dagen cultivering gedurende vijf minuten een trypsine-oplossing onder cultiveringscondities om de cellen los te maken en oogst deze vervolgens.Centrifuge de cellen vervolgens 3 minuten bij 300 Gs. Resuspendeer ze daarna in vier milliliter PBS en bepaal het celgetal. Elk flesje zou ongeveer 45 miljoen cellen moeten opleveren.Er zijn 600 miljoen cellen nodig om een ratlever-ECM te recellulariseren. Om de ECM te recellulariseren, stelt u eerst het bioreactorsysteem op, bestaande uit een leverperfusiekamer, een perfusiesysteem, een mediumreservoir en een bellenvanger. De recellularisatieprocedure bestaat uit twee kritieke stappen.Ten eerste moet worden voorkomen dat er luchtbellen in het perfusiesysteem terechtkomen. Ten tweede moet het gehele systeem steriel worden gehouden. Steriliseer eerst deze componenten van het bioreactorsysteem bij 121 °C gedurende 15 minuten.Vul vervolgens de slangetjes en de gesteriliseerde perfusiekamer met medium. Plaats daarna het gedecellulariseerde rattenleversteiger in de leverperfusiekamer. De volgende stap is om klemmetjes te gebruiken om de gecannuleerde poortader aan het perfusiesysteem te verbinden.Plaats nu het bioreactorsysteem in de incubator en sluit het aan op een peristaltische pomp. Equilibreer vervolgens het scaffold gedurende vijf dagen met 150 milliliters aangevuld medium. Stel de stroomsnelheid in op 1,25 milliliters per minuut.Koppel na vijf dagen het bioreactorsysteem los van de pomp en breng het over naar een steriele zuurkast. Ontkoppel het leversteunstructuur van het mediumcircuit. Vul vervolgens een spuit met vijf milliliter medium dat 300 miljoen Hep G2-cellen bevat en injecteer de cellen via de poortader, waarbij de vorming van luchtbellen wordt vermeden.Laat de cellen vervolgens een uur lang de ECM herbevolken zonder de pomp te laten draaien. Start na een uur de pomp op 1,25 milliliters per minuut. Verhoog na 10 minuten de druk naar 2,5 milliliters per minuut.Stel na nog 20 minuten de pomp in op de bedrijfssnelheid van 3,75 milliliters per minuut. Zet de pomp na 30 minuten op volledige pumpsnelheid uit, voeg nog eens 300 miljoen cellen toe en laat de cellen gedurende een uur de ECM koloniseren. Verhoog na een uur de circulatie geleidelijk door stapsgewijze aanpassingen van de pumpsnelheid, zoals eerder beschreven.Laat de cultuur de lever nu gedurende twee weken recellulariseren. Vervang om de dag 50 milliliters van het medium en meet de fysiologische parameters van een monster van het gebruikte medium. De productie van AAV-vectoren is een ingewikkelde procedure die uit vele stappen bestaat, welke in het tekstprotocol zijn samengevat.In dit gedeelte van de video worden enkele van de cruciale stappen gedemonstreerd. Produceer, zuiver en kwantificeer eerst de AAV-vectoren. Produceer de AAV-vectoren kortweg in rollerflessen en zuiver deze middels iodixanolgradiëntcentrifugatie.Verwijder het resterende iodixanol door filtratie over PD10 gelfiltratiekolommen. Bepaal vervolgens de AAV-vectorenconcentratie via QPCR, waarbij genomisch AAV-DNA als standaard wordt gebruikt. In totaal zijn er 27 biljoen AAV-vectoren nodig per model.Transduce nu het levermodel. Neem eerst 27 biljoen vectoren in vijf milliliters PBS op in een spuit. Fenolrood kan worden toegevoegd in een concentratie van 5 micrograms per milliliter.Koppel vervolgens de lever los van het mediacircuit en injecteer de vectoren in het systeem. Incubee het systeem na injectie gedurende één uur zonder te pompen. Verhoog daarna geleidelijk de flow zoals eerder beschreven.Vervolgens, terwijl de getransduceerde lever gedurende zes dagen wordt geïncubeerd, wordt elke twee dagen 50 milliliters van het medium vervangen. Snijd met een scalpel monsters van elke leverkwab die ongeveer een halve centimeter dik en 1,5 tot twee centimeter lang zijn. Incubeer de coupes in 4% paraformaldehyde met 4% sucrose gedurende 90 minuten bij vier graden Celsius.Was het monster vervolgens drie keer met PBS gedurende één minuut per wasbeurt. Volg de wasbeurten door de monsters een nacht te incuberen in 8% sucrose bij vier graden Celsius. Laad de monsters de volgende dag in cryomallen die een hoeveelheid fixatiemedium bevatten.Voorkom het ontstaan van luchtbellen. Zodra de monsters zijn geladen, moeten ze volledig worden bedekt met fixatium en worden bewaard bij -80 °C. Zodra ze bevroren zijn, worden met behulp van een cryotoom cryosneden van 10 µm van de monsters gemaakt.Kleur de monsters naar behoefte om de recellularisatie te bevestigen. Neem voor genexpressieanalyse monsters met een biopsietang van vier millimeter. Om de recellularisatie te beoordelen, werden cryosneden gekleurd met hematoxyline en eosine.Lappen van twee getransduceerde levers en één controlelever die was gerecellulariseerd maar niet was getransduceerd, werden allemaal opnieuw bevolkt met Hep G2-cellen. De RNA-expressie en de vectortiter werden gekwantificeerd vanuit 28 punchbiopten van elk levermodel. In de twee getransduceerde levermodellen werden 55 en 90 vectorgenomen per cel gemeten, wat voldoende vector is om gene silencing te induceren.Zoals verwacht werden er in de controle geen genomen gemeten. De EmGFP-expressie werd geanalyseerd via RT-PCR en western blotting. De meeste biopten vertoonden mRNA-expressie van EmGFP en eiwitexpressie van EmGFP.Immunokleuring van de cryosneden toonde aan dat, overal waar het model succesvol was recellulariseerd, ook EmGFP-expressie kon worden waargenomen. Dit is indicatief voor een goede AAV-genexpressie. Vervolgens werd de AAV-gemedieerde knockdown van menselijk cyclofiline B geanalyseerd middels kwantitatieve RT-PCR.De gemiddelde knockdown van menselijk cyclofiline B lag tussen 70 en 90% over alle lobben van de twee getransduceerde levers. Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers om de distributie van virussen en virale vectoren in het gevasculariseerde, driedimensionale orgaansysteem te bestuderen. Dergelijke studies zullen helpen om huidige technieken voor gentransfer te verbeteren en zullen bijdragen aan de ontwikkeling van nieuwe antivirale strategieën.

study-viral-vectors-three-dimensional-liver-model-repopulated-with

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

In dit artikel beschrijven we de identificatie van het adeno-geassocieerd virus serotype 3 (AAV3) als de meest efficiënte vector voor het richten van de menselijke lever kankercellen.

High-Efficiency transductie van leverkanker met behulp van recombinant adeno-geassocieerd virus serotype 3 Vectoren

Hepatitis C Virus (HCV) is een belangrijk humaan pathogeen dat leveraandoeningen veroorzaakt, inclusief cirrose en kanker. Een HCV-infectieus celkweeksysteem is essentieel voor het begrijpen van het moleculaire mechanisme van HCV-replicatie en het ontwikkelen van nieuwe therapeutische benaderingen. Hier beschrijven we een protocol om verschillende stadia van de HCV-replicatiecyclus te onderzoeken.

Een protocol voor het analyseren van hepatitis C virus replicatie

Hier beschrijven we een nieuw ontwikkelde hepatitis B-virus (HBV) reportersysteem de vroege stadia van de levenscyclus HBV controleren. Deze vereenvoudigde in vitro systeem zal helpen bij het screenen van anti-HBV middelen met een high-throughput strategie.

Ontwikkeling van een Hepatitis B Virus reportersysteem de vroege stadia van de replicatiecyclus Monitor

Het doel van dit protocol is bedoeld als een stapsgewijze handleiding om uit te voeren van de experimenten van de 3-D "lever-on-a-chip" infectie met het hepatitis B-virus.

"Lever-on-a-Chip" culturen van primaire hepatocyten en Kupffer cellen voor Hepatitis B-virusinfectie

Dit protocol is bedoeld voor het beschrijven van varkens hepatocyte isolatie en ex vivo gene levering om te genezen van modellen van metabole ziekten via cel autologe transplantatie. Hoewel dit model geniet van unieke voordelen die succesvolle therapie gunst, is de toepassing een relevante Stichting bijkomende ziekten en aanduidingen aan te pakken.

Lentivirale Vector-gemedieerde gentherapie van hepatocyten Ex Vivo voor autologe transplantatie in varkens

Hier beschreven is een effectieve methode voor het produceren van hoge virale titer voorraden van hepatitis E-virus (HEV) om efficiënt te infecteren hepatoma cellen. Met de gepresenteerde methode kunnen zowel niet-omhulde, als omhulde virale deeltjes worden geoogst en gebruikt voor het inenten van verschillende cellijnen.

Een cel cultuur model voor de productie van hoge titer hepatitis E virus voorraden

Dit manuscript beschrijft een gedetailleerd protocol voor hepatitis B-virus (HBV) infectie in nieuwe 293T cellen (293T-NE-3NRs, uitdrukken van menselijke NTCP, HNF4α, RXRα en PPARα) en traditionele levercellen (HepG2-NE, uitdrukken van menselijke NTCP).

Modellering hepatitis B-virusinfectie in niet-leverloze 293T-NE-3NRs-cellen

Dit protocol presenteert een 3D biomimetisch model met bijbehorend fibrotisch stromaal compartiment. Bereid met fysiologisch relevante hydrogels in verhoudingen die de biofysische eigenschappen van de stromale extracellulaire matrix nabootsen, een actieve bemiddelaar van cellulaire interacties, tumorgroei en uitzaaiingen.

Een biomimetisch model voor leverkanker om tumor-stroma-interacties te bestuderen in een 3D-omgeving met afstembare bio-fysische eigenschappen

Uitgebreide in vitro modellen die de relevante menselijke ziekte getrouw samenvatten, ontbreken. De huidige studie presenteert driedimensionale (3D) tumor sferoïde creatie en cultuur, een betrouwbaar in vitro hulpmiddel om de tumor-stromale interactie in humaan hepatocellulair carcinoom te bestuderen.

Een driedimensionaal sferoïde model om de tumor-stromale interactie bij hepatocellulair carcinoom te onderzoeken

We presenteren een protocol om anti-hepatitis B-virus (HBV) verbindingen te screenen gericht op pre- en post-virale entry lifecycle stadia, met behulp van isothermische titratie calorimetrie om bindingsaffiniteit (KD) te meten met gastheer natrium taurocholaat cotransporting polypeptide. Antivirale werkzaamheid werd bepaald door de onderdrukking van virale levenscyclusmarkers (cccDNA-vorming, transcriptie en virale assemblage).

Een competent hepatocytenmodel dat de toegang tot het hepatitis B-virus onderzoekt via natrium taurocholaat cotransporterend polypeptide als een therapeutisch doelwit

Organoïden revolutioneren gepersonaliseerde weefselmodellering voor orgaanontwikkeling, medicijnontdekking en ziekteonderzoek. De voortgang in organoïdengineering leidt tot het creëren van ingewikkelde synthetische weefsels. Het doel is om morfogenese, assembloïdtechnologie en biomatrices te integreren om weefselengineering te bevorderen. Dit protocol helpt bij het modelleren van leverorganogenese en het vaststellen van richtlijnen voor de constructie van synthetisch weefsel.

In Vitro Cultuurtechnieken voor het Modelleren van Lever Organogenese, het Bouwen van Assembloids en het Ontwerpen van Synthetisch Weefsel met behulp van Menselijk Cellijnen

Leer hoe u een gerecellulariseerd levermodel met HepG2-cellen opbouwt voor virologisch onderzoek met virale vectoren. Deze methode vermindert dierproeven en verbetert de relevantie voor humane fysiologie.

Studie van virale vectoren in een drie-dimensionale lever Model herbevolkt met de menselijke hepatocellulair carcinoom cellijn HepG2 (Video) | JoVE Journal

Studie van virale vectoren in een drie-dimensionale lever Model herbevolkt met de menselijke hepatocellulair carcinoom cellijn HepG2

Meer video's verkennen