Studie van virale vectoren in een drie-dimensionale lever Model herbevolkt met de menselijke hepatocellulair carcinoom cellijn HepG2
24 oktober 2016
De recellulariseerde extracellulaire matrix van een decellulaire rattenlever kan worden gebruikt als een gehumaniseerd, driedimensionaal ex vivo model om de distributie en transgenexpressie van een virus of vireel vector te bestuderen.
Het algemene doel van deze procedure is om een driedimensionaal levermodel te ontwikkelen om virussen en virale vectoren te bestuderen. Deze methode maakt het mogelijk om biologische processen te bestuderen in een gevasculariseerd driedimensionaal systeem met menselijke cellen die qua fysiologie verschillen van knaagdiercellen in een muis- of rattenmodel. Bovendien is het een stap om het welzijn van dieren te verbeteren omdat het experimenten met levende dieren vermijdt en op de lange termijn bedoeld is om dierlijke componenten volledig te vervangen.
Hoewel we deze methode ontwikkelden om virale vectoren voor genoverdracht te bestuderen, kan deze ook worden toegepast op de studie van infectieuze vitale virussen en andere onderzoeksgebieden zoals kankeronderzoek. Het demonstreren van de procedure zal Viola Rohrs zijn, een technicus uit mijn laboratorium. Omwille van het welzijn van dieren werden alleen overtollige dieren gebruikt voor de huidige studie die werden gedood voor andere dierproeven, d.w.z.
er waren geen extra dieren nodig om de leverstructuren te verkrijgen. Om te beginnen, breidt u eerst de levercellijn Hep G2 uit. Zaai 15 miljoen cellen in T175 flesjes in 30 milliliter medium dat 10% foetaal runderserum en twee millimol gulatmine, penicilline en streptomycine bevat. Na vier dagen cultiveren, gebruikt u vijf minuten trypsinoplossing onder kweekomstandigheden om de cellen los te maken en haalt u ze vervolgens binnen.
Spin vervolgens de cellen 300 Gs gedurende drie minuten. Resuspendeer ze vervolgens in vier milliliter PBS en haal een celtelling. Elke fles zou ongeveer 45 miljoen cellen moeten opleveren.
Er zijn 600 miljoen cellen nodig om een rattenlever-ECM te recellulariseren. Om de ECM te recellulariseren, stelt u eerst het bioreactorsysteem in dat een leverperfusiekamer, een perfusiesysteem, een reservoir van medium en een belval bevat. Er zijn twee kritische stappen in de recellularisatieprocedure.
Een is om te voorkomen dat er luchtbellen in het perfusiesysteem worden opgevangen. De tweede is dat het hele systeem steriel moet worden gehouden. Steriliseer eerst deze componenten van het bioreactorsysteem bij 121 graden Celsius gedurende 15 minuten.
Vervolgens vult u de slangen en de gesteriliseerde perfusiekamer met medium. Plaats vervolgens het gedecellulariseerde rattenleverframe in de leverperfusiekamer. De volgende stap is om buisklemmen te gebruiken om de canuleerde poortader te verbinden met het perfusiesysteem.
Plaats nu het bioreactorsysteem in de incubator en verbindt het met een peristaltiekpomp. Equilibreer vervolgens de scaffold gedurende vijf dagen met 150 milliliter gesupplementeerd medium. Stel de stroom op 1,25 milliliter per minuut.
Na vijf dagen koppelt u het bioreactorsysteem los van de pomp en brengt u het over naar een steriele kap. Koppel de leverstructuur los van het mediacircuit. Laad vervolgens een spuit met vijf milliliter medium dat 300 miljoen Hep G2-cellen bevat en injecteert u de cellen via de poortader, waarbij de vorming van luchtbellen wordt vermeden.
Laat vervolgens de cellen een uur de ECM herbevolken zonder de pomp te laten lopen. Start na een uur de pomp bij 1,25 milliliter per minuut. Verhoog na 10 minuten de druk naar 2,5 milliliter per minuut.
Na nog eens 20 minuten, stelt u de pomp in op de bedrijfssnelheid van 3,75 milliliter per minuut. Na 30 minuten op volle pompsnelheid, zet de pomp uit, voeg nog eens 300 miljoen cellen toe en laat de cellen de ECM een uur lang bevolken. Verhoog na een uur geleidelijk de circulatie door incrementele aanpassingen van de pompsnelheid zoals eerder.
Laat nu het kweekmedium de lever gedurende twee weken recellulariseren. Elke twee dagen vervangt u 50 milliliter van het medium en meet u de fysiologische parameters van een monster van het gebruikte medium. De productie van AAV-vectoren is een ingewikkelde procedure met veel stappen die worden samengevat in het tekstprotocol.
In dit deel van de video worden enkele van de cruciale stappen gedemonstreerd. Produceer, zuiver en kwantificeer eerst de AAV-vectoren. Produceer de AAV-vectoren kort in rollerflesjes en zuiver ze door iodixanolgradiëntcentrifugering.
Verwijder de resterende iodixanol door filtratie over PD10-gelfiltratiekolommen. Bepaal vervolgens de AAV-vectorconcentratie door QPCR met gebruik van genomisch AAV-DNA als standaard. Er zijn in totaal 27 biljoen AAV-vectoren nodig per model.
Transduceer nu het levermodel. Haal eerst 27 biljoen vectoren in vijf milliliter PBS op in een spuit. Fenolrood kan worden toegevoegd bij 5 microgram per milliliter.
Koppel vervolgens de lever los van het mediacircuit en injecteer de vectoren in het systeem. Incubeer het systeem na injectie gedurende een uur zonder te pompen. Verhoog vervolgens de stroom zoals eerder beschreven.
Later, terwijl de getransduceerde lever gedurende zes dagen wordt geïncubeerd, vervangt u elke twee dagen 50 milliliter van het medium. Snijd met behulp van een scalpel monsters uit elk leverkwabje dat ongeveer een halve centimeter dik en 1,5 tot twee centimeter lang is. Incubeer de plakjes gedurende 90 minuten bij vier graden Celsius in 4% paraformaldehyd met 4% sucrose.
Was vervolgens het monster drie keer gedurende één minuut per wasbeurt met PBS. Volg de wasbeurten door de monsters gedurende een nacht in 8% sucrose bij vier graden Celsius te incuberen. De volgende dag laadt u de monsters in cryomolds met wat fixeermedium.
Voorkom het introduceren van luchtbellen. Eenmaal geladen, bedek de monsters volledig met fixeermedium en plaats ze bij minuus 80 graden Celsius. Eenmaal bevroren, bereidt u 10 micron cryosecties van de monsters voor met behulp van een cryotome.
Kleur de monsters zoals nodig om de recellularisatie te bevestigen. Voor genexpressieanalyse neemt u monsters met behulp van een vier millimeter biopsie-pons. Om de recellularisatie te beoordelen, werden cryosecties gekleurd met hemotoxylin en eosin.
Lobben uit twee getransduceerde leveren en één controlelever die werd recellulariseerd maar niet getransduceerd, werden allemaal her
Overzicht
Deze studie presenteert een methode voor de ontwikkeling van een driedimensionaal levermodel met behulp van een recellulariseerde extracellulaire matrix uit gedecellulariseerde rattenlevers. Dit model maakt onderzoek naar virale vectoren en gentransfer in een gehumaniseerde omgeving mogelijk, waardoor de relevantie van de bevindingen voor de menselijke fysiologie wordt vergroot.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschap
- Biologie
- Onderzoek naar virale vectoren
Achtergrond
- Het gebruik van gedecellulariseerde organen als scaffolds voor studies met menselijke cellen.
- Het belang van het bestuderen van biologische processen in een mensachtige omgeving.
- Vermindering van dierproeven door geavanceerde ex vivo-modellen.
- Potentiële toepassingen in gentherapie en kankeronderzoek.
Doel van de studie
- Om een gehumaniseerd levermodel te creëren voor het bestuderen van virale vectoren.
- Om het dierenwelzijn te verbeteren door het gebruik van levende dieren te minimaliseren.
- Om onderzoek naar gentransfer en infectieuze virussen te faciliteren.
Gebruikte methoden
- Expansie van de Hep G2 levercellijn voor recellularisatie.
- Gebruik van een bioreactorsysteem voor perfusie en celzaaien.
- Monitoring van fysiologische parameters tijdens de kweek.
- Transductie van het levermodel met AAV-vectoren voor analyse van genexpressie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle recellularisatie van de lever-ECM met Hep G2-cellen.
- Kwantificering van vectorgenomen die wijzen op een effectieve genoverdracht.
- Demonstratie van de bruikbaarheid van het model voor het bestuderen van virale vectoren.
- Validatie van genexpressie via RT-PCR en western blotting.
Conclusies
- Het recellulariseerde levermodel is een veelbelovend instrument voor virologisch onderzoek.
- Deze methode ondersteunt ethische onderzoekspraktijken door het gebruik van dieren te verminderen.
- Verdere toepassingen in gentherapie en kankeronderzoek worden verwacht.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Dit 3D gehumaniseerd levermodel maakt fysiologisch relevante studie van virale vectoren en genoverdrachtmechanismen in een gevasculariseerd systeem mogelijk, waardoor de afhankelijkheid van diermodellen wordt verminderd en de translationele voorspelbaarheid voor hepatotrope therapieën wordt verbeterd. Het model ondersteunt mechanische risicoreductie van AAV-gebaseerde genoverdracht door de vectorverdeling, transgene expressie en functionele knockdown in een menselijke celcontext te kwantificeren. Het biedt een schaalbaar, reproduceerbaar platform voor vroege targetvalidatie en lead-identificatie in pipelines voor antivirale genetherapie en oncologische genetherapie.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om de transductie-efficiëntie van virale vectoren en de expressie van transgenen te onderzoeken in een context van menselijke hepatocyten.
- Operationele waarde: Ondersteunt functionele targetvalidatie via meetbare knockdown van endogene genen zoals cyclophiline B.
- Voorspellende waarde: Kwantificeerbare vectorgenomen per cel (55–90) bieden een drempelwaarde voor het beoordelen van het potentieel voor gene silencing.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Klaarheid voor Analyse: Maakt gestandaardiseerde qPCR-, Western blot- en immunohistochemie-metingen mogelijk voor de distributie van vectoren en de expressie van transgenen.
- Kwantitatieve Resultaten: Maakt meting van vectorgenomen per cel en eiwitexpressieniveaus mogelijk als dosis-responsmetrieken.
- Reproduceerbaarheid: Perfusie-gestuurde toediening en mediumverversing gedurende zes dagen ondersteunen consistente transductiecondities.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziektebeeld: Humane HepG2-cellen bieden een nauwere fysiologische overeenkomst met de menselijke lever dan knaagdiermodellen.
- Translationele continuïteit: Ondersteunt de voortgang van vectorscreening naar mechanistische studies van gene knockdown en off-target effecten.
- Risicobeperking: Maakt evaluatie van vector-gerelateerde biologische activiteit mogelijk voorafgaand aan in vivo testen.
Integratie van Pipeline & Workflow
Het model past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie via lead-identificatie tot preklinische mechanistische studies, in het bijzonder voor gen-therapieën gericht op de lever.
- Discovery Biology: Faciliteert hypothesetesten met betrekking tot viraal vector-tropisme, transductie-efficiëntie en transgene expressie in een 3D menselijke levermicro-omgeving.
- Screening: Maakt gestandaardiseerde evaluatie van AAV-vectorbatches mogelijk via perfusietoediening en kwantificeerbare moleculaire read-outs.
- Analytics: QPCR voor vectorgenomen, RT-PCR en Western blot voor transgene expressie, en immunohistochemie voor ruimtelijke distributie leveren multiparametrische gegevens.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt de in vitro vectorprestaties met menselijk relevante genexpressie en knockdown-resultaten.
- Bedrijfsmatige Hergebruikbaarheid: Het perfusie-bioreactorsysteem kan worden aangepast voor meerdere vectortypen en cellijnen, wat standaardisatie tussen projecten ondersteunt.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellend vertrouwen in de prestaties van vectoren via menselijke celgebaseerde kwantificering van transductie en genexpressie.
- Operationele waarde: Een steriel, gesloten perfusiesysteem minimaliseert het risico op contaminatie en ondersteunt longitudinale bemonstering.
- Strategische waarde: Maakt go/no-go-beslissingen mogelijk op basis van vector dosis-respons en functionele knockdown-gegevens voorafgaand aan dierstudies.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering van AAV-kandidaten door in vitro metrieken te koppelen aan functionele gensilencing.
Overwegingen voor Implementatie
- Vereist expertise in weefselengineering, virale vectorproductie en moleculaire analyses (qPCR, Western blot, immunohistochemie).
- Afhankelijk van toegang tot bioreactorsystemen, perfusie-opstellingen en steriele celkweekinfrastructuur.
- Vereist standaardisatie van de celzaaidichtheid, vectordosis (27 biljoen vectoren/model) en schema's voor mediumverversing.
- Aanpassing aan andere cellijnen of ziektemodellen kan optimalisatie van de ECM en afstemming van de perfusieparameters vereisen.
- Beperkt door de tijdlijn van twee weken voor recellularisatie en de afhankelijkheid van de beschikbaarheid van donorleverscaffolds.
Veelgestelde vragen over biofarmaceutica
Chapters in this video
0:05
Title
1:08
Recellularization of Extracellular Matrix (ECM) of a Rat Liver
4:28
Transduction of the Recellularized Rat Liver
5:59
Assessment of the Recellularized Transduced Rat Liver
7:14
Results: Recellularization Assessment and Transduction Efficiency
8:39
Conclusion
