Name: voorbereiding en In Vivo Gebruik van een Activity-based Probe voor N -acylethanolamine Acid amidase (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Leer de synthese en toepassing van activiteitsgebaseerde probe ARN14686 voor detectie van actief N-acylethanolamine acid amidase (NAAA) in celextracten en weefsels. Deze methode biedt betrouwbare inzichten in enzymactivatie bij inflammatoire en neurodegeneratieve aandoeningen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken het Nikon Imaging Center bij Istituto Italiano di Tecnologia, Genua, Italië (NIC@IIT).

<ol><li>Gygi, S. P., Han, D. K., Gingras, A. C., Sonenberg, N., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+analysis+by+mass+spectrometry+and+sequence+database+searching%3A+tools+for+cancer+research+in+the+post-genomic+era%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Protein analysis by mass spectrometry and sequence database searching: tools for cancer research in the post-genomic era.</a> Electrophoresis. 20, 310-319 (1999).</li>
<li>Washburn, M. P., Wolters, D., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+analysis+of+the+yeast+proteome+by+multidimensional+protein+identification+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Large-scale analysis of the yeast proteome by multidimensional protein identification technology.</a> Nat Biotechnol. 19, 242-247 (2001).</li>
<li>Zhu, H., Bilgin, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Proteomics.</a> Annu Rev Biochem. 72, 783-812 (2003).</li>
<li>Ito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+for+the+two-hybrid+system+in+exploration+of+the+yeast+protein+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Roles for the two-hybrid system in exploration of the yeast protein interactome.</a> Mol Cell Proteomics. 1, 561-566 (2002).</li>
<li>Evans, M. J., Cravatt, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism-based+profiling+of+enzyme+families%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Mechanism-based profiling of enzyme families.</a> Chem Rev. 106, 3279-3301 (2006).</li>
<li>Cravatt, B. F., Wright, A. T., Kozarich, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-based+protein+profiling%3A+from+enzyme+chemistry+to+proteomic+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Activity-based protein profiling: from enzyme chemistry to proteomic chemistry.</a> Annu Rev Biochem. 77, 383-414 (2008).</li>
<li>Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stepwise+huisgen+cycloaddition+process%3A+copper%28I%29-catalyzed+regioselective+%22ligation%22+of+azides+and+terminal+alkynes%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 41, 2596-2599 (2002).</li>
<li>Meldal, M., Tornoe, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cu-catalyzed+azide-alkyne+cycloaddition%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Cu-catalyzed azide-alkyne cycloaddition.</a> Chem Rev. 108, 2952-3015 (2008).</li>
<li>Speers, A. E., Adam, G. C., Cravatt, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-based+protein+profiling+in+vivo+using+a+copper%28i%29-catalyzed+azide-alkyne+%5B3+%2B+2%5D+cycloaddition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Activity-based protein profiling in vivo using a copper(i)-catalyzed azide-alkyne [3 + 2] cycloaddition.</a> J Am Chem Soc. 125, 4686-4687 (2003).</li>
<li>Saxon, E., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+engineering+by+a+modified+Staudinger+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell surface engineering by a modified Staudinger reaction.</a> Science. 287, 2007-2010 (2000).</li>
<li>Kohn, M., Breinbauer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Staudinger+ligation-a+gift+to+chemical+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">The Staudinger ligation-a gift to chemical biology.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 43, 3106-3116 (2004).</li>
<li>Romeo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-Based+Probe+for+N-Acylethanolamine+Acid+Amidase%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Activity-Based Probe for N-Acylethanolamine Acid Amidase.</a> ACS Chem Biol. 10, 2057-2064 (2015).</li>
<li>Ueda, N., Yamanaka, K., Yamamoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+an+acid+amidase+selective+for+N-palmitoylethanolamine%2C+a+putative+endogenous+anti-inflammatory+substance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of an acid amidase selective for N-palmitoylethanolamine, a putative endogenous anti-inflammatory substance.</a> J Biol Chem. 276, 35552-35557 (2001).</li>
<li>Tsuboi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+N-acylethanolamine-hydrolyzing+acid+amidase%2C+a+novel+member+of+the+choloylglycine+hydrolase+family+with+structural+and+functional+similarity+to+acid+ceramidase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase, a novel member of the choloylglycine hydrolase family with structural and functional similarity to acid ceramidase.</a> J Biol Chem. 280, 11082-11092 (2005).</li>
<li>Tsuboi, K., Takezaki, N., Ueda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+N-acylethanolamine-hydrolyzing+acid+amidase+%28NAAA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biodivers%22%5BJournal%5D)">The N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase (NAAA).</a> Chem Biodivers. 4, 1914-1925 (2007).</li>
<li>Ribeiro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Potent+Systemically+Active+N-Acylethanolamine+Acid+Amidase+Inhibitor+that+Suppresses+Inflammation+and+Human+Macrophage+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">A Potent Systemically Active N-Acylethanolamine Acid Amidase Inhibitor that Suppresses Inflammation and Human Macrophage Activation.</a> ACS Chem Biol. 10, 1838-1846 (2015).</li>
<li>Zhao, L. Y., Tsuboi, K., Okamoto, Y., Nagahata, S., Ueda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolytic+activation+and+glycosylation+of+N-acylethanolamine-hydrolyzing+acid+amidase%2C+a+lysosomal+enzyme+involved+in+the+endocannabinoid+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Proteolytic activation and glycosylation of N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase, a lysosomal enzyme involved in the endocannabinoid metabolism.</a> Biochim Biophys Acta. 1771, 1397-1405 (2007).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acid+residues+crucial+in+pH+regulation+and+proteolytic+activation+of+N-acylethanolamine-hydrolyzing+acid+amidase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Amino acid residues crucial in pH regulation and proteolytic activation of N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase.</a> Biochim Biophys Acta. 1781, 710-717 (2008).</li>
<li>West, J. M., Zvonok, N., Whitten, K. M., Wood, J. T., Makriyannis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometric+characterization+of+human+N-acylethanolamine-hydrolyzing+acid+amidase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometric characterization of human N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase.</a> J Proteome Res. 11, 972-981 (2012).</li>
<li>Bandiera, T., Ponzano, S., Piomelli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+discovery+of+N-acylethanolamine+acid+amidase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Res%22%5BJournal%5D)">Advances in the discovery of N-acylethanolamine acid amidase inhibitors.</a> Pharmacol Res. 86, 11-17 (2014).</li>
<li>Sasso, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antinociceptive+effects+of+the+N-acylethanolamine+acid+amidase+inhibitor+ARN077+in+rodent+pain+models%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Antinociceptive effects of the N-acylethanolamine acid amidase inhibitor ARN077 in rodent pain models.</a> Pain. 154, 350-360 (2013).</li>
<li>Duranti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-%282-oxo-3-oxetanyl%29carbamic+acid+esters+as+N-acylethanolamine+acid+amidase+inhibitors%3A+synthesis+and+structure-activity+and+structure-property+relationships%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">N-(2-oxo-3-oxetanyl)carbamic acid esters as N-acylethanolamine acid amidase inhibitors: synthesis and structure-activity and structure-property relationships.</a> J Med Chem. 55, 4824-4836 (2012).</li>
<li>Ponzano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+structure-activity+relationship+%28SAR%29+of+2-methyl-4-oxo-3-oxetanylcarbamic+acid+esters%2C+a+class+of+potent+N-acylethanolamine+acid+amidase+%28NAAA%29+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Synthesis and structure-activity relationship (SAR) of 2-methyl-4-oxo-3-oxetanylcarbamic acid esters, a class of potent N-acylethanolamine acid amidase (NAAA) inhibitors.</a> J Med Chem. 56, 6917-6934 (2013).</li>
<li>Solorzano, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+structure-activity+relationships+of+N-%282-oxo-3-oxetanyl%29amides+as+N-acylethanolamine-hydrolyzing+acid+amidase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Synthesis and structure-activity relationships of N-(2-oxo-3-oxetanyl)amides as N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase inhibitors.</a> J Med Chem. 53, 5770-5781 (2010).</li>
<li>Vitale, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis%2C+structure-activity%2C+and+structure-stability+relationships+of+2-substituted-N-%284-oxo-3-oxetanyl%29+N-acylethanolamine+acid+amidase+%28NAAA%29+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22ChemMedChem+9%22%5BJournal%5D)">Synthesis, structure-activity, and structure-stability relationships of 2-substituted-N-(4-oxo-3-oxetanyl) N-acylethanolamine acid amidase (NAAA) inhibitors.</a> ChemMedChem 9. 9, 323-336 (2014).</li>
<li>Fiasella, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-Aminoazetidin-2-one+derivatives+as+N-acylethanolamine+acid+amidase+%28NAAA%29+inhibitors+suitable+for+systemic+administration%5BTitle%5D)+AND+%22ChemMedChem+9%22%5BJournal%5D)">3-Aminoazetidin-2-one derivatives as N-acylethanolamine acid amidase (NAAA) inhibitors suitable for systemic administration.</a> ChemMedChem 9. 9, 1602-1614 (2014).</li>
<li>Armirotti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-Lactones+Inhibit+N-acylethanolamine+Acid+Amidase+by+S-Acylation+of+the+Catalytic+N-Terminal+Cysteine%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Med+Chem+Lett%22%5BJournal%5D)">beta-Lactones Inhibit N-acylethanolamine Acid Amidase by S-Acylation of the Catalytic N-Terminal Cysteine.</a> ACS Med Chem Lett. 3, 422-426 (2012).</li>
<li>Nuzzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+alpha-amino-beta-lactam+carbamic+acid+ester+as+NAAA+inhibitors.+Synthesis+and+structure-activity+relationship+%28SAR%29+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Potent alpha-amino-beta-lactam carbamic acid ester as NAAA inhibitors. Synthesis and structure-activity relationship (SAR) studies.</a> Eur J Med Chem. 111, 138-159 (2016).</li>
<li>Bonezzi, F. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Important+Role+for+N-Acylethanolamine+Acid+Amidase+in+the+Complete+Freund%27s+Adjuvant+Rat+Model+of+Arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Exp+Ther%22%5BJournal%5D)">An Important Role for N-Acylethanolamine Acid Amidase in the Complete Freund's Adjuvant Rat Model of Arthritis.</a> J Pharmacol Exp Ther. 356, 656-663 (2016).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal Biochem. 150, 76-85 (1985).</li>
<li>Speers, A. E., Cravatt, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-Based+Protein+Profiling+%28ABPP%29+and+Click+Chemistry+%28CC%29-ABPP+by+MudPIT+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Activity-Based Protein Profiling (ABPP) and Click Chemistry (CC)-ABPP by MudPIT Mass Spectrometry.</a> Curr Protoc Chem Biol. 1, 29-41 (2009).</li>
<li>Rybak, J. N., Scheurer, S. B., Neri, D., Elia, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+biotinylated+proteins+on+streptavidin+resin%3A+a+protocol+for+quantitative+elution%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Purification of biotinylated proteins on streptavidin resin: a protocol for quantitative elution.</a> Proteomics. 4, 2296-2299 (2004).</li>
<li>Penna, A., Cahalan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+Blotting+using+the+Invitrogen+NuPage+Novex+Bis+Tris+minigels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Western Blotting using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels.</a> J Vis Exp. (264), (2007).</li>
<li>Giuffrida, A., Piomelli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isotope+dilution+GC%2FMS+determination+of+anandamide+and+other+fatty+acylethanolamides+in+rat+blood+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Isotope dilution GC/MS determination of anandamide and other fatty acylethanolamides in rat blood plasma.</a> FEBS Lett. 422, 373-376 (1998).</li>
<li>Buczynski, M. W., Parsons, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+brain+endocannabinoid+levels%3A+methods%2C+interpretations+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Quantification of brain endocannabinoid levels: methods, interpretations and pitfalls.</a> Br J Pharmacol. 160, 423-442 (2010).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Enzymactiviteit fijn gereguleerd op verschillende niveaus, zoals RNA transcriptie, eiwitsynthese, eiwittranslocatie, post-translationele modificatie en eiwit-eiwit interactie. Vaak enzymexpressie alleen houdt geen rekening met de activiteiten. ABPP werd ontwikkeld om de activiteit van eiwitten te bestuderen in hun natieve toestand. Twee functies nodig: een chemische probe die covalent bindt aan de actieve plaats van een enzym van belang en een reporter tag aan de probe gelabeld enzym detecteren. <p class="jove_conte...

Veel gebruikte methodes om de expressiepatronen interacties en functies van eiwitten, waaronder vloeistofchromatografie-massaspectrometrie platforms voor jachtgeweer analyse 1,2, gist two-hybrid onderzoeken methoden 3,4 en in vitro assays, zijn beperkt doordat ze in staat om de activiteit van eiwitten bepalen in hun natieve toestand. Activity-based eiwit profiling (ABPP) kan worden gebruikt om deze leemte op te vullen. In deze benadering, kleine-molecule probes covalent binden aan de actieve plaats van een enzym van belang geconjugeerd aan een reporter groep die zorgt voor doeldetectie. Met behulp van click chemie (CC), kan de verslaggever worden geïntegreerd in de probe of kan worden ingevoerd na doelwit betrokkenheid heeft plaatsgevonden 5,6. De laatste procedure vereist het gebruik van probes die geschikte chemische groepen, zoals een terminale alkyn of azide, die met een aantal reporter reagens kan worden gewijzigd via bio-orthogonale reacties such als Cu (I) -gekatalyseerde Huisgen [3 + 2] cycloadditie 7-9 of Staudinger ligation 10,11. Onlangs beschreven wij de verbinding ARN14686 als eerste ABP voor de in vitro en in vivo detectie van de cysteïne hydrolase, NAAA 12. NAAA katalyseert de hydrolytische inactivering van verzadigde en enkelvoudig onverzadigde FAES, waaronder oleoylethanolamide (OEA) en palmitoylethanolamide (PEA), die endogene agonisten van de anti-inflammatoire nucleaire receptor PPAR-alpha 13-15 zijn. NAAA wordt voornamelijk tot expressie gebracht in macrofagen en andere van monocyt afgeleide cellen, en in B-lymfocyten 14,16, suggereert een rol in de regulatie van de aangeboren immuunrespons. Het enzym wordt gesynthetiseerd in het ruw ER in een inactieve vorm en zure compartimenten van de cel wordt geactiveerd door een autoproteolytische mechanisme 17. De autoprotolytische splitsing genereert een nieuw N-terminale cysteïne (C131 bij muizen en ratten, C126 bij de mens), die het nucleofiel belast FAE hydrolyse 18,19. Farmacologische remming van NAAA activiteit verandert de FAE synthese / afbraak balans in het voordeel van verhoogde cellulaire niveaus van Faes 16,20,21. Verschillende β-lacton en β-lactam derivaten aangetoond dat NAAA activiteit te remmen met hoge potentie en selectiviteit 16,22-26. Deze remmers werken via S-acylering van het katalytische cysteïne 16,27,28. De verbinding ARN14686 werd ontworpen op basis van de chemische structuur van de systemisch actieve serine-afgeleide β-lactam NAAA inhibitor, ARN726 (4-cyclohexylbutyl- N - [(S) -2-oxoazetidin-3-yl] carbamaat) 16. De 4-butyl- cyclohexyl groep ARN726 werd vervangen door een C9 verzadigde alifatische keten die van een terminal alkyn tag CC daaropvolgende conjugatie met een azide-dragende reporter tag. Wij kozen voor een tweestaps ABP ontwerpen om minimally veranderen de structuur van de oorspronkelijke steiger, waardoor het behoud van de affiniteit van de sonde voor NAAA. Bovendien vermijden van de introductie van omvangrijke markeringen dergelijke sonde kan meer geschikt zijn voor in vivo behandeling van een directe ABP zijn. ARN14686 remt NAAA met hoge potentie (hNAAA IC 50 = 6 nM, rNAAA IC50 = 13 nM) door vorming van een covalente adduct met de katalytische cysteïne van het enzym 12. Experimenten in levende ratten toonde aan dat de sonde selectief vastleggen NAAA uitgedrukt in longen. Zuur ceramidase, een cysteïne amidase dat 33-34% identiteit deelt met NAAA, werd ook geïdentificeerd als een lage-affiniteit doelwit Als hoge probe concentraties (10 uM in vitro, 10 mg / ml intraveneus, iv) 12. We hebben ook ARN14686 de aanwezigheid van actieve NAAA in ontstoken weefsels ratten na toediening van adjuvans (CFA) 29 volledig Freund bestuderen. Hier schetsen we een protocol voor de preparatiop van ARN14686 (figuur 1) en de toepassing ervan op het onderzoek naar NAAA activering ex vivo. Als voorbeeld beschrijven we een experimentele procedure NAAA visualiseren rat poten na CFA toediening. In dit experiment worden eiwitten geëxtraheerd uit weefsel poot na intraveneuze injectie van de sonde en het ABP-gemerkte proteoom wordt onderworpen aan CC biotine-azide. Gebiotinyleerde monsters worden verrijkt via streptavidine parels en eiwitblots worden uitgevoerd. In een andere toepassing, beschrijven we de lokalisatie van actieve NAAA van fluorescentiemicroscopie in muizenlongen van probe-behandelde muizen. In dit geval wordt het weefsel doorgesneden en secties worden onderworpen aan CC rhodamine toevoeging. Een werkstroom schema is weergegeven in figuur 2.

<table><tbody><tr><td>1,1&rsquo;-sulfonyldiimidazole&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>367818</td><td>Schadelijk</td></tr><tr><td>2-dipyridylcarbonate</td><td>Fluorochem</td><td>11331</td><td>Schadelijk</td></tr><tr><td>2-Methylbutan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M32631</td><td>Ontvlambaar, giftig, gevaarlijk voor het aquatisch milieu</td></tr><tr><td>4-(Dimethylamino)pyridine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>107700</td><td>Giftig</td></tr><tr><td>Azijnzuur</td><td>Sigma Aldrich</td><td>695092</td><td>Ontvlambaar, corrosief</td></tr><tr><td>Acetonitrile&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34998</td><td>Ontvlambaar, giftig</td></tr><tr><td>Geactiveerde houtskool</td><td>Sigma Aldrich</td><td>161551</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumchloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9434</td><td>Schadelijk</td></tr><tr><td>Azide-PEG3-Biotin</td><td>Jena Biosciences</td><td>CLK-AZ104P4</td><td></td></tr><tr><td>Azide-PEG3-Fluor 545</td><td>Jena Biosciences</td><td>CLK-AZ109</td><td></td></tr><tr><td>BCA-eiwitassaykit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Bio-spin kolommen</td><td>Biorad</td><td>732-6204</td><td></td></tr><tr><td>Biotine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B4501</td><td></td></tr><tr><td>Blokbuffer</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>927-40000</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6250</td><td>Zeer giftig</td></tr><tr><td>Rundserumalbumine (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Broomfenolblauw</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B0126</td><td></td></tr><tr><td>Bruker Avance III 400</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Celite</td><td>Sigma Aldrich</td><td>419931</td><td>Gezondheidsrisico</td></tr><tr><td>Ceriumammoniumnitraat&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>22249</td><td>Oxderend, schadelijk</td></tr><tr><td>Chloraalhydraat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8383</td><td>Zeer giftig</td></tr><tr><td>CuSO4.5H2O&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>209198</td><td>Giftig</td></tr><tr><td>Cyclohexadieen</td><td>Sigma Aldrich</td><td>125415</td><td>Ontvlambaar, gezondheidsrisico</td></tr><tr><td>Cyclohexaan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34855</td><td>Ontvlambaar, schadelijk, gezondheidsrisico, milieurisico</td></tr><tr><td>Dichloormethaan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34856</td><td>Schadelijk, gezondheidsrisico</td></tr><tr><td>Di-ethylether</td><td>Sigma Aldrich</td><td>296082</td><td>Ontvlambaar, schadelijk</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td><td>Acros Organics</td><td>348441000</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide d6 (DMSO-d6)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>175943</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>2860</td><td>Ontvlambaar, schadelijk</td></tr><tr><td>Ethylacetaat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34858</td><td>Ontvlambaar, schadelijk</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Irdye 680-LT Streptavidine</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>925-68031</td><td></td></tr><tr><td>IRDye680-LT Streptavidine&nbsp;</td><td>Licor</td><td>925-68031</td><td>Kort centrifugeren voor gebruik om eiwitcomplexen te laten bezinken</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34966</td><td>Zeer giftig</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34860</td><td>Ontvlambaar, giftig, gezondheidsrisico</td></tr><tr><td>N-(3-Dimethylaminopropyl)-N&prime;-ethylcarbodiimide hydrochloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7750</td><td>Schadelijk, corrosief</td></tr><tr><td>N,N-diisopropylethylamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D125806</td><td>Ontvlambaar, corrosief, giftig</td></tr><tr><td>N,N-dimethylformamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>227056</td><td>Ontvlambaar, schadelijk, gezondheidsrisico</td></tr><tr><td>N-Cbz-L-Serine</td><td>Fluorochem</td><td>M03053</td><td>Schadelijk</td></tr><tr><td>Nikon A1 confocale microscopie</td><td>Nikon</td><td></td><td>Lees de gebruiksaanwijzing</td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0335BOX</td><td></td></tr><tr><td>Palladium op koolstof</td><td>Sigma Aldrich</td><td>330108</td><td></td></tr><tr><td>p-anisidine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A88255</td><td>Giftig, gezondheidsrisico, milieurisico</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>sigma Aldrich</td><td>441244</td><td>Giftig, schadelijk voor de luchtwegen, corrosief, ontvlambaar</td></tr><tr><td>Poly(ethyleenglycol)&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3265</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold antifade-medium met DAPI&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36931</td><td>Voorkom vorming van luchtbellen</td></tr><tr><td>Protease-remmercocktail</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonaat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfaat (SDS)&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3771</td><td>Giftig, corrosief, ontvlambaar</td></tr><tr><td>Natriumhydride&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>452912</td><td>Ontvlambaar</td></tr><tr><td>Natriumsulfaat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>239313</td><td></td></tr><tr><td>Starion FLA-9000 beeldscanner</td><td>FUJIFILM</td><td></td><td>Lees&nbsp; de gebruiksaanwijzing</td></tr><tr><td>Streptavidine-agarose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20349</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Tert-butanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>360538</td><td>Giftig, ontvlambaar</td></tr><tr><td>Tetrahydrofuraan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>186562</td><td>Ontvlambaar, schadelijk, gezondheidsrisico</td></tr><tr><td>Thioureum</td><td>Acros Organics</td><td>424542500</td><td>Giftig, verwarmen op 50 &deg;C om op te lossen</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma Aldrich</td><td>RDD008</td><td></td></tr><tr><td>Tris(2-carboxyethyl)fosfine (TCEP)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4706</td><td></td></tr><tr><td>Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA)</td><td>Sigma Aldrich</td>

voorbereiding en<em&gt; in vivo</em&gt; gebruik van een activity-based probe voor<em&gt; n</em&gt; -acylethanolamine acid amidase

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Activiteitsgestuurde eiwitprofilering (ABPP) is een methode voor de identificatie van een enzym van belang in een complex proteoom door het gebruik van een probe die chemisch actieve plaatsen van het enzym gericht. Een reporter tag ingebracht in de probe maakt de detectie van de gemerkte enzym in de gel fluorescentie scanning, eiwitblot, fluorescentiemicroscopie of vloeistofchromatografie-massaspectrometrie. Hier beschrijven we de bereiding en het gebruik van de verbinding ARN14686, een click chemie activiteit-gebaseerde probe (CC-ABP) die selectief herkent het enzym N -acylethanolamine acid amidase (NAAA). NAAA is een cysteïne hydrolase die de ontsteking bevordert door het uitschakelen van endogene peroxisoom proliferator-geactiveerde receptor (PPAR) -alfa agonisten zoals palmitoylethanolamide (PEA) en oleoylethanolamide (OEA). NAAA wordt gesynthetiseerd als een inactieve pro-enzym met volledige lengte, die wordt geactiveerd door autoproteolyse in de zure pH van het lysosoom. Lokalisatiestudies have aangetoond dat NAAA voornamelijk tot expressie wordt gebracht in macrofagen en andere van monocyt afgeleide cellen, en in B-lymfocyten. Wij geven voorbeelden van hoe ARN14686 kan worden gebruikt voor het detecteren en kwantificeren actieve NAAA ex vivo knaagdieren weefsel met eiwitblot en fluorescentie microscopie.

ARN14686 is gemaakt op basis van de steiger van de NAAA inhibitor ARN726. De 4-butyl- cyclohexyl groep ARN726 werd gesubstitueerd met een C9 verzadigde alifatische keten die van een tag terminale alkyn (figuur 1). Het alkyn tag werd ingevoerd om het gebruik van een labelingsprocedure twee stappen laten een fluorofoor of biotine molecuul via CC voegen. Deze functie maakt ARN14686 een zeer veelzijdig instrument om NAAA onderzoeken in vitro en in vivo. </p...

Hier beschrijven we de bereiding en toepassing van een op activiteit gebaseerde probe (ARN14686, undec-10-ynyl- N - [(3S) -2-oxoazetidin-3-yl] carbamaat) waarmee voor de detectie en kwantificering van de actieve vorm van het enzym N proinflammatoire -acylethanolamine acid amidase (NAAA), zowel in vitro en ex vivo.

voorbereiding en<em&gt; In Vivo</em&gt; Gebruik van een Activity-based Probe voor<em&gt; N</em&gt; -acylethanolamine Acid amidase

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical ...

Het algemene doel van deze procedure is het demonstreren van de synthese van de activiteitsgebaseerde probe ARN 14 six eight six, specifiek voor N-acylethanolaminezuur-amidase, of NAAA, en het beschrijven van het gebruik ervan voor het detecteren van het katalytisch actieve enzym in celextracten en weefselcoupes. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van vragen over de in vivo functie van NAAA, waardoor inzicht wordt verkregen in de activering van NAAA onder verschillende fysiologische en pathologische omstandigheden, zoals inflammatoire en neurodegeneratieve ziekten. Het belangrijkste voordeel is dat een eenvoudige manipulatie volgt op de reactie van NAAA met een probe, waardoor betrouwbare informatie wordt verkregen over de in vivo activatiestatus van het enzym.Een ander voordeel is dat onze probe, in tegenstelling tot specifieke antilichamen, alleen de actieve vorm van het enzym detecteert, wat nuttig is voor fluorescentiemicroscopie-status. Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien deze verschillende expertises combineert die samen een volledig verhaal vormen, van de juiste synthese tot de uiteindelijke toepassingen. Los 350 mg undecynenol op in

preparation-vivo-use-an-activity-based-probe-for-n-acylethanolamine

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Een protocol om trichothecenen (mycotoxinen van zorg voor de gezondheid van de mens) met behulp van een nieuw ontwikkelde screening methode gebaseerd op een competitief immunochemische methode en een laatste elektrochemische detectie te detecteren is aangetoond.

ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical) Methode voor Mycotoxine Detection

Dit protocol beschrijft de bereiding van een synthetisch tRNA substraat voor...

In vitro tRNA methylatie test met de Entamoeba histolytica DNA en tRNA methyltransferase Dnmt2 (Ehmeth) Enzym

Een methode voor de bepaling van acetaat kinase activiteit is beschreven. Deze test maakt gebruik van een directe reactie voor het bepalen van enzymactiviteit en de kinetiek van acetaat kinase in de acetaat-vormende richting met verschillende fosforyl acceptoren. Bovendien kan deze methode worden gebruikt voor het testen van andere acetyl fosfaat of acetyl-CoA gebruik te maken van enzymen.

Directe detectie van de acetaat-vormende activiteit van het enzym acetaat Kinase

This video demonstrates the in vitro measurement of enzyme activity for α-galactosidase A and acid α-glucosidase in samples using synthetic 4-Methylumbelliferyl substrates.

In Vitro Measurement of &alpha;-Galactosidase A and Acid &alpha;-Glucosidase Enzyme Activity

De omkeerbare toevoeging van palmitaat aan eiwitten is een belangrijke regulator van intracellulaire eiwitten mensenhandel. Dit is van bijzonder belang in neuronen waar veel synaptische eiwitten gepalmitoyleerd. We gebruiken een eenvoudige biochemische methode gepalmitoyleerd eiwitten in gekweekte neuronen, die kunnen worden aangepast voor meerdere celtypes en weefsels.

Detectie van eiwit palmitoylering in gekweekte hippocampale neuronen door immunoprecipitatie en Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Hier presenteren we een protocol om RNA / eiwit interacties te analyseren. De elektroforetische mobiliteit shift assay (EMSA) is gebaseerd op de differentiële migratie van RNA / eiwit-complexen en vrij RNA in natieve gelelektroforese. Door een radioactief gemerkte RNA-probe, kan RNA / eiwit-complexen worden gevisualiseerd door autoradiografie.

Elektroforetische mobiliteit Shift Assay (EMSA) voor de studie van RNA-eiwit interacties: Het IRE / IRP Voorbeeld

Het huidige rapport beschrijft een in vitro enzymatische test om fosfatidylethaanolaminmethyltransferase-activiteit te meten met behulp van Leishmania-celextracten. Deze test is gebaseerd op de overdracht van een radioactieve methylgroep van S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine naar endogeen fosfatidylethaanolamine.

In vitro test te meten Fosfatidylethanolamine methyltransferase activiteit

Dit werk presenteert een methode voor hoogdoorvoerscherming met behulp van een universeel genetisch enzymschermingssysteem dat theoretisch kan worden toegepast op meer dan 200 enzymen. Hier identificeert het enkele schermsysteem drie verschillende enzymen (lipase, cellulase en alkalische fosfatase) door eenvoudigweg het gebruikte substraat te veranderen (p-nitrofenylacetaat, p-nitrofenyl-α-D-cellobioside en fenylfosfaat).

Multi-enzym screening met een hoge verwerkingscapaciteit Genetische screening Enzyme System

Er is een vraag om preklinische testen voor een nieuwe klasse van "Wees" drugs genoemd farmacologische chaperones reproduceerbaar, snel en efficiënt. Voor patiënten die in aanmerking komen, alsmede nieuwe farmacologische chaperone drugs ontwikkelden we een eenvoudige, sterk gestandaardiseerde en veelzijdig cel cultuur gebaseerde bepaling naar het scherm.

In Vitro Enzym meting aan Test farmacologische Chaperone responsiviteit in Fabry en de ziekte van Pompe

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) wordt toegepast op beeld en analyseren van dendritische stekels in de muriene hippocampus.

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) voor de studie van dendritische stekels

Dit protocol schetst de gedetailleerde stappen van het pre-embedden van immuno-elektronenmicroscopie, met een focus op het verkennen van synaptische circuits en eiwitlokalisatie in het netvlies.

Onderzoek naar retinale circuits en moleculaire lokalisatie door pre-embedding immuno-elektronenmicroscopie

Leer de synthese en toepassing van activiteitsgebaseerde probe ARN14686 voor detectie van actief N-acylethanolamine acid amidase (NAAA) in celextracten en weefsels. Deze methode biedt betrouwbare inzichten in enzymactivatie bij inflammatoire en neurodegeneratieve aandoeningen.

voorbereiding en

Meer video's verkennen