Visualisatie van de Charcoal Agar Resazurin Assay voor Semi-kwantitatieve, Medium-throughput bepalen van het aantal mycobacteriën

Het algemene doel van de CARA is om een semi-kwantitatieve beoordeling met gemiddelde doorvoer te bieden van de activiteit van verbindingen tegen zich replicerende en niet-repliceerende mycobacteriën. Het grote voordeel van deze techniek is dat de CARA, als alternatief voor CFU, het mogelijk maakt om snel de dosis en tijdsafhankelijkheid van een verbinding te testen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het veld van ontdekking van tuberculosegeneesmiddelen, zoals het bepalen of een verbinding bacteriostatisch of bactericide is tegen zich replicerende bacteriën en of het bactericide is tegen niet-repliceerende bacteriën.

Julia Roberts, een medewerker in ons laboratorium, zal de methode demonstreren. Voeg 450 milliliter water toe aan een glazen beker van één liter of 900 milliliter water aan een Erlenmeyer kolf van twee liter. Voeg een autoclaveerbare roerlat toe aan de beker of kolf.

Voeg vervolgens een Middlebrook 7H11 poeder, actieve kool tot een eindconcentratie van 0,4% en 50% glyceroloplossing toe om een eindconcentratie van 0,2% te bereiken. Bedek de opening van de kolf of beker met aluminiumfolie en bevestig deze met autoclaveertape aan het glas. Na het autoclaveren van het medium, koel het af tot ongeveer 55 tot 65 graden Celsius op een magnetische roerplaat ingesteld op lage snelheid om de kool in suspensie te houden.

Werkend onder aseptische omstandigheden in een bioveiligheidskast die een magnetische roerplaat heeft, verwijder de folie van het medium en voeg 100 of 50 milliliter OADC-supplement toe aan de tweeliterkolf of éénliterbeker respectievelijk en blijf mixen. Gebruik een meerkanaalspipet met acht of 12 filtertips om een 96-wells microplaat te vullen met 200 microliter 7H11-OADC-kool uit het reagent reservoir of de beker, werk snel om agar-verdichting en de vorming van bubbels te voorkomen. Plaats stapels CARA-microplaten in hersluitbare plastic zakken om uitdrogen te voorkomen en bewaar ze bij vier graden Celsius.

Inoculeer polypropyleen rondbodem- of kegelcentrifugebuizen met respectievelijk vier of 20 milliliter Middlebrook 7H9-ADN of 7H9-OADC met M.smegmatis bij een OD580 van 0,01 tot 0,1. Incubeer de M.smegmatis-culturen bij 37 graden Celsius en 20%O2 met schudden, en breid de culturen uit tot midden-log-fase of een geschatte OD580 van 0,5. Om een minimaal remmende concentratie-stijl experiment op te zetten onder zich replicerende en niet-repliceerende omstandigheden, verdeel 200 microliter cellen in 7H9-ADN bij een OD580 van 0,01 in alle putjes van een helder-onderkant, weefselkweekbehandelde 96-wellsplaat.

Voor de niet-repliceerende test, gebruik PBS met 0,02% tyloxapol om de cellen twee keer te wassen. En gebruik niet-replicerend medium om de cellen opnieuw te suspenderen. Gebruik niet-replicerend medium om de cellen te verdunnen tot een OD580 van 0,1 en voeg natriumnitraat toe tot een eindconcentratie van 0,5 tot 5 millimolar vanuit een vers bereide één molare stockoplossing.

Verdeel 200 microliter cellen bij een OD580 van 0,1 in alle putjes van een helder-onderkant, weefselkweekbehandelde 96-wellsplaat. Na het bereiden van testmiddelen volgens het tekstprotocol, voeg twee microliters van testmiddel een toe in rijen A tot E en twee microliters van testmiddel twee in rijen E tot H, en meng grondig. Voor zich replicerende tests, incubeer M.smegmatis microplaten bij 37 graden Celsius, 20%O2 en 5%CO2 gedurende één tot 48 uur.

Op de tijdstippen waarop de CARA zal worden gebruikt als een read-out, gebruik een p200 meerkanaalspipet ingesteld op 50 tot 75 microliter om voorzichtig de inhoud van de putjes van de MIC90-stijl testplaat opnieuw te suspenderen door vijf tot 10 keer op en neer te pipetten. Gebruik vervolgens de pipettips om de inhoud van de putjes voorzichtig in een cirkelvormige beweging te draaien. Breng 10 microliter van de onverdunde testput inhoud over naar de overeenkomstige putjes van de CARA-microplaat en vermijd spatten tijdens het overbrengen, zorg ervoor dat de 10 microliter aliquot in het midden van de CARA-microplaatputjes wordt gespot.

Bind met plakband stapels CARA-microplaten en plaats ze vervolgens in een hersluitbare plastic zak. Incubeer de M.smegmatis CARA-microplaten bij 37 graden Celsius met 20%O2 gedurende één tot twee dagen voor zich replicerende platen en gedurende twee tot drie dagen voor niet-replicerende platen. Wanneer een film van bacteriële groei of grotere macroscopische kolonies zichtbaar is in de negatieve controleputjes, gebruik een enkele set van 12 p200 tips met een meerkanaalspipet om 40 microliter steriele PBS langs de zijkant van de putjes te doseren en laat de PBS zich verspreiden over de bovenkant van de agar/bacteriële microkolonies.

Bereid CARA ontwikkelingsreagens voor door vijf milligram resazurin en 50 milliliter 5% Tween80 in PBS te mengen. Voeg 50 microliter vers bereid CARA ontwikkelingsreagens toe aan elke put van de CARA-microplaat. Schud vervolgens de platen een paar keer heen en weer om de reagens over de agar en bacteriële mat in elke put te verdelen.

Plaats de platen in een hersluitbare plastic zak en incubeer bij 37 graden Celsius gedurende ten minste 30 minuten voor M.smegmatis. Plaats de CARA-microplaten voor het lezen van fluorescentie gedurende 15 minuten op kamertemperatuur in een bioveiligheidskast met de deksels verwijderd. Wanneer BSL3 spectrofotometers buiten een bioveiligheidskast worden gebruikt, bevestig een optische kwaliteit PCR sticker over de plaat en gebruik een zachte papieren handdoek om strak te sluiten door voorzichtig op het stickeroppervlak te drukken.

Bepaal de fluorescentie via top-read met excitatie bij 530 nanometer en emissie bij 590 nanometer. Het is niet nodig om de plaat te blanceren. Om de