Name: Een eenvoudige mechanische Procedure aanmaken Limbale Stem Cell Deficiency in Mouse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 55 s
Description: Leer een eenvoudige mechanische techniek om een duurzaam muismodel van limbaal stamceldeficiëntie te creëren zonder ongewenste oogbeschadiging. Deze methode ondersteunt langdurig cel- en molecuulonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken Ruth Zelkha, MS, voor haar genereuze hulp in de beeldvorming. Dit onderzoek werd gesteund door Clinical Development Program Scientist Award K12EY021475 MIJ verlenen R01 EY024349-01A1 om ARD, kern subsidie ​​EY01792 van de National Eye Institute, NIH, en een onbeperkte subsidie ​​van Onderzoek ter voorkoming van Blindheid. ARD is de ontvanger van een Career Development Award van Onderzoek ter voorkoming van Blindheid.

Alle procedures uitgevoerd op dieren aan de Vereniging voor Onderzoek in Visie en Oogheelkunde verklaringen voor het gebruik van dieren in de visie onderzoek. Veertien van vier tot zes maanden oude mannelijke / vrouwelijke C57BL / 6J wild-type muizen werden gebruikt: tien muizen voor de schade model en vier als controle dieren (verwonde hoornvlies). 1. Dierlijke Voorbereiding <ol><li> Verdoven een muis met een intraperitoneale injectie van 100 mg / kg ketamine en 5 mg / kg xylazine mengsel. Na de narcose in werking is getreden, knijpen de teen aan de narcose diepte te bevestigen; het dier niet reageert. </li><li> Inspecteer het ooglid een spleetlamp voor het uitvoeren van de experimenten de afwezigheid van een eerdere cornealetsel verifiëren. </li><li> Druppelen een druppel 1% tetracaïne waterstofchloride op het oog. Na 60-90 seconden, het testen van de cornea reflex om de afwezigheid van de sensatie te bevestigen. Proparacaïne hydrochloride 0,5% kan worden gebruikt. </li><li> Wanneer het verlies van cornea sensatiebepaalde, plaats voorzichtig een daling van 5% povidonjood op het oog en het haar rond de ogen. Veeg de daling na 1 min of verspreid het op het haar rond het oog om te voorkomen dat het haar uit te bemoeien met de penpunt. </li></ol> 2. Schurend het hoornvliesepitheel <ol><li> Draag chirurgische handschoenen en een jurk. Bereid de benodigde hulpmiddelen: een steriel roterende braam en een paar steriele pincet. Voor een betere controle, gebruik gebogen pincet. Plaats het gereedschap op een steriele plaat tijdens de procedure. </li><li> Met behulp van de gebogen pincet, stabiliseren het oog door grijpen de deksels van de nasale kant en voorzichtig proptosing het oog. Vermijd het gebruik van te veel druk. </li><li> Onder een chirurgische microscoop, scheren 360 ° rond de limbale gebied twee keer met behulp van de steriele roterende braam. Ga rond de limbus met een snelheid van 5-6 sec per ronde. NB: De braam heeft een vaste snelheid. Echter, voor te roteren met de vastgestelde snelheid, het &quot;einde moer&quot; worden volledig vastgedraaid. </li><li> Verwijder de hele hoornvliesepitheel van limbus tot limbus met de roterende braam. Voor betere resultaten, verplaats het gereedschap in een circulaire mode en houd hem enigszins parallel aan het oppervlak van de cornea te werken met de zijkant van haar tip. Zorg ervoor het stroma door niet opnieuw het poetsen van de gebieden waar het epitheel is al verwijderd niet te verwonden. Gebruik geen druk op het oog niet van toepassing. Reinig de brush tip zoals vereist. </li><li> Druppelen een druppel steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing op het hoornvlies en veeg eventueel vrijstaande epitheelvellen met een zacht schoonmaakdoekje. </li><li> Scheer de resterende epithelium, indien aanwezig. </li><li> Besteed aandacht aan de staart van de muis tijdens de operatie. LET OP: Als een beweging zich voordoet, heeft de narcose diepte verschoten en verdere injectie nodig is. Een derde tot tweederde van de primaire geïnjecteerde volume voldoende. Heeft het dier met het verdovingsmiddel medicatie overdosis. </li><li> Steriliseer alle instrumenten voordat u ze op een andere oog. </li></ol> 3. Bevestig Compleet Epitheliale Removal <ol><li> Breng een druppel van 1 mg / ml fluoresceïne sodium op het hoornvlies. Reinig het hoornvlies na 30 sec en onderzoek onder een microscoop met een kobaltblauw filter om de volledige verwijdering van het epitheel te controleren. LET OP: Cornea gebieden met epitheliale gebreken worden gevisualiseerd in groen. </li></ol> 4. Post-Onderhoudstoets <ol><li> Leg het dier op een verwarming deken en bewaar deze op een veilige plaats (bijvoorbeeld in zijn kooi), terwijl in het kader van herstel. Heeft een onbewuste dier niet te houden in het gezelschap van bewuste degenen. </li><li> Breng 1% erytromycine oogzalf. Dit zal ook voorkomen droge ogen. Ga door met de applicatie het antibioticum dagelijks voor een week. </li><li> Injecteer 0,1 mg / kg subcutaan buprenorfine na de procedure en opnieuw na 12 uur. Verdere injectie tweemaal per dag gedurende twee dagen. </li><li> Observeer het dier voor 30 - 45 min, tot volledig herstel van anesthesie. NOTITIE: Lichte beweging van de ademhalingsspieren van de ventrale oppervlak aan dierlijk welzijn terwijl onder herstel. </li></ol>

<ol><li>Afsharkhamseh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+of+limbal+stem+cell+deficiency+after+mechanical+and+thermal+injuries+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Stability of limbal stem cell deficiency after mechanical and thermal injuries in mice.</a> Exp. Eye Res. 145, 88-92 (2015).</li>
<li>Dorà, N. J., Hill, R. E., Collinson, J. M., West, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+tracing+in+the+adult+mouse+corneal+epithelium+supports+the+limbal+epithelial+stem+cell+hypothesis+with+intermittent+periods+of+stem+cell+quiescence%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Lineage tracing in the adult mouse corneal epithelium supports the limbal epithelial stem cell hypothesis with intermittent periods of stem cell quiescence.</a> Stem Cell Res. 15 (3), 665-677 (2015).</li>
<li>Ahmad, S., Osei-Bempong, C., Dana, R., Jurkunas, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+culture+and+transplantation+of+human+limbal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">The culture and transplantation of human limbal stem cells.</a> J. Cell Physiol. 225 (1), 15-19 (2010).</li>
<li>Kolli, S., Ahmad, S., Lako, M., Figueiredo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+clinical+implementation+of+corneal+epithelial+stem+cell+therapy+for+treatment+of+unilateral+limbal+stem+cell+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Successful clinical implementation of corneal epithelial stem cell therapy for treatment of unilateral limbal stem cell deficiency.</a> Stem Cells. 28 (3), 597-610 (2010).</li>
<li>Ahmad, S., Figueiredo, F., Lako, M. Corneal epithelial stem cells: characterization, culture and transplantation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAhmad%2C+S+%22Regen.+Med%22">Regen. Med</a>. 1 (1), 29-44 (2006).</li>
<li>He, H., Yiu, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell-based+therapy+for+treating+limbal+stem+cells+deficiency%3A+A+review+of+different+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Saudi+J.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Stem cell-based therapy for treating limbal stem cells deficiency: A review of different strategies.</a> Saudi J. Ophthalmol. 28 (3), 188-194 (2014).</li>
<li>Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+the+basement+membrane+enhances+corneal+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Removal of the basement membrane enhances corneal wound healing.</a> Exp Eye Res. 93 (6), 927-936 (2011).</li>
<li>Stepp, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wounding+the+cornea+to+learn+how+it+heals%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Wounding the cornea to learn how it heals.</a> Exp. Eye Res. 121, 178-193 (2014).</li>
<li>Amirjamshidi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limbal+fibroblast+conditioned+media%3A+a+non-invasive+treatment+for+limbal+stem+cell+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Vis%22%5BJournal%5D)">Limbal fibroblast conditioned media: a non-invasive treatment for limbal stem cell deficiency.</a> Mol. Vis. 17, 658-666 (2011).</li>
<li>Li, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+AlgerBrush+II+rotating+burr+as+a+tool+for+inducing+ocular+surface+failure+in+the+New+Zealand+White+rabbit%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the AlgerBrush II rotating burr as a tool for inducing ocular surface failure in the New Zealand White rabbit.</a> Exp. Eye Res. 147, 1-11 (2016).</li>
<li>Ti, S. E., Anderson, D., Touhami, A., Kim, C., Tseng, S. C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+outcome+following+transplantation+of+ex+vivo+expanded+limbal+epithelium+on+amniotic+membrane+for+total+limbal+deficiency+in+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Factors affecting outcome following transplantation of ex vivo expanded limbal epithelium on amniotic membrane for total limbal deficiency in rabbits.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 43 (8), 2584-2592 (2002).</li>
<li>Ma, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+chemically+burned+rat+corneal+surface+by+bone+marrow-derived+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of chemically burned rat corneal surface by bone marrow-derived human mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells. 24 (2), 315-321 (2006).</li>
<li>Bu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+activated+omental+cells+on+rat+limbal+corneal+alkali+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of activated omental cells on rat limbal corneal alkali injury.</a> Exp. Eye Res. 121, 143-146 (2014).</li>
<li>Luengo Gimeno, F., Lavigne, V., Gatto, S., Croxatto, J. O., Correa, L., Gallo, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+corneal+stem-cell+transplantation+in+rabbits+with+severe+ocular+alkali+burns%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cataract+Refract.+Surg%22%5BJournal%5D)">Advances in corneal stem-cell transplantation in rabbits with severe ocular alkali burns.</a> J. Cataract Refract. Surg. 33 (11), 1958-1965 (2007).</li>
<li>Lin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+of+limbal+stem+cell+deficiency+induced+by+topical+medication+with+the+preservative+benzalkonium+chloride%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">A mouse model of limbal stem cell deficiency induced by topical medication with the preservative benzalkonium chloride.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54 (9), 6314-6325 (2013).</li>
<li>Huang, A. J., Tseng, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+epithelial+wound+healing+in+the+absence+of+limbal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Corneal epithelial wound healing in the absence of limbal epithelium.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 32 (1), 96-105 (1991).</li>
<li>Liu, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cornea-specific+expression+of+K12+keratin+during+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Cornea-specific expression of K12 keratin during mouse development.</a> Curr. Eye Res. 12 (11), 963-974 (1993).</li>
<li>Nakatsu, M. N., González, S., Mei, H., Deng, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+limbal+mesenchymal+cells+support+the+growth+of+human+corneal+epithelial+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Human limbal mesenchymal cells support the growth of human corneal epithelial stem/progenitor cells.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 55 (10), 6953-6959 (2014).</li>
<li>Pajoohesh-Ganji, A., Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+goblet+cells+and+their+niche%3A+implications+for+corneal+stem+cell+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Corneal goblet cells and their niche: implications for corneal stem cell deficiency.</a> Stem Cells. 30 (9), 2032-2043 (2012).</li>
<li>McCloy, R. A., Rogers, S., Caldon, C. E., Lorca, T., Castro, A., Burgess, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+inhibition+of+Cdk1+in+G+2+phase+overrides+the+SAC+and+decouples+mitotic+events%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Partial inhibition of Cdk1 in G 2 phase overrides the SAC and decouples mitotic events.</a> Cell Cycle. 13, 1400-1412 (2014).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze niets hebben te onthullen.

Dit artikel beschrijft een reproduceerbare en betrekkelijk eenvoudige techniek om een ​​muismodel van LSCD creëren. Er zijn een aantal belangrijke aspecten van dit model dat het vermelden waard zijn. Ten eerste, in tegenstelling modellen die chemicaliën 11, 12 gebruikt, de schade betreft hoofdzakelijk de oppervlakte-epitheel (en basaalmembraan), met minimale schade aan de onderliggende hoornvliesstroma of andere intraoculaire structuren. Er is dus slechts beperkte ontsteking en littekenvorming, die beide de p...

Het hoornvliesepitheel is vereist om de duidelijkheid en integriteit van de cornea te behouden. Het voortdurend wordt ververst gedurende het hele leven van de epitheliale stamcellen die in de limbus-een smalle zone op de kruising van het hoornvlies en het bindvlies. Deze zelf-vernieuwing van limbale stamcellen spelen een cruciale rol in het regenereren van het hoornvliesepitheel, zowel normaal en na een blessure. Gedeeltelijke of volledige uitputting van stamcellen resulteert in cornea-erosie, pijn, corneale littekenvorming en neovascularisatie uiterlijk van slijmbekercellen en indien onbehandeld, corneale blindheid. Deze aandoening staat bekend als limbale stamcellen deficiëntie (LSCD) en kan idiopathische worden; erfelijke; of verworven als gevolg van chemische of thermische verwondingen, op lange termijn contactlenzen dragen, en chronische ontsteking 1-6. Onderzoek naar LSCD is een geschikte diermodel dat niet alleen bootst de ziekte bij mensen, maar reproduceerbaar en duurzaam met de minst eenmount van letsel aan andere hoornvlies en oculaire structuren. Dit model is noodzakelijk om behandelingen te beoordelen en de mechanismen ziekte op moleculaire en cellulaire niveaus verduidelijken. 1 als hiervoor beschreven, met behulp van een roterende frees, kan men gemakkelijk ontwikkelen een muismodel van LSCD dat de bovengenoemde voordelen biedt en blijft gedurende ten minste drie maanden. Het doel van deze studie is om een ​​eenvoudige, reproduceerbare en duurzame muismodel van LSCD presenteren. De roterende braam is een handige tool die gelijkmatig verwijdert het epitheel zonder verwonden de onderliggende stroma 1. Het is gebruikt om centrale corneale erosie 7, 8 in wondgenezing studies induceren. Het hierbij gepresenteerde techniek LSCD creëren een muis is niet eerder gerapporteerd. Eerder geïntroduceerde methoden schrapen het epitheel met een stompe spatel resulteren in een minder uniform letsel-vooral de limbus-en een variabel fenotype 1, 9, meer uitgevoerde restauratief normale hoornvliesepitheel 1. In tegenstelling tot de stompe schraper, de roterende frees verwijdert het epitheliale basismembraan en 7, 8, 10. Andere gerapporteerde methoden om stamcellen te scheiden omvatten het gebruik van chemische stoffen, zoals natriumhydroxide, n-heptanol en benzalkoniumchloride, die niet alleen ongewenste schade kunnen veroorzaken aan de onderliggende oogstructuren, maar ook kan leiden tot significante ontsteking en daaropvolgende corneale troebelingen of epitheliale squameuze metaplasie 11-15. De roterende braam wordt niet geassocieerd met deze ernstige complicaties. Het chirurgisch verwijderen van de limbale epitheel, alleen of met het gebruik van chemicaliën 10, 11, 16, is moeilijk uit te voeren en is niet de beste optie bij dieren met kleine ogen en een dunne limbale epitheel (zoals muizen). Bovendien, verrassend, limbectomy kan nog steeds laat een aantal van de limbale epitheel achter 10. De hieronder beschreven techniek leidt tot een LSCD met neovascularisatied conjunctivalization dat de presentatie van de volledige LSCD bij patiënten nabootst en duurt ten minste drie maanden 1. Het is geschikt voor mensen die willen LSCD of wondgenezing pathofysiologie, immunologie en mogelijke behandelingen in muizen te bestuderen. Eventueel met enkele wijzigingen, deze procedure kan worden uitgevoerd bij ratten of konijnen 10. Aangezien de roterende braam efficiënt het epitheel verwijderd, kan worden gebruikt in elk onderzoek over corneale epitheel abrasie / verwonding en verwante behandeling of moleculaire biologisch onderzoek.

<table><tbody><tr><td>Roterende bijl: AlgerBrush II roestring verwijderaar&nbsp;</td><td>Rumex International Co, Clearwater, FL</td><td>16-141</td><td>0,5 mm bijl. Ook verkrijgbaar bij andere bedrijven.</td></tr><tr><td>Chirurgisch microscoop</td><td>Wild Heerbrugg, Zwitserland</td><td>Wild M691</td><td></td></tr><tr><td>Digitale camera</td><td>Nikon, Thailand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon FS-2 spleetlamp</td><td>Nikon, Japan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polyklonaal anti-CK12 antilichaam</td><td>Santa Cruz Blotechnology, CA,</td><td>SC-17101</td><td>1:100 concentratie</td></tr><tr><td>Monoklonaal anti-CK8 antilichaam</td><td>TROMA-I-s, Iowa City, IA</td><td>AB_531826</td><td>1:50 concentratie</td></tr></tbody></table>

een eenvoudige mechanische procedure aanmaken limbale stem cell deficiency in mouse

A Simple Mechanical Procedure to Create Limbal Stem Cell Deficiency in Mouse

Limbale stamcellen deficiëntie (LSCD) is een staat van een storing of verlies van limbale epitheliale stamcellen, waarna de hoornvliesepitheel wordt vervangen door bindvlies. Patiënten die lijden aan terugkerende afwijkingen aan de cornea, pijn, ontsteking, en het verlies van het gezichtsvermogen. Voorheen, een muizenmodel van LSCD beschreven en vergeleken met twee andere modellen. Het doel was om een ​​consistente muismodel van LSCD dat zowel bootst het fenotype bij mensen en duurt lang genoeg om het mogelijk de ziekte pathofysiologie bestuderen en nieuwe behandelingen te evalueren produceren. Hier is de techniek gedetailleerder beschreven. Een gemotoriseerde werktuig met een roterende frees is ontworpen om de roest ringen van het corneale oppervlak te verwijderen of om de pterygium bed glad patiënten. Het is een geschikte inrichting om het gewenste LSCD model te maken. Het is een direct beschikbaar, eenvoudig te gebruiken tool met een fijne tip dat het geschikt is voor het werken op kleine ogen maakt, zoalsin muizen. De toepassing voorkomt onnodige trauma aan het oog en het niet leidt tot ongewenste verwondingen, zoals vaak het geval is bij chemische verwonding modellen. In tegenstelling tot een botte schraper, verwijdert het epitheel van de basale membraan. In dit protocol werd het limbale gebied tweemaal afgesleten, en vervolgens werd het gehele hoornvliesepitheel geschoren van limbus tot limbus. Om stroma letsel te voorkomen, werd verzorgd het hoornvlies niet te poetsen wanneer het epitheel was al verwijderd.

Binnen een maand na het uitvoeren van deze techniek, 100% van de cornea ontwikkelde oppervlakkige neovascularisatie (Figuur 1A. Er werden foto&#39;s genomen met een camera verbonden met een spleetlamp onder helderveld en kobalt blauw filter). In 18/20 (90%) van de ogen, neovascularisatie betrokken het gehele hoornvlies (Figuur 1A). In 2/20 (10%), werd neovascularisatie waargenomen in drie van de vier kwadranten cornea, maar toch bereikte het corneale cen...

Het volgende artikel biedt een eenvoudige, reproduceerbare techniek om effectief een duurzame muismodel van limbale stamcellen deficiëntie (LSCD). Dit diermodel is bruikbaar bij het testen en vergelijken van de werkzaamheid van behandelingen voor limbale stamcellen ziekten.

Een eenvoudige mechanische Procedure aanmaken Limbale Stem Cell Deficiency in Mouse

Limbal stem cell deficiency (LSCD) is a state of malfunction or loss of limbal epithelial stem cells, after which the corneal epithelium is replaced with ...

Het algemene doel van deze procedure is het creëren van een reproduceerbaar, duurzaam en persistent muismodel voor limbale stamceldeficiëntie. Deze eenvoudige techniek biedt een consistent diermodel van limbale stamceldeficiëntie, zonder ongewenst letsel aan het oog te veroorzaken, wat moeilijk te bereiken is met de standaard chemische letselmodellen. Dit model is nuttig voor het bestuderen van het ziekteproces op de lange termijn op cellulair en moleculair niveau.En voor het testen of vergelijken van de effectiviteit van nieuwe behandelingen. Knijp na het anesthetiseren van de muis in de teen om een adequate diepte van de anesthesie te waarborgen. Inspecteer het oog onder een spleetlamp om de afwezigheid van eerdere cornea-letsels te verifiëren.Spiets een druppel 1% tetracaine hydrochloride in het oog en wacht 60 seconden. Breng vervolgens voorzichtig 5% povidonjodium aan op het oog en het omliggende haar. Veeg na één minuut de druppel weg of verspreid deze over het haar rond het oog om te voorkomen dat het haar de punt van het instrument hindert.Bereid een steriele roterende frees en een steriele gebogen pincet voor en houd deze tijdens de procedure op een steriel veld. Stabiliseer vervolgens het oog door de oogleden aan de neuszijde vast te pakken met de gebogen pincet en het oog voorzichtig te protruderen. Let erop dat er niet te veel druk wordt uitgeoefend.Schaaf onder een chirurgische microscoop twee keer rond het limbusgebied met de steriele roterende frees. Verwijder het gehele hoornvliezepitheel van limbus tot limbus met de roterende frees in een cirkelvormige beweging, waarbij de zijkant van de tip wordt gebruikt. Om beschadiging van het stroma te voorkomen, mogen delen van het hoornvlies waarvan het epitheel reeds is verwijderd, niet opnieuw worden gefreesd.Oefen geen druk uit op het oog. Reinig de borsteltip indien nodig. Breng een druppel steriele PBS aan op het hoornvlies en veeg eventuele losgekomen epitheliale vliezen weg met een zacht reinigingsdoekje.Scheer vervolgens het resterende epitheel weg, indien aanwezig. Let op de staart van de muis om te controleren of de diepte van de anesthesie tijdens de operatie voldoende is. Breng een druppel natriumfluoresceïne aan op het hoornvlies.Reinig het hoornvlies na 30 seconden en onderzoek het onder een microscoop met een kobaltblauw filter om de volledige verwijdering van het epitheel te verifiëren. Plaats het dier na de procedure in de kooi op een warmtemat en observeer het gedurende 30-45 minuten tot het volledig is hersteld van de anesthesie. Breng in de tussentijd 1% Erythromycine oogzalf aan in het oog en ga een week lang dagelijks door met de toediening van het antibioticum.Injecteer daarna onmiddellijk 0,1mg/kg Buprenorfine subcutaan, en herhaal dit 12 uur na de procedure, waarna de injecties gedurende twee dagen twee keer per dag worden voortgezet. Dit is het fenotype van het hoornvlies één maand na de procedure. Er is uitgebreide neovascularisatie zichtbaar, wat een kenmerk is van een limbaal stamceldeficiëntie.Een normaal hoornvlies tot expressie brengt Cytokeratin 12, maar is vrij van Cytokeratin 8 of bekercellen. Bij een limbaal stamceldeficiëntie verschijnen Cytokeratin 8 en bekercellen op het hoornvlies, terwijl Cytokeratin 12 verloren gaat. Eenmaal onder de knie, zal deze techniek leiden tot corneale neovascularisatie die na één maand bijna het gehele hoornvliesoppervlak van de muis bedekt en tot drie maanden stabiel blijft.Het is belangrijk om te voorkomen dat delen van het hoornvlies waar het epitheel al is verwijderd, opnieuw worden geborsteld. Dit kan leiden tot ongewenste ontsteking en opacificatie van het stroma. Na de ontwikkeling van een limbaal stamceldeficiëntie kunnen experimentele behandelmethoden worden getest en vergeleken.Als alternatief kunnen behandelingen kort na het letsel worden gestart. Deze video laat zien hoe het limbaal- en cornea-epitheel effectief kan worden verwijderd om een limbaal stamceldeficiëntie bij muizen op te wekken. Met enkele aanpassingen kan deze procedure ook bij andere dieren worden uitgevoerd.

a-simple-mechanical-procedure-to-create-limbal-stem-cell-deficiency

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Een methode wordt beschreven voor de menselijke retinoblastoom tumoren verspreiden in muizen. Tumorcellen worden rechtstreeks geïnjecteerd in de ogen van het immuunsysteem van deficiënte muizen. Secundaire tumoren zijn met succes gebruik van beide cellen direct geoogst van menselijke tumoren en beschaafde tumorspheres.

Oprichting en Voortplanting van Human Retinoblastoom Tumoren in het immuunsysteem van deficiënte muizen

Dit artikel beschrijft een optimale volgorde van de gebeurtenissen voor de multimodale beeldvorming van cellulaire grafts in knaagdier hersenen met behulp van: (i) in vivo bioluminescentie en magnetische resonantie beeldvorming, en (ii) post mortem histologische analyse. De combinatie van deze beeldvorming op een enkel dier laat cellulaire graft evaluatie met een hoge resolutie en gevoeligheid en specificiteit.

Multimodal Imaging van Stem Cell implantatie in het centrale zenuwstelsel van Muizen

Subretinale injectie is een chirurgische techniek voor effectieve genoverdracht naar het retinale pigmentepitheel in het oog van de muis. Hier beschrijven we een eenvoudige en reproduceerbare methode voor subretinale injectie van virale vectoren naar het retinale pigmentepitheel bij experimentele muizen.

Limbale Aanpak-Subretinal injectie van virale vectoren voor gentherapie in Muizen retinaal pigment epitheel

In dit artikel beschrijven we de principes voor het ontwerpen en uitvoeren van een multi-kleurig lijn-traceringsexperiment met behulp van R26R-Confetti muizen. We bieden een specifiek protocol voor het volgen van hoornvliesepitheelcellen die kunnen worden aangepast voor andere weefsels van belang.

Een methode voor Lineage Tracing van hoornvliescellen De Multi-kleur Fluorescent Reporter Muizen

Dit protocol introduceert een eenvoudige twee stappen methode voor het differentiëren van hoornvlies limbal epitheliale cellen van de stam van menselijke pluripotente stamcellen xeno- en voorwaarden feeder cel-vrije cultuur. De cel kweekmethoden gepresenteerde inschakelen kostenefficiënte en grootschalige productie van klinische kwaliteit cellen toepassing op hoornvlies cel therapie gebruik.

Efficiënt en schaalbare gestuurde differentiatie van klinisch hoornvlies Limbal epitheliale cellen van de stam van menselijke pluripotente stamcellen

Dit protocol presenteert een transpupillaire zichtgeleide transsclerale benadering om veilig en nauwkeurig subretinale cellulaire transplantaten af te leveren, met een laag aantal chirurgische complicaties, bij muizenontvangers met of zonder retinale degeneratie.

Transpupilgeleide transsclerale transplantatie van subretinale transplantaten in een muismodel voor retinale degeneratie

Dit protocol beschrijft een methode om een nauwkeurig en reproduceerbaar hoornvlies- en limbaal alkalisch letsel te induceren in een muismodel. Het protocol is voordelig omdat het een gelijkmatig verdeelde verwonding van het sterk gekromde hoornvlies en de limbus van de muis mogelijk maakt.

Inductie van hoornvlies- en limbale alkalische letsels met behulp van een punch-trephine-techniek in een muismodel

Hier presenteren we een protocol om de menselijke limbale nichecellen te isoleren en te identificeren.

Isolatie en identificatie van limbale nichecellen

We beschrijven een gedetailleerd protocol voor de bereiding van post-gecryopreserveerde hESC-afgeleide fotoreceptor-voorlopercellen en de subretinale afgifte van deze cellen in rd10-muizen .

Subretinale toediening van van menselijke embryonale stamcellen afgeleide fotoreceptorvoorlopercellen bij RD10-muizen

We ontwikkelden een rattenmodel van ernstige hoornvliesontsteking door middel van hoornvliesepitheelcurettage in combinatie met hoornvlieshechtingen. De studie evalueerde ontstekingspatronen van het hoornvlies, epitheliale proliferatie en veranderingen in limbale stamcellen onder ontstekingsomstandigheden.

Het opzetten van een model voor ernstige hoornvliesontsteking bij ratten op basis van hoornvliesepitheelcurettage in combinatie met hoornvlieshechtingen

Hier presenteren we een protocol om hoogwaardige single-cell suspensies uit hele muishoornvliezen te verkrijgen via sequentiële vertering met collagenase A en trypsine. Deze methode levert levensvatbare individuele cellen met hoge RNA-integriteit op, waardoor ze compatibel zijn met downstream-toepassingen zoals single-cell RNA-sequencing en flowcytometriey.

Een protocol voor het oogsten van single-cel suspensie uit muizenhoornvliezen

Leer een eenvoudige mechanische techniek om een duurzaam muismodel van limbaal stamceldeficiëntie te creëren zonder ongewenste oogbeschadiging. Deze methode ondersteunt langdurig cel- en molecuulonderzoek.

Een eenvoudige mechanische Procedure aanmaken Limbale Stem Cell Deficiency in Mouse

Meer video's verkennen