Visualisatie van de Charcoal Agar Resazurin Assay voor Semi-kwantitatieve, Medium-throughput bepalen van het aantal mycobacteriën

Het algemene doel van de CARA is om een semi-kwantitatieve beoordeling met medium-doorvoercapaciteit te bieden van de activiteit van verbindingen tegen replicerende en niet-replicerende mycobacteriën. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de CARA, als surrogaat voor CFU, in staat stelt om snel de dosis- en tijdsafhankelijkheid van een verbinding te testen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van geneesmiddelenonderzoek naar tuberculose, zoals het bepalen of een verbinding bacteriostatisch of bactericide is tegen replicerende bacteriën en of deze bactericide is tegen niet-replicerende bacteriën.

De methode zal worden gedemonstreerd door Julia Roberts, een medewerker in ons laboratorium. Voeg 450 milliliters water toe aan een glazen bekerglas van één liter of 900 milliliters water aan een Erlenmeyerkolf van twee liter. Plaats een autoclaafbare roerstaf in het bekerglas of de kolf.

Voeg vervolgens Middlebrook 7H11-poeder, geactiveerde houtskool tot een eindconcentratie van 0,4% en een 50% glyceroloplossing toe om een eindconcentratie van 0,2% te bereiken. Bedek de opening van de erlenmeyer of het bekerglas met aluminiumfolie en bevestig dit aan het glas met autoclaaftape. Laat het medium na het autoclavéren afkoelen tot ongeveer 55 tot 65 °C op een magnetische roerplaat die op een lage snelheid is ingesteld om de houtskool in suspensie te houden.

Werk aseptisch in een biologische veiligheidskast die is uitgerust met een magnetische roerplaat, verwijder de folie van het medium en voeg respectievelijk 100 of 50 milliliters OADC-supplement toe aan de tweeliterfles of het eenliterbekerglas en blijf mengen. Vul met een multichannel pipet met acht of 12 filtertips een 96-well microplaat met 200 microliter 7H11-OADC-charcoal per well vanuit het reagensreservoir of bekerglas, waarbij u snel werkt om stolling van de agar en de vorming van bellen te voorkomen. Plaats stapels CARA-microplaten in hersluitbare plastic zakken om uitdroging te voorkomen en bewaar deze bij vier graden Celsius.

Inoculeer polypropyleen centrifugebuizen met een ronde of conische bodem die respectievelijk vier of 20 milliliters Middlebrook 7H9-ADN of 7H9-OADC bevatten met M.smegmatis bij een OD580 van 0,01 tot 0,1. Incubeer de M.smegmatis-culturen bij 37 °C en 20% O2 onder schudcondities, waarbij de culturen worden uitgebreid tot de mid-log fase of een geschatte OD580 van 0,5. Om een experiment op te zetten naar het model van de minimale remmende concentratie onder replicerende en niet-replicerende condities, verdeel dan 200 microliters cellen in 7H9-ADN bij een OD580 van 0,01 over alle wells van een 96-wells plaat met een transparante bodem die behandeld is voor weefselkweek.

Gebruik voor de assay met niet-replicerende cellen PBS met 0,02% tyloxapol om de cellen twee keer te wassen. Gebruik vervolgens niet-replicerend medium om de cellen opnieuw te suspenderen. Gebruik niet-replicerend medium om de cellen te verdunnen tot een OD580 van 0,1 en voeg natriumnitraat toe tot een eindconcentratie van 0,5 tot 5 millimolar vanuit een vers bereide één molaire stockoplossing.

Verdeel 200 µL cellen bij een OD580 van 0,1 over alle putjes van een 96-well plaat met een transparante bodem en een weefselkweekbehandeling. Voeg, na het bereiden van de testmiddelen volgens het tekstprotocol, twee µL van testmiddel één toe aan de rijen A tot en met E en twee µL van testmiddel twee aan de rijen E tot en met H, en meng dit grondig. Voor replicerende assays worden de M.smegmatis microplaten geïncubeerd bij 37 °C, 20%O2 en 5%CO2 gedurende één tot 48 uur.

Op de tijdstippen waarop de CARA als uitleesmethode wordt gebruikt, wordt een p200 meerkanaals pipet ingesteld op 50 tot 75 µL om de inhoud van de wells van de assayplaat in MIC90-stijl zorgvuldig te resuspenderen door vijf tot 10 keer op en neer te pipetteren. Gebruik vervolgens de pipetpunten om de inhoud van de wells voorzichtig in een cirkelvormige beweging te zwenken. Draag 10 µL van de onverdunde inhoud van de assaywell over naar de overeenkomstige wells van de CARA-microplaat, waarbij spatten tijdens de overdracht worden vermeden en wordt gewaarborgd dat het aliquot van 10 µL in het midden van de wells van de CARA-microplaat wordt geplaatst.

Zet stapels CARA-microplaten vast met plaatlijmband en plaats ze vervolgens in een afsluitbare plastic zak. Incubeer de M.smegmatis CARA-microplaten bij 37 °C met 20% O2 gedurende één tot twee dagen voor replicerende platen en gedurende twee tot drie dagen voor niet-replicerende platen. Wanneer er een film van bacteriële groei of grotere macroscopische kolonies zichtbaar zijn in de putjes van de negatieve controle, gebruik dan één set van 12 p200-tips met een multichannelpipet om 40 µL steriele PBS langs de zijkant van de putjes te dispenseren en laat de PBS zich verspreiden over de bovenkant van de agar/bacteriële microkolonies.

Bereid het CARA-ontwikkelingsreagens voor door vijf milligram resazurin te mengen met 50 milliliters 5%Tween80 in PBS. Voeg 50 microliters van het vers bereide CARA-ontwikkelingsreagens toe aan elke well van de CARA-microplaat. Schud de platen vervolgens een paar keer heen en weer om het reagens gelijkmatig over de agar en de bacteriële mat in elke well te verdelen.

Plaats de platen in een afsluitbare plastic zak en incubeer bij 37 °C gedurende ten minste 30 minuten voor M.smegmatis. Plaats de CARA-microplaten vóór het aflezen van de fluorescentie gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in een biosafety cabinet met de deksels verwijderd. Wanneer BSL3-spectrofotometers buiten een biosafety cabinet worden gebruikt, breng dan een PCR-sticker van optische kwaliteit aan over de plaat en gebruik een zachte papieren handdoek om deze stevig af te sluiten door voorzichtig op het stickeroppervlak te drukken.

Bepaal de fluorescentie via een top-read met excitatie bij 530 nanometers en emissie bij 590 nanometers. Het is niet nodig om de plaat te blanken. Om de gegevens te analyseren, wordt de inhibitorconcentratie op de X-as uitgezet op een log10-schaal en de fluorescentie op de Y-as op een lineaire schaal.

Raadpleeg het tekstprotocol voor aanvullende details. De concentratie van het testmiddel die ertoe leidt dat de CARA-fluorescentie niet boven de achtergrondwaarden stijgt, is de CARA-MBC ≥ 99, zoals hier wordt weergegeven. De subscript ≥ 99 geeft aan dat de CARA-MBC een geschatte concentratie van het testmiddel biedt die leidt tot een bacteriële doding van ≥ twee log10.

Er wordt vermoed dat verbindingen een post-antibioticum effect uitoefenen als ze een statisch venster vertonen, gedefinieerd als een verschuiving naar rechts van meer dan vier keer tussen de MIC- en CARA-curven. Het statische venster geeft aan dat een molecuul dat actief is tegen replicerende M.tuberculosis bacteriostatisch kan zijn in plaats van bactericide. Voor moleculen met een krachtig post-antibioticum effect kunnen statische vensters moeilijk waarneembaar zijn en zijn ze alleen zichtbaar na inspectie van een uitgebreide Y-as voor CARA-fluorescentie, zoals hier te zien is.

Replicerende en niet-replicerende actieve moleculen getest door MIC90 en CARA worden hier weergegeven. Hoewel isoniazid en linezolid activiteit tegen niet-replicerende bacteriën lijken te vertonen via de MIC90-assay, suggereert de CARA dat zij inactief zijn onder de geteste niet-replicerende condities. In dit CARA-experiment bleek blootstelling van M.smegmatis aan toenemende concentraties rifampicine al na één uur een effect te hebben, en werd een toenemende bactericide activiteit vertoond tussen drie en 24 uur, waarbij na 24 uur bij ongeveer 10 micrograms per milliliter groter dan of gelijk aan twee tot drie log10 werd gedood.

Zodra deze techniek onder de knie is, kan het proces in ongeveer twee uur worden uitgevoerd voor het voorbereiden van de platen, minder dan een uur voor het overbrengen van cellen naar CARA-platen, en ongeveer één tot twee uur voor het ontwikkelen en meten van de fluorescentie van CARA-platen, mits dit correct wordt uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de CARA dient als een voorspellende assay om te bepalen of een verbinding bactericide of bacteriostatische activiteit vertoont tegen mycobacteriën die repliceren of niet-replicerend zijn. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een CARA opzet en gegevens analyseert op een manier die helpt bij het voorspellen van het type activiteit van een verbinding.

Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.