Name: LED Thermo Flow - De combinatie van optogenetics met flowcytometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 49 s
Description: Leer een nieuwe methode voor optogenetische stimulatie tijdens flowcytometrische metingen. Dit apparaat maakt real-time analyse van cel-signaleringsroutes mogelijk met Ramos B-lymfocyten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken J. Schmidt van de Universiteit van Freiburg voor het bouwen van het apparaat. We danken P. Nielsen en D. Medgyesi voor hun ondersteuning en kritische lezing van dit manuscript. Dit onderzoek werd ondersteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft via SFB746 en door de Excellence Initiative van de German Research Foundation (GSC-4, Spemann Graduate School).

1. Het ontwerpen en bouwen van de Device <ol><li> Pilot Experimenten LET OP: De vereiste lichtsterkte voor een bepaalde optogenetische gereedschap en celtype kunnen aanzienlijk verschillen. Pilot experimenten met prototypes zijn nuttig om de minimale lichtintensiteit nodig te schatten. Optogenetic het instrument voor de volgende experimenten is Dronpa-Linker-Dronpa fusieconstruct. De Dronpa sequentie werd in de handel verkregen (zie lijst van Materials). Een lange linker werd gekloneerd tussen twee Dronpa sequenties om de expressie construct intramoleculaire (en intermoleculaire) dimeren. De hieronder beschreven stappen kunnen worden aangepast aan vele andere optogenetic gereedschappen of optisch gereguleerde stoffen. <ol><li> Transduceren Ramos B-lymfocyten met een Dronpa-Linker-Dronpa construct bevattende de instructies van de fabrikant voor transductie met de retrovirale-bevattende supernatant van verpakkingscellen. Oogst en tellen cellen volgens een voorafviously gepubliceerd protocol 13. </li><li> Resuspendeer cellen bij een concentratie van 1 x 10 6 / ml in medium (RPMI 1640, 10% door warmte geïnactiveerd FCS, 2 mM L-glutamine, 100 U / ml penicilline, 100 U / ml streptomycine, en 50 pM 2-mercaptoethanol) en overbrengen naar een glazen FACS buis. </li><li> Steek de buis in een flowcytometer en het meten van de fluorescentie-intensiteit van Dronpa (GFP kanaal) 14,15. </li><li> Draag beschermende bril voor alle verdere stappen om de ogen te beschermen tegen mogelijk schadelijke golflengten. </li><li> Handmatig op een 500 nm LED aan de buitenzijde van de buis en verder het meten van de fluorescentie-intensiteit van Dronpa. </li><li> Toename van het aantal en / of de intensiteit van de LED-verlichting tot Dronpa fluorescentie-intensiteit afneemt. </li><li> Handmatig op een 400 nm LED aan de buitenzijde van de buis en verder het meten van de fluorescentie-intensiteit van Dronpa. </li><li> Toename van het aantal en / of de intensiteit van de LED-verlichting tot de Dronpa fluocerend intensiteit toeneemt. </li><li> Gebruik minstens evenveel LED bouw van het apparaat zoals voorspeld noodzakelijk te zijn van de photoswitching stapsgewijs 1.1.5 en 1.1.7. </li></ol></li><li> Het bouwen van het apparaat LET OP: Het apparaat is gebouwd door een professionele machinale winkel, de Arbeitsgruppe Technik van de Universiteit van Freiburg. De meeste onderdelen zijn op maat gemaakt en niet in de handel verkrijgbaar. De exacte afmetingen van elk deel zijn weergegeven in figuren 1 en 2. Om de montage van dit apparaat te verduidelijken, Aanvullende Video 1 is aangebracht en de meest essentiële stappen worden hierna beschreven. <ol><li> Molen piece A uit polyvinylchloride (PVC) met de exacte maten figuur 1A. </li><li> Steek LED-verlichting in de gaten van het werk A en verzegelt elk gat met PVC lijm om water lekkage te voorkomen. </li><li> Sluit LEDs naar een multichannel transformator (elke golflengte moet een aparte chann bezettenel) met een verstelbare uitgangsvermogen 0-29 mA. </li><li> Bevestig de buitenmantel (B) met 3 schroeven piece A zoals getoond om de LED&#39;s te beschermen tegen fysieke schade. </li><li> In staat zijn om het apparaat te verbinden met een waterpomp, lijm in de buis clips (C) in de gaten van het stuk A (weergegeven in figuur 1a, doorsnede Y: 9 mm en 61,5 mm) met behulp van PVC lijm. </li><li> Snijd een 58,5 mm lang Plexiglas buis (D1). </li><li> Vervaardiging stukken D2 en D3 van plexiglas zoals weergegeven in figuur 2. </li><li> Lijm stuk D3 naar de bodem van D1 met plexiglas lijm. </li><li> Bevestig een rubberen O-ring stuk D2 en lijm het aan de top van de D1 met plexiglas lijm. LET OP: De stukken D1, D2 en D3 vormen samen stuk D. </li><li> Inzetstuk D in stuk A met 3 schroeven. </li><li> Test de inrichting voor waterlekkage voordat de stroom naar de transformator. </li></ol></li></ol> 2. Het meten van de kinetiek van een optogenetische Tool <ol&gt; <li> Bereid cellen <ol><li> Cultuur Ramos B-cellen in RPMI-medium (RPMI 1640, 10% door warmte geïnactiveerd FCS, 2 mM L-glutamine, 100 U / ml penicilline, 100 U / ml streptomycine, en 50 pM 2-mercaptoethanol) bij een dichtheid van 3- 10 x 10 6 cellen / ml bij 37 ° C en 5% CO2. </li><li> Oogst Ramos B-cellen door centrifugatie bij 350 xg en 4 ° C gedurende 5 minuten. </li><li> Aantal cellen met behulp van een Neubauer telkamer volgens de instructies van de fabrikant en resuspendeer 1-5 x 10 6 cellen in 600 pl medium. </li><li> Overdracht van de cellen om een ​​glazen FACS buis, leg ze op ijs en hen te beschermen tegen licht tot de meting. </li></ol></li><li> Bereid de flowcytometer en het apparaat. <ol><li> Sluit het apparaat aan een verwarmde waterpomp en de temperatuur op 37 ° C. </li><li> Bij het gebruik van glazen FACS buizen, wisselen de zwarte O-ring van de flowcytometer met een rubberen O-ring en bovendien passen silicium grgemak. </li></ol></li><li> maat <ol><li> Steek de glazen FACS buis in het apparaat en sluit deze aan op de flowcytometer (figuur 3). </li><li> Start de meting en noteer Dronpa fluorescentie-intensiteit (GFP kanaal). </li><li> Verlichten de cel monster met 400 nm of 500 nm licht respectievelijk en noteer de Dronpa fluorescentie-intensiteit (GFP kanaal). </li></ol></li><li> Gegevensanalyse <ol><li> Analyseer experimentele gegevens met geschikte software flowcytometer. Plot voorwaartse verstrooiing tegen zijwaartse scatter en de poort van de levende cellen. Zet de Dronpa fluorescentie-intensiteit in de tijd. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Dugue, G. P., Akemann, W., Knopfel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+concept+of+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">A comprehensive concept of optogenetics.</a> Prog Brain Res. 196, 1-28 (2012).</li>
<li>Tischer, D., Weiner, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+cell+signalling+with+optogenetic+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Illuminating cell signalling with optogenetic tools.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (8), 551-558 (2014).</li>
<li>Toettcher, J. E., Voigt, C. A., Weiner, O. D., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+of+optogenetics+in+cell+biology%3A+interrogating+molecular+circuits+in+space+and+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">The promise of optogenetics in cell biology: interrogating molecular circuits in space and time.</a> Nat Methods. 8 (1), 35-38 (2011).</li>
<li>Zhang, K., Cui, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+intracellular+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of intracellular signaling pathways.</a> Trends Biotechnol. 33 (2), 92-100 (2015).</li>
<li>Bugaj, L. J., Choksi, A. T., Mesuda, C. K., Kane, R. S., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+protein+clustering+and+signaling+activation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Optogenetic protein clustering and signaling activation in mammalian cells.</a> Nat Methods. 10 (3), 249-252 (2013).</li>
<li>Bugaj, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+endogenous+transmembrane+receptors+through+optogenetic+Cry2+clustering%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Regulation of endogenous transmembrane receptors through optogenetic Cry2 clustering.</a> Nat Commun. 6, 6898(2015).</li>
<li>Strickland, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TULIPs%3A+tunable%2C+light-controlled+interacting+protein+tags+for+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">TULIPs: tunable, light-controlled interacting protein tags for cell biology.</a> Nat Methods. 9 (4), 379-384 (2012).</li>
<li>Taslimi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+optogenetic+clustering+tool+for+probing+protein+interaction+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">An optimized optogenetic clustering tool for probing protein interaction and function.</a> Nat Commun. 5, 4925(2014).</li>
<li>Toettcher, J. E., Gong, D., Lim, W. A., Weiner, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-based+feedback+for+controlling+intracellular+signaling+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Light-based feedback for controlling intracellular signaling dynamics.</a> Nat Methods. 8 (10), 837-839 (2011).</li>
<li>Toettcher, J. E., Weiner, O. D., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+optogenetics+to+interrogate+the+dynamic+control+of+signal+transmission+by+the+Ras%2FErk+module%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Using optogenetics to interrogate the dynamic control of signal transmission by the Ras/Erk module.</a> Cell. 155 (6), 1422-1434 (2013).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+a+photoactivatable+antigen+system+to+examine+B-cell+probing+termination+and+the+B-cell+receptor+sorting+mechanisms+during+B-cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Utilization of a photoactivatable antigen system to examine B-cell probing termination and the B-cell receptor sorting mechanisms during B-cell activation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (5), E558-E567 (2016).</li>
<li>Wend, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+protein+kinase+activity+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of protein kinase activity in mammalian cells.</a> ACS Synth Biol. 3 (5), 280-285 (2014).</li>
<li>Zhou, X. X., Chung, H. K., Lam, A. J., Lin, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+control+of+protein+activity+by+fluorescent+protein+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical control of protein activity by fluorescent protein domains.</a> Science. 338 (6108), 810-814 (2012).</li>
<li>Baumgarth, N., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+approach+to+multicolor+flow+cytometry+for+immunophenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping.</a> J Immunol Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).</li>
<li>Givan, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry%3A+an+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry: an introduction.</a> Methods Mol Biol. 699, 1-29 (2011).</li>
<li>Brakemann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reversibly+photoswitchable+GFP-like+protein+with+fluorescence+excitation+decoupled+from+switching%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A reversibly photoswitchable GFP-like protein with fluorescence excitation decoupled from switching.</a> Nat Biotechnol. 29 (10), 942-947 (2011).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

De LED Thermo Flow is een innovatief apparaat om optogenetic gereedschappen studeren in een flowcytometer. Tot nu toe hebben optogenetic monsters werden alleen verlicht met microscopie lasers of zaklamp apparaten 11,12. Afhankelijk van de hoek en de afstand van de zaklamp om het monster wordt aanzienlijke verschillen in de hoeveelheid belichting verwacht tussen experimenten. Verder is er een limiet aan het aantal zaklampen een persoon kan werken in een experiment. Dit beperkt de e...

Optogenetische gereedschappen zijn steeds populairder, mede omdat ze kunnen worden gebruikt om de bedrading van signaalwegen 1-4 ontcijferen. Zij zijn gebaseerd op het vermogen van activeerbare eiwitten om hun conformatie en bindingsaffiniteit veranderen wanneer verlicht met licht. Fuseren van deze eiwitten aan signalering elementen zorgt voor de specifieke regeling van een enkele speler binnen complexe intracellulaire signaalroutes 5-12. Bijgevolg kan een signaleringsroute worden bestudeerd met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie. De meeste cellen gebaseerde studies optogenetic gebruik microscopie gebaseerde methoden gecombineerd met kweken in de aanwezigheid van licht, gevolgd door biochemische analyse 11,12. Daarentegen een flowcytometer singularitseert cellen langs een capillaire en meet celgrootte en granulariteit fluorescentie-intensiteiten. Deze werkwijze heeft grote voordelen ten opzichte van microscopische of biochemische werkwijzen, waaronder de mogelijkheid duizend g analyserends van levende cellen bij eencellige resolutie in een zeer korte tijd. Daarom is het wenselijk om optogenetics combineren met flowcytometrie. Voor zover wij weten, is er geen vastgesteld protocol voor optogenetic flowcytometrie. Een algemeen aanvaarde procedure handmatig cellen verlichten van buiten de reactiebuis met flitslicht apparaten. Echter, handmatige belichting in de stroom vereist cytometer het licht door de reactie buis te passeren en, voor live-cell imaging, een cilindrische, verwarmd waterreservoir. Dit veroorzaakt aanzienlijke lichtverstrooiing en lichtverlies. Bovendien, de lichtintensiteit door handmatige belichting niet reproduceerbaar tussen experimenten (hoek, afstand, etc.) en er een praktische grens aan het aantal golflengten in één experiment. Door het construeren van de LED Thermo stromingsinrichting, waren we in staat om deze beperkingen te overwinnen. Met deze inrichting kunnen cellen worden verlicht met specifieke golflengten in een temp-Erature gecontroleerde wijze tijdens flowcytometrische metingen. Dit zorgt voor nauwkeurige en reproduceerbare hoeveelheden licht binnen en tussen experimenten. Om het nut van onze inrichting in vivo te demonstreren, namen we het fluorescentiesignaal van Dronpa in Ramos B-cellen tijdens photoswitching. Ramos B-cellen zijn afgeleid van een menselijk Burkitt-lymfoom. Dronpa een fluorescent eiwit dat bestaat als een monomeer, dimeer of tetrameer. In zijn monomere vorm, niet-fluorescerend. Belichting met 400 nm licht induceert dimerisatie en tetramerisatie en maakt de Dronpa eiwit fluorescent. Dit proces kan door belichting met 500 nm licht. De Dronpa proteïne is gebruikt om de functie en locatie van signaaleiwitten 4,13 beheersen. Hier, uitgedrukt we een Dronpa-Linker-Dronpa eiwit in Ramos B-cellen photoswitching van Dronpa bestuderen in een flowcytometer. Met behulp van onze apparaat, waren we in staat om efficiënt enreproduceerbaar PHOTOSWITCH Dronpa tijdens het opnemen van de fluorescentie-intensiteit in real time. Deze methode biedt aanzienlijke voordelen ten opzichte van de huidige verlichting protocollen met handmatige belichting en aanzienlijk verbreedt de experimentele repertoire voor optogenetic gereedschappen en kooi verbindingen. Met behulp van onze apparaat zal aanzienlijk vereenvoudigen en versnellen van de ontdekking en ontwikkeling van nieuwe optogenetische gereedschappen.

```html
<table><tbody><tr><td>Glass FACS tube</td><td>Thermo Fisher Scientific; Waltham, USA</td><td>14-961-26</td><td>Borosilicate glass tubes 12x75 mm</td></tr><tr><td>Flow Cytometer</td><td>BD Bioscienceg; Heidelberg, Germany</td><td>Fortessa II</td><td>Special Order</td></tr><tr><td>Dronpa: pcDNA3-mNeptune2-N</td><td>Addgene; Cambridge, USA</td><td>41645</td><td></td></tr><tr><td>PolyJet</td><td>SignaGen, Rockville, USA</td><td>SL100688</td><td></td></tr><tr><td>LED 505 nm</td><td>Avago Technologies; Boeblingen, Germany</td><td>HLMP-CE34-Y1CDD</td><td></td></tr><tr><td>LED 400 nm</td><td>Avago Technologies; Boeblingen, Germany</td><td>UV5TZ-400-15</td><td></td></tr><tr><td>Plexiglas tube 15 mm</td><td>Maertin; Freiburg, Germany</td><td>76999</td><td></td></tr><tr><td>Plexiglas 3 mm</td><td>Maertin; Freiburg, Germany</td><td>692230</td><td></td></tr><tr><td>Plexiglas 2.5 mm</td><td>Maertin; Freiburg, Germany</td><td>692225</td><td></td></tr><tr><td>Plexiglas 1.5 mm</td><td>Maertin; Freiburg, Germany</td><td>692215</td><td></td></tr><tr><td>PVC tile 5 mm</td><td>Maertin; Freiburg, Germany</td><td>690020.005</td><td></td></tr><tr><td>PVC tile 6 mm</td><td>Maertin; Freiburg, Germany</td><td>690020.006</td><td></td></tr><tr><td>PVC block 50 mm</td><td>Maertin; Freiburg, Germany</td><td>690020.050</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Germany</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>EMD; Germany</td><td>805740</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>PAN Biotech; Aidenbach, Germany</td><td>P30-3302</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Strptomycin (10,000 U/mL)</td><td>Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Germany</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Acrifix plexiglas glue</td><td>Evonic industries, Essen, Germany</td><td>1R0192</td><td></td></tr><tr><td>Tangit PVC-U glue</td><td>Henkel, Düsseldorf, Germany</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>
```

led thermo flow - de combinatie van optogenetics met flowcytometrie

LED Thermo Flow &#8212; Combining Optogenetics with Flow Cytometry

Optogenetische hulpmiddelen maken geïsoleerde, functionele onderzoeken mogelijk van bijna elke signaalmolecuul binnen complexe signaalroutes. Een groot obstakel is de gecontroleerde aflevering van licht aan de celmonster en daarom zijn de meest populaire hulpmiddelen voor optogenetische studies microscoopgebaseerde celanalyses en in vitro experimenten. De flowcytometer heeft grote voordelen ten opzichte van een microscoop, inclusief de mogelijkheid om snel duizenden cellen met enkele celresolutie te meten. Toch wordt het nog niet veel gebruikt in de optogenetica. Hier presenteren we een apparaat dat de kracht van optogenetica en flowcytometrie combineert: de LED Thermo Flow. Dit apparaat verlicht cellen op specifieke golflengten, lichtintensiteiten en temperaturen tijdens flowcytometrische metingen. Het kan worden gebouwd tegen lage kosten en kan worden gebruikt met de meeste gangbare flowcytometers. Om de bruikbaarheid te demonstreren, hebben we de fotoswitching-kinetica van Dronpa-eiwitten in vivo en in realtime gekenmerkt. Dit protocol kan worden aangepast aan bijna alle optisch gecontroleerde stoffen en breidt de set mogelijke experimenten aanzienlijk uit. Wat nog belangrijker is, het zal de ontdekking en ontwikkeling van nieuwe optogenetische hulpmiddelen aanzienlijk vereenvoudigen.

Met behulp van de LED Thermo Flow met een flowcytometer De functionele kern van de inrichting een cilindrische kamer waarin LED-lampen zijn in een cirkelvormig naar binnen gerichte wijze. Deze kamer kan worden verbonden met een watertoevoer en de pomp, die het mogelijk maakt de temperatuur van de LED&#39;s, evenals het celmonster. De LED&#39;s zijn aangesloten op een transformator en derhalve de lichtsterkte van elke golflengte ...

Optisch bestuurde stoffen zijn krachtige hulpmiddelen om signaalroutes te bestuderen. Om het spectrum van mogelijke experimenten uit te breiden, hebben we een apparaat ontwikkeld voor het bestuderen van optisch bestuurde stoffen in realtime met behulp van flowcytometrie: de LED Thermo Flow.

LED Thermo Flow - De combinatie van optogenetics met flowcytometrie

Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the ...

Het algemene doel van deze methode is om optisch bestuurde stoffen te stimuleren tijdens flow cytometrische metingen. Dit nieuwe apparaat kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van celsignalering door de kracht van optisch bestuurde stoffen te combineren met flowcytometrie. Voor het eerst kunnen optogenetische tools worden gekarakteriseerd en geanalyseerd met behulp van flowcytometrie.Er bestond tot nu toe geen vergelijkbare gevestigde methode. Om te beginnen, suspendeer getransduceerde Ramos B-lymfocyten bij een concentratie van één miljoen cellen per milliliter en breng ze over naar een glazen FACS-buis. Vervolgens vervang de zwarte O-ring van de flowcytometer door een rubberen O-ring en breng siliconenvet aan om een betere afdichting te creëren.Plaats de glazen buis in een flowcytometer en plaats de LED-prototype rond de buis met de lichten uitgeschakeld. Meet de fluorescentie-intensiteit van Dronpa in het GFP-kanaal. De meest cruciale stap van de procedure is het hanteren van de glazen buizen.Glazen FACS-buizen zijn erg kwetsbaar en daarom wordt het aanbevolen om de plaatsing van de glazen buizen in de cytometer te oefenen voordat u experimenten uitvoert. Schakel vervolgens het 500 nanometer LED-licht aan de buitenkant van de buis in en blijf de fluorescentie-intensiteit van Dronpa meten. Verhoog de intensiteit van de LED-verlichting totdat de fluorescentie-intensiteit van Dronpa afneemt, om de minimale lichstintensiteit te schatten die nodig is om de fotoswitching van het Dronpa-Linker-Dronpa-eiwit te meten.Schakel vervolgens het 400 nanometer LED-licht van de prototype aan de buitenkant van de buis in en blijf de fluorescentie-intensiteit van Dronpa meten. Verhoog de lichtintensiteit van de 400 nanometer LED-verlichting totdat de fluorescentie-intensiteit van Dronpa toeneemt. Begin met het volgen van de ontwerp- en fabricage-instructies in het bijbehorende tekstprotocol om de binnen- en buitenlagen van het fotoswitching LED-apparaat te fabriceren.Plaats de 400 en 500 nanometer golflengte LED's in de kanalen van het apparaat. Lijm ze op hun plaats en bedrade ze zoals aangegeven. Deze specifieke golflengten zullen worden gebruikt om de Dronpa-Linker-Dronpa-fusie-eiwitten tussen hun donkere en heldere toestand te schakelen.Monteer vervolgens het apparaat en zorg ervoor dat het waterdicht is om lekkage te voorkomen voordat u de transformator aansluit. Na de montage van het apparaat, oogst Ramos B-lymfocyten en suspendeer ze in een dichtheid van drie tot tien miljoen cellen per milliliter. Breng 600 microliter van de cellen over naar een glazen FACS-buis.Plaats ze op ijs en bescherm de cellen tegen licht totdat ze worden gemeten. Verbind het gemonteerde apparaat met een verwarmde waterpomp en pas de temperatuur aan op 37 graden Celsius. Plaats vervolgens voorzichtig de glazen FACS-buis in het apparaat en verbind deze met de flowcytometer.Meet de Dronpa-fluorescentie-intensiteit in het GFP-kanaal. Het ontwerp van dit optogenetische apparaat bevat een kamer die kan worden aangesloten op een circylerende watervoorziening om de temperatuur van het monster op een constante waarde te houden. Terwijl het apparaat drie verschillende golflengten uitzendt, was er slechts een marginale temperatuurstijging te zien in het FACS-monster, wanneer er water van 37 graden Celsius door het apparaat stroomde.De Dronpa-Linker-Dronpa-fusieconstructie werd gekloond en getransduceerd in Ramos B-cellen. Wanneer het in de monomere toestand wordt geleid door een 500 nanometer lichtbron, neemt de emissie-intensiteit af. Wanneer de lichtbron vervolgens wordt omgeschakeld naar het 400 nanometer licht, wordt het Dronpa-monomeer snel omgezet in de dimere toestand en neemt de intensiteit snel toe.Met behulp van dit apparaat kon het cytosolische Dronpa-Linker-Dronpa-fusie-eiwit meerdere keren worden gefotoschakeld. Schakelen naar de donkere toestand gebeurt langzaam, terwijl het schakelen naar de heldere toestand bijna onmiddellijk gebeurt. De spontane fluorescentie-herstel van Dronpa in het donker laat zien dat efficiënte fotoswitching naar de heldere vorm specifieke verlichting vereist en alleen langzaam spontaan optreedt.De kinetiekanalyse toont aan dat de fotoswitchingsnelheid over het algemeen zeer reproduceerbaar is en dat zelfs na een lange incubatie in het donker, slechts ongeveer tien procent van de fluorescentie wordt hersteld zonder fotoswitching. Na deze procedure kan elke flow cytometrische analyse, inclusief calciumfluxmetingen, worden uitgevoerd om de functionaliteit van uw gekozen optogenetische tool te onderzoeken. Na de ontwikkeling van deze techniek zal het de weg vrijmaken voor onderzoekers op het gebied van optogenetica om de bekabeling van celsignaleringsroutes te onderzoeken.Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een fotoswitching-protocol voor uw specifieke optogenetische tool kunt opzetten. Vergeet niet dat UV-licht extreem gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen, zoals beschermende brillen, altijd moeten worden gedragen tijdens het uitvoeren van deze procedure.

led-thermo-flow-combining-optogenetics-with-flow-cytometry

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

This video demonstrates a flow cytometry assay to quantify the ROS levels in 3D intestinal organoids obtained from GFP-expressing transgenic mice. This method provides an in vitro experimental model to investigate the efficacy of test compounds on ROS production.

Flow Cytometry Assay to Quantify Oxidative Stress: An Assay to Quantify Reactive Oxygen Species in Intestinal Organoids Using Fluorogenic Probes

This video demonstrates flow cytometry for measuring microglial uptake of fluorescent bioparticles after intravitreal delivery in a mouse eye. Flow cytometry detects live cells expressing CD11b and distinguishes phagocytic microglia cells exhibiting green fluorescence from other myeloid cells, including Ly6C-expressing monocytes and Ly6G-expressing neutrophils.

Measuring Microglial Uptake of Intravitreally-Delivered Fluorescent Particles Using Flow Cytometry

The video demonstrates a fluorescence resonance energy transfer (FRET) flow cytometry assay to detect the seeding activity of protein aggregates isolated from biological samples. Mammalian cells expressing tau reporter proteins are incubated with liposome transduction complexes containing tau seeds. These seeds mediate the aggregation of the reporter proteins, leading to generating a FRET positive signal in the flow cytometer.

A FRET Flow Cytometry Technique to Detect Tau-Seed Induced Reporter Protein Aggregation

Flowcytometrische analyse van Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie biedt een hoge doorvoer kwantitatieve methode om eiwit-eiwit interacties te bestuderen. Deze methodologie kan worden toegepast op mapping eiwitbindingsplaatsen en screenen factoren die eiwit-eiwit interactie te bepalen.

Flowcytometrische analyse van Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie: Een High Throughput kwantitatieve methode om eiwit-eiwit interactie Studie

We methode om het effect van PSMs en andere toxines uitgescheiden door...

Studeren Interacties van<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Met Neutrofielen door flowcytometrie en Time Lapse Microscopie

Terwijl infiltrerende macrofagen continu worden aangeworven op volwassen weefsels uit circulerende precursoren, zitten inwendige macrofagen hun weefsel tijdens ontwikkeling, waar ze worden gehandhaafd zonder verdere input van stamvaders. De voorlopers voor ingezette macrofagen werden recent geïdentificeerd. Hier presenteren wij methoden voor de genetische lotvorming van de ingezeten makrofage stamvaders.

Identificatie van Erythromyeloid Progenitors En Hun Nakomelingen In De Muis Embryo Door Flow Cytometry

Dit protocol beschrijft de implementatie van een asymmetrische detectie tijdstens optisch microscopiesysteem voor single-cell imaging in ultrafast microfluidische stroom en zijn toepassingen in beeldstroomcytometrie.

Microfluïdische Imaging Flow Cytometry door Asymmetrische Deteksie Time-stretch Optische Microscopie (ATOM)

Hier presenteren we een protocol te analyseren van cel naar cel overdracht van oscillerende informatie door optogenetic control en live monitoring van genexpressie. Deze aanpak biedt een uniek platform om te testen een functionele betekenis van dynamische gen expressie programma's in meercellige systemen.

Een Optogenetic methode te controleren en analyseren van gen expressiepatronen in cel-naar-cel interacties

Hier presenteren we een op flowcytometrie gebaseerde methode voor visualisatie en kwantificering van meerdere senescentie-geassocieerde markers in enkele cellen.

Gelijktijdige beeldvorming en flowcytometrie-gebaseerde detectie van meerdere fluorescerende senescentiemarkers in therapie-geïnduceerde senescente kankercellen

Visuele, single-molecule biochemie bestudeerd door microfluïdische kamers wordt aanzienlijk vergemakkelijkt met behulp van glazen vaten, gasdichte spuiten, stabiele verbindingen van slangen met stroomcellen en eliminatie van bellen door schakelkleppen tussen de spuiten en slangen te plaatsen. Het protocol beschrijft dubbele optische vallen die visualisatie van DNA-transacties en intermoleculaire interacties mogelijk maken.

Gebruik van dual optische pincet en microfluïdica voor single-molecule studies

Deze studie beschrijft een methode voor experimenten met hoge doorvoer met behulp van een 3D-geprinte LED-array om licht-induceerbare genexpressie in HEK293T cellen te optimaliseren.

Snelle optimalisatie van een licht-induceerbaar systeem om de genexpressie van zoogdieren te beheersen

Leer een nieuwe methode voor optogenetische stimulatie tijdens flowcytometrische metingen. Dit apparaat maakt real-time analyse van cel-signaleringsroutes mogelijk met Ramos B-lymfocyten.

LED Thermo Flow - De combinatie van optogenetics met flowcytometrie

Meer video's verkennen