Tools om de rol van de Architectural eiwit HMGB1 Bestudeer in de verwerking van Helix vervormen, site-specifieke DNA InterStrand Crosslinks

Het algemene doel van de aangepaste chromatine-immunoprecipitatie en DNA-supercoiling experimenten is om de associatie en daaropvolgende topologische modificaties te bestuderen die worden geïnduceerd door architecturale eiwitten op locatiespecifiek DNA-schade, veroorzaakt door chemotherapeutische of carcinogene stoffen in menselijke cellen. Deze methodologie zal ons in staat stellen om belangrijke vragen over DNA-schade en -reparatie te beantwoorden, wat de ontdekking van nieuwe farmacologische doelen voor kankertherapie zou kunnen vergemakkelijken. Onze technologie stelt ons in staat om locatiespecifieke DNA-schade te richten en maakt evaluatie mogelijk van cruciale DNA-reparatieprocessen die relevant zijn voor menselijke kanker.

Om te beginnen, plateer 24 uur voor transfectie 400.000 zoogdiercellen per 60 millimeter schaal in DMEM aangevuld met 10% FBS zonder antibiotica. Incubeer de cellen gedurende de nacht bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Combineer in een ronde bodembuis van 14 milliliter 30 microliter kamertemperatuurtransfectiemiddel met 500 microliter 1X groeimedium dat is opgewarmd tot 37 graden Celsius.

Combineer in een tweede buis twee microgram TFO-gerichte ICL-bevattende plasmiden in 500 microliter 1X groeimedium. Incubeer de buizen gedurende 10 minuten op kamertemperatuur. Combineer mix een met mix twee en pipet omhoog en omlaag om grondig te mengen.

Bewaar vervolgens de oplossing gedurende 25 tot 30 minuten op kamertemperatuur. Gebruik vervolgens warm PBS om de cellen twee keer te wassen. Voeg vervolgens de transfectiemix druppelsgewijs toe en verdeel de oplossing gelijkmatig over de schaal met cellen.

Voeg een milliliter groeimedium toe aan de schaal en breng het uiteindelijke volume op twee milliliter. Meng goed en plaats de kweekschalen bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Vervang na vier uur het medium met drie milliliter groeimedium met 10% FBS en incubeer nog eens 16 uur.

Na de incubatie, voeg 80 microliter vers 37% formaldehyde per schaal toe aan de cellen en incubeer op kamertemperatuur in het donker gedurende 10 minuten. Quench de formaldehyde cross-linking door 300 microliter gekoeld glycine per schaal toe te voegen en incubeer gedurende vijf minuten. Verwijder vervolgens het medium en was de schalen twee keer met gekoeld PBS.

Vervolgens, na het toevoegen van een millimeter gekoeld PBS, verzamel de cellen door te schraapsen in een microcentrifugebuis op ijs, houd monsters altijd op ijs. Bereid celpellets voor door te centrifugeren bij 13.400 keer G en vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Verwijder vervolgens het supernatant en plaats de pellets op ijs.

Gebruik een milliliter gekoeld Buffer A om de pellets homogeen te hersuspenderen en incubeer op ijs gedurende 10 minuten. Pellet de cellen vervolgens zoals eerder. Nu, met een milliliter gekoeld Buffer B, hersuspendeer de pellets homogeen en incubeer op ijs gedurende 10 minuten met af en toe mengen door te kantelen.

Pellet vervolgens de cellen zoals eerder. Nadat de cellen weer zijn hersuspendeerd, voeg in 200 microliter gekoeld Buffer B twee microliter micrococcinale nuclease of MNase toe en incubeer de reactie gedurende 10 minuten op kamertemperatuur. Stop vervolgens de MNase-reactie door de buizen op ijs te plaatsen en 40 millimolair EDTA toe te voegen.

Het niveau van vertering door micrococcinale nuclease is zeer kritiek, omdat oververtering verlies van signaal kan veroorzaken, terwijl onderdiger vertering veel niet-specifieke achtergrond kan veroorzaken. Na het pelleten van de cellen, hersuspendeer de pellets in 100 microliter chromatine-immunoprecipitatie of ChIP-buffer, aangevuld met proteaseremmercocktail. Breng vervolgens de celsuspensie over in een dunne wandmicrocentrifugebuis.

Soniceer de monsters door ze 20 seconden in een waterbadsonicator te laten zweven, gevolgd door 20 seconden op ijs. Herhaal de sonicatie-stappen negen keer om ongeveer 800 tot 1.200 base-pair fragmenten te genereren. Voeg aan 20 microliter van de gesoniceerde monsters drie microliter vijf molair natriumchloride toe en één microliter RNase A. Vortex de buizen en incubeer ze gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius.

Voeg vervolgens twee microliter proteïnase K toe en incubeer gedurende twee uur bij 65 graden Celsius. Na zuivering van de monsters, volgens het tekstprotocol, draai ze op 1% agarosegel en visualiseer met ethidiumbromide. Voeg in drie afzonderlijke, voorgekoelde gesiliconiseerde buizen 30 microliter lysate toe en 70 microliter gekoeld 1X ChIP-buffer met toegevoegde proteaseremmers.

Voeg één microgram anti-IgG, anti-histone H3 of anti-HMGB1-antilichamen toe aan de respectieve buizen. Incubeer 's nachts in een koude kamer met continue rotatie. In de koude kamer, na het hersuspenderen van Protein G-kralen, voeg vier microliter van de kralen toe aan elke reactiebuis en incubeer in een koude kamer met rotatie gedurende nog eens twee tot vier uur.

Plaats de buizen op een magnetische rek om de kralen te pelleten en verwijder het supernatant. Voeg 200 microliter 1X ChIP-buffer met proteaseremmercocktail toe aan de pellets en was in de kou met rotatie gedurende vijf minuten. Voer vervolgens met hoog zout 1X ChIP-buffer een extra wassing uit.

Gebruik vervolgens 160 microliter elutiebuffer om de pellets te hersuspenderen en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius met rotatie. Pellet de kralen en verzamel het supernatant in een verse buis. Voeg zes microliter vijf molair natriumchloride toe en twee microliter proteïnase K en incubeer 's nachts bij 65 graden Celsius.

Na zuivering van het DNA, volgens het tekstprotocol, voer PCR-reacties uit met primersets voor de regio of regio's van belang en los de producten op op een 1% agarosegel, gekleurd met ethidiumbromide. Ontdooi voor gebruik eerder bereid DNA-reparatiesynthesebuffer op ijs en voeg 40 millimolair fosfocreatien en 2,5 microgram creatinefosfokinase toe. Na het bereiden van 10X supercoilingbuffer, volgens het tekst