Name: Tools om de rol van de Architectural eiwit HMGB1 Bestudeer in de verwerking van Helix vervormen, site-specifieke DNA InterStrand Crosslinks (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: Leer hoe je de associatie van architecturale eiwitten met site-specifieke DNA-schade bestudeert in menselijke cellen. Deze methode helpt onderzoekers DNA-reparatieprocessen te evalueren voor kankertherapie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag de leden van Vasquez laboratorium bedanken voor nuttige discussies. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health / National Cancer Institute [CA097175, CA093279 om KMV]; en de Cancer Prevention and Research Institute van Texas [RP101501]. Financiering voor open access kosten: National Institutes of Health / National Cancer Institute [CA093279 om KMV].

1. Bereiding van TFO gerichte ICLs op Plasmid Substrates <ol><li> Incubeer equimolaire hoeveelheden plasmide pSupFG1 10,11 DNA (5 ug plasmide-DNA is een goed uitgangspunt) met psoraleen geconjugeerd TFO AG30 in 8 gl triplex bindingsbuffer [50% glycerol, 10 mM Tris (pH 7,6), 10 mM MgClz 2] en dH 2 O tot een eindvolume van 40 ul in een amber buisje. Meng goed door en neer te pipetteren. Incubeer de reactie bij 37 ° C waterbad gedurende 12 uur. </li><li> Warmen de UVA lamp op volle vermogen te garanderen. Plaats de triplex reactie op film paraffine en plaats de paraffine film op ijs onder het UVA (365 nm) lamp. Plaats een Mylar filter tussen de lamp en de reactie. </li><li> UVA bestralen voor een totale dosis van 1,8 J / cm2. Bewaar de monsters bij 4 ° C voor verder gebruik. Let op: Draag de juiste beschermende brillen en kleding met UVA-straling. </li><li> Lineariseren 200 ng van het hierboven bereide plasmide met de rerestrictie-enzym Eco R1 in een 20 ui totaal volume met behulp van de fabrikant 10x buffer. Warmte denatureren van het enzym gedurende 20 minuten bij 65 ° C. Spin de monsters gedurende 10 min bij 10.000 xg en bewaren bij 4 ° C. </li><li> Bereid 50x alkalische buffer [1,5 M NaOH, 50 mM Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA)]. Voeg 0,5 mg agarose 50 ml dH 2 O. Kook de agarose op te lossen en te plaatsen in een 50 ° C waterbad. </li><li> Nadat de temperatuur van de opgeloste agarose wordt tot 50 ° C, voeg 1 ml van de alkalische buffer 50x, mengen en giet de gel in de gel lade. Wacht totdat de gel stolt bij kamertemperatuur vóór gebruik. </li><li> Voeg 4 pi 0,5 M EDTA aan de 20 pl gelineariseerd DNA monster en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Voeg 6x alkalische gel laadbuffer (300 mM NaOH, 6 mM EDTA, 18% (w / v) hoogmoleculaire polysacharide, 0,06% broomkresolgroen in dH 2 O) aan de monsters en een 1 kb DNA ladder. LET OP: Het is belangrijk om 6x alkalische gel laadbuffer gebruiken, neem dan zie bespreking. </li><li> samples belasting op de gel in de koude kamer en lopen &#39;s nachts in 1x alkalische buffer (12-16 uur) bij 3,2 volt per cm. Zodra de monsters de gel heeft ingevoerd, plaats een glasplaat boven op de gel te voorkomen drijven. </li><li> Neutraliseren van de monsters door het weken van de gel in neutralisatie buffer [1 M Tris-Cl (pH 7,6), 1,5 M NaCl, 3 M natriumacetaat (pH 5,2)] gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Vlekken op de gel voor DNA met 4 pi 1% ethidiumbromide (EtBr) in 50 ml water gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. Destain met water gedurende 15 min. Visualiseren van het DNA met een beeldvormingssysteem. Let op: EtBr is een krachtige mutagene stof en kan worden geabsorbeerd door de huid. Vermijd direct contact met EtBr. </li></ol> 2. Transfectie en immunoprecipitatie van TFO-gerichte ICL-bevattende Plasmiden Human Cells <ol><li> Plate 400.000 zoogdiercellen (bijv U2OS osteosarcoma cellen) per 60 mm schotel in Dulbecco&#39;s Gemodificeerd Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) zonder antibiotica 24 uur voor transfectie. Incubeer cellen overnacht bij 37 ° C met 5% CO2. </li><li> Voor transfectie, warm kweekmedium en fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) tot 37 ° C in een waterbad. Verwarm het transfectiereagens tot kamertemperatuur. </li><li> Incubeer 30 ui transfectiereagens met 500 pl 1x groeimedia (mengsel 1) en 2 ug TFO-gerichte ICL-bevattende plasmiden in 500 gl van 1x groeimedia (mengsel 2) in afzonderlijke 14 ml ronde bodem buizen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> mix 1 toe te voegen aan mengen 2, meng goed door en neer te pipetteren. Incubeer 25-30 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Was de cellen tweemaal met warm PBS. Voeg de transfectie mix in een druppelsgewijze manier verspreiden gelijkmatig over de plaat van de cellen. Voeg 1 ml groeimedium op de plaat en breng het uiteindelijke volume op 2 ml. meng well. Plaats de kweekplaten in de 37 ° C incubator met 5% CO2 gedurende 4 uur. </li><li> Vervang het medium met 3 ml kweekmedium aangevuld met 10% FBS en incubeer verder gedurende 16 uur. Gebruik geen antibiotica gebruiken. </li><li> Behandel cellen met 80 ul van 37% vers formaldehyde per plaat tot een uiteindelijke concentratie van ongeveer 1% en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur in afwezigheid van licht. Let op: Formaldehyde is giftig en moet worden behandeld in overeenstemming met de veiligheidsvoorschriften. blootstelling aan formaldehyde kan schade aan de huid, ogen en luchtwegen veroorzaken. </li><li> Quench formaldehyde verknoping door toevoeging van 300 pl gekoelde glycine (in de handel verkrijgbare kits geleverd) per plaat en incubatie gedurende 5 min. Verwijder het medium en tweemaal wassen met koud PBS en verzamelen cellen door schrapen in 1 ml gekoelde (4 ° C) PBS in een microcentrifugebuis. Houd de monsters op ijs te allen tijde. </li><li> Bereid celpellets door centrifugeren bij 4 ° C gedurende 5 minuten werd eent 13.400 xg middels een tafelblad gekoelde centrifuge. Pipet uit de bovenstaande vloeistof en leg de cel pellet op ijs. </li><li> Homogeen resuspendeer de pellet in 1 ml gekoelde (4 ° C) Buffer A (geleverd in de handel verkrijgbare kits) en incubeer op ijs gedurende 10 min. Meng af en toe door het omkeren van de buis. Pellet cellen als voorheen (zie stap 2.9 hierboven). </li><li> Homogeen resuspendeer de pellet in 1 ml gekoelde (4 ° C) Buffer B (geleverd in de handel verkrijgbare kits) en incubeer op ijs gedurende 10 minuten met af en toe mengen door omkeren. Pellet cellen door centrifugeren als voorheen (zie stap 2.9 hierboven). </li><li> Resuspendeer de cellen opnieuw in 200 gl gekoelde buffer B. Voeg 2 pl Micrococcal nuclease (MNase) en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 min. Meng reactie af en toe door de knop de buis. Stop de MNase reactie door het plaatsen van de buis op het ijs en de toevoeging van 40 mM EDTA. Pellet cellen als voorheen (zie stap 2.9 hierboven). </li><li> Resuspendeer cellen in 100 ul 1x chromatine immunoprecipitation buffer (ChIP) buffer (geleverd in de handel verkrijgbare kits), aangevuld met protease inhibitor cocktail. </li><li> Plaats de cellen geresuspendeerd in een dunwandige microfugebuis. Ultrasone trillingen van de monsters door drijvende ze op waterbad ultrasoonapparaat gedurende 20 seconden gevolgd door 20 sec incubatie op ijs. Herhaal ultrasoonapparaat stap 9 keer tot het genereren van ~ 800-1200 bp fragmenten. <ol><li> Tot 20 pl van de monsters gesoniceerd en voeg 3 pl 5 M NaCl en 1 pi RNase A. Meng vortex en incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten. Voeg vervolgens 2 pl Proteinase K en incubeer gedurende 2 uur bij 65 ° C. Zuiver de monsters met behulp van een PCR zuivering kit. Run monsters op 1% agarosegel en zichtbaar met EtBr. LET OP: Maximale intensiteit van de resulterende DNA moet worden op of onder 1000 bp. </li></ol></li><li> In drie afzonderlijke buizen, voeg 30 ul lysaat in een voorgekoeld silicium voorziene buis en voeg 70 ul gekoelde 1x ChIP buffer met toegevoegde proteaseremmers. Voeg 1 μg anti-immunoglobuline G (IgG), anti-histon H3 (als positieve controle), of anti-HMGB1 antilichamen tegen de respectievelijke buizen. Incubeer overnacht in een koude kamer met continue rotatie. </li><li> Resuspendeer proteïne G kralen homogeen in de koude kamer. Voeg 4 pi van proteïne G korrels per buis en incubeer gedurende een 2-4 uur in de koude kamer met rotatie. </li><li> Met behulp van een magnetisch rek, pellet de kralen en verwijder het supernatant. Voeg 200 ul 1 x ChIP buffer gemengd met protease inhibitor cocktail de pellet en was gedurende 5 minuten in de koude kamer met rotatie. Herhaal dit twee keer wassen. </li><li> Voer een extra wasbeurt met een hoog zoutgehalte 1x ChIP buffer (die 70 mM NaCl). </li><li> Resuspendeer de korrels met 160 ul elutiebuffer (in de handel verkrijgbare kits geleverd) en incubeer bij 37 ° C met rotatie gedurende 30 min. </li><li> Pellet de kralen en het verzamelen van de supernatant in een nieuwe buis. Voeg 6 pl 5 M NaCl en 2 pl proteinase K, en incubeer overnacht bij 65° C. </li><li> Zuiver het DNA met behulp van een PCR-product zuiveringssamenstel en elueer het DNA met 50 pl dH 2 O. </li><li> Voer PCR 16 reacties met behulp van primer sets van de regio ( &#39;s) van belang, en het oplossen van de producten op een 1% agarosegel gekleurd met EtBr. </li></ol> 3. Assay supercoiling en 2-dimensionale agarosegelelektroforese <ol><li> Bereid DNA herstel synthese buffer (45 mM Hepes-KOH, pH 7,8; 70 mM KCI, 7,4 mM MgCl2, 0,9 mM DTT, 0,4 mM EDTA, 2 mM ATP, 20 pM dNTP&#39;s, 3,4% glycerol en 18 g runderserumalbumine) . Bewaar bij -80 ° C. Dooi op ijs en voorafgaand aan het gebruik toe te voegen 40 mM phosphocreatine en 2,5 ug creatinefosfokinase. </li><li> Bereid 10x supercoiling buffer [500 mM Tris (pH 8,0), 500 mM NaCl, 25 mM MgCl2, 1 mM EDTA], en bewaar bij kamertemperatuur. </li><li> Lineariseren 300 ng supercoiled plasmide DNA pSupFG1 volledig gebruik 1 pi Vaccinia topoisomerase I (5-15 U / pl) met 1xsupercoiling buffer in een 10 pi reactie. Incubeer het mengsel bij 37 ° C gedurende 1 uur. </li><li> Ontdooien HeLa celvrij extract 24 op ijs. Om het volledig ontspannen plasmiden, voeg 25 ul HeLa celvrij extract en DNA herstel synthese buffer. Goed mengen. Voeg extra 1 ui Vaccinia topoisomerase I van het mengsel en incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C. </li><li> De reacties beëindigd door toevoeging van natriumdodecylsulfaat (SDS) (1% eindconcentratie) en proteinase K (0,25 mg / ml eindconcentratie). Incubeer bij 65 ° C gedurende 2 uur. </li><li> Zet een 1% agarosegel met 1 x Tris boraat-EDTA (TBE) buffer. Voeg DNA laadkleurstof en de reacties direct op de gel ten minste 4 rijstroken elkaar laden. Voer de elektroforese gedurende 8-10 uur bij 2 V / cm in 1x TBE (maat 1) bij kamertemperatuur om het topoisomers lossen. OPMERKING: Bereid een 5x TBE voorraad oplossing in 1 L van dH 2 O door toevoeging van 54 g Tris-base. 27,5 g boorzuur en 20 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0). </li><li> Bereid 2 L van 1xTBE met 3 ug / ml chloroquine fosfaat. Laat de gel in 200 ml van deze oplossing gedurende 20 min. Bedek de gel lade met aluminiumfolie. </li><li> Om de gel in de tweede dimensie Electrophorese, zet de gel 90 ° met de klok mee mode en voer het voor 4-6 uur bij 2 V / cm in chloroquine bestaande uit 1x TBE om de positieve en negatieve supercoils lossen. </li><li> Vlekken op de gel met EtBr gedurende 1 uur op een rocker. Destain de gel met dH 2 O 15 min en vervolgens visualiseren warmteverdeling van de topoisomers gebruik van een beeldvormer. </li></ol>

<ol><li>Moser, H. E., Dervan, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence-specific+cleavage+of+double+helical+DNA+by+triple+helix+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sequence-specific cleavage of double helical DNA by triple helix formation.</a> Science. 238, 645-650 (1987).</li>
<li>Cooney, M., Czernuszewicz, G., Postel, E. H., Flint, S. J., Hogan, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+oligonucleotide+binding+represses+transcription+of+the+human+c-myc+gene+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Site-specific oligonucleotide binding represses transcription of the human c-myc gene in vitro.</a> Science. 241, 456-459 (1988).</li>
<li>Beal, P. A., Dervan, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second+structural+motif+for+recognition+of+DNA+by+oligonucleotide-directed+triple-helix+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Second structural motif for recognition of DNA by oligonucleotide-directed triple-helix formation.</a> Science. 251, 1360-1363 (1991).</li>
<li>Vasquez, K. M., Dagle, J. M., Weeks, D. L., Glazer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+targeting+at+short+polypurine+sites+by+cationic+triplex-forming+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Chromosome targeting at short polypurine sites by cationic triplex-forming oligonucleotides.</a> J Biol Chem. 276, 38536-38541 (2001).</li>
<li>Vasquez, K. M., Christensen, J., Li, L., Finch, R. A., Glazer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+XPA+and+RPA+DNA+repair+proteins+participate+in+specific+recognition+of+triplex-induced+helical+distortions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Human XPA and RPA DNA repair proteins participate in specific recognition of triplex-induced helical distortions.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 5848-5853 (2002).</li>
<li>Mukherjee, A., Vasquez, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triplex+technology+in+studies+of+DNA+damage%2C+DNA+repair%2C+and+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Triplex technology in studies of DNA damage, DNA repair, and mutagenesis.</a> Biochimie. 93, 1197-1208 (2011).</li>
<li>Chin, J. Y., Glazer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+DNA+lesions+associated+with+triplex-forming+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Carcinog%22%5BJournal%5D)">Repair of DNA lesions associated with triplex-forming oligonucleotides.</a> Mol Carcinog. 48, 389-399 (2009).</li>
<li>Seidman, M. M., Glazer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+for+gene+repair+via+triple+helix+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">The potential for gene repair via triple helix formation.</a> J Clin Invest. 112, 487-494 (2003).</li>
<li>Vasquez, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+and+processing+of+site-specific+DNA+interstrand+crosslinks%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Mol+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Targeting and processing of site-specific DNA interstrand crosslinks.</a> Environ Mol Mutagen. 51, 527-539 (2010).</li>
<li>Wang, G., Levy, D. D., Seidman, M. M., Glazer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+mutagenesis+in+mammalian+cells+mediated+by+intracellular+triple+helix+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Targeted mutagenesis in mammalian cells mediated by intracellular triple helix formation.</a> Mol Cell Biol. 15, 1759-1768 (1995).</li>
<li>Wang, G., Seidman, M. M., Glazer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenesis+in+mammalian+cells+induced+by+triple+helix+formation+and+transcription-coupled+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mutagenesis in mammalian cells induced by triple helix formation and transcription-coupled repair.</a> Science. 271, 802-805 (1996).</li>
<li>Chen, Z., Xu, X. S., Yang, J., Wang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+function+of+XPC+protein+in+psoralen+and+cisplatin-mediated+DNA+repair+and+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Defining the function of XPC protein in psoralen and cisplatin-mediated DNA repair and mutagenesis.</a> Carcinogenesis. 24, 1111-1121 (2003).</li>
<li>Derheimer, F. A., Hicks, J. K., Paulsen, M. T., Canman, C. E., Ljungman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psoralen-induced+DNA+interstrand+cross-links+block+transcription+and+induce+p53+in+an+ataxia-telangiectasia+and+rad3-related-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Psoralen-induced DNA interstrand cross-links block transcription and induce p53 in an ataxia-telangiectasia and rad3-related-dependent manner.</a> Mol Pharmacol. 75, 599-607 (2009).</li>
<li>Vare, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+interstrand+crosslinks+induce+a+potent+replication+block+followed+by+formation+and+repair+of+double+strand+breaks+in+intact+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+repair%22%5BJournal%5D)">DNA interstrand crosslinks induce a potent replication block followed by formation and repair of double strand breaks in intact mammalian cells.</a> DNA repair. 11, 976-985 (2012).</li>
<li>Huang, Y., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+crosslinking+damage+and+cancer+-+a+tale+of+friend+and+foe%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">DNA crosslinking damage and cancer - a tale of friend and foe.</a> Transl Cancer Res. 2, 144-154 (2013).</li>
<li>Mukherjee, A., Vasquez, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HMGB1+interacts+with+XPA+to+facilitate+the+processing+of+DNA+interstrand+crosslinks+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">HMGB1 interacts with XPA to facilitate the processing of DNA interstrand crosslinks in human cells.</a> Nucleic Acids Res. 44, 1151-1160 (2016).</li>
<li>Bidney, D. L., Reeck, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+from+cultured+hepatoma+cells+of+two+nonhistone+chromatin+proteins+with+preferential+affinity+for+single-stranded+DNA%3A+apparent+analogy+with+calf+thymus+HMG+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Purification from cultured hepatoma cells of two nonhistone chromatin proteins with preferential affinity for single-stranded DNA: apparent analogy with calf thymus HMG proteins.</a> Biochem Biophys Res Commun. 85, 1211-1218 (1978).</li>
<li>Bianchi, M. E., Beltrame, M., Paonessa, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+recognition+of+cruciform+DNA+by+nuclear+protein+HMG1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Specific recognition of cruciform DNA by nuclear protein HMG1.</a> Science. 243, 1056-1059 (1989).</li>
<li>Jung, Y., Lippard, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nature+of+full-length+HMGB1+binding+to+cisplatin-modified+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Nature of full-length HMGB1 binding to cisplatin-modified DNA.</a> Biochemistry. 42, 2664-2671 (2003).</li>
<li>Reddy, M. C., Christensen, J., Vasquez, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+human+high+mobility+group+protein+1+and+replication+protein+A+on+psoralen-cross-linked+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Interplay between human high mobility group protein 1 and replication protein A on psoralen-cross-linked DNA.</a> Biochemistry. 44, 4188-4195 (2005).</li>
<li>Das, D., Scovell, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+binding+interaction+of+HMG-1+with+the+TATA-binding+protein%2FTATA+complex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The binding interaction of HMG-1 with the TATA-binding protein/TATA complex.</a> J Biol Chem. 276, 32597-32605 (2001).</li>
<li>Little, A. J., Corbett, E., Ortega, F., Schatz, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+recruitment+of+HMGB1+during+V%28D%29J+recombination+through+interactions+with+RAG1+and+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Cooperative recruitment of HMGB1 during V(D)J recombination through interactions with RAG1 and DNA.</a> Nucleic Acids Res. 41, 3289-3301 (2013).</li>
<li>Lange, S. S., Mitchell, D. L., Vasquez, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+mobility+group+protein+B1+enhances+DNA+repair+and+chromatin+modification+after+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">High mobility group protein B1 enhances DNA repair and chromatin modification after DNA damage.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 10320-10325 (2008).</li>
<li>Lange, S. S., Reddy, M. C., Vasquez, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+HMGB1+directly+facilitates+interactions+between+nucleotide+excision+repair+proteins+on+triplex-directed+psoralen+interstrand+crosslinks%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+repair%22%5BJournal%5D)">Human HMGB1 directly facilitates interactions between nucleotide excision repair proteins on triplex-directed psoralen interstrand crosslinks.</a> DNA repair. 8, 865-872 (2009).</li>
<li>Park, J. Y., Ahn, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+DNA+topology+on+plasmid+DNA+repair+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+letters%22%5BJournal%5D)">Effect of DNA topology on plasmid DNA repair in vivo.</a> FEBS letters. , 174-178 (2000).</li>
<li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-affinity+triplex-forming+oligonucleotide+target+sequences+in+mammalian+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Carcinog%22%5BJournal%5D)">High-affinity triplex-forming oligonucleotide target sequences in mammalian genomes.</a> Mol Carcinog. 46, 15-23 (2007).</li>
<li>Sheflin, L. G., Spaulding, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+mobility+group+protein+1+preferentially+conserves+torsion+in+negatively+supercoiled+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">High mobility group protein 1 preferentially conserves torsion in negatively supercoiled DNA.</a> Biochemistry. 28, 5658-5664 (1989).</li>
<li>Betous, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+TLS+DNA+polymerases+eta+and+kappa+in+processing+naturally+occurring+structured+DNA+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Carcinog%22%5BJournal%5D)">Role of TLS DNA polymerases eta and kappa in processing naturally occurring structured DNA in human cells.</a> Mol Carcinog. 48, 369-378 (2009).</li>
<li>Luo, Z., Macris, M. A., Faruqi, A. F., Glazer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-frequency+intrachromosomal+gene+conversion+induced+by+triplex-forming+oligonucleotides+microinjected+into+mouse+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">High-frequency intrachromosomal gene conversion induced by triplex-forming oligonucleotides microinjected into mouse cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 9003-9008 (2000).</li>
<li>Vasquez, K. M., Wang, G., Havre, P. A., Glazer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+mutations+induced+by+triplex-forming+oligonucleotides+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Chromosomal mutations induced by triplex-forming oligonucleotides in mammalian cells.</a> Nucleic Acids Res. 27, 1176-1181 (1999).</li>
<li>Puri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimum+number+of+2%27-O-%282-aminoethyl%29+residues+required+for+gene+knockout+activity+by+triple+helix+forming+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Minimum number of 2'-O-(2-aminoethyl) residues required for gene knockout activity by triple helix forming oligonucleotides.</a> Biochemistry. 41, 7716-7724 (2002).</li>
<li>Christensen, L. A., Finch, R. A., Booker, A. J., Vasquez, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+oncogenes+to+improve+breast+cancer+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Targeting oncogenes to improve breast cancer chemotherapy.</a> Cancer Res. 66, 4089-4094 (2006).</li>
<li>Boulware, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triplex-forming+oligonucleotides+targeting+c-MYC+potentiate+the+anti-tumor+activity+of+gemcitabine+in+a+mouse+model+of+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Carcinog%22%5BJournal%5D)">Triplex-forming oligonucleotides targeting c-MYC potentiate the anti-tumor activity of gemcitabine in a mouse model of human cancer.</a> Mol Carcinog. 53, 744-752 (2014).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflict.

De efficiënte vorming van TFO-gerichte ICL is afhankelijk van twee belangrijke factoren: Ten eerste, goede buffercomponenten (bijv MgCl 2) en de incubatietijd van de TFO met een doel-DNA-substraat (afhankelijk van de bindingsaffiniteit van de TFO zijn doelstelling duplex, en de gebruikte concentraties); en ten tweede de juiste dosis UVA (365 nm) bestraling psoraleen verknopingen efficiënt vormen. Optimale triplex vorming kan worden bereikt door HPLC of gel gezuiverd TFOs. Onzuiverheden verontreinigin...

Triplex-vormende oligonucleotiden (TFOs) binden duplex DNA in een sequentie-specifieke manier via Hoogsteen-waterstofbruggen triple helix structuren 1-5 te vormen. Triplex technologie is gebruikt om diverse biomoleculaire mechanismen, zoals transcriptie, DNA schade herstel en gene targeting (beoordeeld in referenties 6-8) ondervragen. TFOs zijn uitgebreid gebruikt voor plaatsspecifieke schade aan reporterplasmiden 9,10 induceren. Ons laboratorium en anderen hebben eerder gebruik gemaakt van een TFO, TL30, vastgemaakt aan een psoraleen molecuul naar site-specifieke DNA InterStrand crosslinks (ICL) in de supF gen op het plasmide pSupFG1 5,10-12 induceren. ICLs zijn zeer cytotoxisch die laesies covalent verknopen de twee DNA-strengen, en indien niet gerepareerd kunnen gentranscriptie blokkeren en belemmeren de DNA-replicatiemachinerie 13,14. Vanwege hun cytotoxische potentieel hebben ICL-inducerende middelen gebruikt als chemotherapeutische middelen bij de behandelingkanker en andere ziekten 15. Echter, de verwerking en reparatie van ICL in menselijke cellen niet goed begrepen. Aldus kan een beter begrip van de bij de verwerking van ICL in menselijke cellen mechanismen bijdragen tot de werkzaamheid van ICL-gebaseerde chemotherapeutische regimes verbeteren. TFO-geïnduceerde ICLs met reparatie tussenproducten kan aanzienlijke structurele verstoringen veroorzaken aan de DNA helix. Dergelijke vervormingen zijn waarschijnlijk doelstellingen voor architecturale eiwitten, die binden aan vervormde DNA met een hogere affiniteit dan aan canonieke B-vorm duplex DNA 16-20. Hier hebben we de associatie van een veel voorkomt architecturaal eiwit, HMGB1 met ICL in humane cellen via chromatine immunoprecipitatie (ChIP) assays op psoraleen-verknoopte plasmiden en die een rol HMGB1 bij het moduleren van de topologie van het psoraleen-verknoopte nucleïnezuren in humane kanker cellysaten. HMGB1 is een veel voorkomt en alomtegenwoordig tot expressie non-histone architectonische eiwit dat aan beschadigde DNA en als alternatief gestructureerde DNA substraten bindt met een hogere affiniteit dan canonieke B-vorm DNA 17-20. HMGB1 is betrokken bij diverse DNA metabole processen zoals transcriptie, DNA-replicatie, DNA herstel en 16,21-23. We hebben eerder aangetoond dat HMGB1 TFO bindt aan gerichte ICLs in vitro met een hoge affiniteit 20. Verder hebben we aangetoond dat gebrek aan HMGB1 verhoogde de mutagene behandeling van TFO-gerichte ICL en geïdentificeerd HMGB1 als NER (NER) cofactor 23,24. Onlangs hebben we gevonden dat HMGB1 is gekoppeld TFO-gerichte ICLs in humane cellen en de rekrutering van deze laesies is afhankelijk van de NER eiwit, XPA 16. Negatieve supercoiling van DNA is aangetoond dat het effectief verwijderen van DNA-laesies bevorderen door NER 25, en we hebben gevonden dat HMGB1 induceert negatieve supercoiling voorkeur op TFO-gerichte ICL-bevattende plasmid substraten (ten opzichte van niet-beschadigde plasmiden substraten) 16, een beter inzicht in de mogelijke rol (s) van HMGB1 als NER cofactor. De verwerking van ICL is niet volledig bekend in menselijke cellen; Zo kunnen de technieken en assays ontwikkeld op basis van de moleculaire methoden hierin beschreven leiden tot de identificatie van additionele eiwitten betrokken bij ICL herstel, waardoor farmacologische doelen die kunnen worden benut om de effectiviteit van chemotherapie regiems verbeteren dienen. Hier wordt een effectieve benadering om de efficiëntie van TFO-gerichte vorming ICL in plasmide DNA beoordelen aan denaturerende agarose gelelektroforese werd besproken. Verder gebruik van de plasmiden die de TFO-gerichte ICL, technieken is bij HMGB1 met ICL-beschadigde plasmiden bepalen een cellulaire context modified ChIP assays zijn beschreven. Daarnaast is er een gemakkelijke methode om topologische wijzigingen die bij th bestuderene architecturaal eiwit HMGB1, specifiek op ICL-beschadigde plasmide substraten in menselijke cellysaten werd bepaald door het uitvoeren van assays supercoiling via tweedimensionale agarosegelelektroforese. De beschreven technieken kunnen worden gebruikt voor het begrip van de rol van DNA herstel en architecturale eiwitten in de verwerking van target DNA schade aan plasmiden in menselijke cellen bevorderen. We beschrijven gedetailleerde protocollen voor de vorming van TFO-gerichte plaatsspecifieke psoraleen ICLs op plasmide-DNA, gevolgd plasmide chip en supercoiling assays voor eiwitten die associëren met de letsels en eiwitten die de DNA-topologie te veranderen identificeren, respectievelijk. Deze testen kunnen worden gemodificeerd te voeren met andere DNA beschadigende agentia, TFOs plasmide substraten en zoogdiercellijnen plaats. In feite hebben we aangetoond dat er ten minste één potentiële unieke hoge affiniteit TFO-bindingsplaats binnen elke geannoteerde genen in het menselijke genoom 26. Hoeooit, voor de duidelijkheid, beschreven deze technieken voor het gebruik van een specifieke psoraleen-geconjugeerd TFO (pAG30) op een specifieke mutatie-reporterplasmide (pSupFG1) in humane cellen als U2OS we Mukherjee &amp; Vasquez, 2016 16 hebben gebruikt.

<table><tbody><tr><td>5'HMT Psoralen-AG30</td><td>Midland Certified Reagent Co., Midland, TX</td><td>Op bestelling</td><td>HPLC (of gel) gezuiverd</td></tr><tr><td>Simple ChIP Enzymatic Chromatin IP Kit</td><td>Cell signaling Inc.</td><td>9003</td><td>De door de fabrikant aanbevolen protocol is geoptimaliseerd voor chromatine IP en niet voor plasmide IP. De controle IgG en H3 antilichamen evenals de Protein G kralen en micrococcische nuclease worden geleverd door de fabrikant.</td></tr><tr><td>GoTaq Green</td><td>Promega</td><td>M7122</td><td>PCR master mix</td></tr><tr><td>HMGB1 antilichaam</td><td>Abcam</td><td>Ab18256</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Gel and PCR cleanup kit</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td></td></tr><tr><td>Chloroquine-difosfaat zout</td><td>Sigma</td><td>C6628-50G</td><td>Voor tweedimensionale agarose gel elektroforese</td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0101S</td><td></td></tr><tr><td>GenePORTER transfectie reagens</td><td>Genlantis</td><td>T201015</td><td></td></tr><tr><td>Vaccinia Topoisomerase I</td><td>Invitrogen</td><td>38042-024</td><td></td></tr><tr><td>Blak-Ray lange golf ultraviolette lamp</td><td>Upland, CA</td><td>B 100 AP</td><td>UVA lamp</td></tr><tr><td>EpiSonic Multi-Functionele Bioprocessor 1100</td><td>Epigentek</td><td>EQC-1100</td><td>Waterbad sonicator</td></tr><tr><td>Mylar filter</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>80112939</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6111</td><td></td></tr><tr><td>BIO-RAD Chemidoc</td><td>BIO-RAD</td><td>XRS+ systeem</td><td>DNA beeldvormingssysteem</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP381-500</td><td></td></tr><tr><td>37% Formaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775-25ML</td><td>Gebaten voor crosslinking</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>New England Biolabs</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>11965092</td><td>Celcultuur media</td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>70013073</td><td>Celcultuur</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>ThermoFisher</td><td>25200056</td><td>Celcultuur</td></tr><tr><td>Bromocresol groen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114-359</td><td>DNA ladings kleurstof</td></tr><tr><td>Siliconised buizen</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-320</td><td>Microfuge buis met lage retentie</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>Boorzuur</td><td>Fisher Scientific</td><td>A74-1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP24731</td><td></td></tr><tr><td>Fotometer</td><td>InternationalLight Technologies</td><td>ILT1400-A</td><td>UVA dosis meting</td></tr><tr><td>Cel lijnen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human U2OS osteosarcoom</td><td>ATCC</td><td>ATCC HTB-96</td><td>Gekweekt volgens de aanbeveling van de leverancier</td></tr><tr><td>Human cervix adenocarcinoom HeLa</td><td>ATCC</td><td>ATCC-CCL-2</td><td>Gekweekt volgens de aanbeveling van de leverancier</td></tr><tr><td>Proximale voorwaartse primer</td><td>5'-gcc ccc ctg acg agc atc ac</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proximale omgekeerde primer</td><td>5'-tag tta ccg gat aag gcg cag cgg</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Distale voorwaartse primer</td><td>5'-aat acc gcg cca cat agc ag</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Distale omgekeerde primer</td><td>5'-agt att caa cat ttc cgt gtc gcc</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

tools om de rol van de architectural eiwit hmgb1 bestudeer in de verwerking van helix vervormen, site-specifieke dna interstrand crosslinks

Tools to Study the Role of Architectural Protein HMGB1 in the Processing of Helix Distorting, Site-specific DNA Interstrand Crosslinks

Hoge mobiliteit groep box 1 (HMGB1) eiwit is een niet-histon architectonische eiwit dat betrokken is bij het reguleren van vele belangrijke functies in het genoom, zoals transcriptie, DNA-replicatie en DNA herstel. HMGB1 bindt structureel vervormde DNA met hogere affiniteit dan canonieke B-DNA. Zo vonden we dat HMGB1 bindt aan DNA InterStrand crosslinks (ICL), die covalent verbinden de twee strengen van het DNA, veroorzaakt vervorming van de helix, en als links unrepaired celdood veroorzaken. Door hun cytotoxische reactie, worden meerdere ICL-inducerende middelen momenteel gebruikt als chemotherapeutische middelen in de kliniek. Terwijl ICL-vormende middelen tonen voorkeuren voor bepaalde basensequenties (bijvoorbeeld 5&#39;-TA-3 &#39;is de geprefereerde verknoping site voor psoraleen), zij grotendeels veroorzaken DNA-schade op een willekeurige manier. Echter, door covalente koppeling van het ICL-inducerende middel aan een triplex-vormende oligonucleotiden (TFO), dat bindt aan DNA op een sequentie-specifiekewijze kan target DNA beschadiging worden bereikt. Hier gebruiken we een TFO covalent geconjugeerd aan het 5 &#39;uiteinde een 4&#39;-hydroxymethyl-4,5&#39;, 8-trimethylpsoraleen (HMT) psoraleen een plaatsspecifieke ICL genereren op een mutatie-reporterplasmide te gebruiken als hulpmiddel de architectonische modificatie, verwerking en reparatie van complexe DNA laesies bestuderen door HMGB1 in humane cellen. We beschrijven experimentele technieken om TFO gerichte ICLs voor te bereiden op de reporter plasmiden, en de associatie van HMGB1 met de TFO gerichte ICLs ondervragen in een cellulair context met behulp van chromatine immunoprecipitatie assays. Daarnaast beschrijven we DNA supercoiling assays voor specifieke architecturale modificatie van het beschadigde DNA beoordelen door het meten van de hoeveelheid superhelische windingen ingevoerd op het psoraleen-verknoopte plasmide door HMGB1. Deze technieken kunnen worden gebruikt om de rol van andere eiwitten die betrokken zijn bij de verwerking en reparatie van TFO-gerichte ICLs of andere gerichte DNA schade in een cellijn van belang bestuderen.

Vorming van het TFO-gerichte ICL essentieel is voor het plasmide-gebaseerde testen die worden gebruikt om de rol van eiwitten in architecturale ICL verwerking ondervragen menselijke cellen. Denaturerende agarose gelelektroforese is een gemakkelijke manier om de efficiëntie van TFO-gerichte ICL formatie te bepalen. De plasmiden TFO gerichte ICLs migreren met een langzamere mobiliteit door de agarose gelmatrix (Figuur 1A, laan 3) vergeleken met de niet-verknoopte controle ...

Gerichte DNA-schade kan worden bereikt door een DNA-beschadigend middel aan een triplex-vormend oligonucleotide (TFO) te koppelen. Met behulp van gemodificeerde TFO's kunnen DNA-schade-specifieke eiwitassociatie en DNA-topologiemodificatie in menselijke cellen worden bestudeerd door het gebruik van gemodificeerde chromatine-immunoprecipitatie-assays en DNA-superspiralisatie-assays zoals hier beschreven.

Tools om de rol van de Architectural eiwit HMGB1 Bestudeer in de verwerking van Helix vervormen, site-specifieke DNA InterStrand Crosslinks

High mobility group box 1 (HMGB1) protein is a non-histone architectural protein that is involved in regulating many important functions in the genome, ...

Het algemene doel van de experimenten met gemodificeerde chromatine-immunoprecipitatie en DNA-supercoiling is het bestuderen van de associatie en de daaropvolgende topologische modificaties, geïnduceerd door architecturale eiwitten, op site-specifieke DNA-schade die is veroorzaakt door chemotherapeutische of carcinogene agentia in menselijke cellen. Deze methodologie stelt ons in staat om kernvragen over DNA-schade en -herstel te beantwoorden, wat de ontdekking van nieuwe farmacologische targets voor cancertherapie moet faciliteren. Onze technologie stelt ons in staat om site-specifieke DNA-schade te richten en faciliteert de evaluatie van kritieke DNA-herstelprocessen die relevant zijn voor menselijke kanker.Om te beginnen plaatst u 24 uur vóór transfectie 400.000 zoogdiercellen per schaal van 60 millimeter in DMEM aangevuld met 10% FBS zonder antibiotica. Incubeer de cellen gedurende de nacht bij 37 °C en 5% CO2. Meng in een ronde buis van 14 milliliter 30 µL transfectiemiddel op kamertemperatuur met 500 µL 1X groeimedium dat is voorverwarmd tot 37 °C.Combineer in een tweede buis twee microgram TFO-gerichte ICL-bevattende plasmiden in 500 microliter 1X groeimedium. Incubeer de buizen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Voeg mengsel één toe aan mengsel twee en pipetteer herhaaldelijk op en neer om grondig te mengen.Incubeer de oplossing vervolgens gedurende 25 tot 30 minuten bij kamertemperatuur. Was daarna de cellen twee keer met warme PBS. Voeg vervolgens de transfectiemix druppelgewijs toe, waarbij de oplossing gelijkmatig over de plaat met cellen wordt verdeeld.Voeg één milliliter groeimedium toe aan de plaat en breng het uiteindelijke volume naar twee milliliter. Meng goed en plaats de kweekplaten bij 37 °C en 5% CO2. Vervang na vier uur het medium door drie milliliter groeimedium met 10% FBS en incubeer gedurende nog eens 16 uur.Voeg na de incubatie 80 µL verse 37% formaldehyde per plaat toe aan de cellen en incubeer 10 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Stop de cross-linking van het formaldehyde door 300 µL gekoelde glycine per plaat toe te voegen en incubeer vijf minuten. Verwijder vervolgens het medium en was de platen twee keer met gekoelde PBS.Voeg vervolgens één millimeter gekoelde PBS toe en verzamel de cellen door deze met een scraper in een microcentrifugebuis op ijs te schrapen, waarbij de monsters te allen tijde op ijs worden bewaard. Bereid celpellets voor door te centrifugeren bij 13.400 ×g en 4 °C gedurende vijf minuten. Verwijder daarna het supernatant en plaats de pellets op ijs.Gebruik één milliliter gekoelde Buffer A om de pellets homogeen opnieuw te resuspenderen en laat dit 10 minuten op ijs incuberen. Pelleteer vervolgens de cellen zoals voorheen. Resuspendeer de pellets nu homogeen met één milliliter gekoelde Buffer B en laat dit 10 minuten op ijs incuberen, waarbij tussentijds af en toe wordt gemengd door te inverteren.Pelleteer vervolgens de cellen zoals voorheen. Nadat de cellen opnieuw zijn gesuspendeerd in 200 µL gekoelde Buffer B, voegt u twee µL micrococcaal nuclease, of MNase, toe en incubeert u de reactie 10 minuten bij kamertemperatuur. Stop daarna de MNase-reactie door de buisjes op ijs te plaatsen en 40 mM EDTA toe te voegen.De mate van digestie door micrococcaal nuclease is zeer kritisch, omdat overdigestie kan leiden tot signaalverlies, terwijl onderdigestie kan resulteren in aanzienlijke aspecifieke achtergrondruis. Resuspendeer de cellen na het pelleten in 100 microliters chromatin immunoprecipitatie-buffer, of ChIP-buffer, aangevuld met een protease-remmercocktail. Breng de celsuspensie vervolgens over naar een dunwandige microcentrifugebuis.Sonicate de monsters door ze 20 seconden in een waterbadsonicator te laten drijven, gevolgd door 20 seconden op ijs. Herhaal de sonicatiestappen negen keer om fragmenten van ongeveer 800 tot 1.200 baseparen te genereren. Voeg aan 20 µL van de gesonicate monsters drie µL van vijf molar natriumchloride en één µL RNase A toe. Vortex de buisjes en incubeer ze 30 minuten bij 37 °C.Voeg vervolgens twee µL proteinase K toe en incubeer gedurende twee uur bij 65 °C. Nadat de monsters zijn gezuiverd volgens het tekstprotocol, worden deze gerund op een 1% agarosegel en gevisualiseerd met ethidiumbromide. Voeg in drie afzonderlijke, vooraf gekoelde gesiliconiseerde buisjes 30 µL lysaat en 70 µL gekoelde 1X ChIP-buffer toe waaraan protease-remmers zijn toegevoegd.Voeg één microgram anti-IgG, anti-histone H3- of anti-HMGB1-antilichamen toe aan de respectievelijke buisjes. Incubeer dit gedurende de nacht in een koelruimte onder continue rotatie. Voeg in de koelruimte, na het resuspenderen van de Protein G-beads, vier microliter van de beads toe aan elk reactiebuisje en incubeer deze nog eens twee tot vier uur in de koelruimte onder rotatie.Plaats de buisjes in een magnetisch rek om de beads neer te slaan en verwijder het supernatant. Voeg 200 microliters 1X ChIP-buffer met protease-inhibitorcocktail toe aan de pellets en was deze in de kou bij rotatie gedurende vijf minuten. Voer vervolgens een extra wasbeurt uit met 1X ChIP-buffer met een hoge zoutconcentratie.Gebruik vervolgens 160 µL elutiebuffer om de pellets opnieuw te suspenderen en incubeer deze 30 minuten bij 37 °C onder rotatie. Centrifugeer de beads om een pellet te vormen en verzamel het supernatant in een nieuw buisje. Voeg zes µL 5 M natriumchloride en twee µL proteinase K toe en incubeer dit gedurende de nacht bij 65 °C.Nadat het DNA is gezuiverd volgens het tekstprotocol, worden PCR-reacties uitgevoerd met primer-sets voor het of de regio's van belang, waarna de producten worden gescheiden op een 1% agarosegel, gekleurd met ethidiumbromide. Ontdooi vóór gebruik eerder bereide DNA-reparatiesynthesebuffer op ijs en voeg 40 millimolar fosfocreatine en 2,5 microgram creatinefosfokinase toe. Nadat de 10X supercoiling-buffer is bereid volgens het tekstprotocol, wordt één microliter vaccinia topoisomerase 1 met 1X supercoiling-buffer gebruikt in een reactie van 10 microliter om 300 nanogram supercoiled plasmide, PCA FG1, te lineariseren.Voeg aan de ontspannen plasmiden 25 µL vers ontdooid HeLa-cellysaat en DNA-synthesebuffer toe. Meng goed, voeg vervolgens één µL vaccinia topoisomerase 1 toe aan de reactie en incubeer gedurende één uur bij 37 °C. Beëindig de reacties door 1% SDS en 0,25 mg/mL proteinase K toe te voegen en incubeer gedurende twee uur bij 65 °C.Nadat een 1% agarosegel met 1X TPE-buffer is gegoten, voegt u DNA-laadkleurstof toe aan de reacties en brengt u de monsters direct aan op de gel met een tussenruimte van ten minste vier banen. Laat de gel voor de eerste dimensie acht tot 10 uur lopen bij twee volt per centimeter in 1X TBE bij kamertemperatuur om de topoisomeren te scheiden. Bereid twee liter 1X TBE voor met drie microgram per milliliter chlorochininefosfaat.Week de gel gedurende 20 minuten in 200 milliliters van de oplossing, afgedekt met aluminiumfolie. Om de gel in de tweede dimensie te elektroforeseren, draait u de gel 90 graden met de klok mee en laat u deze vier tot zes uur lopen bij twee volts per centimeter in 1X TBE met chloroquine om de positieve en negatieve supercoils te scheiden. De hoeveelheid chloroquine in de elektroforesebuffer en in de gel is zeer kritisch; evenzo is het runnen van de gel bij een zeer laag voltage voor de tweede dimensie essentieel om de positieve en negatieve supercoils te scheiden.Na het kleuren en ontkleuren van de gel, volgens het tekstprotocol, wordt een imager gebruikt om de thermodistributie van de topoisomeren te visualiseren. Zoals te zien is in deze gel, migreren ongeveer 79% van de plasmiden met TFO-gestuurde ICL's met een lagere mobiliteit door de agarosegelmatrix in vergelijking met de niet-gecrosslinkte controleplasmiden. ChIP-assays uitgevoerd op lysaten van humane U2OS-cellen, getransfecteerd met ofwel het controleplasmid of plasmiden met TFO-gestuurde ICL's, tonen een verrijking van HMGB1 bij de P-ICL-regio in vergelijking met de controleregio wanneer er werd geïmmunoprecipiteerd met anti-HMGB1-antilichaam.Wanneer HMGB1 uit de cellen werd verwijderd via siRNA-behandeling, nam de P-ICL-specifieke verrijking af. Wanneer dezelfde monsters werden geïmmunoprecipiteerd met behulp van een anti-IgG-antilichaam, werd minimale PCR-amplificatie gedetecteerd. Tot slot demonstreert tweedimensionale agarosegelelektroforese in deze figuur de architecturale modificatie van de TFO-gestuurde ICL-bevattende plasmiden als negatieve supercoiling door HMGB1 in HeLa-celextracten.Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in ongeveer vijf dagen worden uitgevoerd, mits correct uitgevoerd. Tijdens deze procedure is het zeer belangrijk om te onthouden dat alle wasstappen in de koudekamer moeten worden uitgevoerd, aangezien wasbeurten bij kamertemperatuur het achtergrondsignaal kunnen verhogen. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals siRNA-gemedieerde proteïnedepletie gevolgd door mutatiescreening-assays, worden uitgevoerd om vragen te beantwoorden, zoals: is het eiwit van belang betrokken bij DNA-herstel?Of verandert het de mutatiespectra tijdens het proces aanzienlijk? Deze techniek maakte de weg vrij voor het bestuderen van de associatie tussen eiwitten en site-specifieke DNA-schade. Na het bekijken van deze video zou u een goed beeld moeten hebben van hoe u de associatie van architecturale eiwitten met doelgerichte DNA-crosslinks kunt bestuderen en vervolgens het effect van dergelijke associatie op de topologie van het DNA kunt bepalen.Vergeet niet dat het werken met ethidiumbromide extreem gevaarlijk kan zijn en dat daarom tijdens het uitvoeren van dit experiment altijd geschikte beschermende kleding gedragen moet worden.

tools-to-study-role-architectural-protein-hmgb1-processing-helix

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

De Hi-C methode maakt het mogelijk onpartijdige, genoom-brede identificatie van chromatine interacties (1). Hi-C paren nabijheid ligatie en massaal parallelle sequencing. De resulterende gegevens kunnen worden gebruikt om de genomische architectuur studeren op meerdere schalen: eerste resultaten geïdentificeerd functies zoals chromosoom gebieden, scheiding van open en gesloten chromatine, en chromatine structuur op de megabase schaal.

Hi-C: een methode om de driedimensionale architectuur van genoom-onderzoek.

Dit protocol beschrijft een werkwijze voor het visualiseren van een DNA dubbelstrengs breuken signaleringeiwit geactiveerd in reactie op DNA schade en de lokalisatie tijdens mitose.

Twee-en drie-dimensionale live cell imaging van DNA schade respons Eiwitten

Elektronenspectroscopisch beeldvorming kan nucleïnezuur en eiwitten onderscheiden met een resolutie van nanometer. Het kan worden gecombineerd met het miniSOG-systeem, dat gelabelde eiwitten specifiek kan markeren in transmissie-elektronenmicroscopie-monsters. We illustreren het gebruik van deze technologieën met dubbelstrengsbreukreparatiefoci als voorbeeld.

Visualisatie van miniSOG Tagged DNA reparatie-eiwitten in combinatie met Electron spectroscopische beeldvorming (ESI)

Laser microirradiation is een nuttig instrument voor onderzoek naar DNA-herstel in levende cellen. Een methodologische aanpak voor het gebruik van UVA lasers voor het opwekken van verschillende DNA laesies wordt weergegeven. We hebben een methode voor het lokale microirradiation die de normale celcyclus; onderhoudt geoptimaliseerd zo doorloop bestraalde cellen mitose.

Geavanceerde confocale microscopie technieken om te studeren van eiwit-eiwitinteractie en kinetiek op DNA laesies

Een systeem voor het opwekken van laesies op de gedefinieerde regio sub nucleaire's vereist studeren DNA schade reparatie kinetiek. Beschrijven we een methode om gelokaliseerde double-stranded einden met behulp van een laser-scanner confocal microscoop uitgerust met een 405 nm laser maken en leveren van geautomatiseerde procedures om te kwantificeren van de dynamiek van reparatie factoren bij deze letsels.

Onderzoek van eiwit werving aan DNA laesies met behulp van 405 Nm Laser-Micro-bestraling

Na DNA-schade activeren menselijke cellen essentiële hersteltrajecten om de integriteit van hun genoom te herstellen. Hier beschrijven we de methode van indirecte immunofluorescentie als een middel om DNA-hersteleiwitten te detecteren, hun ruimtelijke en temporele rekrutering te analyseren en de eiwitinteractie op de sites van DNA-schade te helpen ondervragen.

Visualisatie van DNA Repair Proteins Interaction door Immunofluorescentie

Dit artikel introduceert essentiële stappen van immunostaining en chromatine immunoprecipitatie. Deze protocollen worden vaak gebruikt om DNA-schadegerelateerde cellulaire processen te bestuderen en om de rekrutering van eiwitten die betrokken zijn bij DNA-reparatie te visualiseren en te kwantificeren.

Visualiseren en kwantificeren van endonuclease-gebaseerde site-specifieke DNA-schade

Het huidige protocol belicht een gemodificeerde methode voor het detecteren en kwantificeren van DNA-eiwit crosslinks (DPC's) en hun posttranslationele modificaties (PTM's), waaronder ubiquitylering, SUMOylation en ADP-ribosylatie geïnduceerd door topoisomeraseremmers en door formaldehyde, waardoor de vorming en reparatie van DPC's en hun PTM's kan worden bestudeerd.

Kwantitatieve detectie van DNA-eiwit crosslinks en hun posttranslationele modificaties

Hier presenteren we een eenvoudig en snel protocol voor de detectie van eiwitinteractie op DNA-schadeplaatsen.

Nabijheidsligandtest om eiwitten te lokaliseren op plaatsen van DNA-schade

Dit protocol demonstreert het uitvoeren van een single-molecule assay voor live visualisatie van DNA-afwikkeling door CMG helicase. Het beschrijft (1) het prepareren van een DNA-substraat, (2) het zuiveren van fluorescerend gelabelde Drosophila melanogaster CMG-helicase, (3) het voorbereiden van een microfluïdische flowcel voor totale interne reflectiefluorescentie (TIRF) microscopie, en (4) de single-molecule DNA-afwikkeltest.

Real-time visualisatie van DNA met één molecuul door CMG Helicase

We presenteren een snelle en efficiënte methode om veel voorkomende fragiele breuken te detecteren door middel van natieve γH2A.X chromatine immunoprecipitatie (ChIP). Deze aanpak vermindert aanzienlijk zowel de tijd als de arbeid die gepaard gaan met traditionele γH2A.X ChIP-assays, terwijl de hoge reproduceerbaarheid en betrouwbaarheid van de resultaten behouden blijven.

Het vastleggen van veelvoorkomende fragiele site-onderbrekingen door native γH2A. X Kanaal

Leer hoe je de associatie van architecturale eiwitten met site-specifieke DNA-schade bestudeert in menselijke cellen. Deze methode helpt onderzoekers DNA-reparatieprocessen te evalueren voor kankertherapie.

Tools om de rol van de Architectural eiwit HMGB1 Bestudeer in de verwerking van Helix vervormen, site-specifieke DNA InterStrand Crosslinks (Video) | JoVE Journal

Tools om de rol van de Architectural eiwit HMGB1 Bestudeer in de verwerking van Helix vervormen, site-specifieke DNA InterStrand Crosslinks

Meer video's verkennen