Een alternatieve benadering voor Monstervoorbereidingstesten met een lage aantal cellen voor TEM Analyse

Het algemene doel van deze procedure is het voorbereiden van monsters met een laag aantal cellen om TEM-analyse op een efficiënte en reproduceerbare manier uit te voeren. Deze methode kan helpen om alle structuren van echte cellen en betere fysiologische instellingen in het biomedische veld te onthullen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat zowel kwalitatieve als kwantitatieve resultaten op reproduceerbare wijze kunnen worden verkregen uit een laag aantal cellen.

Begin met het sorteren van 10.000 hematopoëtische stamcellen, of HSC's, met behulp van FACS in een 1,5 mL microcentrifugebuis die 600 µL isocoves gemodificeerd Dulbecco-medium met 10% FBS bevat. Centrifugeer de gesorteerde HSC's vervolgens 10 minuten lang bij 1.000 ×g met een centrifuge voorzien van een swing-out rotor.

Gebruik een zachte aspiratie om al het medium te verwijderen, behalve 200 µL. Voeg ter fixatie van de cellen 0,2 mL vers bereide twee X fixeeroplossing toe en incubeer gedurende één uur bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens 600 µL 0,1 M cacodylaatbuffer toe om de cellen te wassen.

Centrifugeer de cellen opnieuw, deze keer bij 30 °C. Verwijder na centrifugatie alle buffer behalve 200 µL, voeg 200 µL van 2 mg/mL Evans Blue in cacodylaatbuffer toe en incubeer 20 minuten bij kamertemperatuur om de cellen te kleuren. Was de cellen drie keer met 600 µL 0,1 M cacodylaatbuffer.

Resuspendeer vervolgens de cellen in de resterende 200 microliters buffer voordat de celsuspensie wordt overgebracht naar een 0,5 mL buisje. Bij deze stap moet het pellet in het buisje zichtbaar zijn. Centrifugeer de cellen met een tafelcentrifuge gedurende 10 minuten bij 1.000 ×g.

Verwijder vervolgens voorzichtig de buffer zonder het nu zichtbare kleine celpellet te verstoren, waarbij 50 µL buffer in de buis achterblijft. Bereid een 4% agarose-oplossing door 200 mg laagsmeltende agarose toe te voegen aan vijf milliliter 0,1 M cacodylaatbuffer in een 15 mL buis. Smelt de agarose door de buis in kokend water in een glazen fles van 100 mL te plaatsen.

Voeg 200 µL van de agaroseoplossing toe aan de buis met de cel-suspensie. Centrifugeer onmiddellijk bij 1 000 ×g en 30 °C gedurende 10 minuten. Nadat is bevestigd dat de cellen zijn neergeslagen in de halfvaste agarose op de bodem van de buis, wordt de buis direct voor 20 minuten overgebracht naar 4 °C of op ijs om de agarose te laten stollen.

Breng de gestolde agarose, die het celpellet bevat, met een naald van 27 gauge voorzichtig over naar een plastic petrischaal van 35 mL die 0,1 molar cacodylaatbuffer bevat. Trim met een scalpel de gestolde agarose met het celpellet tot één stukje van ongeveer één tot twee millimeter. Breng dit vervolgens over naar een nieuwe buis van 1,5 mL.

Voeg 600 µL 0,1 M cacodylaatbuffer toe en was het agarose celpellet door de buffer met een pipet toe te voegen en vervolgens te verwijderen. Verwijder de buffer uit het agarose celpellet en voeg in een zuurkast, terwijl u beschermende kleding en handschoenen draagt, 1 mL 1% osmiumtetroxide-oplossing toe. Incubeer het celpellet één uur bij 4 °C.

Was na de incubatie het monster drie keer. Breng het over naar een glazen scintillatiebuisje van 20 mL met dop. Dehydrateer vervolgens het monster met behulp van een ethanolserie.

Infiltreer het monster vervolgens in toenemende concentraties LX 112 hars in ethanol voordat het twee keer gedurende 60 minuten wordt geïncubeerd in 100% hars. Plaats het monster met een pincet voorzichtig op de bodem van een piramidevormige rubberen mal en voeg pure hars toe bovenop het monster om de mal te vullen. Incubeer het monster gedurende 72 uur bij 60 °C om de hars te polymeriseren.

Wanneer de hars is gepolymeriseerd, wordt deze uit de mallen verwijderd door de rubberen mal te torderen. Er moet een klein zwart cluster cellen zichtbaar zijn in de gepolymeriseerde hars-piramide. Gebruik cyanoacrylaat om de gepolymeriseerde hars-piramide op een montagecilinder te bevestigen voor het maken van coupes.

Nadat het blok op een ultramicrotoom is gemonteerd, gebruikt u een scheermesje en een diamantmes om het piramideblok bij te snijden, zodanig dat een korte, brede trapeziumvorm ontstaat waarbij de boven- en onderkant van het blok parallel aan elkaar lopen en de zijkanten gelijkmatig schuin aflopen. Gebruik vervolgens het diamantmes om het blok rondom de celpellet bij te snijden en verwijder de plastic secties rondom het agarose-stukje met de celpellet. Snijd met de ultramicrotoom secties van één micrometer en gebruik een wimpeerinstrument en een metalen lus om de secties van de waterbak naar een objectglas te verplaatsen.

Plaats de objectglaasjes vervolgens op een warmteplaat bij 37 °C om ze te laten drogen. Voeg met een injectiespuit met een filter van 0,22 µm een druppel toluidineblauwe oplossing toe aan de coupes en laat dit drie minuten incuberen. Spoel de objectglaasjes vervolgens met gedestilleerd water en laat de coupes drogen.

Controleer na het drogen de secties onder een lichtmicroscoop om de positie van de cellen te bepalen. Gebruik vervolgens een diamantmes om ultradunne secties te snijden. Verplaats daarna met een wimperhulptool twee tot drie secties vanuit de waterboot naar 200 mesh grids en plaats deze in een glazen petrischaal.

Plaats de schaal met grids 30 minuten op een warmteplaat bij 30 graden Celsius om de coupes te drogen. Voeg druppels 1%uranylacetate toe en incubeer 10 minuten bij kamertemperatuur om de grids te kleuren. Spoel vervolgens zes tot acht keer na met gedestilleerd water.

Kleur met Reynolds loodcitraat bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten voordat u zes tot acht keer spoelt. Plaats de glazen petrischaal met de grids op een warmteplaat bij 37 °C om de secties te drogen. Analyseer slutend de secties met een elektronenmicroscoop bij 87 kV.

Hier zijn bij lage vergroting semi-dunne, met toluidineblauw gekleurde coupes te zien van blokken met een zeer klein cellpellet, die een cluster cellen bevestigen. Deze afbeelding bij hogere vergroting toont de intacte morfologie van de cellen. Deze figuur represents een overzichtsveld van het celcluster uit ultradunne coupes die werden gekleurd met uranylacetaat en loodcitraat en geanalyseerd met elektronenmicroscopie.

Hier is een enkele HSC afgebeeld, wat aantoont dat de morfologie en ultrastructuur van de cellen goed bewaard zijn gebleven. Een elektronenmicrografie van een individuele HSC bij een hogere vergroting toont de intracellulaire ultrastructuren. Daarnaast legden beelden bij hoge vergroting de goed bewaard gebleven structuur en integriteit van subcellulaire organellen, zoals mitochondriën, vast.

Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in vijf tot zes uur worden uitgevoerd. Voor geavanceerde blauwe kleuring en inbedding in agarose, gevolgd door normale TEM-verwerking, is vijf tot zes dagen nodig indien dit correct wordt uitgevoerd. Na het bekijken van deze video heeft u een goed inzicht in hoe u monsters voorbereidt vanuit een werkelijke celpreparatie voor TEM-analyse.