LED Thermo Flow - De combinatie van optogenetics met flowcytometrie
30 december 2016
Optisch bestuurde stoffen zijn krachtige hulpmiddelen om signaalroutes te bestuderen. Om het spectrum van mogelijke experimenten uit te breiden, hebben we een apparaat ontwikkeld voor het bestuderen van optisch bestuurde stoffen in realtime met behulp van flowcytometrie: de LED Thermo Flow.
Het algemene doel van deze methode is om optisch bestuurde stoffen te stimuleren tijdens flow cytometrische metingen. Dit nieuwe apparaat kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van celsignalering door de kracht van optisch bestuurde stoffen te combineren met flowcytometrie. Voor het eerst kunnen optogenetische tools worden gekarakteriseerd en geanalyseerd met behulp van flowcytometrie.
Er bestond tot nu toe geen vergelijkbare gevestigde methode. Om te beginnen, suspendeer getransduceerde Ramos B-lymfocyten bij een concentratie van één miljoen cellen per milliliter en breng ze over naar een glazen FACS-buis. Vervolgens vervang de zwarte O-ring van de flowcytometer door een rubberen O-ring en breng siliconenvet aan om een betere afdichting te creëren.
Plaats de glazen buis in een flowcytometer en plaats de LED-prototype rond de buis met de lichten uitgeschakeld. Meet de fluorescentie-intensiteit van Dronpa in het GFP-kanaal. De meest cruciale stap van de procedure is het hanteren van de glazen buizen.
Glazen FACS-buizen zijn erg kwetsbaar en daarom wordt het aanbevolen om de plaatsing van de glazen buizen in de cytometer te oefenen voordat u experimenten uitvoert. Schakel vervolgens het 500 nanometer LED-licht aan de buitenkant van de buis in en blijf de fluorescentie-intensiteit van Dronpa meten. Verhoog de intensiteit van de LED-verlichting totdat de fluorescentie-intensiteit van Dronpa afneemt, om de minimale lichstintensiteit te schatten die nodig is om de fotoswitching van het Dronpa-Linker-Dronpa-eiwit te meten.
Schakel vervolgens het 400 nanometer LED-licht van de prototype aan de buitenkant van de buis in en blijf de fluorescentie-intensiteit van Dronpa meten. Verhoog de lichtintensiteit van de 400 nanometer LED-verlichting totdat de fluorescentie-intensiteit van Dronpa toeneemt. Begin met het volgen van de ontwerp- en fabricage-instructies in het bijbehorende tekstprotocol om de binnen- en buitenlagen van het fotoswitching LED-apparaat te fabriceren.
Plaats de 400 en 500 nanometer golflengte LED's in de kanalen van het apparaat. Lijm ze op hun plaats en bedrade ze zoals aangegeven. Deze specifieke golflengten zullen worden gebruikt om de Dronpa-Linker-Dronpa-fusie-eiwitten tussen hun donkere en heldere toestand te schakelen.
Monteer vervolgens het apparaat en zorg ervoor dat het waterdicht is om lekkage te voorkomen voordat u de transformator aansluit. Na de montage van het apparaat, oogst Ramos B-lymfocyten en suspendeer ze in een dichtheid van drie tot tien miljoen cellen per milliliter. Breng 600 microliter van de cellen over naar een glazen FACS-buis.
Plaats ze op ijs en bescherm de cellen tegen licht totdat ze worden gemeten. Verbind het gemonteerde apparaat met een verwarmde waterpomp en pas de temperatuur aan op 37 graden Celsius. Plaats vervolgens voorzichtig de glazen FACS-buis in het apparaat en verbind deze met de flowcytometer.
Meet de Dronpa-fluorescentie-intensiteit in het GFP-kanaal. Het ontwerp van dit optogenetische apparaat bevat een kamer die kan worden aangesloten op een circylerende watervoorziening om de temperatuur van het monster op een constante waarde te houden. Terwijl het apparaat drie verschillende golflengten uitzendt, was er slechts een marginale temperatuurstijging te zien in het FACS-monster, wanneer er water van 37 graden Celsius door het apparaat stroomde.
De Dronpa-Linker-Dronpa-fusieconstructie werd gekloond en getransduceerd in Ramos B-cellen. Wanneer het in de monomere toestand wordt geleid door een 500 nanometer lichtbron, neemt de emissie-intensiteit af. Wanneer de lichtbron vervolgens wordt omgeschakeld naar het 400 nanometer licht, wordt het Dronpa-monomeer snel omgezet in de dimere toestand en neemt de intensiteit snel toe.
Met behulp van dit apparaat kon het cytosolische Dronpa-Linker-Dronpa-fusie-eiwit meerdere keren worden gefotoschakeld. Schakelen naar de donkere toestand gebeurt langzaam, terwijl het schakelen naar de heldere toestand bijna onmiddellijk gebeurt. De spontane fluorescentie-herstel van Dronpa in het donker laat zien dat efficiënte fotoswitching naar de heldere vorm specifieke verlichting vereist en alleen langzaam spontaan optreedt.
De kinetiekanalyse toont aan dat de fotoswitchingsnelheid over het algemeen zeer reproduceerbaar is en dat zelfs na een lange incubatie in het donker, slechts ongeveer tien procent van de fluorescentie wordt hersteld zonder fotoswitching. Na deze procedure kan elke flow cytometrische analyse, inclusief calciumfluxmetingen, worden uitgevoerd om de functionaliteit van uw gekozen optogenetische tool te onderzoeken. Na de ontwikkeling van deze techniek zal het de weg vrijmaken voor onderzoekers op het gebied van optogenetica om de bekabeling van celsignaleringsroutes te onderzoeken.
Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een fotoswitching-protocol voor uw specifieke optogenetische tool kunt opzetten. Vergeet niet dat UV-licht extreem gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen, zoals beschermende brillen, altijd moeten worden gedragen tijdens het uitvoeren van deze procedure.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een nieuw apparaat dat is ontworpen voor real-time studie van optisch bestuurde stoffen met behulp van flowcytometrie. Door optogenetische tools te integreren met flowcytometrische metingen, kunnen onderzoekers belangrijke vragen in celsignalering onderzoeken.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Celsignalering
- Optogenetica
- Flowcytometrie
Achtergrond
- Optisch bestuurde stoffen zijn waardevol voor het bestuderen van signaalroutes.
- Flowcytometrie maakt de analyse van celpopulaties mogelijk.
- Vorige methoden combineerden deze twee krachtige technieken niet.
- Deze studie introduceert een apparaat dat deze integratie mogelijk maakt.
Doel van de studie
- Om optisch bestuurde stoffen te stimuleren tijdens flowcytometrische metingen.
- Om optogenetische tools te karakteriseren en analyseren met behulp van flowcytometrie.
- Om een nieuwe methode te bieden voor het onderzoeken van celsignalering.
Gebruikte methoden
- Gesuspendeerde getransduceerde Ramos B-lymfocyten in een concentratie van een miljoen cellen per milliliter.
- Cellen overgebracht naar een glazen FACS-buis.
- De zwarte O-ring van de flowcytometer vervangen door een rubberen O-ring.
- Siliconenvet aangebracht om een betere afdichting te garanderen.
Belangrijkste resultaten
- Het apparaat integreert met succes optogenetische stimulatie met flowcytometrie.
- Maakt real-time analyse van celsignaleringsroutes mogelijk.
- Maakt karakterisering van optogenetische tools voor het eerst mogelijk.
- Behandelt een hiaat in bestaande methodologieën voor het bestuderen van celsignalering.
Conclusies
- Dit nieuwe apparaat vertegenwoordigt een belangrijke vooruitgang in de studie van celsignalering.
- Het opent nieuwe wegen voor onderzoek met behulp van optisch bestuurde stoffen.
- Toekomstige studies kunnen deze methode gebruiken om complexe signaalroutes te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Integrating optogenetic control with flow cytometry enables real-time, single-cell resolution analysis of signaling dynamics, addressing a critical gap in mechanistic de-risking for target validation. This approach enhances predictive confidence by allowing quantitative, reproducible assessment of photoswitching kinetics in live cells, supporting early discovery decisions. The low-cost, adaptable design facilitates enterprise reuse across optogenetic tool development pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through real-time photoswitching of optogenetic tools in live cells.
- Operational Value: Provides quantitative fluorescence readouts to clarify pathway dynamics and reduce mechanistic ambiguity.
- Predictive Value: Supports target confidence by characterizing optogenetic tool performance under physiologically relevant conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by establishing reproducible optogenetic control.
- Operational Value: Enables assay standardization through precise light intensity, wavelength, and temperature control during flow cytometric measurements.
- Scalability: Supports high-throughput analysis of thousands of cells per second, facilitating screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase optogenetic characterization to preclinical validation by enabling functional assessment in disease-relevant systems.
- Mechanistic De-risking: Allows exploration of optogenetic tool functionality in complex signaling pathways, reducing late-stage biological risk.
- Predictive Confidence: Generates quantitative kinetic data to inform go/no-go decisions in target advancement.
Pipeline & Workflow Integration
The method positions itself at the intersection of early discovery and lead identification, enabling hypothesis testing and assay readiness for optogenetic tool evaluation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by allowing real-time manipulation and measurement of optically controlled substances in live cells.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized, reproducible photoswitching measurements at single-cell resolution.
- Analytics: Provides quantitative fluorescence intensity readouts and kinetic analysis to compare conditions and assess tool performance.
- Translational Research: Enables preclinical continuity by characterizing optogenetic tools in a flow-compatible, physiologically relevant format.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, low-cost platform adaptable to diverse optogenetic tools and experimental designs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in optogenetic tool function, reduction of mechanistic ambiguity in signaling pathways.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of photoswitching measurements across cell populations.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions, capital efficiency in tool development, and reduced late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of optogenetic candidates based on quantitative kinetic profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optogenetics, flow cytometry, and basic device assembly.
- Needs access to a flow cytometer, LED light sources, and temperature control via water pump.
- Demands cross-team standardization for consistent light delivery, temperature control, and sample handling.
- Involves adaptation considerations for different cell types, optogenetic tools, and wavelength requirements.
- Includes practical limitations such as glass tube fragility and UV light hazards requiring protective measures.
