Name: Visualisatie van de Charcoal Agar Resazurin Assay voor Semi-kwantitatieve, Medium-throughput bepalen van het aantal mycobacteriën (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Leer de charcoal agar resazurin assay (CARA) voor semi-kwantitatieve bepaling van mycobacteriële activiteit in tuberculoseonderzoek. Deze medium-throughput methode versnelt het screenen van geneesmiddelen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We zijn dankbaar voor Kristin Burns-Huang voor expert review van het manuscript en J. David Warren (Weill Cornell Medical College) voor scheikunde hulp bij de ontwikkeling van het CARA. Dit werk werd ondersteund door de TB Drug Accelerator-programma van de Bill en Melinda Gates Foundation, de Abby en Howard P. Milstein Program in Translational Medicine, en een NIH TB Research Unit (U19 AI111143). Het Departement Microbiologie en Immunologie wordt ondersteund door de William Randolph Hearst Foundation. SSK werd ondersteund door NIH-subsidie ​​K08AI108799.

1. Bereiding van CARA Microplaten <ol><li> Autoclaaf 900 ml Middlebrook 7H11 agar die 0,2% glycerol en 0,4% geactiveerde koolstof in een 2 L Erlenmeyer kolf, of als alternatief 450 ml in een 1 L glazen beker. Omvatten een groot autoclaveerbaar roerstaafje in de kolf of beker. Dek de opening van de kolf of bekerglas af met aluminiumfolie en hechten aan glas met autoclaaf tape. </li><li> Koel om (ongeveer 55-65 ° C) te raken op een magnetische roer plaat ingesteld op een lage snelheid naar de houtskool in suspensie te houden. </li><li> Voer alle volgende stappen aseptisch in een bioveiligheid kap die een magnetische roer plaat. </li><li> Verwijder folie. Voeg 100 ml OADC supplement (OADC supplement, bij gebruik bij 10%, opbrengst uiteindelijke media concentraties van 0,2% dextrose, 0,5% albumine, 0,085% NaCl, 0,0005% oliezuur en 0,4 mg / ml catalase) aan de 2 L Erlenmeyer of 50 ml OADC de 1 L beker en meng. </li><li> Bij gebruik van een erlenmeyer, giet ongeveer 25-40 ml 7H11-OADC-houtskool in een steriele reagensreservoir. Bij gebruik van de beker, is het niet noodzakelijk een reagensreservoir gebruiken. </li><li> Vul een 96-well microplaat met 200 gl / putje 7H11-OADC-houtskool uit het reagensreservoir of beker. Werk snel om agar stollen en de introductie van luchtbellen te vermijden. Vermijd spatten vast medium buiten de putjes, als een bron van schimmel besmetting kan worden. Met behulp van een multichannel pipet, gebruikt u een set van 12 filter tips voor de overdracht van 7H11-OADC houtskool om de 8 rijen (AH) van de 96-well plaat. OPMERKING: Het medium stolt snel. Om te voorkomen dat verstopping pipetpunten, veranderen ze regelmatig. </li><li> Als alternatief, giet CARA microplaten met behulp van een P1000 elektronische multichannel pipet met filter tips om te helpen bij de voorbereiding van een groot aantal platen. LET OP: Door de geringe omvang van microplaat putten, de agar in CARA microplaten stolt binnen enkele minuten van het gieten. </li><li> Plaats stapels CARA microplaten in hersluitbare plastic bags om te voorkomen dat uitdrogen. </li><li> WINKEL CARA microplaten bij 4 ° C. </li></ol> 2. instellen repliceren en niet-replicating MIC 90 Testen <ol><li> Inoculeer M. tuberculosis, M. bovis BCG of M. smegmatis op een OD 580 van 0,01-0,1 en uit te breiden tot mid-log-fase (OD 580 ~ 0.5) in Middlebrook 7H9-ADN (Middlebrook 7H9 dat 0,2% glycerol, 0,2% dextrose , 0,5% albumine en 0,085% NaCl) of 7H9-OADC (Middlebrook 7H9 dat 0,2% glycerol en 10% OADC supplement). </li><li> Grow M. tuberculosis en M. bovis BCG als ~ 20 ml staande culturen in celkweek flessen en M. smegmatis schudden in polypropyleen met ronde bodem (4 ml kweek) of 50 ml conische centrifugebuizen (10-20 ml cultuur). Incubeer pathogène mycobacteriën bij 37 ° C met 20% O2 en 5% CO2, en M. smegmatis bij 37 ° C met 20% O2. </li><li> Het opzetten van een minimale-remmendeconcentratie (MIC 90) -achtige experiment onder replicerende en niet-replicerende omstandigheden (figuur 2). OPMERKING: Testmiddelen worden gewoonlijk getest in duplo of viervoud proeven 4 of 2 verbindingen respectievelijk per 96-well microplaat mogelijk. Bijvoorbeeld, in een 96-well plaat, een testagens kan worden getest in rijen AD en andere in rijen EH. De DMSO (vehikel) in de kolommen 1, 2 en 12, en het testmiddel verdunningsreeks loopt van kolom 3 (laagste concentratie) naar kolom 11 (hoogste concentratie). MIC 90 -achtige assays gebruiken typisch 2-voudige verdunningsreeks. Er zijn tal van non-replicating modellen beschikbaar voor mycobacteriën 14-16,18,24,25 en ter illustratie, maken we gebruik van een multi-stress-model van niet-replicatie 6,8,9. <ol><li> Voor replicating assay distribueren 200 ul cellen in 7H9-ADN bij een OD 580 van 0,01 in ieder putje van een heldere bodem, met weefselkweek behandelde plaat met 96 putjes. </li> &lt;li&gt; Voor de niet-replicerende assay, was de cellen tweemaal in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) bevattende 0,02% tyloxapol en resuspendeer cellen in niet-replicerende medium (0,05% KH 2PO 4, 0,05% MgSO 4, 0,005% ferri-ammoniumcitraat , 0,0001% ZnCl2, 0,1% NH4Cl, 0,5% BSA, 0,085% NaCl, 0,02% tyloxapol, 0,05% butyraat, pH ingesteld op 5,0 met 2 N NaOH). <ol><li> Verdun cellen tot een OD 580 van 0,1 in niet-replicerende medium en NaNO 2 uit een vers bereide 1 M voorraadoplossing toe tot een eindconcentratie van 0,5 mM. </li><li> Verdeel 200 ul cellen in een OD 580 van 0,1 in ieder putje van een heldere bodem, met weefselkweek behandelde plaat met 96 putjes. LET OP: Maak verbinding verdunningen als 100-voudige stockoplossingen in DMSO. Dus een typisch MIC plaat testen van het effect van een molecuul op een eindconcentratie 0,4-100 ug / ml zou voorraadoplossingen van 0,04-10 mg / ml in DMSO vereisen. </li></ol></li><li> Voeg 2 pl disingen van testmiddel 1 in rijen AE en 2 pl verdunningen van testmiddel 2 in rijen EH. Meng grondig. </li><li> Voeg 2 ul mediumcontrole (gewoonlijk DMSO) in controleputjes, kolommen 1, 2, 12 (rijen AH). Meng grondig. </li><li> Voor elk experiment werden ten minste één positieve controle zoals rifampicine 0,004-1 ug / ml (replicerend assay) en / of 0,08-20 ug / ml (niet-replicerende assay). Opmerking: Het gebruik van 6-broom-1H-indazool-3-amine 9 0,1 tot 25 ug / ml wordt aanbevolen als een controle verbinding, die selectief is, NaNO 2 afhankelijke activiteit in de meervoudige stress-model van niet-replicatie. </li><li> Voor het repliceren assays, incubeer microtiterplaten bij 37 ° C bij 20% O2 en 5% CO2 gedurende 7 dagen (M. tuberculosis en M. bovis BCG) of 1-48 uur (M. smegmatis). Voor de meervoudige stress-model van niet-replicatie, incubeer microplaten gedurende 7 dagen bij 37 ° C bij 1% O2 en 5% CO2 (&lt;em&gt; M. tuberculose en M. bovis BCG). </li></ol></li></ol> 3. Enten van CARA Microplaten <ol><li> Op tijdstippen waarop het CARA worden gebruikt als uitlezing zorgvuldig mengen en de inhoud van de MIC 90 -achtige testplaat met een p200 multichannel pipet bedraagt 50-75 pl. Pipet op en neer ten minste 5-10 keer en voorzichtig wervelen de put inhoud in een cirkelvormige beweging met behulp van de pipet tips. </li><li> Breng 10 pl bepalingsbuffer goed inhoud naar de CARA microplaat. Zorg ervoor dat de volgorde van de put inhoud van de assay plaat overeenkomt met de volgorde van de put inhoud van het CARA microplaat. Vermijd spatten tijdens de transfers en zorg ervoor dat de 10 ul worden gespot in het midden van de CARA microplaat putten. Bevestig de 10 ul absorbeert in de CARA microplaat. LET OP: Er zijn geen verdunningen vereist voor het spotten van cellen op het CARA microplaten. </li><li> Bind stapels CARA microplaten met plaat en tapeplaats dan in een hersluitbare plastic zak. Incubeer CARA microplaten bij 37 ° C met 20% O 2 (M. smegmatis) of 1% O2 en 5% CO 2 (M. tuberculosis en M. bovis BCG). </li><li> Voor M. tuberculosis en M. bovis BCG, repliceren assays: incubeer gedurende 7 dagen; voor M. tuberculosis en M. bovis BCG non-replicating assays, incubeer gedurende 10 dagen; M. smegmatis, repliceren assays, incubeer gedurende 1-2 dagen; M. smegmatis, niet-replicerend assays Incubeer 2-3 dagen. LET OP: De tijden zijn schattingen en kunnen dienovereenkomstig worden aangepast voor verschillende repliceren, non-replicating, en stress omstandigheden. </li></ol> 4. Ontwikkeling CARA Microplaten <ol><li> Ontwikkel de CARA microplaten wanneer een film van de groei van bacteriën, of groter, macroscopische kolonies, zijn zichtbaar op de negatieve (voertuig) controleputjes. NB: Na langdurig incubatie, CARA microplaat putten vaaklijken droog en we raden pre-wetting goed inhoud met steriele PBS. Hiermee wordt voorkomen dat de houtskool uit absorberende Resazurin, wat kan leiden tot lage fluorescentie of well-to-well variatie. </li><li> Met behulp van een enkele set van 12 p200 tips met een multichannel pipet, afzien van 40 pi steriel PBS langs de kant van de putten en laat de PBS te verdelen over de bovenkant van de agar / bacteriële microkolonies. </li><li> Bereid CARA ontwikkelen reagens door 5 mg resazurine (0,01% eind) en 50 ml 5% Tween80 in PBS. Vortex en steriel filter. Opmerking: Een alternatieve CARA ontwikkelen reagens kan worden bereid door commercieel bereid resazurin vloeibare oplossing in 1: 1 (vol / vol) met 10% Tween80 in PBS. </li><li> Voeg 50 ul van vers bereide CARA ontwikkelen reagens aan elk putje van de microplaat CARA behulp van een 12-kanaals pipet. Rock platen heen en weer een paar keer om te helpen verspreiden reagens over de agar en bacteriële mat in elk putje. </li><li> Leg de platen ina hersluitbare plastic zak en incubeer bij 37 ° C gedurende ten minste 30 min voor M. smegmatis en 45-60 min voor M. tuberculosis of M. bovis BCG. Opmerking: Als het voertuig controle putjes niet aan rood wordt binnen het eerste uur, de platen kunnen opnieuw worden verpakt en gedurende langere tijdsperioden. </li><li> Vóór lezen fluorescentie plaatst CARA microplaten in een bio kap voor 15 min bij kamertemperatuur met de deksels verwijderd. Bij het gebruik van BSL3 spectrofotometers buiten een bioveiligheid kast, houden een optische kwaliteit PCR sticker over de plaat en sluit strak door zachtjes te drukken op de sticker met een zachte papieren handdoek. </li><li> Bepaal fluorescentie via top gelezen met excitatie bij 530 nm en emissie bij 590 nm. Het is niet nodig om lege de plaat. </li></ol> 5. Data Analysis <ol><li> Plot remmerconcentratie op de X-as op een log schaal 10 en fluorescentie op de Y-as op een lineaire schaal. Gebruik een scatterplot waarbij een curve fit zoals &quot;log remmer versus respons-variabele helling (4 parameters)&quot;. Plot datapunten als gemiddelden ± standaard fout. </li></ol>

<ol><li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fresh+approaches+to+anti-infective+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Medicine%22%5BJournal%5D)">Fresh approaches to anti-infective therapies.</a> Sci. Transl. Medicine. 4 (140), 140-142 (2012).</li>
<li>Gomez, J. E., McKinney, J. D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((tuberculosis+persistence%2C+latency%2C+and+drug+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Tuberculosis+%28Edinb%29%22%5BJournal%5D)">tuberculosis persistence, latency, and drug tolerance.</a> Tuberculosis (Edinb). 84, 29-44 (2004).</li>
<li>Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+persistence+as+a+phenotypic+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial persistence as a phenotypic switch.</a> Science. 305, 1622-1625 (2004).</li>
<li>Bigger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+staphylococcal+infections+with+penicillin+by+intermittent+sterilisation%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Treatment of staphylococcal infections with penicillin by intermittent sterilisation.</a> Lancet. , 497-500 (1944).</li>
<li>Bryk, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+killing+of+nonreplicating+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Selective killing of nonreplicating mycobacteria.</a> Cell Host Microbe. 3, 137-145 (2008).</li>
<li>Gold, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonsteroidal+anti-inflammatory+drug+sensitizes+Mycobacterium+tuberculosis+to+endogenous+and+exogenous+antimicrobials%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Nonsteroidal anti-inflammatory drug sensitizes Mycobacterium tuberculosis to endogenous and exogenous antimicrobials.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 16004-16011 (2012).</li>
<li>Gold, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+semi-quantitative+assay+to+discriminate+among+compounds+with+activity+against+replicating+or+non-replicating+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Rapid, semi-quantitative assay to discriminate among compounds with activity against replicating or non-replicating Mycobacterium tuberculosis.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 59, 6521-6538 (2015).</li>
<li>Gold, B., Warrier, T., Nathan, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGold%2C+B+%22Mycobacteria+Protocols%2C+Methods+in+Molecular+Biology%22">Mycobacteria Protocols, Methods in Molecular Biology</a>. Parish, T., Roberts, D. 1285, Springer. 293-315 (2015).</li>
<li>Warrier, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Novel+Anti-mycobacterial+Compounds+by+Screening+a+Pharmaceutical+Small-Molecule+Library+against+Nonreplicating+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Identification of Novel Anti-mycobacterial Compounds by Screening a Pharmaceutical Small-Molecule Library against Nonreplicating Mycobacterium tuberculosis.</a> ACS Infect. Dis. , 580-585 (2015).</li>
<li>Zheng, P., et al. Synthetic Calanolides with Bactericidal Activity Against Replicating and Nonreplicating Mycobacterium tuberculosis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZheng%2C+P+%22J.+Med.+Chem%22">J. Med. Chem</a>. Chem, J. .M. ed. , (2014).</li>
<li>Darby, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+cell+screen+for+inhibitors+of+pH+homeostasis+in+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Whole cell screen for inhibitors of pH homeostasis in Mycobacterium tuberculosis.</a> PLoS One. 8, e68942(2013).</li>
<li>Darby, C. M., Nathan, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Killing+of+non-replicating+Mycobacterium+tuberculosis+by+8-hydroxyquinoline%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Antimicrob.+Chemother%22%5BJournal%5D)">Killing of non-replicating Mycobacterium tuberculosis by 8-hydroxyquinoline.</a> J. Antimicrob. Chemother. 65, 1424-1427 (2010).</li>
<li>de Carvalho, L. P., Darby, C. M., Rhee, K., Nathan, C. Nitazoxanide Disrupts Membrane Potential and Intrabacterial pH Homeostasis of Mycobacterium tuberculosis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3ade+Carvalho%2C+LP+%22ACS+Med.+Chem.+Lett%22">ACS Med. Chem. Lett</a>. 2, 849-854 (2011).</li>
<li>Xie, Z., Siddiqi, N., Rubin, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+antibiotic+susceptibilities+of+starved+Mycobacterium+tuberculosis+isolates%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Differential antibiotic susceptibilities of starved Mycobacterium tuberculosis isolates.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 49, 4778-4780 (2005).</li>
<li>Grant, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+inhibitors+of+nonreplicating+Mycobacterium+tuberculosis+using+a+carbon+starvation+model%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of novel inhibitors of nonreplicating Mycobacterium tuberculosis using a carbon starvation model.</a> ACS Chem. Biol. 8, 2224-2234 (2013).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptomycin-starved+Mycobacterium+tuberculosis+18b%2C+a+drug+discovery+tool+for+latent+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Streptomycin-starved Mycobacterium tuberculosis 18b, a drug discovery tool for latent tuberculosis.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 56, 5782-5789 (2012).</li>
<li>Mak, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+screen+to+identify+inhibitors+of+ATP+homeostasis+in+non-replicating+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">A high-throughput screen to identify inhibitors of ATP homeostasis in non-replicating Mycobacterium tuberculosis.</a> ACS Chem. Biol. 7, 1190-1197 (2012).</li>
<li>Cho, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-oxygen-recovery+assay+for+high-throughput+screening+of+compounds+against+nonreplicating+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Low-oxygen-recovery assay for high-throughput screening of compounds against nonreplicating Mycobacterium tuberculosis.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 51, 1380-1385 (2007).</li>
<li>Franzblau, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+analysis+of+methods+used+for+the+evaluation+of+compounds+against+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Tuberculosis+%28Edinb%29%22%5BJournal%5D)">Comprehensive analysis of methods used for the evaluation of compounds against Mycobacterium tuberculosis.</a> Tuberculosis (Edinb). 92, 453-488 (2012).</li>
<li>Rebollo-Lopez, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+of+50+new%2C+drug-like+compounds+and+their+computational+target+predictions+for+open+source+anti-tubercular+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Release of 50 new, drug-like compounds and their computational target predictions for open source anti-tubercular drug discovery.</a> PLoS One. 10, e0142293(2015).</li>
<li>Tasneen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+the+nitroimidazoles+PA-824+and+TBA-354+to+the+activity+of+novel+regimens+in+murine+models+of+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Contribution of the nitroimidazoles PA-824 and TBA-354 to the activity of novel regimens in murine models of tuberculosis.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 59, 129-135 (2015).</li>
<li>Grosset, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+clofazimine+activity+in+a+second-line+regimen+for+tuberculosis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Assessment of clofazimine activity in a second-line regimen for tuberculosis in mice.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 188, 608-612 (2013).</li>
<li>Shiloh, M. U., Ruan, J., Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+bacterial+survival+and+phagocyte+function+with+a+fluorescence-based+microplate+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Evaluation of bacterial survival and phagocyte function with a fluorescence-based microplate assay.</a> Infect. Immun. 65, 3193-3198 (1997).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+small+molecule+with+activity+against+drug-resistant+and+persistent+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Identification of a small molecule with activity against drug-resistant and persistent tuberculosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, E2510-E2517 (2013).</li>
<li>Wayne, L. G., Hayes, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+model+for+sequential+study+of+shiftdown+of+Mycobacterium+tuberculosis+through+two+stages+of+nonreplicating+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">An in vitro model for sequential study of shiftdown of Mycobacterium tuberculosis through two stages of nonreplicating persistence.</a> Infect. Immun. 64, 2062-2069 (1996).</li>
<li>Barry, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBarry%2C+AL+%22Methods+for+determining+bactericidal+activity+of+antimicrobial+agents%3A+approved+guideline%22">Methods for determining bactericidal activity of antimicrobial agents: approved guideline</a>. 19, National Committee for Clinical Laboratory Standards. (1999).</li>
</ol>

Er zijn geen belangenconflicten bekend te maken.

Het CARA werd oorspronkelijk ontwikkeld om een knelpunt in vordert niet-replicerende of dual-actieve moleculen 7 te verlichten. De CARA dient als tussenstap tussen concentratie-respons Bevestiging van primaire screening hits en CFU assays (figuur 1). Aangezien een enkele CARA plaat tal van microtiterplaten nodig om seriële verdunningen te bereiden en-agar dat Petri platen gebruikt om overlevende bacteriën te sommen kan vervangen, de CARA biedt een eenvoudig middel om de activiteit van een molecuul snel te beoordelen en te testen meerdere variabelen in een keer, met inbegrip van samengestelde concentratie en de tijd van blootstelling aan de verbinding. In CFU assay, naast seriële verdunningen die vaak bereik tot 10 6-voudige, de agarplaat verdunt typisch moleculen met een extra ~ 800-voudig (10 ui op 8 ml in een tri-stijl Petri plaat). Onze twee-fase, multi-stress-screening test voor verbindingen die actief zijn op non-replicating M. tuberculosis een overdracht factor 5-voudig, dat wil zeggen een verbinding in de niet-replicerende fase van de bepaling die bij een vijfde van de oorspronkelijke concentratie in de uitgroei (replicerend) fase van de test is 6-9. De CARA matigt carry-over-effecten door sekwestreren kleine moleculen met actieve kool. De meeste tuberculosedrugs en klinische kandidaten binden snel en volledig actieve kool, met uitzondering van de aminoglycoside streptomycine 7. Opneming van geactiveerde koolstof in agar platen voor CFU assays voorkomen bacteriële groeiremming of bacteriën doden door overgedragen TMC207 en PA-824 7,21,22. Dus op grond van het opnemen van actieve kool in de bacteriologische agar, het CARA niet afhankelijk van seriële verdunningen van cellen en testmiddel. De CARA kan helpen bacteriostatische of bacteriedodende effect van het repliceren van actieven en bacteriedodende effect van niet-actieven repliceren voorspellen. in glgemene, het CARA wordt gebruikt in parallel met standaard MIC 90 assays. De voorspellende kracht van het CARA komt van vergelijking van MIC 90 en CARA resultaten (Figuur 2 en Tabel 1). Bij gebruik van anti-mycobacteriële middelen te bestuderen, kan de CARA voorspellen activiteit die repliceert bactericide (figuur 4a), repliceren bacteriostatisch (figuur 4b), niet-replicerende bactericide (Figuur 4c) of dubbele actieve (figuur 4d). De CARA maakt ook eenvoudige evaluatie van de activiteit van een verbinding in zowel de dosis en tijd. CFU assays alleen vereist veel inspanning en materiaal om de activiteit van een verbinding over een groot bereik van doseringen en tijden evalueren, maar de taak wordt beheersbaar wanneer CARA verfijnen het traject van omstandigheden die waarin de verbinding aantoonbaar actief (Figuur 5 ). Terwijl het CARA heeft bruikbaarheid bij het bestuderen van de werking van eennti-infectiva op mycobacteriën, de test heeft beperkingen. De CARA heeft een smal dynamisch bereik (2-3 log 10) en mogen niet geschikt zijn voor de omstandigheden waarin men anticipeert er mag niet meer dan 2 tot 3 log 10 bacteriële doden zijn. CARA voorspellingen verder bestudeerd met een strengere en nauwkeurige methode voor bacteriële aantallen, zoals CFU assay sommen. De post-antibiotische effect van sommige anti-infectiva, zoals PAS, kan het CARA verwarren als een voorspellend instrument om onderscheid te maken tussen verbindingen met bacteriedodende en bacteriostatische activiteit tegen het repliceren van M. tuberculosis 7. Er zijn twee aanbevelingen om de kwaliteit van de CARA verbeteren. Ten eerste moet men CARA pour microplaten snel voordat de agar stolt, met behoud volumetrische nauwkeurigheid en het vermijden van spatten buiten microputjes. Ongeacht het aantal platen nodig is, raden wij aan het maken van 0,5 tot 1 L batches van medium te helpen handhaven van de medium in vloeibare vorm voor de duur van de tijd die nodig is om platen gieten. Het veranderen van tips vaak tijdens het vullen van microplaten met medium vermijdt het gebruik van gedeeltelijk verstopt tips. Ten tweede moet men artifactual variatie in fluorescentie tussen herhalingen minimaliseren. Mycobacteriële microkolonies, met name pathogène mycobacteriën zoals M. tuberculosis, vaak onregelmatig groeien. Bijvoorbeeld kan microkolonies groeien op het agar oppervlak variëren in grootte, vorm, lengte, of kunnen zich uitstrekken tot de inwendige wanden van putjes microplaat. Een uitdaging is om alle bacillen gelijkmatig te bedekken met de ontwikkelingslanden reagens. Andere hindernis is dat na verlengde incubatie bij 37 ° C, het vaste bacteriologische medium van de CARA microplaten kan droog en gevoelig voor het absorberen van de ontwikkelende reagens wordt. Omdat actieve kool kan binden resazurin en doven fluorescentie 7, kan er well-to-well variatie te wijten zijn aan droge putten opvangen van de resazurin ontwikkelen oplossing en de geactiveerde Charcoal blussen resazurin fluorescentie. Vooraf bevochtigen van het oppervlak van CARA microplaat putjes met PBS onmiddellijk vóór het toevoegen van de ontwikkelende reagens vermindert beide problemen - de ontwikkeling van reagens alle mycobacteriële kolonies even bereiken en de resazurine blijft veilig boven de actieve kool. Het CARA kunnen aanvragen bij het identificeren en karakteriseren van fenotypes van mycobacteriële mutanten, of in medium-throughput drug discovery assays voor andere bacteriële soorten hebben.

Mycobacterium tuberculosis, het etiologische agens van tuberculose, kan overleven in een gastheer in een latente toestand die ongevoelig is voor antibiotica uitroeiing. Fenotypische (niet-genetische) resistentie van M. tuberculosis tijdens infectie wordt verondersteld het gevolg te zijn, gedeeltelijk, populaties van niet-replicerende bacillen 1,2. Klasse I persisters weergeven van fenotypische resistentie tegen geneesmiddelen ontstaan via zeldzame stochastische mechanismen onder grote populaties van drugs gevoelige cellen 3,4. Klasse II persisters worden bewezen non-replicating door factoren van de immuniteit van de gastheer, met inbegrip van externe spanningen in microenvironments tegengekomen tijdens infectie. We ontwikkelden onlangs een in vitro model van klasse II niet-replicerende persistentie voorwaarden geconfronteerd met M. tuberculosis in geactiveerde macrofagen en granulomen nabootsen. Multi-stressmodel van klasse II persistentie kunnen aandoeningen die langzame groei, zoals een vetzuur koolstofbron en volledig halt groei, zoals lichte zuurgraad (pH 5,0), hypoxia (1% O2) en stikstofoxide en andere reactieve stikstof tussenproducten 5-9. Grootschalige screening gebruik deze multi-stress-model van niet-replicatie, en andere Class II non-replicating modellen, heeft diverse moleculen waarvan de activiteit is gericht tegen het niet-replicerende staat 5-7,9-18 opgeleverd. Dezelfde niet-replicerende schermen bleek ook een categorie van moleculen die activiteit bezitten tegen zowel replicerende en niet-replicerende bacillen, zogenaamde &quot;dual actieve&quot; 7,10,12,19,20. Antibacteriële drug discovery in de hit-to-lead fase omvat uitgebreide karakterisering van kandidaat-moleculen om leads voor hit uitbreiding voorlopige farmacologische karakterisering, target identificatie, en de voorlopige in vivo studies kiezen. Als een vroege stap worden anti-infectiva ingedeeld volgens hun bacteriostatische of bacteriedodende werkingsmechanisme en, indien bacteriedodend, wHether bacteriële kill is tijd- en / of de concentratie-afhankelijk. Het kiemgetal (CFU) test is de klassieke, gouden standaard methode om deze vragen te beantwoorden. In de CFU assay worden bacteriën blootgesteld aan een testmiddel, waarna monsters verwijderd, serieel verdund en porties van verdunningen worden uitgespreid op vast medium en geïncubeerd bacteriologische groei van overlevende cellen mogelijk. Tenslotte worden bacteriële kolonies geteld. De CFU assay vereist grote aantallen microtiterplaten cellen en agar bevattende Petri-platen verdunnen tot overlevende kolonies sommen. De CFU test voor langzaam groeiende mycobacteriën wordt gehinderd door hun langzame generatie tijd (18-24 uur), die ongeveer 3 weken nodig heeft om kolonies te verschijnen op platen. Verder wordt incubator ruimte vaak beperkt in gespecialiseerde bioveiligheid-niveau-3-faciliteiten. Terwijl omslachtig, CFU assays zijn de gouden standaard voor de impact van niet-replicerende en dual-actieve moleculen op mycobacter karakteriserenIA. Non-repliceren assays zijn onderhevig aan hoge vals-positieve tarieven als velen zijn gekoppeld aan repliceren assays om cellulaire levensvatbaarheid 6-8 te beoordelen. Bijvoorbeeld, een verbinding die krachtige activiteit tegen replicerende M. tuberculosis (een &quot;actieve replicerende&quot;) mogelijk niet doden tijdens de niet-replicerende assay, maar nog steeds doden dankzij overdracht van de niet-replicerende fase van het test om de herstelfase van de test, die onder omstandigheden die replicatie ( &quot;repliceren voorwaarden&quot;) te ondersteunen wordt uitgevoerd. Verbinding overdracht compliceert analyse van dubbele actieve moleculen, waardoor het moeilijk te onderscheiden of activiteit replicerende, niet-replicerend of dubbel. Om de hierboven beschreven problemen aan te pakken, ontwikkelden we de c harcoal een gar r esazurin een ssay (CARA) voor een snelle, semi-kwantitatieve opsomming van mycobacteriële soorten zoals M. tuberculosis, M. bovis BCG, M. smegmatis 7 (figuren 1 en 2). In buffer oplossingen in vitro, actieve kool snel sequesters de meeste van de standaard drugs gebruikt voor de behandeling van tuberculose 7. Actieve kool in CARA microplaten bindt verbindingen die dan kan vervoeren van een assay microplaat, en deze functie van de CARA elimineert de eis om serieel verdunnen test goed inhoud voorafgaand aan de opsomming 7,21,22. Het aantal mycobacteriële microkolonies op het agar oppervlak van CARA microplaten wordt geschat door de toevoeging van Resazurin, een blauwe kleurstof, een gereduceerde vorm, resorufine, is een rose molecule waarvan de fluorescentie wordt gemeten door spectrofotometrie 23. CARA microplaten worden gedurende 1-2 dagen voor M. smegmatis en 7-10 dagen voor langzaam groeiende mycobacteriën zoals M. tuberculosis en M. bovis BCG. De CARA heeft een smal dynamisch bereik van ~ 2-3 log 10 diffeRenče in CFU. Wanneer gebruikt in plaats van CFU-test, één CARA microplaat vervangt ongeveer vijf 96-well platen gebruikt voor seriële verdunningen en 120 tri-style agarplaten voor plateren. Interpretatie van CARA gegevens helpen begeleiden latere studies door te bepalen welke incubatietijden en samengestelde concentraties te testen in meer bewerkelijke CFU-gebaseerde testen.

<table><tbody><tr><td>Middlebrook 7H9</td><td>Beckton Dickinson</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrook 7H11</td><td>Beckton Dickinson</td><td>298810</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrook OADC</td><td>Beckton Dickinson</td><td>212351</td><td></td></tr><tr><td>BSA, heat shock</td><td>Roche</td><td>3118958001</td><td></td></tr><tr><td>geactiveerde kool</td><td>Sigma</td><td>C5510</td><td></td></tr><tr><td>PBS, Dulbecco's Ca2+ en Mg2+ vrij</td><td>Life Technologies / Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>tween 80</td><td>Sigma</td><td>P8074</td><td></td></tr><tr><td>tyloxapol</td><td>Sigma</td><td>T8761</td><td></td></tr><tr><td>natriumnitriet</td><td>Sigma</td><td>2252</td><td></td></tr><tr><td>rifampicine</td><td>Sigma</td><td>R3501</td><td></td></tr><tr><td>6-bromo-1H-indazol-3-amine</td><td>Alfa Aesar</td><td>H34095</td><td></td></tr><tr><td>kaliumfosfaat monobasic&nbsp;&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>magnesiumsulfaat, heptahydraat&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M1880</td><td></td></tr><tr><td>ferric ammoniumcitraat&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>F5879</td><td></td></tr><tr><td>zinksulfaat, heptahydraat</td><td>Sigma</td><td>Z0251</td><td></td></tr><tr><td>ammoniumchloride&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>boterzuur, vloeibaar</td><td>Sigma</td><td>B103500</td><td></td></tr><tr><td>resazurin poeder</td><td>Sigma</td><td>R7017</td><td></td></tr><tr><td>natriumchloride&nbsp;</td><td>J.T. Baker</td><td>4058-01&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>bereid resazurin oplossing&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>DAL1100</td><td></td></tr><tr><td>PCR stickers</td><td>Denville</td><td>B1212-5</td><td></td></tr><tr><td>spectrofotometer</td><td>Molecular Devices</td><td>M5</td><td></td></tr><tr><td>96-well, tissue culture treated microplates</td><td>Corning</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>reagent reservoirs</td><td>VWR&nbsp;</td><td>89094-678</td><td></td></tr><tr><td>hersluitbare plastic zakken</td><td>VWR&nbsp;</td><td>395-94602</td><td></td></tr><tr><td>14 ml Polypropyleen buisjes met ronde bodem</td><td>Corning&nbsp;</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>50 ml conische centrifugeerbuis</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 Celcultuur fles</td><td>Corning</td><td>431464U</td><td></td></tr><tr><td>heldere, platte bodem tissue culture treated 96-well microplate</td><td>Costar</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>Prism 6 voor OS X</td><td>GraphPad</td><td>http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/</td><td></td></tr></tbody></table>

visualisatie van de charcoal agar resazurin assay voor semi-kwantitatieve, medium-throughput bepalen van het aantal mycobacteriën

Visualization of the Charcoal Agar Resazurin Assay for Semi-quantitative, Medium-throughput Enumeration of Mycobacteria

Er is een dringende behoefte om te ontdekken en de vooruitgang anti-infectiva dat de duur van tuberculose (tbc) behandeling verkorten. Mycobacterium tuberculosis, het etiologische agens van tuberculose, ongevoelig is voor snelle en duurzame chemotherapie vanwege de aanwezigheid van bacillen vertonen fenotypische geneesmiddelresistentie. De c harcoal een gar r esazurin een ssay (CARA) werd ontwikkeld als een instrument om actieve moleculen door high-throughput screening campagnes ontdekt karakteriseren tegen repliceren en non-replicating M. tuberculosis. Opneming van geactiveerde koolstof in bacteriologische agar medium die helpt het effect van verbinding versleping, en elimineert de noodzaak voor een pre-cellen te verdunnen voordat spotten op CARA microplaten. Na 7-10 dagen incubatie bij 37 ° C, de vermindering van Resazurin door mycobacteriën microkolonies groeien op het oppervlak van CARA microtiterplaat putjes maakt semikwantitatieve assessment van bacteriële nummers via fluorometrie. De CARA detecteert ongeveer 2-3 log 10 verschil in bacteriële aantallen en voorspelt een minimale bacteriedodende concentratie leidt tot ≥99% bacteriële kill (MBC ≥99). De CARA helpt bepalen of een molecuul is aangemeld bacillen die replicerend, niet-replicerend, of beide. Proefprojecten met behulp van de CARA vergemakkelijkt de identificatie van die concentratie van testmiddel en het tijdstip van de blootstelling verbinding vereist verdere evaluatie door kiemgetal (CFU) assays. Bovendien kan de CARA voorspellen of replicerende actieve bactericide of bacteriostatisch.

CARA verwachte resultaten worden in figuur 2 weergegeven en samengevat in Tabel 1. Voor replicerende cellen, is het CARA parallel met een standaard MIC 90 assays, en voor niet-replicerende assays, de CARA is parallel met een aangepaste MIC 90 test die is gekoppeld met een uitgroei fase. De concentratie van testmiddel dat resulteert in het uitvallen van CARA-fluorescentie boven de achtergrond levels te stijgen is het CARA-MBC ≥99 (Figuur 3a). De &quot;≥99 &#39;subscript geeft aan dat het CARA-MBC biedt een geschatte concentratie van die agent die aanleiding geeft tot ≥2 log 10 bacteriële kill (≥99% kill). De vloeistof bouillon MIC 90 assay niet in staat is om onderscheid te maken tussen bacteriedodende en bacteriostatische activiteit en dit onderscheid moet worden opgelost door een CFU assay. Doorconventie, de drempel die bactericide onderscheidt van bacteriostatische activiteit voor langzaam groeiende mycobacteriën is ongeveer 2-3 log 10 doden meer dan 7 dagen 7,26. Omdat het dynamisch bereik van de CARA is 2-3 log 10 doden, kan het CARA een schatting van bactericide of bacteriostatische activiteit. De CARA identificeert eenvoudig enkele actieve replicerende bacteriostatisch wijten aan het falen van deze verbindingen CARA fluorescentie achtergrondniveaus te verlagen (figuur 2). Echter, sommige verbindingen met bacteriostatische werking tegen replicatie M. tuberculosis een sterke post-antibiotische effect, hetgeen betekent dat zij niet hergroei bacteriën remmen tijdens de herstelfase, zelfs in afwezigheid van verbinding overdracht. Dit effect kan moeilijk te herkennen in de CARA assay. Verbindingen worden verdacht van het uitoefenen van een post-antibiotisch effect als ze een &quot;vast venster&quot; weergegeven, gedefinieerd als&gt; 4-voudige verschuiving naar rechts tun het MIC en CARA curves (figuur 3b). De statische venster geeft aan dat een molecuul werkzaam is tegen replicerende M. tuberculosis bacteriostatische plaats van bactericide zijn. In sommige gevallen, de statische ramen pas bekend na inspectie van een geëxpandeerd Y-as voor CARA fluorescentie (figuur 3c en 3d). CARA en MIC 90 gegevens worden meestal samen uitgezet (figuur 4). Representatieve gegevens voor replicating- en niet-replicerende-actieve moleculen getest door MIC 90 en CARA zijn weergegeven in figuur 4. Er zijn 4 belangrijke activiteit klassen voor moleculen: 1) repliceren bacteriedodende (gedemonstreerd met isoniazide, Figuur 4a); 2) repliceren bacteriostatisch (gedemonstreerd met linezolid, figuur 4b); 3) non-replicating bacteriedodende (gedemonstreerd met oxyfenbutazon, Figuur 4c); en 4) replicating-actieve (bacteriostatische of bactericide) en niet-replicerende bactericide (aangetoond PA-824, figuur 4d). Belangrijker Figuren 4a en 4b tonen dat terwijl isoniazide en linezolid lijken werkzaamheid tegen niet-replicerend bacteriën door de MIC 90 assay, de CARA stelt deze niet actief onder de geteste niet-replicerend omstandigheden. Om het nut van de CARA testen voorspellen tijds- en concentratie-afhankelijke effect van een molecuul, repliceren M. smegmatis werd blootgesteld aan toenemende concentraties rifampicine (figuren 5a - d) en op verschillende tijdstippen tussen 1-24 uur werden aliquots gespot op CARA platen. Deze gegevens gaven aan dat rifampicine uitgeoefende invloed al 1 uur (figuur 5a), in oplopende bactericide activiteit tussen 3 en 24 uur (figuren 5b-d), en gedood ≥2-3 log 10 bij ~ 10 pg / ml van 24 uur (Figuur 5d). Een soortgelijk experiment testen viervoud van een mediumcontrole en 9 geneesmiddelconcentraties en op 4 tijdstippen prohibitief zou door een standaard CFU-gebaseerde assay. Dus de CARA een rol in drug discovery als medium-throughput, snel mechanisme om een ​​molecuul activiteitsprofiel identificeren. CARA voorspellingen moeten rigoureus worden geëvalueerd met behulp van een standaard CFU test. De toevoeging van 0,4% geactiveerde koolstof Petri platen voor CFU analyse kan verbeteren correlatie CARA data, en kan een nauwkeurigere CFU tellingen, de grootte van de correctie in het algemeen evenredig is met de potentie van de verbinding 21,22. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/54690/54690fig1.jpg" /> Figuur 1: De CARA is een voorspellend instrument in drug discovery. Deze grafiek vat de bruikbaarheid van de CARA alstussenstap tussen drug discovery (single point screening, cherry-picking, en de dosis-respons assays) en tijdrovende hit-to-lead assays (CFU assays en target identificatie). [Aangepast met toestemming van Gold et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2015 7] <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54690/54690fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/54690/54690fig2.jpg" /> Figuur 2: Schema van de bouillon MIC 90 assay en CARA met verwachte resultaten. Zowel MIC 90 en CARA resultaten worden gepresenteerd voor 8 mogelijke activiteiten. De kleurcodering voor MIC 90 microtiterplaat wells is wit (geen groei) en bruin (groei), en voor het CARA microplaten is zwart (geen fluorescentie) en roze (resorufine fluorescentie). Gegevens zijn hypothetisch. [Aangepast met toestemming van Gold et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2015 7] <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54690/54690fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 3" src="/files/ftp_upload/54690/54690fig3.jpg" /> Figuur 3: Gespecialiseerde CARA termen en definities. De minimale bactericide concentratie van een molecuul leidt tot achtergrondniveaus van CARA fluorescentie het CARA-MBC ≥99 (a). Onder omstandigheden repliceren, een ≥4-voudige verschuiving van de CARA-MBC ≥99 rechts van de MIC 90 geeft vaak bacteriostatische werking en een &quot;vast venster&quot; (b) genoemd. Voor moleculen met een sterke post-antibiotisch effect kan statisch ramen moeilijk te observeren (c) en vereisenuitbreiding van de Y-as (CARA fluorescentie) te visualiseren (d). Gegevens zijn hypothetisch. [Aangepast met toestemming van Gold et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2015 7] <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54690/54690fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 4" src="/files/ftp_upload/54690/54690fig4.jpg" /> Figuur 4: Illustratieve MIC 90 en CARA resultaten voor geselecteerde verbindingen. Gegevens voor MIC 90 (rood) en CARA (blauw) worden aangetoond voor (a) isoniazide (INH), (b) linezolid, (c) oxyfenbutazon, en (d) PA-824. Wildtype M. tuberculosis H37Rv werd blootgesteld aan verbindingen voor 7 dagen onder standaard omstandigheden replicerende of meervoudige stress-model van niet-replicatie 7-9.<html> MIC 90 assays en CARA werden uitgevoerd zoals getoond in figuur 2. [Aangepast met toestemming van Gold et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2015 7] <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54690/54690fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 5" src="/files/ftp_upload/54690/54690fig5.jpg" /> Figuur 5: dosis- en tijdsafhankelijke activiteit van rifampicine. De niet-pathogene, snelgroeiende M. smegmatis werd blootgesteld aan toenemende concentraties rifampicine repliceren onder omstandigheden en hoeveelheden werden bemonsterd voor CARA 1 (a), 3 (b), 6 (c) en 24 (d) hr. [Aangepast met toestemming van Gold et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2015 7].com / files / ftp_upload / 54690 / 54690fig5large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken. <img alt="tafel 1" src="/files/ftp_upload/54690/54690tbl1.jpg" /> Tabel 1: Samenvatting van de verwachte resultaten in figuur 2. [Aangepast met toestemming van Gold et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2015 7] <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54690/54690tbl1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze tabel te bekijken.</a>

De kolen agar rezazurin assay (CARA) is een semi-kwantitatief, medium-doorvoer methode om de activiteit van testmiddelen te beoordelen tegen mycobacteriën die zich vermenigvuldigen, niet vermenigvuldigen of beide. De CARA maakt een snelle evaluatie mogelijk van tijd- en concentratie-afhankelijke activiteit en identificeert parameters om na te streven door kolonievormende eenheid (CFU) assays.

Visualisatie van de Charcoal Agar Resazurin Assay voor Semi-kwantitatieve, Medium-throughput bepalen van het aantal mycobacteriën

There is an urgent need to discover and progress anti-infectives that shorten the duration of tuberculosis (TB) treatment. Mycobacterium tuberculosis, the ...

Het algemene doel van de CARA is om een semi-kwantitatieve beoordeling met medium-doorvoercapaciteit te bieden van de activiteit van verbindingen tegen replicerende en niet-replicerende mycobacteriën. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de CARA, als surrogaat voor CFU, in staat stelt om snel de dosis- en tijdsafhankelijkheid van een verbinding te testen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van geneesmiddelenonderzoek naar tuberculose, zoals het bepalen of een verbinding bacteriostatisch of bactericide is tegen replicerende bacteriën en of deze bactericide is tegen niet-replicerende bacteriën.De methode zal worden gedemonstreerd door Julia Roberts, een medewerker in ons laboratorium. Voeg 450 milliliters water toe aan een glazen bekerglas van één liter of 900 milliliters water aan een Erlenmeyerkolf van twee liter. Plaats een autoclaafbare roerstaf in het bekerglas of de kolf.Voeg vervolgens Middlebrook 7H11-poeder, geactiveerde houtskool tot een eindconcentratie van 0,4% en een 50% glyceroloplossing toe om een eindconcentratie van 0,2% te bereiken. Bedek de opening van de erlenmeyer of het bekerglas met aluminiumfolie en bevestig dit aan het glas met autoclaaftape. Laat het medium na het autoclavéren afkoelen tot ongeveer 55 tot 65 °C op een magnetische roerplaat die op een lage snelheid is ingesteld om de houtskool in suspensie te houden.Werk aseptisch in een biologische veiligheidskast die is uitgerust met een magnetische roerplaat, verwijder de folie van het medium en voeg respectievelijk 100 of 50 milliliters OADC-supplement toe aan de tweeliterfles of het eenliterbekerglas en blijf mengen. Vul met een multichannel pipet met acht of 12 filtertips een 96-well microplaat met 200 microliter 7H11-OADC-charcoal per well vanuit het reagensreservoir of bekerglas, waarbij u snel werkt om stolling van de agar en de vorming van bellen te voorkomen. Plaats stapels CARA-microplaten in hersluitbare plastic zakken om uitdroging te voorkomen en bewaar deze bij vier graden Celsius.Inoculeer polypropyleen centrifugebuizen met een ronde of conische bodem die respectievelijk vier of 20 milliliters Middlebrook 7H9-ADN of 7H9-OADC bevatten met M.smegmatis bij een OD580 van 0,01 tot 0,1. Incubeer de M.smegmatis-culturen bij 37 °C en 20% O2 onder schudcondities, waarbij de culturen worden uitgebreid tot de mid-log fase of een geschatte OD580 van 0,5. Om een experiment op te zetten naar het model van de minimale remmende concentratie onder replicerende en niet-replicerende condities, verdeel dan 200 microliters cellen in 7H9-ADN bij een OD580 van 0,01 over alle wells van een 96-wells plaat met een transparante bodem die behandeld is voor weefselkweek.Gebruik voor de assay met niet-replicerende cellen PBS met 0,02% tyloxapol om de cellen twee keer te wassen. Gebruik vervolgens niet-replicerend medium om de cellen opnieuw te suspenderen. Gebruik niet-replicerend medium om de cellen te verdunnen tot een OD580 van 0,1 en voeg natriumnitraat toe tot een eindconcentratie van 0,5 tot 5 millimolar vanuit een vers bereide één molaire stockoplossing.Verdeel 200 µL cellen bij een OD580 van 0,1 over alle putjes van een 96-well plaat met een transparante bodem en een weefselkweekbehandeling. Voeg, na het bereiden van de testmiddelen volgens het tekstprotocol, twee µL van testmiddel één toe aan de rijen A tot en met E en twee µL van testmiddel twee aan de rijen E tot en met H, en meng dit grondig. Voor replicerende assays worden de M.smegmatis microplaten geïncubeerd bij 37 °C, 20%O2 en 5%CO2 gedurende één tot 48 uur.Op de tijdstippen waarop de CARA als uitleesmethode wordt gebruikt, wordt een p200 meerkanaals pipet ingesteld op 50 tot 75 µL om de inhoud van de wells van de assayplaat in MIC90-stijl zorgvuldig te resuspenderen door vijf tot 10 keer op en neer te pipetteren. Gebruik vervolgens de pipetpunten om de inhoud van de wells voorzichtig in een cirkelvormige beweging te zwenken. Draag 10 µL van de onverdunde inhoud van de assaywell over naar de overeenkomstige wells van de CARA-microplaat, waarbij spatten tijdens de overdracht worden vermeden en wordt gewaarborgd dat het aliquot van 10 µL in het midden van de wells van de CARA-microplaat wordt geplaatst.Zet stapels CARA-microplaten vast met plaatlijmband en plaats ze vervolgens in een afsluitbare plastic zak. Incubeer de M.smegmatis CARA-microplaten bij 37 °C met 20% O2 gedurende één tot twee dagen voor replicerende platen en gedurende twee tot drie dagen voor niet-replicerende platen. Wanneer er een film van bacteriële groei of grotere macroscopische kolonies zichtbaar zijn in de putjes van de negatieve controle, gebruik dan één set van 12 p200-tips met een multichannelpipet om 40 µL steriele PBS langs de zijkant van de putjes te dispenseren en laat de PBS zich verspreiden over de bovenkant van de agar/bacteriële microkolonies.Bereid het CARA-ontwikkelingsreagens voor door vijf milligram resazurin te mengen met 50 milliliters 5%Tween80 in PBS. Voeg 50 microliters van het vers bereide CARA-ontwikkelingsreagens toe aan elke well van de CARA-microplaat. Schud de platen vervolgens een paar keer heen en weer om het reagens gelijkmatig over de agar en de bacteriële mat in elke well te verdelen.Plaats de platen in een afsluitbare plastic zak en incubeer bij 37 °C gedurende ten minste 30 minuten voor M.smegmatis. Plaats de CARA-microplaten vóór het aflezen van de fluorescentie gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in een biosafety cabinet met de deksels verwijderd. Wanneer BSL3-spectrofotometers buiten een biosafety cabinet worden gebruikt, breng dan een PCR-sticker van optische kwaliteit aan over de plaat en gebruik een zachte papieren handdoek om deze stevig af te sluiten door voorzichtig op het stickeroppervlak te drukken.Bepaal de fluorescentie via een top-read met excitatie bij 530 nanometers en emissie bij 590 nanometers. Het is niet nodig om de plaat te blanken. Om de gegevens te analyseren, wordt de inhibitorconcentratie op de X-as uitgezet op een log10-schaal en de fluorescentie op de Y-as op een lineaire schaal.Raadpleeg het tekstprotocol voor aanvullende details. De concentratie van het testmiddel die ertoe leidt dat de CARA-fluorescentie niet boven de achtergrondwaarden stijgt, is de CARA-MBC ≥ 99, zoals hier wordt weergegeven. De subscript ≥ 99 geeft aan dat de CARA-MBC een geschatte concentratie van het testmiddel biedt die leidt tot een bacteriële doding van ≥ twee log10.Er wordt vermoed dat verbindingen een post-antibioticum effect uitoefenen als ze een statisch venster vertonen, gedefinieerd als een verschuiving naar rechts van meer dan vier keer tussen de MIC- en CARA-curven. Het statische venster geeft aan dat een molecuul dat actief is tegen replicerende M.tuberculosis bacteriostatisch kan zijn in plaats van bactericide. Voor moleculen met een krachtig post-antibioticum effect kunnen statische vensters moeilijk waarneembaar zijn en zijn ze alleen zichtbaar na inspectie van een uitgebreide Y-as voor CARA-fluorescentie, zoals hier te zien is.Replicerende en niet-replicerende actieve moleculen getest door MIC90 en CARA worden hier weergegeven. Hoewel isoniazid en linezolid activiteit tegen niet-replicerende bacteriën lijken te vertonen via de MIC90-assay, suggereert de CARA dat zij inactief zijn onder de geteste niet-replicerende condities. In dit CARA-experiment bleek blootstelling van M.smegmatis aan toenemende concentraties rifampicine al na één uur een effect te hebben, en werd een toenemende bactericide activiteit vertoond tussen drie en 24 uur, waarbij na 24 uur bij ongeveer 10 micrograms per milliliter groter dan of gelijk aan twee tot drie log10 werd gedood.Zodra deze techniek onder de knie is, kan het proces in ongeveer twee uur worden uitgevoerd voor het voorbereiden van de platen, minder dan een uur voor het overbrengen van cellen naar CARA-platen, en ongeveer één tot twee uur voor het ontwikkelen en meten van de fluorescentie van CARA-platen, mits dit correct wordt uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de CARA dient als een voorspellende assay om te bepalen of een verbinding bactericide of bacteriostatische activiteit vertoont tegen mycobacteriën die repliceren of niet-replicerend zijn. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een CARA opzet en gegevens analyseert op een manier die helpt bij het voorspellen van het type activiteit van een verbinding.Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

visualization-charcoal-agar-resazurin-assay-for-semi-quantitative

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

This video showcases the Charcoal Agar Resazurin Assay (CARA) for evaluating the activity of antimicrobial compounds against Mycobacterium tuberculosis. CARA aids in assessing the efficacy of these compounds by gauging their impact on bacterial growth and distinguishing between bactericidal and bacteriostatic effects.

A Charcoal Agar Resazurin Assay to Evaluate Test Compound Activity Against Mycobacteria

This video demonstrates an assay to evaluate the efficacy of drugs against Mycobacterium tuberculosis (Mtb) infection. An in vitro infection model containing Mtb/macrophage aggregates is generated that mimics in vivo infection. Upon introducing suitable antibiotics, their efficacy is tested via resuzarin assay to monitor the survival of bacteria with increasing drug concentrations.

An Assay to Evaluate Drug Efficacy against a Mycobacterium tuberculosis Infection Model

This video demonstrates an in-broth assay to determine antibiotic efficacy against Mycobacterium tuberculosis. The bacterial culture is incubated with different concentrations of a bactericidal antibiotic. The bactericidal efficacy is measured by assessing the presence of viable bacteria using a resazurin assay.

Evaluating the Effectiveness of a Test Compound against Mycobacteria in Broth

Hier beschrijven we een fenotypische test die van toepassing is op de high-throughput/high-content schermen van small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemische verbinding en Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. Deze methode is gebaseerd op de detectie van fluorescerend gelabelde Mycobacterium tuberculosis in fluorescerend gelabelde gastheercel met behulp van geautomatiseerde confocale microscopie.

Een microscopische fenotypische test voor de kwantificering van intracellulaire mycobacteriën aangepast voor screening met hoge doorvoer/hoge inhoud

We hebben een modulair high-throughput screening ontwikkeld voor het ontdekken van nieuwe verbindingen tegen Mycobacterium tuberculosis, intracellulaire targeting en-bouillon kweken bacteriën en cytotoxiciteit tegen de zoogdiergastheercel.

Systeem voor de werkzaamheid en cytotoxiciteit Screening van inhibitoren voor intracellulaire<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Nieuwe modellen en testen die het vroege proces van geneesmiddelontwikkeling voor de volgende generatie tuberculosebestrijdende middelen zouden verbeteren, zijn zeer wenselijk. Hier beschrijven we een snelle, goedkope en BSL-2-compatibele test om de werkzaamheid van geneesmiddelen tegen Mycobacterium tuberculosis te evalueren, die gemakkelijk kan worden aangepast voor screening met hoge doorvoer.

Een High-throughput Compatible Assay te evalueren Drug De werkzaamheid tegen macrofaag gepasseerd<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Snelle en efficiënte kwantificering van intracellulaire M. tuberculosis-groei is cruciaal voor het nastreven van verbeterde therapieën tegen tuberculose (TB). Dit protocol beschrijft een op bouillon gebaseerde colorimetrische detectietest met behulp van een geautomatiseerd vloeistofkweeksysteem om de Mtb-groei te kwantificeren in macrofagen die worden behandeld met kandidaat-gastheergerichte therapieën.

Een geautomatiseerd kweeksysteem voor gebruik bij preklinische tests van gastheergerichte therapieën voor tuberculose

De bepaling van kolonievormende eenheden (CFU) is de gouden standaardtechniek voor het kwantificeren van bacteriën, waaronder Mycobacterium tuberculosis, die weken nodig heeft om zichtbare kolonies te vormen. Hier beschrijven we een micro-CFU voor CFU-bepaling met verhoogde tijdsefficiëntie, lagere laboratoriumruimte en reagenskosten, en schaalbaarheid voor experimenten met gemiddelde en hoge doorvoer.

Microkolonievormende eenheidstest voor evaluatie van de werkzaamheid van vaccins tegen tuberculose

Deze studie ontwikkelde een test voor high-throughput screening tegen Mycobacterium abscessus met een recent gecreëerde dubbele reporterstam, waarbij fluorescentie en luminescentie worden gebruikt om de levensvatbaarheid van bacteriën snel te beoordelen. Dit protocol zal relevant zijn voor onderzoekers die nieuwe geneesmiddelen willen screenen op deze resistente bacterie.

Ontwikkeling van tests voor high-throughput medicijnscreening tegen mycobacteriën

Hier presenteren we een protocol om potentiële anti-tuberculose-geneesmiddelkandidaten te identificeren via fenotypische screening, waaronder de chemische synthese van een 4-aminoquinolineverbinding, het bepalen van de minimale remmende concentratie tegen Mycobacterium tuberculosis en de beoordeling van de cytotoxiciteit in zoogdiercellijnen.

Identificatie van potentiële anti-TB-kandidaten: Een stapsgewijze gids voor synthese, MIC-bepaling en cytotoxiciteitsbeoordeling in zoogdiercellen

Leer de charcoal agar resazurin assay (CARA) voor semi-kwantitatieve bepaling van mycobacteriële activiteit in tuberculoseonderzoek. Deze medium-throughput methode versnelt het screenen van geneesmiddelen.

Visualisatie van de Charcoal Agar Resazurin Assay voor Semi-kwantitatieve, Medium-throughput bepalen van het aantal mycobacteriën (Video) | JoVE Journal

Visualisatie van de Charcoal Agar Resazurin Assay voor Semi-kwantitatieve, Medium-throughput bepalen van het aantal mycobacteriën

Meer video's verkennen