Name: De geïsoleerde Mouse perfusie Kidney Techniek (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Leer de geïsoleerde geperfuseerde niertechniek bij muizen voor nierfysiologieonderzoek zonder systemische invloeden. Deze methode biedt inzicht in acute nierbeschadiging en geïsoleerde orgaanfunctie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen Hans-Joachim Schurek bedanken voor zijn onschatbare wetenschappelijke advies. De auteurs willen Monique Carrel en Michèle Heidemeyer bedanken voor uitstekende technische assistentie, David Penton Ribas en Nourdine Faresse voor een kritische lezing van het manuscript en Carsten Wagner en Jürg Biber voor het NaPi-2a antilichaam. Dit werk werd ondersteund door het Zwitsers Nationaal Centrum voor Competentie in Onderzoek "Kidney.CH" en door een projectsubsidie (310030_143929/1) van de Zwitserse Nationale Wetenschapsstichting.

Alle procedures waarbij dieren in dit manuscript beschreven, werden uitgevoerd volgens Zwitsers recht en door de veterinaire dienst van het kanton Zürich, Zwitserland goedgekeurd. 1. Buffer Voorbereiding <ol><li> Bereid oplossingen 1-4 en de oplossing antidiuretisch hormoon (ADH) (Tabel 1). </li><li> Bereid de dialyse buffer (Tabel 1). Opmerking: Dit is de buffer als de dialyse buffer tijdens de perfusie. Later zal de erytrocyten worden verdund in de buffer tot de uiteindelijke perfusaat vormen. </li><li> Erytrocytpreparaat. <ol><li> Verdun 250 ml humaan erytrocytenconcentraat (getest materiaal verkregen van de plaatselijke bloedbank) tot 500 ml met dialyse buffer. Centrifugeer bij 2000 xg gedurende 8 minuten. Verwijder de buffer, zorg dat u geen erytrocyten niet te verwijderen. Herhaal 3x. </li></ol></li><li> Bereid de albumine (runderserumalbumine; BSA) buffer. <ol><li> In 200 ml dialysis buffer, los 44 g BSA met behulp van een roerstaafje. Filter de oplossing met filter papier. </li></ol></li><li> Bereid de perfusaat. <ol><li> Filter de erytrocyten uit stap 1.3.1 door middel van filter papier in de BSA buffer. Vult tot een totaal volume van 800 ml met dialysebuffer. LET OP: Dit is de laatste perfusaat. De hematocriet moet nu tussen 8 en 12%. Het perfusaat kan worden bewaard tot 12 uur bij 4 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Initiëren Dialyse en Oxygenatie <ol><li> Zet het waterbad rond de grotere bufferreservoir kleiner bufferreservoir en de vochtige kamer (een kleine, dubbelwandige kamer gebracht tot 37 ° C en 100% vochtigheid later houden de nier) tot 37 ° C (figuur 2) . </li><li> Vul het grotere bufferreservoir met de dialysebuffer en hoe kleiner reservoir van het perfusaat. </li><li> Schakel de 5% CO2 / 95% O2 gas aanvoer naar de dialyse buffer. </li><li> Schakel continue dialyse van het perfusaat tegen dialyse buffer. Zorg ervoor dat low-flux dialyse tubing gebruiken. Ga verder met stap 3. </li></ol><img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/54712/54712fig2.jpg" /> Figuur 2: schematische tekening van de perfusie Circuit. Schema toont de belangrijkste onderdelen van het perfusiecircuit en de richting van de bufferstroom. Alle componenten omgeven door donkerblauwe worden bij 37 ° C gehouden met een waterbad / thermostaat. 1: Dialyse buffer van ten minste 3 keer het volume van de perfusie buffer continu geborreld met 95% O2 / 5% CO2. 2: dialysebuffer en perfusiebuffer continu gedialyseerd tegen elkaar in een dialysebuis door een rollerpomp. 3: Hierdoor dialyse, de perfusie buffer verrijkt met 9% O2 / 5% CO 2 en elektrolyten worden constant gehouden throughout perfusie. 4: Een rollenpomp stuwt de perfusie buffer naar de nier. 5: Een windketel verwijdert peristaltische golven en fungeert als een zeepbel te houden. 6: Druk meters (aangesloten op 4. (roller pomp) continue druk te houden terwijl het toestaan van vrij afwisselend flow). 7: Gedurende perfusie, de nier blijft in een vochtige kamer 100% luchtvochtigheid en 37 ° C nier temperatuur. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54712/54712fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> 3. Chirurgische Procedure Part 1 (voor een schema van ligaturen, zie figuur 3) Opmerking: Voer alle ligaturen met behulp van 5-0 chirurgische draad. <ol><li> Verdoven een muis door intraperitoneale injectie (10 ul / g lichaamsgewicht, 20 mg / ml ketamine en 1 mg / ml xylazine opgelost in 0,9% NaCl). Bevestig voldoende diepte van AnesthESIA door het testen voor de afwezigheid van de achterste voet reflexen. </li><li> Bevestig de muis in een liggende positie in de vochtige kamer. Bescherm de ogen met dierenarts zalf. Plaats een 1 ml spuit onder de ruggengraat naar de lumbale vaten verhogen. </li><li> Voer een mediane laparotomie van de schaamstreek kuif aan het borstbeen opening eerst de huid, dan is de buikspieren, met een schaar. </li><li> Verwijder de darm en plaats het op de linkerkant van de muis laterale uit de buik. </li><li> Bevrijd de blaas uit bindweefsel en verken zowel urineleiders en de plasbuis. </li><li> Plaats een ligatuur rond de linker ureter (ligatuur I). Sluit het. </li><li> Plaats een ligatuur rond de plasbuis (ligatuur II). Sluit het. </li><li> Plaats een &quot;lasso&quot; ligatuur rond de gehele blaas (ligatuur III). </li><li> Insnijden de blaas 1 mm. </li><li> Canule de opening 2 cm PE 50 buis. </li><li> Sluiten ligatuur III rond de buis. </li><li> Snijd de linker urineleider en de urinebuis distale van de ligaturen. het bladder is nu aan de rechter ureter alleen en vrij bewegen. </li><li> Schakel de abdominale aorta van bindweefsel en vet. </li><li> Plaats een abdominale aorta mid-ligatuur (ligatuur IV). </li><li> Plaats een ligatuur rond de aorta onder het diafragma tussen de mesenterica superior en het Celiac kofferbak (ligatuur V). </li><li> Plaats een ligatuur rond de mesenterica superior (ligatuur VI). </li><li> Plaats een aorta ligatuur direct onder rechts en boven de linker nierslagader (ligatuur VII). </li><li> Plaats een ligatuur rond de staartader pakket (cava) (ligatuur VIII). Ga verder met stap 4. </li></ol><img alt="figuur 3" src="/files/ftp_upload/54712/54712fig3.jpg" /> Figuur 3: schematische tekening van de Ligatures geplaatst tijdens de operatie. Uitzicht op de open buik na de laparotomie. De darm wordt verplaatst naar links. L en R geven de linker en rechter nier. Dezwarte lijnen tonen het gebied van de respectievelijke ligatuur. Ligaturen eerst gelegd en dan gesloten, in de volgorde in de tekst. X geeft de locatie van de incisie voor aorta infusen. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54712/54712fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> 4. Vullen van de perfusiekringloop <ol><li> Start de roterende pomp en vul de buis met perfusaat. Zorg ervoor dat alle luchtbellen leeg te maken van het. </li><li> Vul het windketel apparaat tot ongeveer mid-level met perfusaat. </li><li> Kalibreer de drukomvormer aan 0 mm Hg wanneer alle buis wordt gevuld en flow 0. Laat de perfusie naald onder nier niveau gedurende deze tijd. </li><li> Houd stroom op een constant minimaal niveau (0,6 ml / min) en ga verder met stap 5. </li></ol> 5. Chirurgische Procedure Part 2 <ol><li> Plaats een klem tussen ligatuur IV en de vertakking van de linker renal slagader. </li><li> Maak een kleine incisie in de aorta staart van ligature IV, zorg ervoor dat niet snijd de dorsale muur. </li><li> Verwijden van de opening in de aorta met een vaatverwijder. </li><li> Canule van de aorta met een naald (2 cm lang, trok PE 50), duwt de punt alleen maar om de klem. </li><li> Open de klem. </li><li> Duw de punt van de naald craniaal tot aan de kruising van de rechter nierslagader en de aorta bereikt. </li><li> Sluit ligatuur VII. </li><li> Sluit ligatuur IV. </li><li> Open de kist met een schaar door het ontleden van het middenrif. Met een enkele cut, scheiden de aorta, vena cava, hart en vegetatieve zenuwen. Met deze stap wordt het dier opgeofferd via snelle verbloeding onder continu diep narcose. </li><li> Start drukregeling de perfusiepomp. Handhaaf de gemiddelde druk tussen 80 en 100 mmHg. </li><li> Sluiten ligatuur V. </li><li> Sluit ligatuur VI. </li><li> Sluit ligatuur VIII. </li><li> Gratis de rechter nier van verbindende tissue en de inbedding in het vet capsule met een schaar. </li><li> Snijd de aorta proximaal aan Ligatuur V. </li><li> Snijd de mesenterica superior distaal aan Ligatuur VI. </li><li> Snijd de nier ondersteunende schip bundel uit, zorg ervoor dat niet in de vaten zelf te snijden. </li><li> Snijd de lever in de verbinding met de nier. Zorg ervoor dat de nieren vrij, maar laat een klein deel van de lever hechtend aan, zodat de vena cava opengehouden wordt door het. </li><li> Neem de nier bundel uit de muis. Verwijder de muis uit de vochtige kamer. </li><li> Plaats een &quot;lasso&quot; ligatuur rond de aansluiting van de lever en de nieren (ligatuur IX). </li><li> Canule van de vena cava met een veneuze lijn (2 cm PE 50). </li><li> Sluit ligatuur IX. Veneuze uitstroom door de veneuze lijn moet onmiddellijk beginnen. </li><li> Sluit de vochtige kamer. </li></ol> 6. Downstream Analyses <ol><li> Gedurende het volgende uur, voortdurend te controleren bloedstroom en intravascular druk 15. Verzamel veneuze uitstroom, die kan worden gebruikt voor analyse van bijvoorbeeld renale reninesecretie 7. Verzamel urine voor de analyse van de elektrolyt concentratie en glomerulaire filtratiesnelheid 14. Na 1 h perfusie, nieren kan worden snel bevroren voor western blotting of beeldvorming vastgesteld nadert 16. </li></ol>

<ol><li>Carrel, A., Lindbergh, C. A. The culture of whole organs. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCarrel%2C+A+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22">Science (New York, N.Y.)</a>. 81 (2112), 621-623 (1935).</li>
<li>Skutul, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSkutul%2C+K+%22%C3%9Cber+Durchstr%C3%B6mungsapparate+Pfl%C3%BCger%27s+Archiv%22">Über Durchströmungsapparate Pflüger's Archiv</a>. 123 (4-6), 249-273 (1908).</li>
<li>Nizet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolated+perfused+kidney%3A+possibilities%2C+limitations+and+results%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">The isolated perfused kidney: possibilities, limitations and results.</a> Kidney Int. 7 (1), 1-11 (1975).</li>
<li>Weiss, C., Passow, H., Rothstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoregulation+of+flow+in+isolated+rat+kidney+in+the+absence+of+red+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Autoregulation of flow in isolated rat kidney in the absence of red cells.</a> Am J Physiol. 196 (5), 1115-1118 (1959).</li>
<li>Schurek, H. J., Kriz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphologic+and+functional+evidence+for+oxygen+deficiency+in+the+isolated+perfused+rat+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Morphologic and functional evidence for oxygen deficiency in the isolated perfused rat kidney.</a> Lab Invest. 53 (2), 145-155 (1985).</li>
<li>Stolte, H., Schurek, H. J., Alt, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glomerular+albumin+filtration%3A+a+comparison+of+micropuncture+studies+in+the+isolated+perfused+rat+kidney+with+in+vivo+experimental+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Glomerular albumin filtration: a comparison of micropuncture studies in the isolated perfused rat kidney with in vivo experimental conditions.</a> Kidney Int. 16 (3), 377-384 (1979).</li>
<li>Schweda, F., Wagner, C., Krämer, B. K., Schnermann, J., Kurtz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preserved+macula+densa-dependent+renin+secretion+in+A1+adenosine+receptor+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22AJP+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Preserved macula densa-dependent renin secretion in A1 adenosine receptor knockout mice.</a> AJP Renal Physiol. 284 (4), F770-F777 (2003).</li>
<li>Moers, C., Smits, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Machine+perfusion+or+cold+storage+in+deceased-donor+kidney+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Machine perfusion or cold storage in deceased-donor kidney transplantation.</a> N Engl J Med. 360 (1), 7-19 (2009).</li>
<li>Nicholson, M. L., Hosgood, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+transplantation+after+ex+vivo+normothermic+perfusion%3A+the+first+clinical+study%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Renal transplantation after ex vivo normothermic perfusion: the first clinical study.</a> Am J Transplant. 13 (5), 1246-1252 (2013).</li>
<li>Worner, M., Poore, S., Tilkorn, D., Lokmic, Z., Penington, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+low-cost%2C+small+volume+circuit+for+autologous+blood+normothermic+perfusion+of+rabbit+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Art+Org%22%5BJournal%5D)">A low-cost, small volume circuit for autologous blood normothermic perfusion of rabbit organs.</a> Art Org. 38 (4), 352-361 (2014).</li>
<li>Kaths, J. M., Spetzler, V. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normothermic+Ex+Vivo+Kidney+Perfusion+for+the+Preservation+of+Kidney+Grafts+prior+to+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation.</a> J Vis Exp. (101), e52909(2015).</li>
<li>Song, J. J., Guyette, J. P., Gilpin, S. E., Gonzalez, G., Vacanti, J. P., Ott, H. C. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSong%2C+JJ+%22Nature+Med%22">Nature Med</a>. 19 (5), 646-651 (2013).</li>
<li>Hall, A. M., Crawford, C., Unwin, R. J., Duchen, M. R., Peppiatt-Wildman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+imaging+of+the+functioning+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22JASN%22%5BJournal%5D)">Multiphoton imaging of the functioning kidney.</a> JASN. 22 (7), 1297-1304 (2011).</li>
<li>Lindell, S. L., Williams, N., Brusilovsky, I., Mangino, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+IPK%3A+A+Powerful+Tool+to+Partially+Characterize+Renal+Reperfusion+and+Preservation+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Transplant+J%22%5BJournal%5D)">Mouse IPK: A Powerful Tool to Partially Characterize Renal Reperfusion and Preservation Injury.</a> Open Transplant J. 5, 15-22 (2011).</li>
<li>Wagner, C., De Wit, C., Kurtz, L., Grünberger, C., Kurtz, A., Schweda, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin40+is+essential+for+the+pressure+control+of+renin+synthesis+and+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Connexin40 is essential for the pressure control of renin synthesis and secretion.</a> Circ Res. 100 (4), 556-563 (2007).</li>
<li>Czogalla, J., Vohra, T., Penton, D., Kirschmann, M., Craigie, E., Loffing, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mineralocorticoid+receptor+%28MR%29+regulates+ENaC+but+not+NCC+in+mice+with+random+MR+deletion%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCger%27s+Archiv%22%5BJournal%5D)">The mineralocorticoid receptor (MR) regulates ENaC but not NCC in mice with random MR deletion.</a> Pflüger's Archiv. , (2016).</li>
<li>Poosti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision-cut+kidney+slices+%28PCKS%29+to+study+development+of+renal+fibrosis+and+efficacy+of+drug+targeting+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Precision-cut kidney slices (PCKS) to study development of renal fibrosis and efficacy of drug targeting ex vivo.</a> Dis Model Mech. 8 (10), 1227-1236 (2015).</li>
<li>Rahgozar, M., Guan, Z., Matthias, A., Gobé, G. C., Endre, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin+II+facilitates+autoregulation+in+the+perfused+mouse+kidney%3A+An+optimized+in+vitro+model+for+assessment+of+renal+vascular+and+tubular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nephrology%22%5BJournal%5D)">Angiotensin II facilitates autoregulation in the perfused mouse kidney: An optimized in vitro model for assessment of renal vascular and tubular function.</a> Nephrology. 9 (5), 288-296 (2004).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen en niets anders te onthullen.

De muis die geperfuseerde nier is een hulpmiddel voor het bestuderen van nierfunctie in een gecontroleerde omgeving ex vivo gedurende 1 uur, de kloof tussen in vivo experimenten bij intacte dieren, eventueel ontsierd door de impact van talrijke systemische factoren, en in vitro experimenten geïsoleerde nefron segmenten of gekweekte cellen, die de impact van intacte orgaan structuur op de functie noodzakelijk verwaarlozen. Er is, om de kennis van de auteurs, geen alternatieve techniek waarmee d...

De geïsoleerde perfusie van organen is het onderwerp van een voortdurende inspanning onder fysiologen al vele tientallen jaren 1. De techniek maakt de functie van het orgaan, zonder systemische invloeden zoals bloeddruk, hormonen of zenuwen, te bestuderen. Carl Eduard Loebell wordt beschouwd als de eerste te hebben beschreef de succesvolle perfusie van een geïsoleerde nier, in 1849 2 te zijn. Sindsdien is de perfusie apparaat aanzienlijke verfijning ondergaan. Frey en Gruber introduceerde een kunstmatige long voor oxygenatie en pulserende pomp voor continue perfusie 2. Terwijl de vroege onderzoekers bestudeerden vooral de nieren van de grote zoogdieren, namelijk varkens en honden 2 3 -het eerste verslag van het gebruik van de rat nieren, door Weiss et al. , Was een mijlpaal in de studie van kleine zoogdieren-orgel perfusie 4. Schurek et al. meldde de noodzaak van het toevoegen van zoogdieren erytrocyten aan het perfusaat voldoende als tubulaireoxygenatie moest worden bereikt 5. Kritiek voor langdurige experimenten was de introductie van continue dialyse van de buffer van dezelfde onderzoeksgroep 6. In 2003, Schweda et al. waren de eersten die een geïsoleerd functionele muis doorbloed nier (MIPK) 7, later verfijnd door Rahgozar et al melden. 18 en Lindell et al. 14. Terwijl technisch lastiger dan de rat geïsoleerde geperfuseerde nier, het gebruik van de MIPK draagt ​​het voordeel dat het gebruik van een breed scala van genetisch gemanipuleerde muizen. Dit document geeft de details van de methode van de auteurs voor perfuseren geïsoleerde muis nieren gedurende 1 uur. De methode maakt het mogelijk voor de continue evaluatie van renale stroomsnelheid, vasculaire weerstand, afgifte van hormonen, bloed gas analyse, urine-analyse, en de toepassing van drugs. De procedure kan nieren worden verwerkt voor moleculaire en biochemische analyse, voor microscopie worden vastgesteld, ofgetransplanteerd in een ontvanger muis (Figuur 1). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/54712/54712fig1.jpg" /> Figuur 1: Overzicht van mogelijke Input / Output aan de geïsoleerde geperfuseerde nier. BGA: Blood gas analyse. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54712/54712fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> Deze techniek zal waarschijnlijk krijgen steeds meer aandacht de komende jaren, zoals vele innovatieve toepassingen worden met het aanbreken van langdurige normotherme nier perfusie besproken voorafgaand aan de transplantatie (met of zonder de toepassing van anti-afwijzing of-genoom bewerken drugs) 8, 9, 10 , 11, de bioengineering van hele nieren van cellen ontdane scaffolds 12, en de toepassing van hoge doses van fluorescente kleurstoffen voor beeldvorming multiphoton 13 </sup&gt;. Het is ook een ideaal model waarmee de rol van specifieke genen te bestuderen bij acuut nierfalen 14. Een stap-voor-stap protocol gegeven zodat andere laboratoria geïsoleerde muizennier perfusie succes uit te voeren. Eerst wordt de samenstelling en de bereiding van de buffer opgegeven. Vervolgens wordt de operatie beschreven en de kritische stappen worden. Ten derde, gegevens worden gepresenteerd die representatief zijn voor een succesvolle voorbereiding zijn: renale bloedstroom, vaatweerstand, glomerulaire filtratiesnelheid en fractionele uitscheiding van elektrolyten-all als functionele metingen van de levensvatbaarheid-en transmissie elektronen microfoto van de morfologie van verschillende nephron segmenten van geperfundeerde nieren vastgesteld na 1 uur van perfusie.

<table><tbody><tr><td>Perfusiekringloop:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vochtige kamer 834/8</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-2901</td><td></td></tr><tr><td>Cannula met mand en zijpoort</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-2947</td><td></td></tr><tr><td>Thermostaat TC120-ST5 </td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-4544</td><td></td></tr><tr><td>ISM 827/230V Rollerpomp Reglo Analogue</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-0114</td><td></td></tr><tr><td>Reservoir gemanteld voor bufferoplossing 1 L</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-3438</td><td></td></tr><tr><td>Reservoir gemanteld voor bufferoplossing 0.5 L</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-3436</td><td></td></tr><tr><td>Druktransducer APT300 </td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-3862</td><td></td></tr><tr><td>TAM-D Plugsys Transducer</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-1793</td><td></td></tr><tr><td>SCP Plugsys servoregelaar</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-2806</td><td></td></tr><tr><td>Windkessel </td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-3717</td><td></td></tr><tr><td>HSE-USB data acquisitie</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-3330</td><td></td></tr><tr><td>Laag-Flux Dialysator Diacap Polysulfone</td><td>B.Braun</td><td>7203525</td><td></td></tr><tr><td>PE-Buis voor aorta cannulatie 1.19 mm I.D. x 1.70 mm O.D.</td><td>Scientific Commodities Inc.</td><td>BB31695-PE/8</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Buffer reagentia:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aminoplasmal 10%</td><td>B.Braun</td><td>134518064</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutaminzuur natriumzout hydraat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1626-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-(-)-Appelzuur natriumzout</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1125-25G</td><td></td></tr><tr><td>Natrium-L-Lactaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L7022-10G</td><td></td></tr><tr><td>Alpha-Ketoglutaarzuur natriumzout</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K1875-25G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31434-1KG-R</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761-5KG</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60130-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5378-500G</td><td></td></tr><tr><td>Creatinine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4255-10G</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilline</td><td>Roche</td><td>10835242001</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 * 6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2393-500G</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 * 6H2O&nbsp;</td><td>Riedel-de-Haën</td><td>12074</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638-500G</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0876-500G</td><td></td></tr><tr><td>Antidiuretisch Hormoon dDAVP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V2013-1MG</td><td></td></tr><tr><td>FITC-Inuline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filter gebruikt voor erytrocyt filtratie</td><td>Macherey-Nagel</td><td>MN 615</td><td></td></tr><tr><td>BGA Analyse:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ABL 80 flex</td><td>Radiometer Medical ApS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elektronenmicroscoop:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Philips CM100 TEM</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

de geïsoleerde mouse perfusie kidney techniek

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

De muis die geperfuseerde nier (MIPK) is een techniek voor het houden van een muizennier onder ex vivo omstandigheden geperfuseerd en functioneel voor 1 uur. Dit is een voorwaarde voor de fysiologie van het geïsoleerde orgaan en vele innovatieve toepassingen die in de toekomst mogelijk is, zoals perfusie van cellen ontdoen van nier biotechniek of de toediening van anti-afwijzing of genoom bewerken geneesmiddelen in hoge doses prime de nier voor transplantatie. Ten tijde van de perfusie kan de nieren worden gemanipuleerd, nierfunctie meetbaar zijn en verschillende geneesmiddelen toegediend. Na de procedure kunnen de nieren worden getransplanteerd of bewerkt voor moleculaire biologie, biochemische analyse of microscopie. Dit artikel beschrijft het perfusaat en de chirurgische techniek die nodig is voor de ex vivo perfusie van nieren muis. Details van de perfusie inrichting worden gegeven en gegevens zijn die de vANSPRAKELIJKHEID van de voorbereiding van de nieren: renale bloedstroom, vasculaire weerstand, en urine gegevens als functioneel, transmissie electronenmicroscoop van verschillende nephron segmenten als morfologische uitlezingen en western blots van transporteiwitten van verschillende nephron segmenten als moleculaire uitlezing.

Met de werkwijze beschreven, kan geïsoleerd muis nieren levensvatbaar is ten minste 1 uur. We testten het weefsel levensvatbaarheid na 1 uur van continue perfusie met functionele (renale bloedstroom en vasculaire weerstand, bloedgasanalyse van veneuze uitstroom, glomerulaire filtratiesnelheid, urinair fractionele Na + en K + excretie en urine osmolaliteit) en morfologische (transmissie elektronen microscopie, TEM) methoden vier nieren van wildtype C57BL / 6 muizen. ...

De muis die geperfuseerde nier (MIPK) is een techniek voor het houden van een muizennier onder ex vivo omstandigheden geperfuseerd en functioneel voor 1 uur. De buffers en operatietechniek worden beschreven.

De geïsoleerde Mouse perfusie Kidney Techniek

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

Het algemene doel van dit protocol is om de geïsoleerde nierfunctie in een ex vivo geperfuseerde muizenier te analyseren, waarbij de invloed van bloeddruk, hormonen of het autonome zenuwstelsel wordt uitgesloten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen de nefrologie.Biedt inzicht in de functie van geïsoleerde organen en dient als een elegant hulpmiddel om acute nierinsufficiëntie te bestuderen. Het belangrijkste voordeel van de IPK is dat de orgaanfunctie wordt bestudeerd in afwezigheid van systemische invloeden. Nadat de muis voor de operatie is voorbereid, voert u met een schaar een mediane laparotomie uit van de schaambeenkam tot aan het sternum.Open eerst de huid en vervolgens de buikspieren. Verwijder daarna de darmen en plaats deze aan de linkerzijde van de muis, lateraal ten opzichte van de buikholte. Maak nu de blaas vrij van bindweefsel en leg beide ureters en de urethra bloot.Plaats voor deze procedures alle ligaturen met 5-0 hechtdraad. De eerste ligatuur wordt rond de linkerureter geplaatst. Sluit deze stevig af met een dubbele chirurgische knoop.Plaats vervolgens een ligatuur rond de urethra met behulp van dezelfde techniek. Plaats daarna een lasso-ligatuur rond de gehele blaas, maar laat deze ongebonden. Wanneer de eerste drie hechtingen zijn geplaatst, wordt er met oogscharen een incisie van één millimeter lang in de blaas gemaakt.Plaats in deze incisie een canule bestaande uit twee centimeter PE-50 tubing. Sluit nu de ligatuur die om de blaas is geplaatst om de canule te fixeren. Nadat de blaas is gecannuleerd, worden de linker ureter en de urethra distaal van de ligaturen doorgesneden.De blaas zou nu alleen nog aan de rechterureter vastzitten en vrij moeten kunnen bewegen. Verwijder vervolgens het bindweefsel en vet rondom de abdominale aorta. Plaats daarna ligaturen rond het midden van de blootgelegde aorta en net onder het diafragma, tussen de arteria mesenterica superior en de truncus coeliacus.Houd ook elk van deze los. Plaats vervolgens een ligatuur rond de arteria mesenterica superior. Plaats nu een derde ligatuur rond de aorta direct onder de rechter arteria renalis en boven de linker arteria renalis.Dit is ligatuur nummer zeven. Plaats slutend een ligatuur rond het pakket van de caudale vene. Plaats nu een klem tussen ligatuur nummer zeven en de vertakking van de linker nierslagader.Maak vervolgens een kleine incisie in de aorta, caudaal ten opzichte van ligatuur zeven, waarbij u er alert op bent de dorsale wand niet door te snijden, en rek de opening open met een vaatdilatator. Voer via de opening een getrokken PE-50 canule van twee centimeter in en duw de punt precies in de klem. Open daarna de klem.Duw vervolgens de punt van de naald craniaal tot deze de aansluiting van de rechter nierarterie en de aorta bereikt. Sluit nu ligatuur zeven en sluit daarna de ligatuur op het middenpunt van de abdominale aorta. Ga verder door de borstkas met een schaar te openen door het diafragma te disseceren.Scheid vervolgens met één enkele snede de aorta, de vena cava, het hart en de vegetatieve zenuwen. Start nu de drukregeling van de perfusiepomp en houd de gemiddelde druk tussen 80 en 100 millimeters kwik. Sluit nu de drie resterende, nog niet vastgeknoopte ligaturen rond het pakket van de aorta en de staartader.Bevrij met een schaar de rechternier van het omringende bindweefsel en verwijder de vetkapsel. Snijd de aorta proximaal van de ligatuur tussen de arteria mesenterica superior en de truncus coeliacus door. Snijd vervolgens de arteria mesenterica superior distaal van de ligatuur rond de arteria mesenterica superior door.Verwijder nu het ondersteunende vattenbundel van de nier, waarbij u er zorg voor neemt de vaten zelf niet door te snijden. Snijd vervolgens de lever door bij de verbinding met de nier, maar laat een klein deel van de lever eraan vastzitten, zodat de vena cava hiermee open wordt gehouden. De volgende stap is het verwijderen van de nierbundel uit de muis.Laat nu de nier in de kamer en verwijder de muis. Plaats een lasso-ligatuur bij de verbinding tussen de lever en de nier. Cannuleer vervolgens de vena cava met een veneuze lijn en sluit de lasso-ligatuur.De nier moet nu stabiel in de box liggen. De veneuze uitstroom via de veneuze lijn moet onmiddellijk beginnen. De urine-uitstroom zal na ongeveer drie minuten beginnen.De peristaltiek van de ureter moet onmiddellijk beginnen en gedurende ten minste één uur stabiel blijven. Sluit de doos. De preparatie is nu voltooid en zou gedurende ten minste een uur levensvatbaar moeten blijven.Na toepassing van de beschreven methode op C57 black 6-muizen werd de weefsellevensvatbaarheid van vier nieren getest na een uur continue perfusie. De druk werd constant gehouden op 100 millimeters kwik. De perfusaatstroom en de vasculaire weerstand bleven stabiel in alle vier de nieren.De glomerulaire filtratiesnelheid werd beoordeeld met behulp van FITC-inulineklaring, waarvan werd verwacht dat deze na verloop van tijd zou toenemen, maar niet significant. De fractionele excretie van natrium en kalium werd beoordeeld na 55 minuten perfusie. Deze parameters waren verhoogd in vergelijking met de in vivo situatie.Na 55 minuten steeg de molaliteit van de urine niet boven de osmolaliteit van de veneuze uitstroom. De nieren werden vervolgens gefixeerd en hun ultrastructuur werd beoordeeld met TEM. Glomeruli in S1-segmenten van proximale tubuli bleken grotendeels ongewijzigd.Sommige, maar niet alle S2- en S3-segmenten van de proximale tubuli in de dikke opstijgende schenkels die niet dicht bij vaatbundels lagen, vertoonden tekenen van orgaanschade. Bij nadere inspectie vertoonden de distale gewonden tubuli en verzamelbuizen geen tekenen van necrose. Over het algemeen weerspiegelden de nieren wat er is gerapporteerd voor geïsoleerde geperfuseerde rattennieren.Na deze procedure kunnen analysemethoden zoals imaging of FACS, gevolgd door eiwit- of RNA-analyse, op het weefsel worden uitgevoerd om verdere inzichten te verkrijgen.

the-mouse-isolated-perfused-kidney-technique

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een precieze muis model voor acute nierschade (AKI) als gevolg van ischemie is een belangrijk instrument om acute nierschade te onderzoeken en eventueel vinden therapeutische instrumenten om schade aan de nieren te behandelen. De opknoping gewicht systeem biedt een tool voor onmiddellijke en betrouwbare renale arterie occlusie en reperfusie zonder dat renale congestie.

Het gebruik van een Opknoping gewicht System voor geïsoleerde renale arterie occlusie

In this video, we describe the procedure for kidney extraction from the retroperitoneal space of the mouse. The extracted kidney can further be microdissected to obtain an intact kidney without a renal capsule and the surrounding fat layer.

Extracting Intact Kidney from Mouse: A Technique to Obtain Kidney Without Renal Capsule from Murine Models

This video describes the method to isolate intact glomeruli from mouse kidneys. The encapsulated and decapsulated glomeruli thus obtained can further be used for culturing parietal epithelial cell outgrowths from the murine kidney.

Glomeruli Isolation: A Technique to Obtain Intact Glomeruli from Murine Kidney

We beschrijven modellen van matige en ernstige ischemie-reperfusie geïnduceerde nierschade waarin de muizen ondergaan unilaterale renale pedicle klemmen gevolgd door gelijktijdige of vertraagde contralaterale nefrectomie, respectievelijk. Deze modellen consequent aanleiding geven tot nierinsufficiëntie en na het letsel fibrose, maar letselernst en overleving afhankelijk zijn van de muis achtergrond, leeftijd en chirurgische apparatuur.

Ischemie-reperfusie model van Acute Kidney Injury en Post Letsel Fibrosis in Muizen

Technieken die betrouwbaar en efficiënt zijn voor het isoleren van immuuncellen in de nieren zijn nodig voor downstream-toepassingen. Dit vereist oppervlakte-antilichaammarkering van een klein aantal immuuncellen in de nieren. Hierin beschrijven we een beknopte methode voor het isoleren van immuuncellen in de nieren die schijnbaar dit doel bereikt.

Betrouwbaar en High Efficiency Winning van Kidney immuuncellen

Dit protocol biedt een rendabele aanpak om te isoleren en karakteriseren van muis primaire renale tubulaire cellen die vervolgens sub kunnen worden gekweekt om te beoordelen renale biologische functies- ex vivo, met inbegrip van de mitochondriale Bioenergetica.

Isolatie, karakterisering en High Throughput extracellulaire Flux-analyse van muis primaire renale tubulaire epitheliale cellen

Hier presenteren we een protocol voor het lymfkliertest in vivo labelen van glomerulaire cel oppervlakte eiwitten met biotine. Dit protocol bevat informatie over hoe perfuse muis nieren, het isoleren van de glomeruli, en het uitvoeren van endogene immunoprecipitation van de proteïne van belang.

Isolatie van de Glomeruli en In Vivo Labeling van glomerulaire cel oppervlakte-eiwitten

De combinatie van antilichaam etikettering, optische clearing en geavanceerde Lichtmicroscopie maakt een driedimensionale analyse van complete structuren of organen mogelijk. Hier beschreven is een eenvoudige methode om immunolabeling van dikke nierschijfjes te combineren, optische clearing met ethyl CINNAMAAT, en confocale beeldvorming die visualisatie en kwantificering van driedimensionale nierstructuren mogelijk maakt.

Optische clearing en beeldvorming van Immunolabeled nierweefsel

Dit artikel bevat gedetailleerde instructies om onderzoekers in staat te stellen omkeerbare unilaterale ureterobstructie bij muizen uit te voeren met behulp van een gestandaardiseerd model dat analyse mogelijk maakt van de structurele en functionele resultaten op lange termijn na de omkering van langdurige ureterobstructie.

Een muismodel om de structurele en functionele resultaten op lange termijn te evalueren na de omkering van langdurige unilaterale ureterobstructie

Dit artikel presenteert een ischemisch CKD-model met behulp van unilaterale nier-IRI met contralaterale nefrectomie die één dag voor het monster wordt genomen; dit protocol maakt serumgebaseerde functionele beoordeling, hoge overleving en reproduceerbare CKD-pathologie na 28 en 42 dagen mogelijk, wat een veelzijdig platform biedt voor mechanistische en interventionele studies.

Muizenmodel van de overgang van acute naar chronische nierziekte veroorzaakt door nierischemie/reperfusieschade

Een laser-speckle contrast beeldvormingssysteem werd gebruikt om de veranderingen in de microvasculaire bloedstroom van de nier te monitoren tijdens unilaterale nierischemie-reperfusie na de resectie van de rechternier bij muizen.

Microvasculaire perfusie gemonitord met laserspeckle contrastbeeldvorming tijdens nierischemie - reperfusieschade bij muizen

Leer de geïsoleerde geperfuseerde niertechniek bij muizen voor nierfysiologieonderzoek zonder systemische invloeden. Deze methode biedt inzicht in acute nierbeschadiging en geïsoleerde orgaanfunctie.

De geïsoleerde Mouse perfusie Kidney Techniek

Meer video's verkennen