Visualisatie van IL-22-uiting van lymfocyten Met behulp van Reporter Muizen

Het algemene doel van deze procedure voor genetische modificatie van muizen is om IL-22-producerende immuuncellen te identificeren, zuiveren en karakteriseren. Cellen van het immuunsysteem geven bemiddelaars af die cytokinen worden genoemd, die verantwoordelijk zijn voor onze verdediging tegen vreemde agentia zoals bacteriën en het herstel van beschadigde weefsels. IL-22 is een van die cytokinen en er zijn er veel activiteiten aan toegeschreven, variërend van weefselreparatie tot pathologie.

En er zijn verschillende celtypen in het immuunsysteem gerapporteerd die in staat zijn om het te produceren. Om duidelijk te maken welke cellen daadwerkelijk IL-22 produceren, ontwikkelden we een nieuwe IL-22 reporter muis. Dit stelde ons in staat om relevante IL-22 producenten in vivo in muizen onder normale omstandigheden en in een model van inflammatoire darmziekte te identificeren.

We gebruikten ook reporter cellen om IL-22 expressors te zuiveren om hun andere eigenschappen te bepalen. De methode voor het genereren van reporter muizen wordt kort geschetst en de analysemethoden worden beschreven. De beschreven methoden kunnen worden toegepast op andere genen met als doel de expressors te identificeren en levensvatbare expresserende cellen te zuiveren voor verdere karakterisering.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het veld van de immunologie over de biologische activiteiten van IL-22 en de eigenschappen van de cellen die het produceren. Het demonstreren van de procedure met mij zal Julie Hixon zijn, een bioloog, Caroline Andrews, een post-doc, en Wenqing Li, een stafwetenschapper, allemaal van Dr.Durham's lab. Nadat het tdTomato reporter gen is ingebracht in een shuttle vector, het GFP gen binnen dezelfde site heeft vervangen, gebruikt u de geschikte bacteriële kunstmatige chromosoom, of BAC sjabloon om de A en B homologie boxen te versterken naar het eerste vertaalde exon van IL-22 in een 50 microliter PCR reactie systeem.

Transformeer vervolgens de gezuiverde vectoren in BAC competente bacteriële cellen op Luria-Bertani of LB agar platen bevattend chloramfenicol en ampicilline bij 37 graden Celsius. Aan het einde van de incubatie, inoculeer twee tot drie kolonies in één milliliter LB bouillon, aangevuld met chloramfenicol bij 37 graden Celsius en 225 rpm. Na één uur, spreid 100 microliter van elke mix op een LB agar plaat aangevuld met chloramfenicol en sucrose voor een overnachtelijke cultuur bij 37 graden Celsius.

De volgende ochtend, herplant de grote kolonies op een nieuwe LB agar plaat met chloramfenicol en de kleine kolonies op een andere LB agar plaat en stel de platen bloot aan UV licht gedurende 30 seconden. Selecteer vervolgens een UV gevoelige kolonie en gebruik een tdTomato IL-22 heterozygote primer om de aanwezigheid van het gemodificeerde BAC DNA door PCR te bevestigen. Na het verwijderen van de milt en thymus, gebruik fijn punt gekartelde dissectie pincetten om de parelwitte mesenteriale lymfeklieren te verzamelen dicht bij de wand van de dunne darm.

Vervolgens verwijdert u de volledige dunne darm en colon en gebruikt u scharen om de uitgebreide ovale Peyer's patches langs de darm te extraheren. Wanneer alle lymfweefsels zijn verzameld, vermaalt u de mesenteriale lymfeklieren en Peyer's patches samen tussen twee bevroren dia's in PBS aangevuld met FBS op ijs. Na het genereren van individuele milt en thymus enkele cel suspensies op dezelfde manier, centrifugeer de miltcellen gevolgd door splenische Rode Bloedcel Lysis met één milliliter van ACK Lysing Buffers milt.

Na één minuut, herstel de isotoniciteit met negen milliliters PBS en centrifugeer de cellen opnieuw. Resuspendeer de pellet in vijf milliliters PBS en filter de cellen door een 100 micron cel strainer. Verzamel vervolgens de cellen door een andere centrifugatie, resuspendeer het pellet in vijf milliliters van RPI medium voor enumeratie door trypan blauw uitsluiting.

Na het verzamelen van de dunne darm van de duodenum tot de ileum samen met de volledige colon gebruikt u pincetten om het extra vet en mesenterisch weefsel van de darm te verwijderen en plaatst u onmiddellijk het darmweefsel in ijs koud PBS. Gebruik pincetten om de Peyer's patches langs de distale regio van de dunne darm te verzamelen. Gebruik vervolgens scharen om de darm in de lengterichting te openen en spoel het weefsel grondig door met 10 milliliters ijs koud PBS.

Breng het monster over in 20 milliliters predigestie buffer voor twee 30 minuut incubaties bij 37 graden Celsius en 50 rpm in een shaker waarbij het weefsel gedurende 30 seconden op 12.000 rpm wordt gevortext en alle fragmenten aan het einde van elke incubatie door een 100 micron cel strainer worden geduwd om de epitheliale cel laag te verzamelen. Voeg vervolgens 20 milliliters verse EDTA oplossing toe aan de cel slurrie voor nog een 30 minuut incubatie met schudden bij 37 graden Celsius, het filteren en koelen van de intestinale epitheliale cellen aan het einde van de incubatie zoals zojuist gedemonstreerd. Plaats de resterende darmfragmenten op ijs en verzamel de gepoolde intestinale epitheliale cellen door centrifugatie, gevolgd door een was in 10 milliliters van HBSS aangevuld met FBS.

Resuspendeer de gewassen pellet in acht milliliters van 44%colloïdaal silica medium en overdek de cel suspensie met vijf milliliters van 67%colloïdaal silica medium. Scheid de cellen door centrifugatie en gebruik een één milliliter pipet om de bovenste vijf milliliter van het celscheidingsmedium te verwijderen. Verzamel vervolgens de cellen op het grensvlak en was de intestinale epitheliale cellen in 10 milliliters van RPMI medium, resuspendeer het pellet in vijf milliliters vers RPMI.

Na het bereiden van enkele miltcel suspensies van IL-22 td-Tomato muizen zoals zojuist gedemonstreerd. Resuspendeer de cellen bij een eenmaal 10 tot de zevende cellen per milliliter concentratie in steriele PBS en gebruik de muis CD4 cel negatieve isolatie methode om de CD4 positieve T cellen te zuiveren. Label vervolgens de T cellen met anti-CD4 en anti-CD45RB antilichamen gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius.

Aan het einde van de incubatie, verzamel de cellen door centrifugatie gevolgd door een was in