De geïsoleerde Mouse perfusie Kidney Techniek

Het algemene doel van dit protocol is om de geïsoleerde nierfunctie te analyseren in een ex vivo geperfuseerde muizennier. Exclusief de invloed van bloeddruk, hormonen of het autonome zenuwstelsel. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de nefrologie.

Door inzicht te geven in de geïsoleerde orgaanfunctie en als een elegant hulpmiddel om acute nierbeschadiging te bestuderen. Het belangrijkste voordeel van de IPK is dat de orgaanfunctie wordt bestudeerd zonder systemische invloeden. Na de muis voor te bereiden op de operatie, gebruik makend van schaar, voer een middelste laparotomie uit van de schaambeenkam tot het borstbeen.

Open eerst de huid en vervolgens de buikspieren. Verwijder vervolgens de darmen en plaats ze aan de linkerkant van de muis, lateraal van de buik. Bevrijd nu de blaas van bindweefsel en leg beide urineleiders en de urethra bloot.

Voor deze procedures plaatst u alle ligaturen met behulp van 5-0 hechtdraad. De eerste ligatuur die u plaatst, is rond de linker urineleider. Sluit deze stevig met een dubbele chirurgische knoop.

Plaats vervolgens een ligatuur rond de urethra met dezelfde techniek. Plaats dan een lasso-ligatuur rond de hele blaas, maar laat deze los. Met de eerste drie hechtingen op hun plaats, gebruik schaar om een incisie van één millimeter lang in de blaas te maken.

Plaats in deze incisie een canule gemaakt van twee centimeter PE-50 slang. Sluit nu de ligatuur die de blaas lassoert, om de canule vast te zetten. Met de gecanuleerde blaas, snijdt u de linker urineleider en urethra distaal van de ligaturen door.

De blaas moet nu alleen aan de rechter urineleider zijn bevestigd en vrij kunnen bewegen. Verwijder vervolgens het bindweefsel en vet rond de abdominale aorta. Plaats vervolgens ligaturen rond het middelpunt van de blootgestelde aorta en net onder het middenrif tussen de arteria mesenterica superior en de truncus coeliacus.

Houd elk van deze los. Plaats vervolgens een ligatuur rond de arteria mesenterica superior. Plaats nu een derde ligatuur rond de aorta direct onder de rechter nierslagader en boven de linker nierslagader.

Dit is ligatuur nummer zeven. Plaats ten slotte een ligatuur rond het staartvenenpakket. Plaats nu een klem tussen ligatuur nummer zeven en de vertakking van de linker nierslagader.

Maak vervolgens een kleine incisie in de aorta, caudaal van ligatuur zeven, zorg ervoor dat u de dorsale wand niet snijdt en strek de opening uit met een vaatdilator. In de opening, breng een twee centimeter getrokken PE-50 canule in, duw het puntje net in de klem. Open vervolgens de klem.

Duwt vervolgens het puntje van de naald craniaal totdat het de verbinding van de rechter nierarterie en de aorta bereikt. Sluit nu ligatuur zeven en sluit vervolgens de ligatuur op het middelpunt van de abdominale aorta. Ga verder met het openen van de borstkas met schaar door het diafragma te dissecteren.

Scheed vervolgens met een enkele snede de aorta, vena cava, hart en vegetatieve zenuwen. Begin nu met de drukcontrole van de perfusiepomp en houd de gemiddelde druk tussen 80 en 100 millimeter kwik. Sluit nu de drie resterende ongebonden ligaturen rond de aorta en het staartvenenpakket.

Bevrijden met schaar de rechter nier van het omringende bindweefsel en los het uit de vetcapsule. Snijd de aorta proximaal naar de ligatuur tussen de arteria mesenterica superior en de truncus coeliacus. Snijd vervolgens de arteria mesenterica superior distaal naar de ligatuur rond de arteria mesenterica superior.

Verwijder nu het nierondersteunende vaatbundel, zorg ervoor dat u niet in de vaten zelf snijdt. Snijd vervolgens de lever bij de verbinding met de nier, maar laat een klein deel van de lever eraan bevestigd, zodat de vena cava erdoor open wordt gehouden. De volgende stap is om het nierbundel uit de muis te verwijderen.

Laat nu de nier in de kamer en verwijder de muis. Plaats op de verbinding tussen de lever en de nier een lasso-ligatuur. Canuleer vervolgens de vena cava met een veneuze lijn en sluit de lasso-ligatuur.

De nier moet nu stabiel in de doos zitten. Veneuze uitstroom via de veneuze lijn moet onmiddellijk beginnen. Urineafvoer zal beginnen na ongeveer drie minuten.

De peristaltiek van de urineleider moet onmiddellijk beginnen en gedurende ten minste een uur stabiel blijven. Sluit de doos. De voorbereiding is nu voltooid en zou minimaal een uur levensvatbaar moeten blijven.

Na het gebruik van de beschreven methode op C57 zwarte 6 muizen, werd de weefsellevensvatbaarheid van vier nieren getest na een uur continue perfusie. De druk werd op een continue 100 millimeter kwik gehouden. Perfusaatvloed en vasculaire weerstand bleven stabiel in alle vier de nieren.

De glomerulaire filtratiesnelheid werd beoordeeld met behulp van FITC inuline klaring, bedoeld om in de loop van de tijd toe te nemen, maar niet significant. Fractionele excretie van natrium en kalium werd beoordeeld na 55 minuten perfusie. Deze parameters namen toe in vergelijking met de in vivo situatie.

Na 55 minuten steeg de osmolaliteit van de urine niet boven de osmolaliteit van de veneuze uitstroom. De nieren werden vervolgens gefixeerd en hun ultrastructuur werd beoordeeld met TEM. Glomeruli in S1-segmenten van proximale tubuli bleken grotendeels onveranderd.

Sommige, maar niet alle S2, S3-segmenten van de proximale tubuli in de dikke ascenderende ledematen die niet dicht bij vasculaire bundels waren, vertoonden tekenen van orgaanschade. Bij nader onderzoek vertoonden distale gewrongen tubuli en verzamelbuisjes geen tekenen van necrose. Over het algemeen weerspiegelden de nieren wat wordt gerapporteerd voor geïsoleerde geperfuseerde rattennieren.

Na deze procedure kunnen analysemethoden zoals beeldvorming of feiten gevolgd door eiwit- of RNA-analyse worden uitgevoerd op het weefsel om meer inzicht te verkrijgen.