Name: Methoden om te studeren Lipidenveranderingen in neutrofielen en de daaropvolgende vorming van neutrofielen Extracellulaire Traps (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Leer lipidenanalyse van neutrofielen met HPTLC en HPLC voor onderzoek naar NET-vorming. Deze methode biedt inzicht in de rol van cholesterol bij de functie van menselijke bloedneutrofielen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door een beurs van de Akademie für Tiergesundheit (HvH) en een beurs van het promotietraject, &quot;Animal and zoönotische infecties,&quot; van de Universiteit van Diergeneeskunde, Hannover, Duitsland, verstrekt aan Ariane Neumann.

De collectie van het perifere bloed in dit protocol werd goedgekeurd door de lokale human onderzoek ethische commissie. Alle proefpersonen op voorwaarde dat hun informed consent. 1. Isolatie van Menselijk bloed afkomstige neutrofielen door dichtheidsgradiënt centrifugeren <ol><li> Isolatie van humaan bloed afgeleide neutrofielen <ol><li> Laag ~ 20 ml bloed op 20 ml natrium diatrizoaat / dextran-oplossing bij een vlam en zonder menging. </li><li> Centrifugeer 30 min bij 470 xg zonder rem. </li><li> Verwijder de mononucleaire cellen en het gelige plasmalaag. Breng de polymorfonucleaire cellen (PMN) fase (tweede fase met accumulatie cellen; Figuren 1 en 2) naar een nieuwe buis van 50 ml en vul tot 50 ml met 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS). </li><li> Centrifugeer 10 min bij 470 xg met rem. </li><li> Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 5 ml steriel water for5 en de erytrocyten te lyseren. </li><li> Onmiddellijk vul tot 50 ml met 1x PBS en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 470 x g. </li><li> Verwijder het supernatant. De pellet moet wit zijn. Als het nog steeds rood, herhaalt u de stappen 1.1.5 en 1.1.6. </li><li> Resuspendeer de pellet in 1000 pl Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium. Tel het aantal cellen met behulp van trypan blauw kleuring in een hemocytometer onder een lichtmicroscoop. </li><li> Bereid een celsuspensie in RPMI bij een concentratie van 2 x 10 6 / ml. Ongeveer 2,5 x 10 7 neutrofielen kunnen worden geoogst uit 20 ml bloed. </li></ol></li><li> Farmacologische behandeling van neutrofielen op lipide analyses <ol><li> Met 5 x 10 7 cellen uit stap 1.1.9. Pas het aantal cellen in zuivere Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS) medium in aanwezigheid of afwezigheid van 10 mM MβCD of 25 nM PMA in een totaal volume van 300 pl in een 1,5 ml reactiebuis. </li><li> Incubeer de monsters in dereactiebuizen gedurende 2 uur bij 37 ° C en 5% CO2. </li><li> Centrifugeer 10 min bij 470 xg met rem. </li><li> Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet in 300 ui HBSS. </li><li> Centrifugeer 10 min bij 470 xg met rem. </li><li> Resuspendeer de celpellet in 1 ml chloroform / methanol (1: 1), gehomogeniseerd met een 26 G injectienaald door zuigen het monster in en uit in een 1 ml injectiespuit 10 keer, en de monsters bewaren bij -20 ° C. </li></ol></li><li> Farmacologische behandeling van neutrofielen voor NET kwantificering van immunofluorescentie <ol><li> Bereid poly-L-lysine-gecoate 48-well platen met glazen dekglaasjes. <ol><li> Plaats een 8-mm glazen dekglaasje in elk putje, voeg 55 ul steriel 0,01% poly-L-lysine en incubeer gedurende ~ 20 minuten bij kamertemperatuur (RT). </li></ol></li><li> Tweemaal wassen met 200 pi 1X PBS. Opslaan van de platen met 200 pi 1X PBS per putje in de koelkast totdat ze nodig. </li><li> Autoefully 100 ul celsuspensie (2 x 10 5/100 ul) toe uit stap 1.1.9 per putje in het midden van elke dekglaasje. </li><li> Voeg 100 ul per putje van hetzij de laatste 10 mM MβCD of de laatste 25 nM PMA. </li><li> Centrifugeren gedurende 5 min bij 370 xg met rem. </li><li> Incubeer gedurende 2 uur bij 37 ° C en 5% CO2. </li><li> Centrifugeren gedurende 5 min bij 370 xg met rem. </li><li> Fixeer de cellen met 155 pl 4% PFA, wikkel ze in plastic paraffinefilm en bewaar ze overnacht bij 4 ° C of gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. LET OP: Voor gegevens over het netto vorming geïnduceerd door MβCD, zie Neumann et al. 15. </li></ol></li></ol> 2. Lipide Isolatie en analyse van menselijk bloed afgeleide Neutrofielen <ol><li> Isoleer de lipiden van menselijk perifeer bloed neutrofielen afgeleide gebaseerd op Bligh en Dyer 22 en Brogden et al. 23 <ol><li&gt; Neem neutrofielen uit stap 1.2.6 en leg ze op ijs. </li><li> Op ijs, pipet de neutrofielen (aanwezig in methanol en chloroform oplossing) aan een 15 ml glazen buis met schroefdop met een polytetrafluorethyleen (PTFE) afdichting en homogeniseer ze door gedurende 1 min. Met glazen buizen om te voorkomen dat de lipiden binden aan kunststof oppervlakken. Met PTFE caps om verontreiniging van rubber / kunststof te voorkomen. </li><li> Voeg 2 ml methanol, gevolgd door 1 min later 1 ml chloroform. Weer schudden gedurende 1 min. </li><li> Roteer de glazen buizen bij kamertemperatuur en 50 rpm gedurende 30 minuten. </li><li> Pellet de eiwitfractie door centrifugeren van de oplossing bij 7 ° C en 1952 x g gedurende 10 min. </li><li> Voorzichtig decanteren van het supernatans in een nieuwe 15 ml glazen buis met schroefdop, waarbij de proteïne bevattende pellet achteren. Bewaar de pellet bij -20 ° C voor toekomstig kwantificering. </li><li> Voeg 1 ml chloroform, wacht 1 min, voeg 1 ml dubbel gedestilleerd water, en keren de glazen schroefdop buis met het monster gedurende 30 s. </li&gt; <li> Centrifugeer bij 7 ° C en 1952 x g gedurende 10 min en gooi de bovenste fase, tot aan, maar niet inclusief, de troebele laag. </li><li> Eventueel uitvoeren van een eventuele verdere zuiveringsstap door het herhalen van stap 2.1.8. </li><li> De monsters in een vacuümconcentrator bij 60 ° C en bewaar ze bij -20 ° C totdat ze nodig waren. </li></ol></li><li> Hoge prestatie dunnelaagchromatografie (HPTLC) semi-kwantificeren van de hoeveelheid verschillende lipiden, zoals cholesterol, fosfolipiden en sfingomyeline <ol><li> Bereid de volgende vier lopende oplossingen en kleuroplossing. <ol><li> Oplossing 1: Meng ethylacetaat (26,6%), 1-propanol (26,6%), chloroform (26,6%), methanol (26,6%) en kaliumchloride (9,6%). KCl bereid door het oplossen van 0,25 g KCl in 100 ml HPLC kwaliteit water. </li><li> Oplossing 2: Mix n-hexaan (73%), diethylether (23%) en citroenzuur (2%). </li><li> Oplossing 3: 100% n-hexaan. </li><li> Bereid de kleuroplossing doormengen gedestilleerd water (90 ml) met 7,5 g kopersulfaat en voeg 10 ml fosforzuur. </li></ol></li><li> Vult tot 5 mm van elke oplossing in een afzonderlijke glazen kamer. Voeg eventueel soort filter papier om de loopsnelheid in elke kamer te verhogen. </li><li> Pre-incubeer 20 x 10 cm HPTLC silicagel 60 glasplaat eerste running oplossing tot de oplossing running de bovenkant van de plaat bereikt. droog het vervolgens gedurende 10 minuten bij 110 ° C. Opmerking: Deze platen kunnen worden opgeslagen voor toekomstig gebruik in aluminiumfolie en gedurende 10 minuten bij 110 ° C voorafgaand aan gebruik. </li><li> Los de lipide pellet verkregen uit stap 2.1.10 in 200 pl chloroform / methanol (1: 1) oplossing en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 ° C op te lossen. </li><li> Gebruik een liniaal en een viltstift om de belasting plekken voor het gewenste aantal monsters markeren, vermeerderd met ten minste één standaard. Markeer de afgelegde afstand bij benadering 4 cm en 6 cm voor de eerste en tweede lopende oplossing resp. </li><li> De samples, was de 10 pi injectiespuit 3 maal in chloroform / methanol (1: 1) voorafgaande aan het laden van elk nieuw monster. Belasting 10 pi van elk monster druppelsgewijze en probeerde de monster zo klein mogelijk gebied te concentreren. De monsters moeten worden geladen ten minste in duplo. </li><li> Plaats de plaat verticaal in de eerste kamer met stromend oplossing 1 (stap 2.2.1.1). Zorgen dat de plaat parallel aan de wand van de glazen kamer van een gelijkmatige migratie snelheid te bereiken. </li><li> Zodra de oplosmiddelleiding de eerste markering heeft bereikt, verwijder de plaat, drogen en plaats deze in de tweede oplossing. Herhaal soortgelijke stappen voor de tweede en de derde lopende oplossingen; Laat de plaat in de oplossing tot het oplosmiddel voor de bovenkant van de plaat bereikt, verwijder en drogen bij KT gedurende 1 minuut. </li><li> Plaats plaat kopersulfaatoplossing 7 s. Verwijderen van de plaat, het grondig te drogen en bakken in een oven gedurende 7 minuten bij 170 ° C. Wacht tot de plaat af te koelen. </li><li> Using dunnelaagchromatografie en gel analyse software, en een beeldverwerkingssoftware, scannen en analyseren zoals eerder beschreven door Brogden et al. 23. </li></ol></li><li> Hoge prestatie vloeistofchromatografie (HPLC) om de hoeveelheid cholesterol kwantificeren <ol><li> Bevestig een 100 x 4,6 mm kolom tot 5 um / 4,6 mm guard cartridge en verwarm tot 32 ° C. Met methanol als de mobiele fase bij een stroomsnelheid van 1 ml / min bij 65 bar en een UV-detector bij 202 nm meet de hoeveelheid cholesterol in elk monster te kwantificeren. </li><li> Was de HPLC machine grondig vóór analyse van de monsters, de volgende stappen: het reinigen van de pomp, het wassen van de naald, het spoelen van de pot, spoelen de spuit, en wassen van de pomp spoeling. Was alle met water. Tenslotte voeren een systeem spoelen met methanol bij een debiet van 5 ml / min gedurende 5 min. </li><li> Een cholesterol standaardkromme vast, bereiden ten minste 4 concentraties0,05 mg / ml tot 2 mg / ml cholesterol in chloroform / methanol (1: 1) 24. </li><li> Resuspendeer de verkregen uit stap 2.1.10 in 500 pl chloroform / methanol monsters (1: 1) in amberkleurige 1,5 ml glazen flesjes met schroefdop rode PTFE / wit silicone deksels. </li><li> Kwantificeren cholesterol door gebruikmaking van de standaard bereid in stap 2.3.3. OPMERKING: Vul het bemonsteringsprotocol, uitgaande van ten minste één standaard en één negatieve controle, gevolgd door de monsters. </li><li> De resultaten worden uitgedrukt als het oppervlak onder de curve en vergelijken tussen de nodige monsters met behulp van een statistische software. Opmerking: De resultaten kunnen ook worden gekwantificeerd tegen een standaardcurve en kan worden weergegeven als de totale hoeveelheid cholesterol per ml, g of aantal cellen. De standaardkromme vergelijking worden berekend met de waarden verkregen bij stap 2.3.3. </li></ol></li></ol> 3. visualisatie en kwantificering van NET <ol><li> Visualization van NET LET OP: De visualisatie van de netten is gebaseerd op eerder gepubliceerd werk van Neumann et al. 15. <ol><li> Was de vaste monsters uit stap 1.3.8 3 maal met 200 pi 1X PBS. </li><li> Blok en permeabilize met 100 pl 2% BSA, 0,2% Triton X-100 in PBS per putje gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Voeg 100 ul van primaire antilichamen: monoklonaal anti-DNA-histone 1-antilichaam (verdund de bouillon met 2,2 mg / ml 1: 5000 in PBS met 2% BSA en 0,2% Triton X-100) of polyklonaal antilichaam tegen myeloperoxidase (MPO; konijn anti-MPO, verdund 1: 300 in PBS met 2% BSA en 0,2% Triton X-100). Incubeer overnacht bij 4 ° C. </li><li> Was 3 maal met 200 pi 1X PBS. </li><li> Voeg 100 ul van het secundaire antilichaam (fluorescentie-gemerkt geit-anti-muis, 1: 1000 in BSA-PBS-Triton X-100 en geit anti-konijn, 1: 1000 BSA-PBS-Triton X-100) gedurende 1 uur bij RT in het donker. </li><li> Was 3 maal met 200 &amp; #181, l 1 x PBS. </li><li> Dekglaasjes verwijderd met een pincet en leg ze neer met 3 ul van montage medium met DAPI op glasplaatjes. </li><li> Onderzoek de monsters met behulp van een confocale omgekeerde base fluorescentiemicroscoop uitgerust met een HCX PL APO 40X 0,75-1,25 olie immersie objectief 15. </li></ol></li><li> Kwantificering van de-NET vrijgeven kernen <ol><li> Open een image processing software (bijvoorbeeld ImageJ) en sleep foto van belang in de werkbalk. </li><li> Klik op &quot;Plugins&quot;, &quot;analyseren&quot; en &quot;Cell teller.&quot; </li><li> Druk op de knop &quot;Initialize&quot; in de teller venster en kies een teller type (bijvoorbeeld, klik op 7 in rood voor-NET het vrijgeven van cellen en 8 in het geel voor niet-vrijgeven van cellen, zoals weergegeven in figuur 6B-i en ii). LET OP: De criteria voor NET-positieve cellen: positief kleurden groen kern + een minder dicht nucleus (verlies van lobvorming) of een verlies van de ronde vorm van de kern + een toegenomen omvang van de kern of het optreden van een afzonderlijke extracellulair uitloper. </li><li> Klik op elke cel vast te houden aan de bovengenoemde criteria en schrijf het getelde aantal cellen in een data sheet van een analyse software. </li><li> Bereken het percentage-NET het vrijgeven van cellen met behulp van het getelde aantal cellen van NET-vrijgeven en niet-vrijgeven van cellen. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Riethmuller, J., Riehle, A., Grassme, H., Gulbins, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+rafts+in+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Membrane rafts in host-pathogen interactions.</a> Biochim Biophys Acta. 1758 (12), 2139-2147 (2006).</li>
<li>Shahbazian, H., Atrian, A., Yazdanpanah, L., Lashkarara, G. R., Zafar Mohtashami, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25866715">Anti-inflammatory effect of simvastatin in hemodialysis patients.</a> Jundishapur J Nat Pharm Prod. 10, e17962(2015).</li>
<li>Bavari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+raft+microdomains%3A+A+gateway+for+compartmentalized+trafficking+of+Ebola+and+Marburg+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Lipid raft microdomains: A gateway for compartmentalized trafficking of Ebola and Marburg viruses.</a> J Exp Med. 195, 593-602 (2002).</li>
<li>Zaas, D. W., Duncan, M., Rae Wright,, J,, Abraham, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+lipid+rafts+in+the+pathogenesis+of+bacterial+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">The role of lipid rafts in the pathogenesis of bacterial infections.</a> Biochim Biophys Acta. 1746 (3), 305-313 (2005).</li>
<li>Rohde, M., Muller, E., Chhatwal, G. S., Talay, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+cell+caveolae+act+as+an+entry-port+for+group+A+streptococci%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Host cell caveolae act as an entry-port for group A streptococci.</a> Cell Microbiol. 5 (5), 323-342 (2003).</li>
<li>Grassme, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+defense+against+Pseudomonas+aeruginosa+requires+ceramide-rich+membrane+rafts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Host defense against Pseudomonas aeruginosa requires ceramide-rich membrane rafts.</a> Nat Med. 9 (3), 322-330 (2003).</li>
<li>Heung, L. J., Luberto, C., Del Poeta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+sphingolipids+in+microbial+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Role of sphingolipids in microbial pathogenesis.</a> Infect Immun. 74 (1), 28-39 (2006).</li>
<li>Gatfield, J., Pieters, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+role+for+cholesterol+in+entry+of+mycobacteria+into+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Essential role for cholesterol in entry of mycobacteria into macrophages.</a> Science. 288 (5471), 1647-1650 (2000).</li>
<li>Rapini, R. P., Bolognia, J. L., Jorizzo, J. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRapini%2C+RP+%22Dermatology+2-Volume+Set%22">Dermatology 2-Volume Set</a>. , St. Louis: Mosby. (2007).</li>
<li>Tamilselvam, B., Daefler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Francisella+targets+cholesterol-rich+host+cell+membrane+domains+for+entry+into+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Francisella targets cholesterol-rich host cell membrane domains for entry into macrophages.</a> J Immunol. 180 (12), Baltimore, Md. 8262-8271 (2008).</li>
<li>Garner, M. J., Hayward, R. D., Koronakis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Salmonella+pathogenicity+island+1+secretion+system+directs+cellular+cholesterol+redistribution+during+mammalian+cell+entry+and+intracellular+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The Salmonella pathogenicity island 1 secretion system directs cellular cholesterol redistribution during mammalian cell entry and intracellular trafficking.</a> Cell Microbiol. 4 (3), 153-165 (2002).</li>
<li>Gilk, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+colonization+of+host+cells+in+the+absence+of+cholesterol%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Bacterial colonization of host cells in the absence of cholesterol.</a> PLoS Pathog. 9 (1), e1003107(2013).</li>
<li>Tuong, Z. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+Ror%CE%B11+and+cholesterol+25-hydroxylase+expression+attenuates+phagocytosis+in+male+Roralphasg%2Fsg+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Disruption of Rorα1 and cholesterol 25-hydroxylase expression attenuates phagocytosis in male Roralphasg/sg mice.</a> Endocrinology. 154 (1), 140-149 (2013).</li>
<li>Bryan, A. M., Farnoud, A. M., Mor, V., Del Poeta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+cholesterol+depletion+and+its+effect+on+the+phagocytosis+of+Cryptococcus+neoformans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Macrophage cholesterol depletion and its effect on the phagocytosis of Cryptococcus neoformans.</a> J Vis Exp. (94), (2014).</li>
<li>Neumann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+alterations+in+human+blood-derived+neutrophils+lead+to+formation+of+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Lipid alterations in human blood-derived neutrophils lead to formation of neutrophil extracellular traps.</a> Eur J Cell Biol. 93 (8-9), 347-354 (2014).</li>
<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li>
<li>von Köckritz-Blickwede, M., Nizet, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immunity+turned+inside-out%3A+antimicrobial+defense+by+phagocyte+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Innate immunity turned inside-out: antimicrobial defense by phagocyte extracellular traps.</a> J Mol Med. 87 (8), 775-783 (2009).</li>
<li>Fuchs, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+cell+death+program+leads+to+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps.</a> J. Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).</li>
<li>Lauth, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M1+Protein+Allows+Group+A+Streptococcal+Survival+in+Phagocyte+Extracellular+Traps+through+Cathelicidin+Inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Innate+Immun%22%5BJournal%5D)">M1 Protein Allows Group A Streptococcal Survival in Phagocyte Extracellular Traps through Cathelicidin Inhibition.</a> J Innate Immun. 1 (3), 202-214 (2009).</li>
<li>Chow, O. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statins+Enhance+Formation+of+Phagocyte+Extracellular+Traps%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Statins Enhance Formation of Phagocyte Extracellular Traps.</a> Cell Host Microbe. 8 (5), 445-454 (2010).</li>
<li>Simons, K., Vaz, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+systems%2C+lipid+rafts%2C+and+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys+Biomol+Struct%22%5BJournal%5D)">Model systems, lipid rafts, and cell membranes.</a> Annu Rev Biophys Biomol Struct. 33, 269-295 (2004).</li>
<li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+of+total+lipid+extraction+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Biochem+Physiol%22%5BJournal%5D)">A rapid method of total lipid extraction and purification.</a> Can J Biochem Physiol. 37, 911-917 (1959).</li>
<li>Brogden, G., Propsting, M., Adamek, M., Naim, H. Y., Steinhagen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+analysis+of+membrane+lipids+and+lipid+rafts+in+common+carp+%28Cyprinus+carpio+L%29%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Biochem+Physiol+B+Biochem+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and analysis of membrane lipids and lipid rafts in common carp (Cyprinus carpio L).</a> Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 169, 9-15 (2014).</li>
<li>Saldanha, T., Sawaya, A. C., Eberlin, M. N., Bragagnolo, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HPLC+separation+and+determination+of+12+cholesterol+oxidation+products+in+fish%3A+comparative+study+of+RI%2C+UV%2C+and+APCI-MS+detectors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Agric+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">HPLC separation and determination of 12 cholesterol oxidation products in fish: comparative study of RI, UV, and APCI-MS detectors.</a> J Agric Food Chem. 54 (12), 4107-4113 (2006).</li>
<li>Hubicka, U., Krzek, J., Woltynska, H., Stachacz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+identification+and+quantitative+determination+of+selected+aminoglycoside+antibiotics+by+thin-layer+chromatography+and+densitometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+AOAC+Int%22%5BJournal%5D)">Simultaneous identification and quantitative determination of selected aminoglycoside antibiotics by thin-layer chromatography and densitometry.</a> J AOAC Int. 92 (4), 1068-1075 (2009).</li>
<li>Maalouf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+lipid+composition+in+Fabry+disease+leads+to+an+intracellular+block+of+the+detergent-resistant+membrane-associated+dipeptidyl+peptidase+IV%5BTitle%5D)+AND+%22J+Inherit+Metab+Dis%22%5BJournal%5D)">A modified lipid composition in Fabry disease leads to an intracellular block of the detergent-resistant membrane-associated dipeptidyl peptidase IV.</a> J Inherit Metab Dis. 33 (4), 445-449 (2010).</li>
<li>Correia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori%27s+cholesterol+uptake+impacts+resistance+to+docosahexaenoic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori's cholesterol uptake impacts resistance to docosahexaenoic acid.</a> Int J Med Microbiol. 304 (3-4), 314-320 (2014).</li>
<li>Gorudko, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lectin-induced+activation+of+plasma+membrane+NADPH+oxidase+in+cholesterol-depleted+human+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Lectin-induced activation of plasma membrane NADPH oxidase in cholesterol-depleted human neutrophils.</a> Arch Biochem Biophys. 516 (2), 173-181 (2011).</li>
<li>Masoud, R., Bizouarn, T., Houée-Levin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol%3A+A+modulator+of+the+phagocyte+NADPH+oxidase+activity+-+A+cell-free+study%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biol%22%5BJournal%5D)">Cholesterol: A modulator of the phagocyte NADPH oxidase activity - A cell-free study.</a> Redox Biol. 3, 16-24 (2014).</li>
<li>Knight, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidylarginine+deiminase+inhibition+is+immunomodulatory+and+vasculoprotective+in+murine+lupus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Peptidylarginine deiminase inhibition is immunomodulatory and vasculoprotective in murine lupus.</a> J Clin Invest. 123 (7), 2981-2993 (2013).</li>
<li>Reichel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harbour+seal+%28Phoca+vitulina%29+PMN+and+monocytes+release+extracellular+traps+to+capture+the+apicomplexan+parasite+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Comp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Harbour seal (Phoca vitulina) PMN and monocytes release extracellular traps to capture the apicomplexan parasite Toxoplasma gondii.</a> Dev Comp Immunol. 50 (2), 106-115 (2015).</li>
<li>Chuammitri, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chicken+heterophil+extracellular+traps+%28HETs%29%3A+novel+defense+mechanism+of+chicken+heterophils%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Immunol+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Chicken heterophil extracellular traps (HETs): novel defense mechanism of chicken heterophils.</a> Vet Immunol Immunopathol. 129, 126-131 (2009).</li>
<li>Palic, D., Ostojic, J., Andreasen, C. B., Roth, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fish+cast+NETs%3A+Neutrophil+extracellular+traps+are+released+from+fish+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Comp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fish cast NETs: Neutrophil extracellular traps are released from fish neutrophils.</a> Dev Comp Immunol. 31 (8), 805-816 (2007).</li>
<li>Ng, T. H., Chang, S. H., Wu, M. H., Wang, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shrimp+hemocytes+release+extracellular+traps+that+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Comp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Shrimp hemocytes release extracellular traps that kill bacteria.</a> Dev Comp Immunol. 41 (4), 644-651 (2013).</li>
<li>Hawes, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+DNA%3A+the+tip+of+root+defenses%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Extracellular DNA: the tip of root defenses?</a> Plant Sci. 180 (6), 741-745 (2011).</li>
<li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps%3A+is+immunity+the+second+function+of+chromatin%3F%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin?</a> J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).</li>
<li>Xu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+raft-associated+%CE%B2-adducin+is+required+for+PSGL-1-mediated+neutrophil+rolling+on+P-selectin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Lipid raft-associated β-adducin is required for PSGL-1-mediated neutrophil rolling on P-selectin.</a> J Leukoc Biol. 97 (2), 297-306 (2015).</li>
<li>Ermert, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+neutrophil+extracellular+traps+in+microbial+infections%5BTitle%5D)+AND+%22J+Innate+Immun%22%5BJournal%5D)">Mouse neutrophil extracellular traps in microbial infections.</a> J Innate Immun. 1 (3), 181-193 (2009).</li>
<li>Metzler, K. D., Goosmann, C., Lubojemska, A., Zychlinsky, A., Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+myeloperoxidase-containing+complex+regulates+neutrophil+elastase+release+and+actin+dynamics+during+NETosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">A myeloperoxidase-containing complex regulates neutrophil elastase release and actin dynamics during NETosis.</a> Cell Rep. 8 (3), 883-896 (2014).</li>
<li>McGee, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol+enhances+Helicobacter+pylori+resistance+to+antibiotics+and+LL-37%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Cholesterol enhances Helicobacter pylori resistance to antibiotics and LL-37.</a> Antimicrob Agents Chemother. 55 (6), 2897-2904 (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De hier beschreven werkwijzen kunnen worden gebruikt om specifieke lipiden, zoals cholesterol, door HPTLC of HPLC analyseren en de effecten van farmacologische Lipidenveranderingen op de vorming van NET onderzoeken (zie Neumann et al. 15). HPTLC is een relatief kosteneffectief en eenvoudige methode om een ​​groot aantal lipiden analyseren van een groot aantal monsters. Deze werkwijze is gebruikt in vele onderzoeksgebieden, waaronder antibiotica kwantificering...

<html> Lipiden is aangetoond dat ze een belangrijke rol spelen in cel homeostase, celdood, gastheer-pathogeen interacties, en cytokine release 1. Na verloop van tijd, belangstelling voor en kennis over de impact van lipiden in gastheer-pathogeen interacties of ontsteking zijn toegenomen, en verschillende publicaties bevestigen de centrale rol van bepaalde lipiden, in het bijzonder de steroïde cholesterol, in cellulaire reacties. Farmacologische behandeling met statinen, die als remmers van cholesterol-biosynthese worden door blokkeren van 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzym-A-reductase (HMG-CoA-reductase), kan fungeren als anti-inflammatoire middelen door verlaging van de serumspiegels van interleukine 6 en C-reactief proteïne 2. Cholesterol en glycosphingolipide verrijkte structuren kan worden gebruikt door verschillende pathogenen, zoals bacteriën en virussen, als toegangspoort tot de host 3, 4, 5,class = &quot;xref&quot;&gt; 6. Sfingolipiden (zoals sfingomyeline) bleken te gebruiken door ziekteverwekkers hun pathogeniciteit 7 bevorderen. In macrofagen, mycobacteriën gebruik cholesterol-verrijkte domeinen cellen binnendringt; een uitputting van cholesterol remt mycobacteriële opname 8. Bovendien infectie van macrofagen met Francisella tularensis, een zooenoseverwekker belast tularemie (ook bekend als konijn koorts) 9, geleid tot een infectie die werd afgeschaft toen cholesterol werd ontdaan van de membranen 10. Ook de invasie van gastheercellen door Escherichia coli via lipide-rijke structuren werd aangetoond dat cholesterol-afhankelijke 4 zijn. Bovendien Salmonella typhimurium besmettingsexperimenten epitheelcellen aangetoond dat cholesterol essentieel pathogeen binnenkomst in de cellen 11. Cholesterol uitputting inhibited de opname van Salmonella 11. Bovendien, een recente studie van Gilk et al. aangetoond dat cholesterol een belangrijke rol bij de opname van Coxiella burnetii 12 speelt. Bovendien Tuong et al. bleek dat 25-hydroxycholesterol een cruciale rol in fagocytose door lipopolysaccharide (LPS) speelt gestimuleerde macrofagen 13. Fagocytose werd verminderd wanneer macrofagen farmacologisch werden getrakteerd op cholesterol 14 afbreken. Zo, cholesterol en andere lipiden lijken een belangrijke rol bij infecties en ontstekingen te spelen, omdat hun uitputting het risico op invasie van een aantal ziekteverwekkers 10, 11, 12 kan verminderen. Onlangs waren we in staat om aan te tonen dat Lipidenveranderingen, in het bijzonder de uitputting van cholesterol uit de cel, induceren de vorming van neutrofielen extracellular vallen (NET) in menselijk bloed afgeleide neutrofielen 15. Sinds de ontdekking van NET in 2004, hebben ze aangetoond dat cruciale rol spelen in bacteriële beknelling, en dus belemmeren de verspreiding van de infectie 16, 17. NET bestaan uit een DNA skelet geassocieerd met histonen, proteasen en antimicrobiële peptiden 16. De afgifte van het NET door neutrofielen kan worden geïnduceerd door binnendringende ziekteverwekkers 18, 19 en chemicaliën zoals forbol myristaat acetaat (PMA) of statines 16, 20. Echter, de gedetailleerde cellulaire mechanismen, en in het bijzonder de rol van lipiden in dit proces, zijn nog steeds niet helemaal duidelijk. De analyse van de lipiden kan leiden tot een beter begrip van de betrokken in een breed scala van cellulaire processen en interacties, zoals de vrijlating van de netten mechanismen. CholesteRol en sfingomyeline zijn vitale bestanddelen van het celmembraan en lipide microdomeinen, waar stabiliteit toe te voegen en het clusteren van de bij eiwittransport en signaleringsgebeurtenissen 21 eiwitten bevorderen. De mechanistische rol van bepaalde lipiden, amfifiele farmacologische middelen, zoals de cyclische oligosaccharide methyl-β-cyclodextrine (MβCD) onderzoeken kunnen worden toegepast om de lipidesamenstelling van een cel veranderen en cholesterol in vitro 15 verminderen. Hier presenteren we een methode om HPTLC gebruiken om de lipide samenstelling van neutrofielen te analyseren in reactie op MβCD. HPLC werd gebruikt om het niveau van cholesterol in de neutrofielen bevolking te bevestigen. Verder beschrijven we een werkwijze voor de vorming van NET door immuunfluorescentiemicroscopie in menselijk bloed afgeleide visualiseren neutrofielen als reactie op MβCD.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Neutrophil isolation, NET staining and quantification</td></tr><tr><td>Alexa Flour 633 goat anti-rabbit IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A-21070</td><td></td></tr><tr><td>Anti-MPO&alpha; antibody</td><td>Dako</td><td>A0398</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3912-100G</td><td></td></tr><tr><td>Marienfeld-Neubauer improved counting chamber</td><td>Celeromics</td><td>MF-0640010</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope TCS SP5 AOBS with tandem scanner</td><td>Leica</td><td>DMI6000CS</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&acute;s PBS 10x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493-1L</td><td>Dilute 1:10 in water for 1x working solution</td></tr><tr><td>Dy Light 488 conjugated highly cross-absorbed</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35503</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>2010</td><td></td></tr><tr><td>DNA/Histone 1 antibody</td><td>Millipore</td><td>MAB3864</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>1.8</td><td>http://imagej.nih.gov/ij/</td></tr><tr><td>Light microscope</td><td>VWR</td><td>630-1554</td><td></td></tr><tr><td>Methyl-&beta;-cyclodextrin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4555-1G</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Carl Roth</td><td>0335.3</td><td>dissolve in water, heat up to 65 &deg;C and add 1 N NaOH to clear solution</td></tr><tr><td>PMA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8139-1MG</td><td>Stock 16 &micro;M, dissolved in 1x PBS</td></tr><tr><td>Poly-L-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Polymorphprep</td><td>AXIS-SHIELD</td><td>AN1114683</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold antifade reagent with DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P7481</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>P7581</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>PAA</td><td>E 15-848</td><td></td></tr><tr><td>HBSS with CaCl and Mg</td><td>Sigma</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787-50ml</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblue</td><td>Invitrogen</td><td>15250-061</td><td>0.4% solution</td></tr><tr><td>Water</td><td>Carl Roth</td><td>3255.1</td><td>endotoxin-free</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number&nbsp;</td><td>Comments</td></tr><tr><td colspan="4">Lipid isolation and analysis</td></tr><tr><td>1-propanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>33538</td><td></td></tr><tr><td>10 &micro;L syringe</td><td>Hamilton</td><td>701 NR 10 &micro;l</td><td></td></tr><tr><td>Diethyl ether</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>346136</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl acetate</td><td>Carl Roth</td><td>7336.2</td><td></td></tr><tr><td>Canullla 26 G</td><td>Braun</td><td>4657683</td><td></td></tr><tr><td>Copper(II)sulphatepentahydrate</td><td>Merck</td><td>1027805000</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Carl Roth</td><td>7331.1</td><td></td></tr><tr><td>CP ATLAS software</td><td>Lazarsoftware</td><td>2.0</td><td></td></tr><tr><td>Chromolith HighResolution RP-18 endcapped 100-4.6 mm column</td><td>Merck</td><td>152022</td><td></td></tr><tr><td>High Performance Liquid Chromatograph Chromaster</td><td>Hitachi</td><td>HITA 892-0080-30Y</td><td>Paramaters are dependent on individual HPLC machine</td></tr><tr><td>HPLC UV Detector</td><td>Hitachi</td><td>5410</td><td></td></tr><tr><td>HPLC Column Oven</td><td>Hitachi</td><td>5310</td><td></td></tr><tr><td>HPLC Auto Sampler</td><td>Hitachi</td><td>5260</td><td></td></tr><tr><td>HPLC Pump</td><td>Hitachi</td><td>5160</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Carl Roth</td><td>7342.1</td><td></td></tr><tr><td>n-Hexane</td><td>Carl Roth</td><td>7339.1</td><td></td></tr><tr><td>Phosphoric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30417</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Merck</td><td>49,361,000</td><td></td></tr><tr><td>Potters</td><td>LAT Garbsen</td><td>5 ml</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Carl Roth</td><td>CN30.3</td><td></td></tr><tr><td>HPTLC silica gel 60</td><td>Merck</td><td>105553</td><td></td></tr><tr><td>Vacufuge plus basic device</td><td>Eppendorf</td><td>22820001</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar cell culture 48-well plate, flat bottom</td><td>Sigma</td><td>CLS3548</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1198882</td><td></td></tr><tr><td>Glass slide</td><td>Carl Roth</td><td>1879</td><td></td></tr><tr><td>BD Tuberculin Syringe Only 1 mL</td><td>BD Bioscience</td><td>309659</td><td></td></tr></tbody></table>

methoden om te studeren lipidenveranderingen in neutrofielen en de daaropvolgende vorming van neutrofielen extracellulaire traps

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

Lipide-analyse uitgevoerd door hoge prestatie dunnelaagchromatografie (HPTLC) is een relatief eenvoudige, kosteneffectieve werkwijze voor het analyseren van een breed scala aan lipiden. De functie van lipiden (bijvoorbeeld in gastheer-pathogeen interacties of gastheer entry) is gemeld dat zij een cruciale rol in de cellulaire processen. Hier tonen wij een werkwijze voor lipidesamenstelling te bepalen, met een focus op het cholesterolgehalte primaire bloed afgeleide neutrofielen door HPTLC vergeleken met sterk scheidende vloeistofchromatografie (HPLC). Het doel was om de rol van lipiden / cholesterol veranderingen in de vorming van neutrofielen extracellulaire vallen (NET&#39;s) te onderzoeken. Nettovrijval is bekend als een afweer mechanisme om ziektekiemen te voorkomen verspreiding in de gastheer. Daarom werden bloed-afkomstige humane neutrofielen behandeld met methyl-β-cyclodextrine (MβCD) lipide veranderingen induceren in de cellen. Gebruik HPTLC en HPLC, hebben we aangetoond dat MβCD behandeling van de cellen leidt tot lipideveranderingen geassocieerd met een significante verlaging van het cholesterolgehalte van de cel. Tegelijkertijd, MβCD behandeling van neutrofielen leidde tot de vorming van NET, zoals getoond door immunofluorescentie microscopie. Kortom, hier presenteren we een gedetailleerde methode om lipide veranderingen in neutrofielen en de vorming van de netten te bestuderen.

Humaan bloed afgeleide neutrofielen werden geïsoleerd door dichtheidsgradiënt centrifugatie (figuur 2). Om het effect van Lipidenveranderingen op neutrofielen te onderzoeken, werden de cellen behandeld met 10 mM MβCD die cholesterol put uit de cel. Vervolgens werden de lipiden geïsoleerd uit monsters van Bligh en Dyer (figuur 1, linker paneel), zoals beschreven door Brogden et al. 23. De bereide lipide monsters werden op ...

Lipiden is bekend dat ze een belangrijke rol in cellulaire functies spelen. We beschrijven een werkwijze om de lipidesamenstelling van neutrofielen te bepalen, met de nadruk op het cholesterolgehalte, door zowel HPTLC en HPLC aan een beter begrip van de onderliggende mechanismen van neutrofielen extracellulaire val vorming krijgen.

Methoden om te studeren Lipidenveranderingen in neutrofielen en de daaropvolgende vorming van neutrofielen Extracellulaire Traps

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

Het algemene doel van deze methode is om veranderingen in de lipidensamenstelling van neutrofielen te onderzoeken tijdens de afgifte van neutrofiele extracellulaire vallen door middel van dunnelaagchromatografie en HPLC. Deze methode kan worden gebruikt om meer gedetailleerde informatie te verkrijgen over de mechanismen die betrokken zijn bij de vorming van neutrofiele extracellulaire vallen, of kortweg, NET-vorming. Het grote voordeel van deze procedure is dat het informatie biedt over de rol van lipiden in de algemene functie van neutrofielen door gebruik te maken van een eenvoudig te volgen protocol.De isolatie van humane bloedafgeleide cellen zal worden gedemonstreerd door een voormalig PhD-student van ons lab, Ariane Neumann. En ze zal worden bijgestaan door Friederike Reuner. De bereiding van cellen voor lipideanalyse zal worden gedemonstreerd door Graham Brogden, een post-doc in mijn laboratorium en Diab Husein, een masterstudent in het biochemieprogramma.Om humane bloedafleiding neutrofielen te isoleren, plaatst u ongeveer 20 mL bloed op 20 mL natriumdiatrizoaat/dextran-oplossing in de buurt van een vlam, zonder te mengen. Centrifugeer gedurende 30 minuten bij 470 keer g zo

methods-to-study-lipid-alterations-neutrophils-subsequent-formation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Neutrofielen extracellulaire Vallen (NET's) zijn een belangrijk aangeboren immuun mechanisme om pathogene bacteriën, schimmels en parasieten te bestrijden. Hier beschrijven we methoden om neutrofiele granulocyten isoleren uit menselijk bloed en ze te activeren om netten te vormen. We presenteren bereidingstechnieken aan netten in licht-en elektronenmicroscopie te visualiseren.

Neutrofielen Extracellulaire Traps: Hoe te genereren en te visualiseren

This video demonstrates an in vitro technique to generate and isolate neutrophil extracellular traps (NETs). Neutrophils are isolated from peripheral blood and stimulated with phorbol myristate acetate (PMA) to produce NETs. During incubation, the neutrophils undergo a process of cell death (NETosis) to release NETs comprising decondensed chromatin mixed with granular cytoplasmic proteins.

An In Vitro Technique to Generate Human Neutrophil Extracellular Traps

This video demonstrates the induction and visualization of neutrophil extracellular traps or NETs in pre-labeled neutrophils using patient serum containing anti-neutrophil cytoplasmic antibodies. Furthermore, using an impermeable DNA dye and fluorescence microscopy enables the visualization of NETs.

Induction and Visualization of Neutrophil Extracellular Traps in Pre-Labeled Neutrophils

We beschrijven de methoden om te isoleren canine neutrofielen van volbloed en visualiseren van netto vorming in levende neutrofiele granulocyten met behulp van fluorescentie microscopie. Ook beschreven zijn protocollen te kwantificeren netto vorming en citrullinated Histon H3 (citH3)-expressie met immunofluorescentie microscopie.

In Vitro Canine neutrofiele extracellulaire Trap vorming: Dynamische en kwantitatieve analyse door fluorescentie microscopie

Dit protocol beschrijft een zeer gevoelige en hoge doorvoer neutrofiele extracellulaire val (NET) assay voor de semi-automatische kwantificering van ex vivo NET vorming door immunofluorescentie driedimensionale confocale microscopie. Dit protocol kan worden gebruikt voor het evalueren van de netto vorming en afbraak na verschillende prikkels en kan worden gebruikt voor het bestuderen van potentiële NET-gerichte therapieën.

Een High-throughput Assay voor het beoordelen en kwantificeren van neutrofiele extracellulaire Trap vorming

Hier is een protocol voor het opsporen van macrofaag extracellulaire trap (met) productie in levende celcultuur met behulp van microscopie en fluorescentie kleuring. Dit protocol kan verder worden uitgebreid om specifieke MET eiwit markers te onderzoeken door immunofluorescentie kleuring.

In vitro stimulatie en visualisatie van extracellulaire val afgifte in gedifferentieerde humane monocyte-afgeleide macrofagen

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de inductie en analyse van in vitro neutrofiele extracellulaire vallen (NET's). Kwantificering van DNA, cathelicidin (LL37) en enzymactiviteit leverde gegevens op die de variabiliteit in de samenstelling en morfologie van NET's geïnduceerd door microbiële en chemische stimuli onder vergelijkbare gecontroleerde omstandigheden aantonen.

Morfologische en compositorische analyse van neutrofiele extracellulaire vallen geïnduceerd door microbiële en chemische stimuli

We presenteren een geautomatiseerde high-throughput methode om neutrofiele extracellulaire vallen (NET's) te kwantificeren met behulp van het live cell analysesysteem, gekoppeld aan een membraanpermeabiliteit-afhankelijke dual-dye benadering.

Real-time High Throughput-techniek om de vorming van extracellulaire neutrofielen in menselijke neutrofielen te kwantificeren

Dit gedefinieerde protocol beschrijft een real-time high-throughput microscopiebenadering om de afgifte van humane neutrofielen extracellulaire val (NET) in vitro te visualiseren en te kwantificeren. De reproduceerbare methode maakt onderzoek mogelijk naar de kenmerken en kinetiek van NETosis-afgifte na stimulatie met verschillende NETosis-inductoren en maakt beoordeling van de farmacologie van NETosis-antagonisten mogelijk.

Realtime, high-throughput microscopische kwantificering van de afgifte van extracellulaire vallen van menselijke neutrofielen en beoordeling van de farmacologie van antagonisten

Er wordt een reeks methoden beschreven, waaronder de isolatie van lipoproteïne met lage dichtheid (LDL) uit menselijk plasma, differentiatie van HL-60-cellen in neutrofielenachtige cellen, bereiding van neutrofiele extracellulaire vallen (NET's) in aanwezigheid van LDL, en stimulatie van menselijke aorta-endotheelcellen met een mengsel van NET en LDL.

Stimulatie van vasculaire endotheelcellen met behulp van neutrofiele extracellulaire vallen in aanwezigheid van lipoproteïne met lage dichtheid

Neutrofielen met lage dichtheid (LDN) nemen aanzienlijk toe bij verschillende ziekten. LDN worden meestal geïsoleerd door middel van celsortering. We presenteren een praktische methode om zuiver en levensvatbaar LDN te verkrijgen. Na dichtheidsgradiëntcentrifugatie van perifeer bloed worden cellen geïncubeerd met magnetische microbeads en vervolgens wordt LDN gescheiden door magnetische kolommen.

Snelle magnetische microbead-methode voor efficiënte zuivering van neutrofielen met lage dichtheid

Leer lipidenanalyse van neutrofielen met HPTLC en HPLC voor onderzoek naar NET-vorming. Deze methode biedt inzicht in de rol van cholesterol bij de functie van menselijke bloedneutrofielen.

Methoden om te studeren Lipidenveranderingen in neutrofielen en de daaropvolgende vorming van neutrofielen Extracellulaire Traps (Video) | JoVE Journal

Methoden om te studeren Lipidenveranderingen in neutrofielen en de daaropvolgende vorming van neutrofielen Extracellulaire Traps

Meer video's verkennen