Name: Met behulp van RNA-sequencing te detecteren Novel Splice varianten Gerelateerd aan Drug Resistance in In Vitro Cancer Models (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Leer RNA-sequencing om nieuwe splice-varianten te detecteren die gerelateerd zijn aan medicijnresistentie in kankercellen. Deze methode combineert transcriptoomanalyse met cytotoxiciteitsscreening voor beter inzicht in chemotherapiefalen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen prof. J.J. McGuire, prof. R. Kofler en dr. K. Quint graag danken voor het verstrekken van de resistente cellijnen die in dit werk zijn gebruikt. Het onderzoek is gefinancierd door subsidies van de Cancer Center Amsterdam (CCA) Foundation (voor JC, EG en RS), de KiKa (Kinderen Kankervrij) stichting (voor AW), de Peter G. Angelos Advocatenkantoor-subsidie van de Mesothelioma Applied Research Foundation (voor VEG en EG), Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC), Istituto Toscano Tumori (ITT) en Regione Toscana Bando FAS Salute (voor EG).

<ol><li>Gottesman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+cancer+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Med%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of cancer drug resistance.</a> Annu Rev Med. 53, 615-627 (2002).</li>
<li>McDermott, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+Development+of+Chemotherapy+and+Targeted+Therapy+Drug-Resistant+Cancer+Cell+Lines%3A+A+Practical+Guide+with+Case+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">In vitro Development of Chemotherapy and Targeted Therapy Drug-Resistant Cancer Cell Lines: A Practical Guide with Case Studies.</a> Front Oncol. 4, 40(2014).</li>
<li>Kaspers, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prednisolone+resistance+in+childhood+acute+lymphoblastic+leukemia%3A+vitro-vivo+correlations+and+cross-resistance+to+other+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Prednisolone resistance in childhood acute lymphoblastic leukemia: vitro-vivo correlations and cross-resistance to other drugs.</a> Blood. (1), 259-266 (1998).</li>
<li>van Meerloo, J., Kaspers, G. J., Cloos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+sensitivity+assays%3A+the+MTT+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell sensitivity assays: the MTT assay.</a> Methods Mol Biol. 731, 237-245 (2011).</li>
<li>Vichai, V., Kirtikara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sulforhodamine+B+colorimetric+assay+for+cytotoxicity+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Sulforhodamine B colorimetric assay for cytotoxicity screening.</a> Nat Protoc. 1 (3), 1112-1116 (2006).</li>
<li>Wojtuszkiewicz, A., Assaraf, Y. G., Maas, M. J., Kaspers, G. J., Jansen, G., Cloos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-mRNA+splicing+in+cancer%3A+the+relevance+in+oncogenesis%2C+treatment+and+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Metab+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Pre-mRNA splicing in cancer: the relevance in oncogenesis, treatment and drug resistance.</a> Expert Opin Drug Metab Toxicol. 5, 673-689 (2015).</li>
<li>Liu, S., Cheng, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+RNA+splicing+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+RNA%22%5BJournal%5D)">Alternative RNA splicing and cancer.</a> Wiley Interdiscip Rev RNA. 4 (5), 547-566 (2013).</li>
<li>Wojtuszkiewicz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folylpolyglutamate+synthetase+splicing+alterations+in+acute+lymphoblastic+leukemia+are+provoked+by+methotrexate+and+other+chemotherapeutics+and+mediate+chemoresistance%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Folylpolyglutamate synthetase splicing alterations in acute lymphoblastic leukemia are provoked by methotrexate and other chemotherapeutics and mediate chemoresistance.</a> Int J Cancer. 138 (7), 1645-1656 (2016).</li>
<li>Shendure, J., Ji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+DNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Next-generation DNA sequencing.</a> Nat Biotechnol. 10, 1135-1145 (2008).</li>
<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat Rev Genet. 1, 57-63 (2009).</li>
<li>Ozsolak, F., Milos, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+sequencing%3A+advances%2C+challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA sequencing: advances, challenges and opportunities.</a> Nat Rev Genet. 2, 87-98 (2011).</li>
<li>Han, Y., Gao, S., Muegge, K., Zhang, W., Zhou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+Applications+of+RNA+Sequencing+and+Challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinform+Biol+Insights%22%5BJournal%5D)">Advanced Applications of RNA Sequencing and Challenges.</a> Bioinform Biol Insights. 9 (Suppl 1), 29-46 (2015).</li>
<li>Khatoon, Z., Figler, B., Zhang, H., Cheng, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+to+RNA-Seq+and+its+applications+to+drug+discovery+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Dev+Res%22%5BJournal%5D)">Introduction to RNA-Seq and its applications to drug discovery and development.</a> Drug Dev Res. 5, 324-330 (2014).</li>
<li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+stranded+and+non-stranded+RNAseq+transcriptome+profiling+and+investigation+of+gene+overlap%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Comparison of stranded and non-stranded RNAseq transcriptome profiling and investigation of gene overlap.</a> BMC Genomics. 16, 675(2015).</li>
<li>Carrara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+detection+workflow+needs+a+careful+combination+of+sample+prep+and+bioinformatics+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing detection workflow needs a careful combination of sample prep and bioinformatics analysis.</a> BMC Bioinformatics. 16 (Suppl 9), (2015).</li>
<li>Dobin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAR%3A+ultrafast+universal+RNA-seq+aligner%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner.</a> Bioinformatics. 29, 15-21 (2013).</li>
<li>Wang, L., Wang, S., Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RSeQC%3A+quality+control+of+RNA-seq+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">RSeQC: quality control of RNA-seq experiments.</a> Bioinformatics. 28, 2184-2185 (2012).</li>
<li>Hooper, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+software+for+genome-wide+discovery+of+differential+splicing+in+RNA-Seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Genomics%22%5BJournal%5D)">A survey of software for genome-wide discovery of differential splicing in RNA-Seq data.</a> Hum Genomics. 8, (2014).</li>
<li>Shen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MATS%3A+a+Bayesian+framework+for+flexible+detection+of+differential+alternative+splicing+from+RNA-Seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">MATS: a Bayesian framework for flexible detection of differential alternative splicing from RNA-Seq data.</a> Nucleic Acids Res. 8, e61(2012).</li>
<li>Vargas, I. M., Vivas-Mejìa, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+mRNA+splice+variants+by+qRT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Assessment of mRNA splice variants by qRT-PCR.</a> Methods Mol Biol. 1049, 171-186 (2013).</li>
<li>Hala, M., Hartmann, B. L., Böck, G., Geley, S., Kofler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoid-receptor-gene+defects+and+resistance+to+glucocorticoid-induced+apoptosis+in+human+leukemic+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoid-receptor-gene defects and resistance to glucocorticoid-induced apoptosis in human leukemic cell lines.</a> Int J Cancer. 68 (5), 663-668 (1996).</li>
<li>Schmidt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoid+resistance+in+two+key+models+of+acute+lymphoblastic+leukemia+occurs+at+the+level+of+theglucocorticoid+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoid resistance in two key models of acute lymphoblastic leukemia occurs at the level of theglucocorticoid receptor.</a> FASEB J. 20 (14), 2600-2602 (2006).</li>
<li>McCloskey, D. E., McGuire, J. J., Russell, C. A., Rowan, B. G., Bertino, J. R., Giuseppe Pizzorno, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+folylpolyglutamate+synthetase+activity+as+a+mechanism+of+methotrexate+resistance+in+CCRF-CEM+human+leukemia+sublines%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Decreased folylpolyglutamate synthetase activity as a mechanism of methotrexate resistance in CCRF-CEM human leukemia sublines.</a> The Journal of Biological Chemistry. 266 (10), 6181-6187 (1991).</li>
<li>Quint, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+cancer+cells+surviving+gemcitabine+treatment+express+markers+of+stem+cell+differentiation+and+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Oncol%22%5BJournal%5D)">Pancreatic cancer cells surviving gemcitabine treatment express markers of stem cell differentiation and epithelial-mesenchymal transition.</a> Int J Oncol. 41 (6), 2093-2102 (2012).</li>
<li>Lin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DDX5+is+a+positive+regulator+of+oncogenic+NOTCH1+signaling+in+T+cell+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">DDX5 is a positive regulator of oncogenic NOTCH1 signaling in T cell acute lymphoblastic leukemia.</a> Oncogene. 32 (40), 4845-4853 (2013).</li>
<li>Mazurek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquired+dependence+of+acute+myeloid+leukemia+on+the+DEAD-box+RNA+helicase+DDX5%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Acquired dependence of acute myeloid leukemia on the DEAD-box RNA helicase DDX5.</a> Cell Rep. 7 (6), 1887-1899 (2014).</li>
<li>Calabretta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+PKM+alternative+splicing+by+PTBP1+promotes+gemcitabine+resistance+in+pancreatic+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Modulation of PKM alternative splicing by PTBP1 promotes gemcitabine resistance in pancreatic cancer cells.</a> Oncogene. , (2016).</li>
<li>Azoitei, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKM2+promotes+tumor+angiogenesis+by+regulating+HIF-1%CE%B1+through+NF-%CE%BAB+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer%22%5BJournal%5D)">PKM2 promotes tumor angiogenesis by regulating HIF-1α through NF-κB activation.</a> Mol Cancer. 15 (1), (2016).</li>
<li>Samuels, A. L., Heng, J. Y., Beesley, A. H., Kees, U. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+modulation+overcomes+glucocorticoid+resistance+in+T-lineage+acute+lymphoblastic+leukaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic modulation overcomes glucocorticoid resistance in T-lineage acute lymphoblastic leukaemia.</a> Br J Haematol. 165 (1), 57-66 (2014).</li>
<li>Rots, M. G., Pieters, R., Kaspers, G. J., Veerman, A. J., Peters, G. J., Jansen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classification+of+ex+vivo+methotrexate+resistance+in+acute+lymphoblastic+and+myeloid+leukaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Classification of ex vivo methotrexate resistance in acute lymphoblastic and myeloid leukaemia.</a> Br J Haematol. 110 (4), 791-800 (2000).</li>
<li>Funel, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+microdissection+and+primary+cell+cultures+improve+pharmacogenetic+analysis+in+pancreatic+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Laser microdissection and primary cell cultures improve pharmacogenetic analysis in pancreatic adenocarcinoma.</a> Lab Invest. 88 (7), 773-784 (2008).</li>
<li>Gillet, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redefining+the+relevance+of+established+cancer+cell+lines+to+the+study+of+mechanisms+of+clinical+anti-cancer+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Redefining the relevance of established cancer cell lines to the study of mechanisms of clinical anti-cancer drug resistance.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (46), 18708-18713 (2011).</li>
<li>Kole, R., Krainer, A. R., Altman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+therapeutics%3A+beyond+RNA+interference+and+antisense+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">RNA therapeutics: beyond RNA interference and antisense oligonucleotides.</a> Nat Rev Drug Discov. 11 (2), 125-140 (2012).</li>
<li>Shen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((rMATS%3A+robust+and+flexible+detection+of+differential+alternative+splicing+from+replicate+RNA-Seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">rMATS: robust and flexible detection of differential alternative splicing from replicate RNA-Seq data.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (51), E5593-E5601 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier beschrijven we een nieuwe benadering die gevestigde cytotoxiciteit screening technieken en krachtige NGS-gebaseerde transcriptomische combineert analyses differentiële splicing gebeurtenissen te identificeren met betrekking tot resistentie tegen geneesmiddelen. Spectrofotometrische assays gemakkelijk en robuust high-throughput methoden geneesmiddelgevoeligheid in vitro kankermodellen beoordelen en vormen de eerste keuze voor veel laboratoria die cytotoxiciteit screenings. Problemen en mogelijke varianten v...

Ondanks aanzienlijke vooruitgang in de behandeling van kanker, resistentie van kwaadaardige cellen voor chemotherapie, intrinsiek of bij langdurige blootstelling aan het geneesmiddel verkregen, is de belangrijkste oorzaak van falen van de behandeling in een breed scala van leukemie en vaste tumoren 1. Om de onderliggende mechanismen resistentie, in vitro cellijn modellen bakenen ontwikkeld door stapsgewijze selectie van kankercellen resistent zijn tegen chemotherapeutica. Deze procedure bootst de regimes worden gebruikt in de klinische settings en maakt daarom een ​​diepgaand onderzoek van de relevante mechanismen weerstand. Resistente cellen die de behandeling overleven worden vervolgens uit ouderlijke gevoelige cellen gekenmerkt met cellevensvatbaarheid / cytotoxiciteitassays 2. In vitro resistentie profielen van primaire cellen bleken significant gerelateerd aan klinische respons op chemotherapie 3 te zijn. High-throughput cytotoxiciteit testen vormen een geschikte methode om geneesmiddelgevoeligheid in vitro bepalen. Hierin wordt de levensvatbaarheid van de cellen beoordeeld door bijvoorbeeld de 3- [4,5-dimethylthiazol-2-yl] -2,5-difenyltetrazoliumbromide - MTT assay 4, die is gebaseerd op de metabole omzetting van bepaalde substraten (dwz tetrazoliumzouten) in gekleurde producten, waardoor de mitochondriale activiteit van cellen weerspiegelt. Als alternatief kan de cellulaire eiwitten worden gekwantificeerd met behulp van de sulforhodamine B (SRB) test 5. Hier is het aantal levensvatbare cellen is evenredig met de optische dichtheid (OD) gemeten bij een geschikte golflengte in een spectrofotometer, zonder behoefte uitgebreide en tijdrovende procedures celtellingen. De groeiremming veroorzaakt door een bepaald chemotherapeutisch geneesmiddel kan worden berekend op basis van de buitendiameter van de putjes die cellen werden behandeld met een testmiddel en vergeleken met de OD van onbehandelde controlecellen. Een dosis-response curve OBTAined door het uitzetten geneesmiddelconcentratie versus percentage levensvatbare cellen ten opzichte van controle cellen. Tenslotte kan geneesmiddelgevoeligheid worden gerapporteerd als de concentratie die resulteert in 50% van de celgroei remming vergeleken met onbehandelde cellen (IC 50). De onderliggende mechanismen geneesmiddelresistentie omvatten vele verschillende afwijkingen zoals veranderingen beïnvloeden genexpressie determinanten medicijnactiviteit en cellulaire metabolisme. Deze moleculaire laesies, met inbegrip van mutaties, afwijkingen bij een transcriptionele en post-transcriptionele niveau als gestoorde epigenetische regulatie vaak van invloed op genen die betrokken zijn, hetzij in het metabolisme van geneesmiddelen of apoptose 6. Alternatieve pre-mRNA splicing en zijn ingewikkelde regelgeving hebben onlangs veel aandacht als een nieuwe entiteit die geneesmiddelen resistentie van kankercellen 7 kan dicteren. Tot 95% van de menselijke genen alternatief gesplitste in normale cellen door middel van dezestrak gereguleerd proces waarbij verschillende isovormen eiwit produceert uit hetzelfde gen. Alternatieve splicing is vaak gedereguleerd bij kanker en verscheidene tumoren worden gekenmerkt door veranderde splicing van steeds meer genen betrokken bij geneesmiddelmetabolisme (dwz desoxycytidinekinase, folylpolyglutamaat synthetase of Multidrug resistentie eiwitten) 6,8. Echter, uitgebreide analyse van splicing profielen van geneesmiddelen resistente cellen pijnlijk ontbreekt. Daarom is het noodzakelijk om hoge doorvoer werkwijzen voor alternatieve splicing analyse ontwikkelen. Dit zou kunnen helpen om meer effectieve therapeutische benaderingen te ontwikkelen. Tijdens het laatste decennium heeft de snelle ontwikkeling van de volgende generatie sequencing (NGS) technologieën voor biomedisch onderzoek met nieuwe inzichten in de moleculaire mechanismen die ten grondslag regulatie van het genoom meningsuiting en hun rol in verschillende biologische processen 9 verrijkt. RNA-sequencing (RNA-seq) is een krachtige sub-applicatievan NGS op het gebied van transcriptomics. Het kan een genoom-brede profilering (kwalitatief en kwantitatief) van de expressiepatronen van duizenden genen tegelijkertijd is zeer geschikt voor de karakterisering van nieuwe coderende mRNAs als lange niet-coderende RNA, miRNA, siRNA en andere kleine RNA klassen (bijv snRNA en Pirna) 10,11. RNA-Seq heeft vele voordelen ten opzichte van eerdere technieken voor transcriptoom karakterisering (bijvoorbeeld Sanger sequentiebepaling en expressie microarrays). Het is niet gebaseerd op bestaande genoomannotatie, het heeft een enkele nucleotide resolutieniveau en een breder dynamisch bereik voor expressieniveau schatting. In het kort, de basis experimentele workflow van RNA-seq experimenten bestaat uit gepolyadenyleerd transcript (mRNA) selectie en fragmentatie, gevolgd door omzetting in cDNA, bibliotheek bouw en ten slotte, massaal parallelle deep sequencing 12,13. Door snelle daling van sequencinkosten g in de afgelopen jaren, RNA-seq wordt geleidelijk vervangen door andere technologieën en aanzienlijke inspanningen worden gedaan om de bibliotheek voorbereiding protocollen te verbeteren. Zo is het mogelijk om de streng informatie van mRNA transcripten behouden door het markeren van de tweede cDNA-streng met deoxyuridine trifosfaat (dUTP) en voorafgaand aan PCR amplificatie, digereren de gemerkte streng met uracil-DNA-glycosilase (UDG). Dit proces verbetert de nauwkeurigheid van gen-annotatie en de schatting van de expressie levels 14,15. Het analyseren en interpreteren van RNA-seq data vereisen complexe en krachtige computationele softwarepakketten en verwerking in bioinformatica pijpleidingen 16,17. Ten eerste, de rauwe leest kwaliteitscontrole ondergaan door het wegnemen van technische en biologische artefacten en weggooien (trimmen) de sequenties die geen strenge kwaliteitseisen niet bereiken. Vervolgens wordt het bed voor elk monster worden toegewezen aan een referentie genoom en geïndexeerdin gen-niveau, exon-niveau of transcript niveau, teneinde de overvloed van elke categorie bepalen. Afhankelijk van de toepassing, zijn verfijnde data vervolgens berekend door middel van statistische modellen voor de identificatie van allel-specifieke expressie, alternatieve splicing, gen fusies en single nucleotide polymorphisms (SNPs) 12. Ten slotte kan differentiële analyses op geselecteerde niveau (dat wil zeggen, genexpressie of alternatieve splicing) worden gebruikt om monsters die onder verschillende omstandigheden te vergelijken. Differentiële splicing analyse beschrijft de verschillen in splice gebruik van de site tussen de twee monsters. Steeds softwarepakketten is voor dit doel zijn gebaseerd op verschillende statistische modellen, uitvoeringen en gebruikersinterface 18. Onder deze, MATS (Multivariate analyse van Transcript verbinden) naar voren als een vrij beschikbaar en precieze computational tool gebaseerd op een Bayesian statistische kader en ontworpen om diffe detecterenrential splicing gebeurtenissen uit enkele of gepaarde end RNA-seq data. Vanaf de uitgelijnde (.bam) bestanden, kan MATS detecteren alle belangrijke types van alternatieve splicing gebeurtenissen (exon skipping, alternatieve 3&#39;-splitsingsplaats, alternatieve 5&#39;-splitsingsplaats, elkaar uitsluitende exons en retentie intron - zie ook figuur 1). Ten eerste, de software identificeert leest die een zekere verbinding gebeurtenis, bij voorbeeld exon skipping en classificeert ze in twee types. &quot;Inclusion leest&quot; (voor de canonieke splice event) kaart binnen de onderzochte exon en span de verbindingen tussen die specifiek exon en de twee upstream en downstream flankerende exonen. &quot;Skipping leest&quot; (voor de alternatieve splice event) overspannen de kruising tussen de twee flankerende exonen. Vervolgens MATS geeft de genormaliseerde opname niveau voor zowel de canonieke en alternatieve evenementen en vergelijkt waarden tussen de monsters of voorwaarden. Uiteindelijk berekent P-waarde and valse ontdekking rate (FDR) aangenomen dat het verschil in de verhouding variant van een gen tussen twee voorwaarden een bepaalde door de gebruiker gedefinieerde drempel voor elke splitsing gebeurtenis 19,34 overschrijdt. Naar aanleiding van differentiële splicing analyse in combinatie met RNA-seq, is een uitgebreide experimentele validatie gerechtvaardigd om true-positieve kandidaten 18 gen te identificeren. Kwantitatieve reverse transcriptie-polymerase ketenreactie (qRT-PCR) is de meest gebruikte en optimale methode validatie kandidaten verkregen uit RNA-Seq analyse 20. Het doel van dit artikel is om een ​​robuuste methodologie om resistentie gerelateerde splicing profielen in solide tumoren en hematologische maligniteiten onderzoeken bieden. Onze aanpak maakt gebruik van RNA-seq-gebaseerde transcriptoom profilering van geselecteerde cellijn modellen van resistente vormen van kanker in combinatie met een gevestigde qRT-PCR-methode voor de validatie van kandidaat-genen betrokken bij resistentie tegen geneesmiddelen. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; De humane leukemie cellijn modellen die in deze studie werden pediatrische T-cel acute lymfoblastische leukemie (T-ALL) cellijn CCRF-CEM (CEM-WT), de twee glucocorticoïden (GC) resistente subklonen CEM -C7H2-R5C3 (CEM-C3) en CEM-C7R5 (CEM-R5) 21,22 en de methotrexaat (MTX) resistente sublijn CEM / R30dm 23. Hoewel de huidige therapieën op basis van GC en MTX vestigen klinisch voordeel bij ongeveer 90% van de gevallen, de opkomst van GC-resistentie vormt nog steeds een onopgelost probleem met een onduidelijke moleculaire mechanisme. GC-resistente subklonen isoleren CEM-WT cellen werden gekweekt in 1 uM dexamethason (Dex) gedurende 2 tot 3 weken. MTX-resistente sublijn CEM / R30dm werd ontwikkeld door middel van herhaalde korte termijn (24 uur) blootstelling van CEM-WT-cellen tot 30 uM MTX als een nabootsing van de klinische protocollen. Interessant is weergegeven deze cellijn ook kruisresistentie Dex (niet gepubliceerde resultaten) waarvoor het mechanisme niet volledig begrepen. De vaste tumof model onderzocht in deze studie is de pancreas ductaal adenocarcinoom, berucht om zijn buitengewone ongevoeligheid voor chemotherapie. Daartoe selecteerden we Panc-1 cellijn en gemcitabine-resistente subkloon Panc-1R verkregen door continue incubatie met 1 uM van het geneesmiddel 24. Hier beschrijven we een benadering om nieuwe onderliggende mechanismen in vitro geneesmiddelresistentie ontdekken combineert drie protocollen: colorimetrische cytotoxiciteit assays geneesmiddelgevoeligheid in leukemische cellen en kankercellen van solide tumoren, RNA-seq gebaseerde pijpleiding beoordelen op nieuwe splice-varianten met betrekking tot identificatie geneesmiddelgevoeligheid / resistentie en RT-PCR en qRT-PCR analyse potentiële kandidaten valideren.

<table><tbody><tr><td>Sulforhodamine B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230162</td><td></td></tr><tr><td>Trichloroazijnzuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>251399</td><td></td></tr><tr><td>CCRF-CEM</td><td>ATCC, Manassas, VA, USA</td><td>ATCC CCL-119</td><td></td></tr><tr><td>Panc-1</td><td>ATCC, Manassas, VA, USA</td><td>ATCC CRL-1469</td><td></td></tr><tr><td>DMEM hoge glucose</td><td>Lonza, Basel, Zwitserland</td><td>12-604F</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640&nbsp;</td><td>Gibco, Carlsbad, CA, USA</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>Foetaal runderserum en kalfserum</td><td>Greiner Bio-One, Frickenhausen, Duitsland</td><td>758093</td><td></td></tr><tr><td>penicilline G streptomycinesulfaat</td><td>Gibco, Carlsbad, CA, USA</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)-aminomethaan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>252859</td><td></td></tr><tr><td>MTT formazan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2003</td><td></td></tr><tr><td>Anthos-Elisa-reader 2001</td><td>Labtec, Heerhugowaard, Nederland</td><td></td><td>UV-Vis 96-well plate spectrofotometer</td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR 96-well platen</td><td>Greiner/Sigma</td><td>M0812-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine/EDTA-oplossing 100 ml</td><td>Lonza, Basel, Zwitserland</td><td>CC-5012</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR celcultuurkolven 25 cm2</td><td>Greiner Bio-One, Frickenhausen, Duitsland</td><td>82051-074</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR celcultuurkolven 75 cm3</td><td>Greiner Bio-One, Frickenhausen, Duitsland</td><td>82050-856</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaatbufferoplossing (NaCl 0,9%)</td><td>B.Braun Melsungen AG, Duitsland</td><td>362 3140</td><td></td></tr></tbody></table>

met behulp van rna-sequencing te detecteren novel splice varianten gerelateerd aan drug resistance in<em&gt; in vitro</em&gt; cancer models

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

Geneesmiddelenresistentie blijft een groot probleem in de behandeling van kanker voor zowel hematologische maligniteiten en vaste tumoren. Intrinsiek of verworven resistentie kan worden veroorzaakt door een aantal mechanismen, waaronder verhoogde eliminatie van het geneesmiddel, verminderde geneesmiddelopname, drug inactivatie en veranderingen van drug targets. Recente gegevens toonden aan dat anders dan door bekende genetische (mutatie, versterking) en epigenetische (DNA Hypermethylering, histone post-translationele modificatie) modificaties, resistentie tegen geneesmiddelen mechanismen kan ook worden gereguleerd door splicing aberraties. Dit is een snel groeiend gebied van onderzoek dat toekomstige aandacht om meer effectieve therapeutische benaderingen plannen verdient. De in dit document beschreven protocol is gericht op onderzoek naar de gevolgen van afwijkende splitsing op resistentie in solide tumoren en hematologische maligniteiten. Om dit doel te bereiken, analyseerden we het transcriptoom profielen van verschillende in vitro modellen door middel van RNA-seq en stellened een qRT-PCR-methode om kandidaatgenen te valideren. In het bijzonder, evalueerden we de differentiële splicing van DDX5 en PKM transcripties. De afwijkende splitsing gedetecteerd door de rekenkundige functie MATS werd gevalideerd in leukemische cellen, wat aantoont dat verschillende DDX5 splice varianten zijn tot expressie gebracht in de ouderlijke vs. resistente cellen. In deze cellen zagen we ook meer PKM2 / PKM1 verhouding, die niet werd gedetecteerd in de Panc-1 gemcitabine-resistente tegenhanger in vergelijking met ouderlijke Panc-1-cellen, suggereert een ander mechanisme van resistentie geïnduceerd door blootstelling gemcitabine.

De cytotoxiciteit assays beschreven in het protocol een betrouwbare en robuuste werkwijze voor de weerstand van kankercellen te bepalen chemotherapeutische middelen in vitro. Door middel van de MTT assay gevoeligheid voor Dex werd bepaald vier T-ALL cellijnen, waaronder Dex-gevoelige ouderlijke CEM-WT-cellen, en drie Dex-resistente sublijnen: CEM / R30dm, CEM-R5 en CEM-C3. Twee verschillende concentratiebereiken moesten worden gebruikt vanwege het grote verschil in gevoeligheid ...

Hier beschrijven we een protocol gericht op onderzoek naar de gevolgen van afwijkende splicing op resistentie in solide tumoren en hematologische maligniteiten. Om dit doel te bereiken, analyseerden we het transcriptoom profielen van de ouders en bestand in vitro modellen door middel van RNA-seq en vestigde een qRT-PCR-methode om kandidaatgenen te valideren.

Met behulp van RNA-sequencing te detecteren Novel Splice varianten Gerelateerd aan Drug Resistance in<em&gt; In Vitro</em&gt; Cancer Models

Drug resistance remains a major problem in the treatment of cancer for both hematological malignancies and solid tumors. Intrinsic or acquired resistance ...

Het algemene doel van dit protocol is om de associatie van aberrante splicing met drugresistentieprofielen te onderzoeken in in vitro-modellen van solide tumoren en hematologische maligniteiten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van de moleculaire farmacologie en chemotherapieresistentie, zoals: wat zijn de mechanismen die ten grondslag liggen aan drugresistentie op post-transcriptioneel niveau? Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een goed gevestigd cytotoxiciteitsscreeningsprotocol combineert met krachtige transcriptomische analyse op basis van next-generation sequencing.Deze techniek zou kunnen leiden tot een beter begrip van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan het falen van chemotherapie en zal de vroegtijdige detectie van drugresistentie verbeteren. Deze methode kan inzicht verschaffen in genoombrede determinanten van drugresistentie in cellijnmodellen. Daarnaast kan het worden toegepast op andere systemen, zoals primaire patiëntenmonsters en xenografts.Deze procedure zal worden gedemonstreerd door Johan Fomirno, een technicus van ons laboratorium bij het Cancer Center Amsterdam. Bereid voor het u

using-rna-sequencing-to-detect-novel-splice-variants-related-to-drug

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Vanwege het tijdelijke karakter van de pre-mRNA, kan het moeilijk zijn te isoleren en te...

Een snelle High-throughput Methode voor Mapping Ribonucleoproteins (RNP&#39;s) op de menselijke pre-mRNA

Het is aangetoond dat de regulatie van alternatieve splicing bijdraagt aan de epitheel-mesenchymale overgang (EMT), een essentieel cellulair programma in verschillende fysiologische en pathologische processen. Hier beschrijven we een methode die gebruikmaakt van een induceerbaar EMT-model voor de detectie van alternatieve splicing tijdens EMT.

Detectie van alternatieve splicing Tijdens-mesenchymale transitie

RNA-sequencing en bioinformatica analyses werden significant verschillend tot expressie en transcriptiefactoren in Lin-CD34 + en CD34-Lin subpopulaties van muis EMLcells identificeren. Deze transcriptiefactoren kunnen een belangrijke rol spelen bij het bepalen van de switch tussen zelfvernieuwende Lin-CD34 + en gedeeltelijk gedifferentieerd Lin-CD34-cellen.

Identificatie van Key factoren die de Self-vernieuwing en differentiatie in EML Hematopoietic voorloper cellen door RNA-sequencing Analyse

Geneesmiddelresistentie voor gerichte therapeutica is wijdverbreid en de noodzaak om resistentiemechanismen te identificeren - voor of na de eerste klinische verschijnselen - is essentieel voor het geleiden alternatieve klinische strategieën. Hier presenteren we een protocol te koppelen afleiding van resistente lijnen in vitro sequentiebepaling ontdekking van deze mechanismen te bespoedigen.

Invoer van<em&gt; In Vitro</em&gt; Drug Resistance Testen: maximaliseren van het potentieel voor het blootleggen van klinisch relevante resistentiemechanismen

Dit manuscript beschrijft een techniek voor het opsporen van mutaties van lage frequentie in ctDNA, ER-Seq. Deze methode is onderscheiden zich door het unieke gebruik van twee-directionele foutcorrectie, een speciale achtergrond filter en efficiënte moleculaire verwerving.

Detectie van zeldzame mutaties in CtDNA met behulp van de volgende generatie Sequencing

Hier beschrijven we een in situ hybridisatie bepaling waarmee gevoelige en specifieke detectie van sequenties 50 nucleotiden met single-nucleotide resolutie op het niveau van eencellige zo kort. De assay, die kan worden uitgevoerd, handmatig of automatisch, kunt inschakelen visualisatie van splice varianten, korte reeksen en mutaties in het kader van het weefsel.

Visualiseren van genetische varianten, korte doelen en puntmutaties in het kader van de morfologische weefsel met een RNA In Situ hybridisatie Assay

Dit protocol biedt een snel en nuttig hulpmiddel voor het evalueren van de rol van een eiwit met een niet-gekarakteriseerde functie in alternatieve splicing-regulatie na chemotherapeutische behandeling.

De E1A Minigene Tool gebruiken om mRNA-splicingwijzigingen te bestuderen

Alternatieve splicing (AS) en alternatieve polyadenylation (APA) vergroten de diversiteit van transcriptisovormen en hun producten. Hier beschrijven we bioinformatische protocollen om bulk RNA-seq en 3'-eindsequencingtests te analyseren om AS en APA te detecteren en te visualiseren, variërend tussen experimentele omstandigheden.

Identificatie van alternatieve splicing en polyadenylation in RNA-seq-gegevens

Dit protocol beschrijft een minigene reporter assay om de impact van 5'-splice site mutaties op splicing te monitoren en ontwikkelt suppressor U1 snRNA voor de redding van mutatie-geïnduceerde splicing remming. De reporter en suppressor U1 snRNA constructen worden uitgedrukt in HeLa cellen, en splicing wordt geanalyseerd door primer extensie of RT-PCR.

Een op reporter gebaseerde cellulaire test voor het bewaken van splicing-efficiëntie

Het protocol beschrijft een tandem-immunofluorescentiehybridisatietest met in formaline gefixeerd in paraffine ingebed weefsel om microRNA en gemultiplexte eiwitten tegelijkertijd te detecteren en te kwantificeren.

MicroRNA-amplificatie en -herkenning door middel van locked-nucleic-acid in situ hybridisatie als een nieuwe detectie- en kwantificeringsmethode

Leer RNA-sequencing om nieuwe splice-varianten te detecteren die gerelateerd zijn aan medicijnresistentie in kankercellen. Deze methode combineert transcriptoomanalyse met cytotoxiciteitsscreening voor beter inzicht in chemotherapiefalen.

Met behulp van RNA-sequencing te detecteren Novel Splice varianten Gerelateerd aan Drug Resistance in

Meer video's verkennen