Methoden om te studeren Lipidenveranderingen in neutrofielen en de daaropvolgende vorming van neutrofielen Extracellulaire Traps

Het algemene doel van deze methode is om veranderingen in de lipidensamenstelling van neutrofielen te onderzoeken tijdens de afgifte van neutrofiele extracellulaire vallen door middel van dunnelaagchromatografie en HPLC. Deze methode kan worden gebruikt om meer gedetailleerde informatie te verkrijgen over de mechanismen die betrokken zijn bij de vorming van neutrofiele extracellulaire vallen, of kortweg, NET-vorming. Het grote voordeel van deze procedure is dat het informatie biedt over de rol van lipiden in de algemene functie van neutrofielen door gebruik te maken van een eenvoudig te volgen protocol.

De isolatie van humane bloedafgeleide cellen zal worden gedemonstreerd door een voormalig PhD-student van ons lab, Ariane Neumann. En ze zal worden bijgestaan door Friederike Reuner. De bereiding van cellen voor lipideanalyse zal worden gedemonstreerd door Graham Brogden, een post-doc in mijn laboratorium en Diab Husein, een masterstudent in het biochemieprogramma.

Om humane bloedafleiding neutrofielen te isoleren, plaatst u ongeveer 20 mL bloed op 20 mL natriumdiatrizoaat/dextran-oplossing in de buurt van een vlam, zonder te mengen. Centrifugeer gedurende 30 minuten bij 470 keer g zonder te remmen. Het is van cruciaal belang om de bloedfase niet te mengen met de dichtheidsgraad in oplossing.

Na de centrifugatiestap moeten mononucleaire cellen voorzichtig worden verwijderd om besmetting of onspecifieke activering van cellen te voorkomen. Verwijder de mononucleaire cellen en de gelige plasmalaag. Breng de polymorf-nucleaire cel, of PMN-fase, over in een nieuwe 50 mL buis en vul deze op tot 50 mL met 1X fosfaatgebufferde zoutoplossing.

Centrifugeer het monster gedurende 10 minuten bij 470 keer g met remmen. Vervolgens verwijdert u het supernatant en suspendeert u de pellet opnieuw in 5 mL steriel water gedurende vijf seconden om de erytrocyten te lyseren. Vul de buis onmiddellijk op tot 50 mL met 1X PBS en centrifugeer het monster.

Na het verwijderen van het supernatant moet de pellet wit zijn. Als het nog rood is, herhaalt u deze stappen. Suspendeer vervolgens de pellet in 1000 microliters Roswell Park Memorial Institute, of RPMI-medium.

Tel het aantal cellen met behulp van Trypan Blue-kleuring en een hemocytometer onder een lichtmicroscoop. Bereid een celsuspensie in RPMI met een concentratie van twee miljoen cellen per mL. Ongeveer 25 miljoen neutrofielen kunnen worden geoogst uit 20 mL bloed.

Om neutrofielen farmacologisch te behandelen voor lipideanalyse, gebruikt u 15 miljoen van de bereide cellen. Incubeer de monsters in de reactiebuizen gedurende twee uur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Na centrifugatie van de monsters verwijdert u het supernatant en suspendeert u de celpellet opnieuw in 300 microliters HBSS.

Nadat het monster opnieuw is gecentrifugeerd met behulp van dezelfde parameters, suspendeert u de celpellet opnieuw in 1 mL van een 1:1 chloroform:methanol-oplossing. Homogeniseer vervolgens de gesuspendeerde pellet met een 26 gauge canula door het monster 10 keer in en uit een 1 mL spuit te duwen. Om de lipiden van de humane perifere bloedafleiding neutrofielen te isoleren, neemt u de bereide neutrofielen en plaatst u ze op ijs.

Pipetteer de neutrofielen in een 15 mL schroefdopglasbuis met een PTFE-afdichting en homogeniseer ze door een minuut te schudden. Voeg vervolgens 2 mL methanol toe, gevolgd door 1 minuut later 1 mL chloroform. Na nog een minuut schudden, roteert u de glasbuizen bij kamertemperatuur en 50 rpm gedurende 30 minuten.

Pellet de proteïnefractie vervolgens door de oplossing gedurende 10 minuten te centrifugeren bij 7 graden Celsius en 1.952 keer g. Decanteer voorzichtig het supernatant in een nieuwe 15 mL glasschroefdopbuis, waarbij u het proteïnehoudende pellet achterlaat. Bewaar het pellet bij 20 graden Celsius voor toekomstige kwantificering.

Voeg 1 mL chloroform toe en wacht een minuut. Voeg vervolgens 1 mL twee keer gedistilleerd water toe en draai de glasschroefdopbuis met het monster gedurende 30 seconden om. Na het centrifugeren van het monster zoals hiervoor, verwijdert en gooit u de bovenste fase weg tot aan, maar niet inclusief de troebele laag.

Droog de monsters in een vacuümconcentrator bij 60 graden Celsius en bewaar ze bij 20 graden Celsius tot ze nodig zijn. Vul om te beginnen elk glaskamer tot 5 mL met de overeenkomstige oplossing. Voeg elk soort filterpapier toe om de looptijd in elke kamer te verhogen.

Pre-incubeer een 20x10cm HPTLC silicagel 60 glasplaat in de eerste loopoplossing. Zodra de loopoplossing de bovenkant van de plaat bereikt, droogt u deze gedurende 10 minuten bij 110 graden Celsius. Los het lipidenpellet, eerder verkregen na droging met een vacuümconcentrator, op in het gewenste volume 1:1 chloroform:methanol-oplossing en incubeer het gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius om op te lossen.

Gebruik vervolgens een liniaal en een zachte potlood om de laadplekken te markeren voor het gewenste aantal monsters plus ten minste één standaard. Markeer de loopafstand op ongeveer 4 cm voor de eerste loopoplossing en ongeveer 6 cm voor de tweede loopoplossing. Om de monsters te laden, was de 10 microliter spuit drie keer in 1:1 chloroform:methanol voordat u elk nieuw monster laadt.

Laad 10 microliters van elk monster druppelsgewijs en probeer het monster op zo klein mogelijk gebied te concentreren. Plaats de plaat verticaal in de eerste kamer met loopoplossing een. Zorg ervoor dat de plaat parallel staat aan de muur van de glaskamer om een uniforme migratiesnelheid te bereiken.

Zorg ervoor dat de platen parallel aan de achterwand van de glaskamers worden geplaatst en dat de oplosmiddelfronten niet te ver lopen om ervoor te zorgen dat de lipiden efficiënt worden gescheiden. Zodra de oplosmiddellijn de eerste markering heeft bereikt, verwijdert u de plaat, droogt u deze en plaatst u deze in de tweede oplossing. Herhaal soortgelijke stappen voor de tweede en derde loopoplossingen.

Laat de plaat in de