Name: Visualisatie van IL-22-uiting van lymfocyten Met behulp van Reporter Muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Leer hoe u IL-22-producerende immuuncellen visualiseert met een transgen reporter muismodel. Deze methode maakt in vivo tracking van cytokine-expressie mogelijk in weefsels zoals de darm.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We bedanken Kelli Czarra en Megan Karwan voor technische hulp met dieren, Kathleen Noer en Roberta Matthai voor hulp bij flowcytometrie, en Donna Butcher en Miriam R. Anver voor pathologieanalyse. Dit project werd ondersteund door een subsidie van de Ely and Edythe Broad Foundation (aan Scott Durum) en is geheel of gedeeltelijk gefinancierd met federale fondsen van het National Cancer Institute, National Institutes of Health, onder contractnummer HHSN261200800001E (MRA).

Alle dieren kregen de juiste zorg in overeenstemming met de in de Guide 2011 voor de zorg en het gebruik van het Laboratorium Comité Dieren van Frederick National Laboratory for Cancer Research experimentele procedures. 1. Generatie van IL-22-tdTomato Reporter muizen door BAC recombineering OPMERKING: De muizen moeten onbewust en niet bewegen in reactie op een schadelijke prikkel. Steriliseer de chirurgische gebied met 70% ethanol en steriliseer alle chirurgische instrumenten met een glazen kraal sterilisator. <ol><li> Zuiver BAC DNA (RP23-401E11, lengte kloon 228.391 bps) met een alkalische extractiewerkwijze 10, 11. Kenmerkend zijn voor de BAC-kloon door Spel vertering van 5 ug van RP23-401E11 om de juiste omvang van de target-gen te bevestigen. LET OP: De BAC DNA werd verteerd in 14 fragmenten. </li><li> Plaats de TdTomato reportergen in de NotI / SalI-plaats van de PLD53SC-A-GFP-B shuttlevector11 en vervang het GFP-gen in dezelfde plaats. Dan, met BAC RP23-401E11 als een matrijs, versterken de homologie boxen (A en B) aan de eerste vertaalde exon van IL-22 (exon 1) door PCR (95 ° C 2 min, 30 cycli van 95 ° C gedurende 30 sec, 55 ° C gedurende 30 sec en 72 ° C gedurende 30 sec, en een laatste verlenging bij 72 ° C gedurende 10 min). In een 50 gl PCR reactiesysteem, voeg 50 ng (1 ul) van BAC DNA, 0,5 pl van primers (10 pM), 40 pl PCR Supermix high fidelity en 8 pi H2O OPMERKING: De primers voor de A- en B-boxen zijn: Een doos Forward: 5&#39;-T GGCGCGCC GGAGCTGTGAAGAAAG en omgekeerde: 5&#39;- CAGAGATCGCACAAGTGTCAAC; B box Forward: 5&#39;-G TTAATTAA CTGCCCGTCAACA en Reverse: 5&#39;-T GGCCGGCC TGAGCACCTGCTT CATC 10. Het plaatsen van de restrictie-enzymen (Asc I en Pac I) zijn onderstreept. </li><li> Ligeren 500 ng Ascl-digestie A en 500 ng PacI gedigereerd B Fragments in 50 ng PLD53SC-ATB (tdTomato) vector bij 16 ° C gedurende 1 uur. </li><li> Transformeer de gezuiverde PLD53SC ATB-vector in BAC-competente cellen 11 en kweken ervan op Luria-Bertani (LB) agarplaten met chlooramfenicol (20 ug / ml) en ampicilline (30 ug / ml) bij 37 ° C. Pick 2-3 kolonies van co-integratie van de Ch / Amp meester-platen. </li><li> Inoculeer elke kolonie in 1 ml LB aangevuld met 20 ug / ml chlooramfenicol en incubeer ze gedurende 1 uur bij 37 ° C en 225 rpm. Spread 100 ul van elk mengsel op een LB-agarplaat (10 g pepton 140, 5 g gistextract, 12 g agar en 1 L water, pH 7,5) aangevuld met chlooramfenicol en 4-4,5% sucrose. Incubeer de kweek gedurende de nacht bij 37 ° C. </li><li> Pick zowel grote als kleine kolonies en replate ze op twee LB-agar platen met chlooramfenicol. Vervolgens blootstellen de platen al dan niet met UV licht gedurende 30 seconden en kies de UV-gevoelige kolonies voor verdere analyse. </li><li> Identificeer de gewijzigde BAC DNA door PCR met behulp van tdTomato / IL-22 heterozygote primer (Forward: 5 &#39;ACT TGT GCG ATC TCT Gat GGT; Keerzijde: 5&#39; AAT TGT CGG BGA TGT CGG C). De thermocycler omstandigheden zijn: 95 ° C gedurende 2 min; 30 cycli van 95 ° C gedurende 30 sec, 56 ° C gedurende 30 sec en 72 ° C gedurende 30 seconden; en een laatste verlenging bij 72 ° C gedurende 10 minuten. </li><li> Bevestigt de sequentie van het gemodificeerde gebied van de BAC BAC door directe sequentiebepaling van grote prep BAC DNA 12. </li><li> Verdoven een ontvanger muis met een dosering van 0,25% tribroomethanol in de peritoneale holte bij het implanteren van de micro-injectie zygoten in pseudo-zwangere C57BL / 6c muizen. </li><li> Lineariseren de IL-22-tdTomato BAC construct (10 ug) door digestie met 5 ui restrictie endonucleasePi-Sce I in 100 gl van het reactiesysteem en microinject gelineariseerde BAC DNA in bevruchte eieren van C57BL / 6 vrouwtjes bij de pronucleaire stadium 13. screen de transgene muizen door Southern blot analyse van DNA geïsoleerd uit staartpuncties volgens standaardprocedures. </li></ol> 2. Single-cell Bereiden uit milt, thymus, lymfeklieren en Patch Peyer&#39;s LET OP: IL-22-tdTomato reporter muizen werden bij het National Cancer Institute (NCI, Frederick, MD) gehandhaafd. De euthanasie methode voldoet aan de meest recente AVMA richtsnoeren inzake euthanasie. Alle muizen werden gedood met behulp CO 2 inhalatie 14. <ol><li> Euthanaseren een IL-22-tdTomato muis in een CO 2 kamer en zet het op een schone pad. Steriliseer de buik huid door het sproeien van 70% alcohol en snijd hem open. Verwijder de milt in de linker flank en de thymus achter het borstbeen. </li><li> Om de mesentericlymph knooppunten (gelegen in het mesenteriale weefsel) en patches Peyer&#39;s (small lymphoidnodules de hele ileum gebied van de dunne darm) oogsten, neem de parelwitte mesenteriale knooppunten dicht bij tHij wand van de dunne darm met behulp ontleden pincet met fijne punt getande tips eerst en verwijder vervolgens de hele dunne darm en dikke darm uit het lichaam. Vind de verlengde ovalen vlekken (plaques van Peyer) langs de darm en snijd ze met een schaar. Stamp deze lymfoïde weefsels (lymfeklieren en plaques van Peyer) individueel tussen twee matte glijdt in een enkele-celsuspensie in PBS / 1% foetaal runderserum (FBS) buffer op ijs. </li><li> Gehakt de milt of thymus weefsels met dezelfde werkwijze als in stap 2,2. Centrifugeer de milt suspensie gedurende 8 min bij 500 xg en 4 ° C. Voeg 1 ml ACK lysisbuffer per milt de celpellets. </li><li> Meng goed en laat ze staan ​​voor 1 min. Voeg 9 ml steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) buffer aan elk monster. Spin door centrifugatie gedurende 8 minuten bij 500 xg en 4 ° C om de rode bloedcellen te verwijderen. OPMERKING: ACK lyserende buffer niet toe te voegen aan de thymus cellen. </li><li> Resuspendeer de resulterende leukocyten in 5 ml PBS en pass de cellen door een 100 um zeef cel. Verzamel de celpellets door centrifugatie bij 500 xg gedurende 8 minuten. </li><li> Resuspendeer de cellen in 5 ml RPMI media of FACS buffer en tel de levensvatbare cellen met behulp van 0,4% trypan blauwe kleurstof / PBS oplossing. </li></ol> 3. Isolatie van intra-epitheliale lymfocyten en Lamina Propria Cellen uit de darmen <ol><li> Open de buikhuid als in stap 2,1, snijd de dunne darm van duodenum (naast de maag) te ileum (nabij de appendix), en de hele dikke darm, recht boven de anus. Verwijder de extra vet- en mesenteriale weefsel met behulp van een tang. Zet de darmen onmiddellijk in ijskoude PBS. </li><li> Zoeken plaques van Peyer (kleine ruwe knobbeltjes) langs het distale gebied van de dunne darm. Verwijder de massa behulp van een tang andopen de darm lengte met een schaar. Spoel de darm met 10 ml ijskoude PBS. </li><li> Incubeer de weefsels in 20 ml pre-digestie buffer (5 mM EDTAen 1 mM dithiothreitol in Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)) gedurende 30 min bij 37 ° C onder langzame rotatie (50 tpm) in een shaker. Na elk van 2 incubatie, verwijder de epitheliale cellaag, die het intra-epitheliale lymfocyten (IELs), door de intense vortex (30 sec bij 12.000 rpm) en passeren alle weefsels door een 100 um cel zeef. </li><li> Voeg 20 ml EDTA nieuwe oplossing voor het weefsel voor de tweede incubatie gedurende 30 minuten bij 37 ° C. Passeer de IEL fracties door een 100 um cel zeef en bundelen ze met de vorige fracties. Houd de overblijvende darm fragmenten op ijs in stap 3,9 te behandelen. </li><li> Centrifugeer de samengevoegde fracties IEL bij 800 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Was de samengevoegde IEL fracties met 10 ml HBSS / 5% FBS en draaien ze neer gedurende 5 min bij 800 xg en 4 ° C. </li><li> Resuspendeer de cellen in 8 ml 44% colloïdaal silica drager 15 en die met 5 ml van 67% colloïdaal silica medium. Centrifugeer de 44% / 670,5% celmengsel gradiënt gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur en 1500 x g. </li><li> Verzamel de IEL cellen van de band op het grensvlak. Verwijder eerst de bovenste laag van het supernatant (ongeveer 5 ml) onder toepassing van 1 ml pipet. Dan, oogst IELs op het grensvlak van de colloïdale silica medium verloop. </li><li> Was de IELs door toevoeging van 10 ml van RPMI medium. Draai de cellen af ​​gedurende 5 min bij 800 xg en 4 ° C. Resuspendeer de IELs in 5 ml RPMI voor stap 3.15. </li><li> Voor de isolatie van de lamina propria lymfocyten (LPLs), gehakt het darmweefsel fragmenten uit stap 3.4 in kleine stukjes met een schaar (1 mm) en verteren de stukken met 10 ml digestiebuffer (0,05 g collagenase, 0,05 g DNaseI, en 0,3 g dispase II in RPMI / 5% FBS) gedurende 15-20 min bij 37 ° C. </li><li> Filtreer het mengsel door een 70 um cel zeef. Het doorstroomkanaal supernatant bevat het LPL vrijgegeven. </li><li> Volledig verteren de darm fragmenten door herhalen van de stappen 3,9-3,10 (normaal, moeten ze3 keer herhaald). Elke keer, zwembad de supernatanten die de LPLs. </li><li> Verzamel de cellen door centrifugatie gedurende 5 minuten bij 1500 xg en kamertemperatuur en resuspendeer de pellets in RPMI / 5% FBS. Geef ze door een 40 um cel zeef. </li><li> Resuspendeer de celpellets in 10 ml van de 40% fractie van een 40:80 colloïdale silica middelmatige niveauverschillen en deze wordt vervolgens op 5 ml van de fractie 80% in een 15 ml buis. </li><li> Voer de dichtheidsgradiënt scheiding door centrifugatie gedurende 20 minuten bij 1500 xg en 15 kamertemperatuur. </li><li> Verzamel de LPLs, zoals beschreven in stap 3.7. Was ze eenmaal met 10 ml PBS en resuspendeer de pellets in 1 ml PBS / 1% FBS buffer of RPMI medium. </li><li> Tel het aantal levensvatbare cellen (zowel IELs en LPLs) met behulp van 0,4% trypan blauwe kleurstof / PBS-oplossing. </li></ol> 4. Expressie van IL-22-tdTomato in Colitis <ol><li> Bereid één miltcelsuspensies van IL-22-TdTomato muizen bij een concentratie van 1 x 10 &lt;sup&gt; 7 cellen / ml in steriel PBS, zoals beschreven in stap 2,1-2,4. </li><li> Zuiver het CD4 + T-cellen met de muis CD4 Cell Negative Isolation methode 10. Labelen met anti-CD4-APC (kloon RM4-5, 0,5 gl / 1 x 10 6 cellen in PBS / 1% FBS buffer) en anti-CD45RB-FITC (kloon 16A, 0,5 gl / 1 x 10 6 cellen in PBS / 1% FBS buffer) door incubatie bij 4 ° C gedurende 30 minuten. </li><li> Draai de cellen af ​​gedurende 5 min bij 500 xg en 4 ° C. Was de cellen met 2 ml PBS / 1% FBS buffer en resuspendeer ze in 1 ml PBS / 1% FBS vlekken buffer. </li><li> Voer het gelabelde T-cellen op een flowcytometrie machine 16. Poort de cellen op een T-celpopulatie en sorteer CD4 + CD45RB high dubbel-positieve cellen (het gedetecteerd bij 488 nm en 633 nm lasers golflengte). </li><li> Oogst de gesorteerde cellen door centrifugatie gedurende 5 minuten bij 500 xg en 4 ° C. Resuspendeer de celpellets in steriele PBS buffer met 1 x 10 6 </sup&gt; cellen / ml. Injecteer de cellen (0,5 x 10 6) in het peritoneum ofeach RAG1 - / - ontvanger muis. </li><li> Offer de ontvangende muizen onder CO 2 op verschillende tijdstippen. Oogst de mesenterische lymfeklieren en de dunne en dikke darm, zoals beschreven in stappen 2,1 en 2,2. Zet elke mesenterische lymfeklieren en snijd open darm (papier / darm / paper sandwich) in 4% paraformaldehyde (PFA, behandelen onder een zuurkast) &#39;s nachts naar de weefsels te repareren. Vervang de PFA met 18% sucrose voor 16-24 uur en dan bevriezen de weefsels voor het snijden. </li><li> Gebruik de cryostaat machine om het weefsel 17, 18, 19 gesneden. Verwarm de weefselcoupes tot kamertemperatuur gedurende ongeveer 60 minuten en plaats ze in aceton gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Droog bij kamertemperatuur gedurende ongeveer 5 minuten. </li><li> Voeg FBS in overmaat, verwijderen met een pipet en voeg anti-RFP bij een 1: 200 verdunning in 0,1% BSA / 1x PBS. Incubeer het antilichaam bij 37 ° C gedurende 60 minuten. </li><li> Spoel de secties in 1x PBS gedurende 10 min en de overeenkomstige secundaire antilichaam (geit anti-konijn 568) van toepassing op het weefsel, verdund 1: 300 in 1% BSA / 1x PBS, gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Spoel de dia&#39;s in 1x PBS gedurende 10 minuten, veeg ze droog en dekglaasjes toe te voegen. </li><li> Visualiseer alle monsters met een fluorescentiemicroscoop onder consistente verlichting (RFP: excitatie filter 540-580 nm) met behulp van de 40x objectief. </li></ol>

<ol><li>Awasthi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+IL-23+receptor+gfp+reporter+mice+reveal+distinct+populations+of+IL-17-producing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: IL-23 receptor gfp reporter mice reveal distinct populations of IL-17-producing cells.</a> J Immunol. 182, 5904-5908 (2009).</li>
<li>Price, A. E., Reinhardt, R. L., Liang, H. E., Locksley, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marking+and+quantifying+IL-17A-producing+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Marking and quantifying IL-17A-producing cells in vivo.</a> PLoS One. 7, e39750(2012).</li>
<li>Kamanaka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+interleukin-10+in+intestinal+lymphocytes+detected+by+an+interleukin-10+reporter+knockin+tiger+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Expression of interleukin-10 in intestinal lymphocytes detected by an interleukin-10 reporter knockin tiger mouse.</a> Immunity. 25, 941-952 (2006).</li>
<li>Sonnenberg, G. F., Fouser, L. A., Artis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Border+patrol%3A+regulation+of+immunity%2C+inflammation+and+tissue+homeostasis+at+barrier+surfaces+by+IL-22%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Border patrol: regulation of immunity, inflammation and tissue homeostasis at barrier surfaces by IL-22.</a> Nat Immunol. 12, 383-390 (2011).</li>
<li>Dumoutier, L., Louahed, J., Renauld, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+characterization+of+IL-10-related+T+cell-derived+inducible+factor+%28IL-TIF%29%2C+a+novel+cytokine+structurally+related+to+IL-10+and+inducible+by+IL-9%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cloning and characterization of IL-10-related T cell-derived inducible factor (IL-TIF), a novel cytokine structurally related to IL-10 and inducible by IL-9.</a> J Immunol. 164, 1814-1819 (2000).</li>
<li>Cella, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+natural+killer+cell+subset+provides+an+innate+source+of+IL-22+for+mucosal+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A human natural killer cell subset provides an innate source of IL-22 for mucosal immunity.</a> Nature. 457, 722-725 (2009).</li>
<li>Sanos, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RORgammat+and+commensal+microflora+are+required+for+the+differentiation+of+mucosal+interleukin+22-producing+NKp46%2B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">RORgammat and commensal microflora are required for the differentiation of mucosal interleukin 22-producing NKp46+ cells.</a> Nat Immunol. 10, 83-91 (2009).</li>
<li>Spits, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+lymphoid+cells--a+proposal+for+uniform+nomenclature%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Innate lymphoid cells--a proposal for uniform nomenclature.</a> Nat Rev Immunol. 13, 145-149 (2013).</li>
<li>Mazzucchelli, R. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+identification+of+IL-7+producing+cells+in+reporter+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Visualization and identification of IL-7 producing cells in reporter mice.</a> PLoS One. 4, e7637(2009).</li>
<li>Shen, W., Hixon, J. A., McLean, M. H., Li, W. Q., Durum, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-22-Expressing+Murine+Lymphocytes+Display+Plasticity+and+Pathogenicity+in+Reporter+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-22-Expressing Murine Lymphocytes Display Plasticity and Pathogenicity in Reporter Mice.</a> Front Immunol. 6, 662(2015).</li>
<li>Gong, S., Yang, X. W., Li, C., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+modification+of+bacterial+artificial+chromosomes+%28BACs%29+using+novel+shuttle+vectors+containing+the+R6Kgamma+origin+of+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Highly efficient modification of bacterial artificial chromosomes (BACs) using novel shuttle vectors containing the R6Kgamma origin of replication.</a> Genome Res. 12, 1992-1998 (2002).</li>
<li>Shen, W., Huang, Y., Tang, Y., Liu, D. P., Liang, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+method+to+modify+BACs+to+generate+large+recombinant+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A general method to modify BACs to generate large recombinant DNA fragments.</a> Mol Biotechnol. 31, 181-186 (2005).</li>
<li>Cho, A., Haruyama, N., Kulkarni, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol.+Chapter%22%5BJournal%5D)">Generation of transgenic mice.</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter. Chapter 19, Unit 19 11(2009).</li>
<li>Danneman, P. J., Stein, S., Walshaw, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humane+and+practical+implications+of+using+carbon+dioxide+mixed+with+oxygen+for+anesthesia+or+euthanasia+of+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">Humane and practical implications of using carbon dioxide mixed with oxygen for anesthesia or euthanasia of rats.</a> Lab Anim Sci. 47, 376-385 (1997).</li>
<li>Omata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+coccidian+enteroepithelial+stages+of+Toxoplasma+gondii+from+the+intestinal+mucosa+of+cats+by+Percoll+density-gradient+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation of coccidian enteroepithelial stages of Toxoplasma gondii from the intestinal mucosa of cats by Percoll density-gradient centrifugation.</a> Parasitol Res. 83, 574-577 (1997).</li>
<li>Kumar, N., Borth, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-cytometry+and+cell+sorting%3A+an+efficient+approach+to+investigate+productivity+and+cell+physiology+in+mammalian+cell+factories%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Flow-cytometry and cell sorting: an efficient approach to investigate productivity and cell physiology in mammalian cell factories.</a> Methods. 56, 366-374 (2012).</li>
<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryosectioning+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Cryosectioning tissues.</a> CSH Protoc. 2008, pdb.prot4991(2008).</li>
<li>Hilbe, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+automated+cellular+imaging+system+and+manual+microscopy+for+immunohistochemically+stained+cryostat+sections+of+lung+cancer+specimens+applying+p53%2C+ki-67+and+p120%5BTitle%5D)+AND+%22Oncol+Rep%22%5BJournal%5D)">Comparison of automated cellular imaging system and manual microscopy for immunohistochemically stained cryostat sections of lung cancer specimens applying p53, ki-67 and p120.</a> Oncol Rep. 10, 15-20 (2003).</li>
<li>Suzuki, Y., Furukawa, M., Abe, J., Kashiwagi, M., Hirose, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+porcine+trappin-2+%28SKALP%2Felafin%29+in+trachea+and+large+intestine+by+in+situ+hybridization+and+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Localization of porcine trappin-2 (SKALP/elafin) in trachea and large intestine by in situ hybridization and immunohistochemistry.</a> Histochem Cell Biol. 114, 15-20 (2000).</li>
<li>Wolk, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-22+increases+the+innate+immunity+of+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">IL-22 increases the innate immunity of tissues.</a> Immunity. 21, 241-254 (2004).</li>
<li>Brand, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-22+is+increased+in+active+Crohn%27s+disease+and+promotes+proinflammatory+gene+expression+and+intestinal+epithelial+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">IL-22 is increased in active Crohn's disease and promotes proinflammatory gene expression and intestinal epithelial cell migration.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 290, G827-G838 (2006).</li>
<li>Nagalakshmi, M. L., Rascle, A., Zurawski, S., Menon, S., Waal Malefyt, de, R, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-22+activates+STAT3+and+induces+IL-10+by+colon+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunopharmacol%22%5BJournal%5D)">Interleukin-22 activates STAT3 and induces IL-10 by colon epithelial cells.</a> Int Immunopharmacol. 4, 679-691 (2004).</li>
<li>Maloy, K. J., Powrie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+homeostasis+and+its+breakdown+in+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intestinal homeostasis and its breakdown in inflammatory bowel disease.</a> Nature. 474, 298-306 (2011).</li>
<li>Andoh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-22%2C+a+member+of+the+IL-10+subfamily%2C+induces+inflammatory+responses+in+colonic+subepithelial+myofibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Interleukin-22, a member of the IL-10 subfamily, induces inflammatory responses in colonic subepithelial myofibroblasts.</a> Gastroenterology. 129, 969-984 (2005).</li>
<li>Bhan, A. K., Mizoguchi, E., Smith, R. N., Mizoguchi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colitis+in+transgenic+and+knockout+animals+as+models+of+human+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Colitis in transgenic and knockout animals as models of human inflammatory bowel disease.</a> Immunol Rev. 169, 195-207 (1999).</li>
<li>Mombaerts, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+development+of+inflammatory+bowel+disease+in+T+cell+receptor+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Spontaneous development of inflammatory bowel disease in T cell receptor mutant mice.</a> Cell. 75, 274-282 (1993).</li>
<li>Powrie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+regulation+in+the+intestine%3A+a+balancing+act+between+effector+and+regulatory+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Immune regulation in the intestine: a balancing act between effector and regulatory T cell responses.</a> Ann N Y Acad Sci. 1029, 132-141 (2004).</li>
<li>Ahlfors, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-22+fate+reporter+reveals+origin+and+control+of+IL-22+production+in+homeostasis+and+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-22 fate reporter reveals origin and control of IL-22 production in homeostasis and infection.</a> J Immunol. 193, 4602-4613 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

IL-22 speelt een essentiële rol in de aangeboren afweer en weefsel remodeling. IL-22-producerende cellen zijn geïdentificeerd ex vivo door intracellulaire kleuring. Echter, het blijft moeilijk om IL-22 expressie volgen in situ, in de normale toestand of ontstekingsaandoeningen. Dit protocol beschrijft een nieuwe werkwijze voor een IL-22 reporter muismodel, waardoor we de reporter tot expressie brengen in vivo te lokaliseren ontwikkelen. Het reportergen codeert TdTomato werd in de IL-22 locus o...

Celtype-specifieke expressie van reportergenen nuttig om cellen actief expressie het doelwit weefsels onder homeostatische en verstoorde staten identificeren. Het staat ook voor de zuivering van deze cellen die levensvatbaar blijven hun andere eigenschappen te bestuderen. Reportermuizen zijn gebruikt in het ophelderen van het werkingsmechanisme van bepaalde cytokines, transcriptiefactoren en regulerende elementen. Previous strategieën 1, 2, 3 hebben grotendeels gebruikt kloppen de reporter in het doel-locus in de muis chromosoom, een tijdrovende en kostbare procedure. Dus een eenvoudiger werkwijze voor het genereren van reportermuizen gewenst. Cytokinen zijn een brede klasse van kleine, uitgescheiden eiwitten / peptiden die immuunreacties door middel van intercellulaire signalering reguleren. Interleukine 22 (IL-22) is een cytokine met vele gerapporteerde activiteiten, zoals barrière functies, weefselherstel, en ontsteking 4. Alhoewel IL-22 werd oorspronkelijk ontdekt als een T-celproduct 5, vervolgrapporten toonde de expressie ervan in natural killer (NK) cellen bij de mens en muizen 6 7 en in andere klassen van lymfocyten aangeboren 8. Ondanks uitgebreid observatie van IL-22-producerende cellen visualisatie van IL-22 voorheen ex vivo stimulatie en permeabilisatie vlekken met antilichamen. Daarom zouden nieuwe IL-22 reportermuizen bijzonder nuttig om de functie van IL-22 in homeostatische en pathogene processen onderzoeken. Hier hebben we een vereenvoudigde reporter transgene muismodel voor de IL-22-producerende cellen te observeren in vivo en in vitro. Met behulp van een BAC recombineering methode 9, we ingevoegd tdTomato de cDNA sequentie met poly A signaal fragmenten in de IL-22 locons en vervangen exon 1. De andere onvertaalde regio, exons en regulatoire elementen werden niet verstoord, want we willen de natuurlijke regulatie van IL-22 zo goed mogelijk na te bootsen. De plaats van insertie reporter verstoort de signaalsequentie, resulterend in de accumulatie van de reporter in de cellen, in tegenstelling tot IL-22 zelf, die snel wordt uitgescheiden. Deze nieuwe werkwijze kan ook worden toegepast voor het genereren van reportermuizen voor andere uitgescheiden eiwitten.

<table><tbody><tr><td>RP23-401E11 BAC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>RPCI23.C</td><td>Need gene ID: 50929</td></tr><tr><td>NucleoBond BAC 100</td><td>Takara Clontech</td><td>740579</td><td></td></tr><tr><td>PCR SuperMix High Fidelity</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10790020</td><td></td></tr><tr><td>PI-SceI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0696S</td><td></td></tr><tr><td>SpeI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0133S</td><td></td></tr><tr><td>LB Broth</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10855-001</td><td>1 L: 10 g SELECT Peptone 140, 5 g SELECT Yeast Extract, 5 g sodium chloride&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD3</td><td>eBioscience</td><td>11-0031</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD4</td><td>eBioscience</td><td>17-0041</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD45</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MCD4530</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD45RB</td><td>eBioscience</td><td>11-0455</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse RFP</td><td>Abcam</td><td>Ab62341</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14175145</td><td>KCl, KH2PO4, Na2HPO4, NaHCO3, NaCl, D-Glucose</td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>ACK lysing buffer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1049201</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE healthcare life sciences</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase D</td><td>Roche</td><td>11088858001</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II (neutral protease, grade II)</td><td>Roche</td><td>4942078001</td><td></td></tr><tr><td>IX70 inverted fluorescence microscope</td><td>Olympus</td><td></td><td>Ask for quote</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse 80i microscope</td><td>Nikon</td><td></td><td>Ask for quote</td></tr><tr><td>Dynal shaker</td><td>Electron Microscopy Science</td><td>61050-10</td><td></td></tr><tr><td>FACSAria</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td>Ask for quote</td></tr><tr><td>LSRII SORP/flow cytometry</td><td>Becton, Dickinson and Company&nbsp;</td><td></td><td>Ask for quote</td></tr></tbody></table>

visualisatie van il-22-uiting van lymfocyten met behulp van reporter muizen

Visualization of IL-22-expressing Lymphocytes Using Reporter Mice

Reportermuizen zijn op grote schaal gebruikt voor de lokalisatie van de expressie van gerichte genen observeren. Dit protocol richt zich op een strategie om een ​​nieuwe transgene reporter muismodel vast te stellen. We kozen te visualiseren interleukine (IL) 22 genexpressie omdat cytokine heeft belangrijke activiteiten in de darm, waar het bijdraagt ​​aan weefsel beschadigd door ontsteking herstellen. Reportersystemen bieden grote voordelen boven andere werkwijzen voor het identificeren producten in vivo. In het geval van IL-22, had andere studies eerste geïsoleerde cellen uit weefsels en vervolgens opnieuw gestimuleerde cellen in vitro. IL-22, die normaal wordt uitgescheiden, werd opgesloten in cellen met een geneesmiddel, en intracellulaire kleuring werd gebruikt voor het visualiseren. Deze werkwijze identificeert cellen die in staat is IL-22, maar niet bepalen of ze dat deden in vivo. De reporter ontwerp omvat het inbrengen van een gen voor een fluorescerend eiwit (tdTomato) in de IL-22-gen in dergelijke way dat het fluorescerende eiwit kan worden uitgescheiden en derhalve blijft opgesloten in de cellen in vivo. Fluorescerende producenten kunnen vervolgens worden gevisualiseerd in weefselcoupes of door ex vivo analyse door middel van stromingscytometrie. De eigenlijke bouwproces voor de reporter opgenomen recombineering een bacterieel kunstmatig chromosoom dat de IL-22-gen bevatte. Deze gemanipuleerde chromosoom werd vervolgens in het muis genoom. Homeostatische IL-22 reporter expressie werd waargenomen in verschillende muizenweefsels, waaronder de milt, thymus, lymfeklieren, Peyer&#39;s patch en darmen, met stroomcytometrie analyse. Colitis werd geïnduceerd door T-cellen (CD4 + CD45RBhigh) overdracht en reporter expressie werd gevisualiseerd. Positieve T cellen werden eerst in de mesenterische lymfeklieren en vervolgens geaccumuleerd zij in de lamina propria van de distale dunne darm en colon weefsel. De strategie van het gebruik van BAC&#39;s gaf goede-fidelity reporter uitdrukking in vergelijking met IL-22 expressie en het is eenvoudiger dan knock-in procedures.

Een muis-IL-22 reporter transgen is gemaakt met recombineering een bacterieel kunstmatig chromosoom die het IL-22 locus wijzigen. Figuur 1 een schema van pBACe3.6 vector die het gen sacBII een positieve selectiemerker en chlooramfenicol antibioticumresistentiegen 11. Na de introductie tdTomato in exon 1, werd de signaalpeptidesequentie verstoord, zie figuur 2. Aldus werd de tdTomato reporter opgesloten in de IL-22 tot exp...

We beschrijven hier een transgenisch reportermuismodel om de IL-22-producerende cellen in verschillende muisweefsels te visualiseren. Deze methode kan worden gebruikt om de locatie van andere cytokinen of secretoire eiwitten in de muis te volgen.

Visualisatie van IL-22-uiting van lymfocyten Met behulp van Reporter Muizen

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new ...

Het algemene doel van deze procedure voor genetische modificatie van muizen is om IL-22-producerende immuuncellen te identificeren, zuiveren en karakteriseren. Cellen van het immuunsysteem geven bemiddelaars af die cytokinen worden genoemd, die verantwoordelijk zijn voor onze verdediging tegen vreemde agentia zoals bacteriën en het herstel van beschadigde weefsels. IL-22 is een van die cytokinen en er zijn er veel activiteiten aan toegeschreven, variërend van weefselreparatie tot pathologie.En er zijn verschillende celtypen in het immuunsysteem gerapporteerd die in staat zijn om het te produceren. Om duidelijk te maken welke cellen daadwerkelijk IL-22 produceren, ontwikkelden we een nieuwe IL-22 reporter muis. Dit stelde ons in staat om relevante IL-22 producenten in vivo in muizen onder normale omstandigheden en in een model van inflammatoire darmziekte te identificeren.We gebruikten ook reporter cellen om IL-22 expressors te zuiveren om hun andere eigenschappen te bepalen. De methode voor het genereren van reporter muizen wordt kort geschetst en de analysemethoden worden beschreven. De beschreven methoden kunnen worden toegepast op andere genen met als doel de expressors te ident

visualization-of-il-22-expressing-lymphocytes-using-reporter-mice

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Deze procedure beschrijft de detectie en isolatie van de muis Th17 leukocyten die actief IL-17 afscheiden na stimulatie.

Detectie en isolatie van levensvatbare muis IL-17-afscheidende T-cellen

Het is een uitdaging om stabiele, intravitale, hoogwaardige beelden van immuuncellen in de lever te maken. Hier bieden we een zeer gevoelige en betrouwbare methode om migratie en cel-cel-interacties van immuuncellen in de muizenlever gedurende langere perioden (ongeveer 6 uur) te bestuderen door middel van intravitale multifoton laser scanning microscopie in combinatie met intensieve zorg monitoring.

Long Term intravitale Multiphoton Microscopie Beeldvorming van immuuncellen in gezonde en zieke lever behulp CXCR6.Gfp Reporter Muizen

Lymfocyten zijn de belangrijkste spelers in adaptieve immuunresponsen. Hier presenteren we een protocol voor de zuivering van lymfocyten om de fysiologische functies van de gewenste moleculen bij lymfocytenactivatie in vitro en in vivo te bepalen. De beschreven experimentele procedures zijn geschikt voor het vergelijken van functionele capaciteiten tussen controle- en genetisch gemodificeerde lymfocyten.

Isolatie en Activering van Muizen lymfocyten

De hier beschreven werkwijze maakt het mogelijk om visualisatie van IL-8 promotorafhankelijke ontstekingsactivering in de longen van muizen door middel van niet-invasieve bioluminescentie beeldvorming (BLI). Het zelfde dier kan meerdere keren tot BLI worden onderworpen tot maximaal twee maanden vanaf de tijd van afgifte van het luciferase reporterconstruct.

Een IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model voor de<em&gt; In Vivo</em&gt; Lange termijn monitoring van inflammatoire reacties

Dit protocol beschrijft de kwantificering van meerdere cytokine doelen tegelijkertijd in weefselkweek supernatant gestimuleerd muis splenocytes met behulp van multiplex kraal gebaseerde immunoassay platform en een stroom cytometer verkregen.

Multiplex Cytokine profilering van gestimuleerd muis Splenocytes met behulp van een kraal cytometrische gebaseerde Immunoassay Platform

Hier tonen we de methoden voor in vivo kwantificering van leukocyten egress van naïef, ontstoken, en kwaadaardige lymfkliertest huid. Wij voeren een head-to-head vergelijking van twee modellen: transdermaal FITC toepassing en in situ photoconversion. Bovendien tonen wij het nut van photoconversion voor het bijhouden van leukocyten egress van cutane tumoren.

Kwantificeren van de leukocyten Egress via de lymfevaten van lymfkliertest huid en tumoren

Dit protocol beschrijft een techniek om verschillende celpopulaties in aftappen van lymfeklieren zonder veranderingen in de orgaan structuur te beeld.

Visualisering van lymfeklieren structuur en cellulaire lokalisatie met behulp van ex-vivo confocale microscopie

Hier beschrijven we een eenvoudige confocale beeldvormings methode om de in-situ lokalisatie van cellen die het cytokine interferon gamma in Murine secundaire lymfoïde organen afscheidende te visualiseren. Dit protocol kan worden uitgebreid voor de visualisatie van andere cytokines in diverse weefsels.

Beeldvorming van in situ interferon gamma productie in de muis milt na Listeria monocytogenes infectie

Groep 2 aangeboren lymfoïde cellen (ILC2's), betrokken bij type 2-ontsteking, nemen voornamelijk deel aan de reactie op worminfectie, allergische aandoeningen, metabole homeostase en weefselherstel. In deze studie wordt een procedure aangetoond om ILC2's te isoleren van murine neusslijmvlies en de expressie van CD226 te detecteren.

Isolatie van groep 2 aangeboren lymfoïde cellen van muis neusslijmvlies om de expressie van CD226 te detecteren

IL-9-tot expressie brengende T- en ILC2-cellen worden geïnduceerd tijdens N. brasiliensis-infectie , maar hun karakterisering is grotendeels over het hoofd gezien in de geïnfecteerde darm vanwege hun lage frequentie en differentiële kinetiek. Dit protocol beschrijft de isolatie van deze cellen uit verschillende doelorganen en de bevestiging van hun identiteit via flowcytometrie in verschillende infectiestadia.

Een strategie voor de studie van IL-9-producerende lymfoïde cellen in het Nippostrongylus brasiliensis infectiemodel

We beschrijven een methode om tumor-infiltrerende lymfocyten (TIL's) van muizen te gebruiken door middel van flowcytometrie voor adoptieve celoverdracht. Dit protocol heeft tot doel de specifieke cytotoxiciteit van TIL's tegen tumoren in een syngene alvleesklierkanker muismodel te verifiëren en inzicht te verschaffen in de ontwikkeling van adoptieve celtherapieën voor alvleesklierkanker.

Op flowcytometrie gebaseerde isolatie en therapeutische evaluatie van tumor-infiltrerende lymfocyten in een muismodel van alvleesklierkanker

Leer hoe u IL-22-producerende immuuncellen visualiseert met een transgen reporter muismodel. Deze methode maakt in vivo tracking van cytokine-expressie mogelijk in weefsels zoals de darm.

Visualisatie van IL-22-uiting van lymfocyten Met behulp van Reporter Muizen

Meer video's verkennen