Name: Een alternatieve benadering voor Monstervoorbereidingstesten met een lage aantal cellen voor TEM Analyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Leer een efficiënte methode voor TEM-analyse van monsters met weinig cellen, zoals 10.000 hematopoëtische stamcellen. Deze techniek levert reproduceerbare kwalitatieve en kwantitatieve resultaten voor celbiologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken de Pathology Research Core voor de hulp bij elektronenmicroscoopanalysestudies in het Cincinnati Children's Hospital Medical Center. Het werk werd ondersteund door NIH (American Society of Hematology Bridge award naar MDF; R01 DK102890 naar MDF).

Alle experimentele procedures werden goedgekeurd door de institutionele dier commissie bij Research Foundation de Cincinnati Children&#39;s. Voor dit onderzoek werden hematopoietische stamcellen uit het beenmerg van C57BL / 6 inteeltmuizen leeftijd 2-4 maanden. Celsortering middels FACS na kleuring van BM met verschillende oppervlakte makers zoals Lineage, c-Kit, Sca-1, Flt3 en CD34 werd gebruikt voor zuivering van HSC op basis Lin- Sca-1 + c-Kit + Flt3 - CD34 - gating strategie standaard protocol beschreven vóór 8. LET OP: Een aantal zeer giftige chemicaliën worden gebruikt tijdens deze procedure. Deze zijn giftig bij inademing en contact met de huid. Draag handschoenen en beschermende kleding. Werken in zuurkast tijdens het werken met deze chemicaliën. 1. Cellen, Fixatie, vlekken en pre-inbedding <ol><li> Sorteren 10.000 hematopoietische stamcellen (middels Lin - Sca-1 <sup&gt; + c-Kit + Flt3 - CD34 - gating strategie; LT-HSC populatie) in een 1,5 ml microcentrifugebuis met 600 pl Iscove&#39;s gemodificeerd Dulbecco&#39;s medium (IMDM) met 10% foetaal runderserum middels FACS. </li><li> Spin down gesorteerde HSCs bij 1000 g gedurende 10 min in een 1,5 ml microcentrifugebuis met een centrifuge met swing-out emmers. Verwijder medium door behoedzame aspiratie en laat 200 ul medium in de buizen bij elke stap. In dit stadium de celpellet onzichtbaar blijft in de buis. </li><li> Fixeer de cellen door toevoeging van 0,2 ml 2x fixeeroplossing bij kamertemperatuur (KT) gedurende 1 uur 1,9. <ol><li> Maak de fixerende oplossing vers voor gebruik. Bij 1x wordt de oplossing bestaat uit 3% paraformaldehyde en 2,5% glutaaraldehyde in 0,1 M cacodylaatbuffer. </li></ol></li><li> Centrifugeer de cellen bij 1000 xg gedurende 10 min bij 30 ° C onder toepassing van een centrifuge met swing-out emmers. </li><li> Was de cellen met 600 pi 0,1 M cacodylaatbuffermiddels centrifugatie en laat 200 pl buffer in de buis na centrifugeren. </li><li> Vlekken op de gefixeerde cellen door toevoeging van 200 ui 2 mg / ml oplossing van Evans Blue in cacodylaatbuffer en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. De cellen zullen blauw gekleurd. </li><li> Was de cellen 3 maal met 600 ui 0,1 M cacodylaatbuffer middels centrifugatie en laat 200 pl buffer in de buis telkens. </li><li> Resuspendeer de cellen in 200 ul buffer en breng de celsuspensie aan een 0,5 ml buis. Centrifugeer bij 1000 xg gedurende 10 min met behulp van een tafelblad centrifuge. Verwijder voorzichtig buffer zonder de nu zichtbaar kleine celpellet en laat 50 pl buffer in de buis. </li><li> Voeg 200 mg laagsmeltende agarose 5 ml 0,1 M cacodylaatbuffer in de 15 ml buis voor een 4% agarose-oplossing. Smelt de agarose door de overdracht van de buis aan kokend water in een 100 ml glazen fles en blijf lauw tot gebruik. </li><li> Voeg 200 ui 4% laagsmeltende agarose opgelost in 0,1 M cacodylaTE-buffer aan de celsuspensie in 0,5 ml buis direct gecentrifugeerd bij 1000 xg gedurende 10 min bij 30 ° C met een tafelblad centrifuge. </li><li> Na bevestiging dat cellen gepelleteerd onderaan de 0,5 ml buis in de halfvaste agarose na centrifugatie geeft de buis 4 ° C of ijs overdragen gedurende 20 min om de agarose stollen. Deze stap is zeer kritisch, als een kleine toegankelijk celpellet in deze stap resulteert in een goede cluster van cellen onder de elektronenmicroscoop. </li><li> Breng voorzichtig de gestolde agarose met de celpellet van de buis naar een 35 mm plastic petrischaal met buffer met behulp van een 27 G naald 3,10. </li><li> Trim de gestolde agarose met de celpellet in een stuk van ongeveer 1-2 mm met een scalpel. Breng de agarose stuk met de celpellet om een ​​nieuwe 1,5 ml buis. </li><li> Was 2-3 maal van 600 gl 0,1 M cacodylaatbuffer door het toevoegen en verwijderen van buffer met een pipet zonder centrifugeren. Gebruik deze agarose stuk waarin de cel pellet voor de volgende stap. Bij deze stap kan het monster worden bewaard bij 4 ° C geïncubeerd alvorens naar de volgende stap. </li></ol> 2. Osmification, Uitdroging, Embedding <ol><li> Verwijder de cacodylaatbuffer van 1,5 ml buis met de celpellet met agarose met een pipet. Voeg 1,0 ml van 1% osmiumtetraoxide (OsO 4) oplossing in een zuurkast, en incubeer gedurende 1 uur bij 4 ° C. </li><li> Was driemaal met 600 ui 0,1 M cacodylaatbuffer en overbrengen van het monster naar een 20 ml glazen scintillatiebuisje met een kap. </li><li> Verwerk de steekproef voor uitdroging, infiltratie en het integreren hars (bijv LX-112) met periodieke veranderingen van de volgende oplossingen in een 6-wells plaat. Verplaats de cel-pellet agarose stuk behulp van een tang. <ol><li> Dompel het monster in 25% ethanol bij kamertemperatuur gedurende 15 min. </li><li> Dompel het monster in 50% ethanol bij kamertemperatuur gedurende 15 min. </li><li> Dompel het monster in 75%ethanol bij kamertemperatuur gedurende 15 min. </li><li> Dompel het monster in 95% ethanol bij kamertemperatuur gedurende 15 min. </li><li> Dompel het monster in 100% ethanol bij kamertemperatuur gedurende 15 min, tweemaal. </li><li> Dompel het monster in ethanol: resin (3: 1) bij kamertemperatuur gedurende 30 min. </li><li> Dompel het monster in ethanol: resin (1: 1) bij kamertemperatuur gedurende 30 min. </li><li> Dompel het monster in ethanol: resin (1: 3) bij kamertemperatuur gedurende 30 min. </li><li> Dompel het monster in zuivere hars bij kamertemperatuur gedurende 60 min, tweemaal. </li></ol></li><li> Breng het monster op de bodem van de piramide tip vormige rubber mal met behulp van een tang zorgvuldig en voeg meer pure hars op de top van het monster om de mal te vullen. Incubeer het monster bij 60 ° C gedurende 72 uur voor polymerisatie hars. </li><li> Verwijder de gepolymeriseerde hars piramide van de mallen door het verdraaien van de rubberen mal. Een kleine zwarte cluster van cellen moet zichtbaar zijn in de gepolymeriseerde hars piramide, zoals eerder 7 beschreven. Bevestig de gepolymeriseerde hars piramide op de montage van de cilinder met behulp van cyanoacrylaat. </li></ol><ol><li> Knip het piramideblok met een scheermesje en een diamanten mes na montage het blok op een ultra-microtoom. Voeg een korte brede trapeziumvorm met de bovenkant en de onderkant van het blok evenwijdig aan elkaar en bij gelijkmatig schuine kanten. Deze vorm van de piramide helpt voor seriële snijden. </li><li> Verder, trim het blok rond de cel pellet met de diamant mes en verwijder de plastic delen rond de cel pellet agarose stuk. </li><li> Snijd 1 micrometer secties met behulp van een ultra-microtoom. Verplaats de 1 micrometer secties uit het water boot naar een glasplaatje met behulp van een wimper gereedschap en een metalen lus gereedschap zoals eerder gemeld 7. Transfer secties op objectglaasjes en overdracht objectglaasjes hete plaat (37 ° C) te drogen. </li><li> Een druppeltje toluïdineblauw oplossing van de secties met een spuit met 0,22 urn filter en incubeer gedurende 3 min. Spoel de dia&#39;s met gedestilleerd water en let de secties drogen. Controleren met een lichtmicroscoop om de positie van de cellen te identificeren. </li><li> Snijd ultra-dunne secties (70-100 nm) met een diamanten mes. Move 2-3 secties op 200-mesh netten uit het water boot naar een glazen petrischaal met behulp van een wimper tool. </li><li> Breng de glazen petrischaal met netten sectie om een ​​hete plaat bij 30 ° C te drogen secties 30 min. </li><li> Vlekken op de roosters met dalingen van 1% uranylacetaat bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten en spoel in gedestilleerd water 6-8 tijden. Vlek met Reynolds loodcitraat bij kamertemperatuur 5 minuten en spoel in gedestilleerd water 6-8 keer. Breng de glazen petrischaal met de roosters een hete plaat bij 37 ° C te drogen secties. </li><li> Analyseer de secties met een elektronenmicroscoop bij 80 kV 7. </li></ol>

<ol><li>Bozzola, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conventional+specimen+preparation+techniques+for+transmission+electron+microscopy+of+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Conventional specimen preparation techniques for transmission electron microscopy of cultured cells.</a> Methods Mol Biol. 369, 1-18 (2007).</li>
<li>Leapman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+techniques+in+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Novel techniques in electron microscopy.</a> Curr Opin Neurobiol. 14, 591-598 (2004).</li>
<li>Anderson, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+of+preparing+peripheral+leucocytes+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ulstract+Res%22%5BJournal%5D)">A method of preparing peripheral leucocytes for electron microscopy.</a> J Ulstract Res. 13, 263-268 (1965).</li>
<li>Taupin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+scarce+biological+samples+for+light+and+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Histochem%22%5BJournal%5D)">Processing scarce biological samples for light and transmission electron microscopy.</a> Eur J Histochem. 52, 135-139 (2008).</li>
<li>Mather, J., Stanbridge, C. M., Butler, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+the+removal+of+selected+cells+from+cytological+smear+preparations+for+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Method for the removal of selected cells from cytological smear preparations for transmission electron microscopy.</a> J Clin Pathol. 34, 1355-1357 (1981).</li>
<li>Oorschot, V., de Wit, H., Annaert, W. G., Klumperman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+flat-embedding+method+to+prepare+ultrathin+cryosections+from+cultured+cells+in+their+in+situ+orientation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">A novel flat-embedding method to prepare ultrathin cryosections from cultured cells in their in situ orientation.</a> J Histochem Cytochem. 50, 1067-1080 (2002).</li>
<li>Kumar, S., Ciraolo, G., Hinge, A., Filippi, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+and+reproducible+process+for+transmission+electron+microscopy+%28TEM%29+of+rare+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">An efficient and reproducible process for transmission electron microscopy (TEM) of rare cell populations.</a> J Immunol Methods. 404, 87-90 (2014).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+hematopoietic+stem+cells+with+SLAM+and+LSK+markers+for+the+detection+of+hematopoietic+stem+cell+function+in+normal+and+Trp53+null+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Enrichment of hematopoietic stem cells with SLAM and LSK markers for the detection of hematopoietic stem cell function in normal and Trp53 null mice.</a> Exp Hematol. 36, 1236-1243 (2008).</li>
<li>Hopwood, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+reactions+between+formaldehyde%2C+glutaraldehyde+and+osmium+tetroxide%2C+and+their+fixation+effects+o+bovine+serum+albumin+and+on+tissue+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry%22%5BJournal%5D)">The reactions between formaldehyde, glutaraldehyde and osmium tetroxide, and their fixation effects o bovine serum albumin and on tissue blocks.</a> Histochemistry. 24, 50-64 (1970).</li>
<li>Saini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+synthase+localization+in+the+rat+neutrophils%3A+immunocytochemical%2C+molecular%2C+and+biochemical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide synthase localization in the rat neutrophils: immunocytochemical, molecular, and biochemical studies.</a> J Leukoc Biol. 79, 519-528 (2006).</li>
<li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+small+GTPase+Rap1b+negatively+regulates+neutrophil+chemotaxis+and+transcellular+diapedesis+by+inhibiting+Akt+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The small GTPase Rap1b negatively regulates neutrophil chemotaxis and transcellular diapedesis by inhibiting Akt activation.</a> J Exp Med. 211, 1741-1758 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Deze methode maakt het mogelijk TEM analyse van laag aantal cellen, met behulp van Evans blauwe vlekken en agarose inbedding een kleine cel pellet te lokaliseren tijdens de uitdroging, hars inbedding en snijden processen. Belangrijk stelt zij celgroepen elkaar en behoudt de cel ultra-structuur, hetgeen wenselijk om meerdere cellen voor het kwantificeren van data worden onderzocht. In TEM onderzoeken, wordt een celpellet met miljoenen cellen vaak vereist voor een efficiënte inbedding in een a...

Ultra-structurele en suborganel data van cellen zijn voornamelijk aangetoond door transmissie- elektronenmicroscopie (TEM) studies weefsels of celpellets 1,2. Stevige stukjes weefsel kan eenvoudig worden gebruikt voor elektronenmicroscopie studies. Echter, TEM analyse 1,3 op cellen in suspensie blijven uitdagend en vereisen hoge celaantallen, dwz miljoenen cellen. Hierdoor ultra-structurele analyses van zeldzame celpopulaties in suspensie, bijvoorbeeld hematopoietische stamcellen (HSC) worden niet gemakkelijk beoordeeld. Meerdere pogingen voor TEM analyse van schaarse monsters met behulp van cytospin of monolaag benaderingen niet aan belangrijke kwantitatieve gegevens te krijgen van het beperkte aantal cellen. Zo is de eis van een hoog aantal cellen beperkt het gebruik van deze krachtige instrument om de subcellulaire ultrastructurele data van zeldzame celpopulaties begrijpen. Een belangrijke beperking voor TEM studies met een beperkt aantal van de cels in suspensie is de lokalisatie van de cellen voor verwerking en dus TEM onderzoeken van beperkte cellen met bijzonder kleine afmetingen blijven uitdagend. Verschillende alternatieve benaderingen zijn genomen om deze beperking tegen te gaan: de BSA / bisacrylamide (BSA-BA) gemedieerde polymerisatie van celsuspensie, de kleuring van cellen met een kleurstof ze zichtbaar op een dunne film-ondersteuning, inclusief dekglaasjes te maken, en TEM analyses van cytospinpreparaten 4-6. Echter, was zeer beperkt succes, als zeer weinig cellen werden gevonden in de secties na ultra-snijden. De belangrijkste uitdaging voor het identificeren van schaarse cellen blijft bestaan, omdat de cel monolaag grotendeels onzichtbaar in de gestolde gel voor het snijden blijft. Bovendien kunnen cytospine bereiding van cellen hun cellulaire organisatie veranderen door celspreiding en de kwetsbaarheid van de celstructuur. Vandaar dat deze inherente nadelen rechtvaardigen een nieuwe benadering voor TEM studies uit te voeren vanaf zeldzame celpopulaties met meerconsistentie. Om dit probleem op te lossen, hebben we een nieuwe en alternatieve monstervoorbereiding methode beschreven voor TEM studies zeldzame celpopulaties 7. Hier melden wij een efficiënte monstervoorbereiding protocol om TEM uit te voeren vanaf schaarse biologische monsters met consistente kwalitatieve en kwantitatieve resultaten. Evans blauw kleuring werd uitgevoerd na bevestiging aan een kleine cel pellet van lage aantal cellen, dat wil zeggen, 10.000 beenmerg hematopoietische stamcellen en stamcellen die anders onzichtbaar zou zijn gebleven lokaliseren, en de pellet werd ingebed in agarose voor uitdroging en hars inbedding processen. Deze methode bundelt de cellen elkaar en maakt een efficiënte analyse van de ultrastructuur en subcellulaire organisatie van hematopoietische stamcellen (aangeduid als Lin - Sca-1 + c-Kit + Flt3 - CD34 -, HSC), een zeldzame 0,2-0,5% celpopulatie in het beenmerg. Deze experimentele proprotocol kan nuttig zijn om ultra-structurele studies uit te voeren en de kwantitatieve resultaten op vele zeldzame, maar zeer belangrijke populatie te verkrijgen.

<table><tbody><tr><td>Paraformaldehyde 20% Aqueous Soln</td><td>Electron microscopy Sciences</td><td>15713</td><td>VOORZICHTIG Toxisch via inademing, contact met de huid. Draag handschoenen, gebruik afzuiging.</td></tr><tr><td>Gluteraldehyde 70% Aqueous Soln</td><td>Electron microscopy Sciences</td><td>16350</td><td>VOORZICHTIG Toxisch via inademing, contact met de huid. Draag handschoenen, gebruik afzuiging.</td></tr><tr><td>Cacodyladate buffer&nbsp;</td><td>Electron microscopy Sciences</td><td>12300</td><td>Maak 0.1 M Cacodyladate buffer (pH 7.4) in gedistilleerd water, bewaar bij 4 &deg;C. VOORZICHTIG Irriterend bij inademing of contact met de huid, draag handschoenen en werk in afzuigkap.</td></tr><tr><td>Evans Blue&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>E-2129</td><td></td></tr><tr><td>Low melting agarose&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A-5030</td><td></td></tr><tr><td>Osmium tetraoxide</td><td>Electron microscopy Sciences</td><td>19130</td><td>1 g in 50 ml van 0.1 M cacodyladate buffer om 2% OsO4 voorraad te maken, VOORZICHTIG Zeer toxisch bij inademing of contact met de huid, sterke oxidator, draag beschermende kleding, oogbescherming, gebruik afzuigkap.</td></tr><tr><td>LX-112 Inbeddingskits (LADD&reg;)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DDSA (Dodecenylsuccinic anhydride)</td><td>LADD</td><td>21340</td><td>Meng 16% DDSA; 30% NMA; 54% LX-112 samen en voeg vervolgens 1.4% DMP-30 toe</td></tr><tr><td>NMA (Nadic methyl anhydride)</td><td>LADD</td><td>21350</td><td></td></tr><tr><td>Epoxyharsen Epon 812 (LX-112)</td><td>LADD</td><td>21310</td><td>VOORZICHTIG Toxisch via inademing, contact met de huid. Draag handschoenen, beschermende kleding, gebruik afzuigkap.</td></tr><tr><td>DMP-30 (2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)fenol)</td><td>LADD</td><td>21370</td><td></td></tr><tr><td>Reynolds lead citrate (EM Stain II)</td><td>Leica</td><td></td><td>VOORZICHTIG Toxisch via inademing, vermijd contact met de huid of ogen.</td></tr><tr><td>Uranyl acetate (EM Stain I)</td><td>Leica</td><td>8072820</td><td>VOORZICHTIG Toxisch via inademing, vermijd contact met de huid of ogen.</td></tr><tr><td>Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)</td><td>ATCC</td><td>30-2005</td><td>samenstelling: NaCl, NaHCO3, HEPES, Glucose, Ca, Mg, natriumpyrovaronaat etc. Voor details https://www.atcc.org/~/media/Attachments/E/9/7/E/4893.ashx</td></tr><tr><td>Pyramid tip mold&nbsp;</td><td>Ted Pella</td><td>10585</td><td></td></tr><tr><td>montage cilinders</td><td>Ted Pella</td><td>10580</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-microtome&nbsp;</td><td>(Leica EM UC7)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 mesh grids (nikil)</td><td>Electron microscopy Sciences</td><td>G-200 Ni</td><td></td></tr><tr><td>Elektronenmicroscoop</td><td>Hitachi model H-7650&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beeldopnamesoftware</td><td>AMT-600&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 mm plastic petrischalen</td><td>Fisher scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quick Bond Super lijm Cyanoacrylaat&nbsp;</td><td>Electron microscopy Sciences</td><td>72588</td><td></td></tr><tr><td>Veiligheidsmesjes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glazen scintillatiebuisjes&nbsp;</td><td>Fisher scientific&nbsp;</td><td>03-337-14</td><td></td></tr><tr><td>Glazen objectglaasjes&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eyelash tool</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metaal lus tool&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

een alternatieve benadering voor monstervoorbereidingstesten met een lage aantal cellen voor tem analyse

An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

Transmissie elektronen microscopie (TEM) geeft details van de cellulaire organisatie en ultrastructuur. Echter, TEM analyse van zeldzame celpopulaties, met name cellen in suspensie zoals hematopoietische stamcellen (HSCs) blijft beperkt door de eis van een hoog aantal cellen tijdens de voorbehandeling. Er zijn enkele cytospin of monolaag benaderingen TEM analyse van schaarse monsters, maar deze benaderingen niet significante kwantitatieve gegevens uit het beperkte aantal cellen. Hier wordt een alternatieve en nieuwe benadering voor de monstervoorbereiding in TEM studies beschreven voor zeldzame celpopulaties dat kwantitatieve analyse mogelijk maakt. Een relatief laag aantal cellen, dat wil zeggen, 10.000 HSCs, werd met succes gebruikt voor TEM analyse werden de miljoenen cellen doorgaans gebruikt voor TEM studies. In het bijzonder werd Evans blauw kleuring uitgevoerd na paraformaldehyde-glutaaraldehyde fixatie (PFA-GA) naar het kleine cel pel visualiserenlaat die gefaciliteerd inbedding in agarose. Clusters van talrijke cellen waargenomen in ultra-dunne secties. De cellen hadden een goed bewaard morfologie en de ultra-structurele details van het Golgi complex en verschillende mitochondriën toegankelijk. Deze efficiënte, eenvoudige en reproduceerbare protocol maakt monstervoorbereiding van geringe aantal cellen en kan worden gebruikt voor de kwalitatieve en kwantitatieve analyse van TEM zeldzame celpopulaties van biologische monsters beperkt.

Een efficiënte en consistente protocol voor monstervoorbereiding tot TEM analyse van een gering aantal cellen wordt beschreven uit te voeren. Post-fixatie kleuren met Evans blauw en de overdracht van cellen naar een 0,5 ml microcentrifugebuis geholpen visualiseren kleine celpellet 7. Osmification met osmiumtetraoxide in agarose geleid tot een eenvoudige detectie van het donkere celpellet gedurende de dehydratie en inbedding. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-...

Hier presenteren we een protocol om monsters met een laag aantal cellen voor te bereiden op transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) analyse.

Een alternatieve benadering voor Monstervoorbereidingstesten met een lage aantal cellen voor TEM Analyse

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

Het algemene doel van deze procedure is het voorbereiden van monsters met een laag aantal cellen om TEM-analyse op een efficiënte en reproduceerbare manier uit te voeren. Deze methode kan helpen om alle structuren van echte cellen en betere fysiologische instellingen in het biomedische veld te onthullen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat zowel kwalitatieve als kwantitatieve resultaten op reproduceerbare wijze kunnen worden verkregen uit een laag aantal cellen.Begin met het sorteren van 10.000 hematopoëtische stamcellen, of HSC's, met behulp van FACS in een 1,5 mL microcentrifugebuis die 600 µL isocoves gemodificeerd Dulbecco-medium met 10% FBS bevat. Centrifugeer de gesorteerde HSC's vervolgens 10 minuten lang bij 1.000 ×g met een centrifuge voorzien van een swing-out rotor.Gebruik een zachte aspiratie om al het medium te verwijderen, behalve 200 µL. Voeg ter fixatie van de cellen 0,2 mL vers bereide twee X fixeeroplossing toe en incubeer gedurende één uur bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens 600 µL 0,1 M cacodylaatbuffer toe om de cellen te wassen.Centrifugeer de cellen opnieuw, deze keer bij 30 °C. Verwijder na centrifugatie alle buffer behalve 200 µL, voeg 200 µL van 2 mg/mL Evans Blue in cacodylaatbuffer toe en incubeer 20 minuten bij kamertemperatuur om de cellen te kleuren. Was de cellen drie keer met 600 µL 0,1 M cacodylaatbuffer.Resuspendeer vervolgens de cellen in de resterende 200 microliters buffer voordat de celsuspensie wordt overgebracht naar een 0,5 mL buisje. Bij deze stap moet het pellet in het buisje zichtbaar zijn. Centrifugeer de cellen met een tafelcentrifuge gedurende 10 minuten bij 1.000 ×g.Verwijder vervolgens voorzichtig de buffer zonder het nu zichtbare kleine celpellet te verstoren, waarbij 50 µL buffer in de buis achterblijft. Bereid een 4% agarose-oplossing door 200 mg laagsmeltende agarose toe te voegen aan vijf milliliter 0,1 M cacodylaatbuffer in een 15 mL buis. Smelt de agarose door de buis in kokend water in een glazen fles van 100 mL te plaatsen.Voeg 200 µL van de agaroseoplossing toe aan de buis met de cel-suspensie. Centrifugeer onmiddellijk bij 1 000 ×g en 30 °C gedurende 10 minuten. Nadat is bevestigd dat de cellen zijn neergeslagen in de halfvaste agarose op de bodem van de buis, wordt de buis direct voor 20 minuten overgebracht naar 4 °C of op ijs om de agarose te laten stollen.Breng de gestolde agarose, die het celpellet bevat, met een naald van 27 gauge voorzichtig over naar een plastic petrischaal van 35 mL die 0,1 molar cacodylaatbuffer bevat. Trim met een scalpel de gestolde agarose met het celpellet tot één stukje van ongeveer één tot twee millimeter. Breng dit vervolgens over naar een nieuwe buis van 1,5 mL.Voeg 600 µL 0,1 M cacodylaatbuffer toe en was het agarose celpellet door de buffer met een pipet toe te voegen en vervolgens te verwijderen. Verwijder de buffer uit het agarose celpellet en voeg in een zuurkast, terwijl u beschermende kleding en handschoenen draagt, 1 mL 1% osmiumtetroxide-oplossing toe. Incubeer het celpellet één uur bij 4 °C.Was na de incubatie het monster drie keer. Breng het over naar een glazen scintillatiebuisje van 20 mL met dop. Dehydrateer vervolgens het monster met behulp van een ethanolserie.Infiltreer het monster vervolgens in toenemende concentraties LX 112 hars in ethanol voordat het twee keer gedurende 60 minuten wordt geïncubeerd in 100% hars. Plaats het monster met een pincet voorzichtig op de bodem van een piramidevormige rubberen mal en voeg pure hars toe bovenop het monster om de mal te vullen. Incubeer het monster gedurende 72 uur bij 60 °C om de hars te polymeriseren.Wanneer de hars is gepolymeriseerd, wordt deze uit de mallen verwijderd door de rubberen mal te torderen. Er moet een klein zwart cluster cellen zichtbaar zijn in de gepolymeriseerde hars-piramide. Gebruik cyanoacrylaat om de gepolymeriseerde hars-piramide op een montagecilinder te bevestigen voor het maken van coupes.Nadat het blok op een ultramicrotoom is gemonteerd, gebruikt u een scheermesje en een diamantmes om het piramideblok bij te snijden, zodanig dat een korte, brede trapeziumvorm ontstaat waarbij de boven- en onderkant van het blok parallel aan elkaar lopen en de zijkanten gelijkmatig schuin aflopen. Gebruik vervolgens het diamantmes om het blok rondom de celpellet bij te snijden en verwijder de plastic secties rondom het agarose-stukje met de celpellet. Snijd met de ultramicrotoom secties van één micrometer en gebruik een wimpeerinstrument en een metalen lus om de secties van de waterbak naar een objectglas te verplaatsen.Plaats de objectglaasjes vervolgens op een warmteplaat bij 37 °C om ze te laten drogen. Voeg met een injectiespuit met een filter van 0,22 µm een druppel toluidineblauwe oplossing toe aan de coupes en laat dit drie minuten incuberen. Spoel de objectglaasjes vervolgens met gedestilleerd water en laat de coupes drogen.Controleer na het drogen de secties onder een lichtmicroscoop om de positie van de cellen te bepalen. Gebruik vervolgens een diamantmes om ultradunne secties te snijden. Verplaats daarna met een wimperhulptool twee tot drie secties vanuit de waterboot naar 200 mesh grids en plaats deze in een glazen petrischaal.Plaats de schaal met grids 30 minuten op een warmteplaat bij 30 graden Celsius om de coupes te drogen. Voeg druppels 1%uranylacetate toe en incubeer 10 minuten bij kamertemperatuur om de grids te kleuren. Spoel vervolgens zes tot acht keer na met gedestilleerd water.Kleur met Reynolds loodcitraat bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten voordat u zes tot acht keer spoelt. Plaats de glazen petrischaal met de grids op een warmteplaat bij 37 °C om de secties te drogen. Analyseer slutend de secties met een elektronenmicroscoop bij 87 kV.Hier zijn bij lage vergroting semi-dunne, met toluidineblauw gekleurde coupes te zien van blokken met een zeer klein cellpellet, die een cluster cellen bevestigen. Deze afbeelding bij hogere vergroting toont de intacte morfologie van de cellen. Deze figuur represents een overzichtsveld van het celcluster uit ultradunne coupes die werden gekleurd met uranylacetaat en loodcitraat en geanalyseerd met elektronenmicroscopie.Hier is een enkele HSC afgebeeld, wat aantoont dat de morfologie en ultrastructuur van de cellen goed bewaard zijn gebleven. Een elektronenmicrografie van een individuele HSC bij een hogere vergroting toont de intracellulaire ultrastructuren. Daarnaast legden beelden bij hoge vergroting de goed bewaard gebleven structuur en integriteit van subcellulaire organellen, zoals mitochondriën, vast.Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in vijf tot zes uur worden uitgevoerd. Voor geavanceerde blauwe kleuring en inbedding in agarose, gevolgd door normale TEM-verwerking, is vijf tot zes dagen nodig indien dit correct wordt uitgevoerd. Na het bekijken van deze video heeft u een goed inzicht in hoe u monsters voorbereidt vanuit een werkelijke celpreparatie voor TEM-analyse.

an-alternative-approach-for-sample-preparation-with-low-cell-number

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In dit artikel beschrijven we een eenvoudige methode voor het verzamelen van enkele cellen van rat primaire neuronale culturen en de daaropvolgende transcriptoom analyse met behulp van ARNA versterking. Deze aanpak is generaliseerbaar naar een willekeurige cel type.

Transcriptoom Analyse van de individuele cellen

Dit protocol is te herstellen en zeldzame doelcellen een mengsel met de doelsoort achtergrond cellen voorbereiden moleculaire genetische karakterisering op het niveau van één cel. DNA kwaliteit is gelijk aan niet-behandelde afzonderlijke cellen en zorgt voor eencellige toepassing (beide screening gebaseerd en gerichte analyse).

Target cel pre verrijking en hele genoom versterking voor eencellige Downstream karakterisering

Een instrument en methoden voor de bereiding van de monster nanoliter middelgrote volumes voor transmissie-elektronenmicroscopie wordt gepresenteerd. Er zijn geen papier-bevlekken stappen vereist, dus het vermijden van de schadelijke gevolgen dat voor eiwitten hebben kan, aanzienlijk verminderen monster verlies en de analyse van eencellige lysate voor visuele proteomics inschakelen.

Verkleinde monstervoorbereiding voor transmissie-elektronenmicroscopie

Dit protocol worden de algemene procedures beschreven en kwaliteitscontrole controles nodig voor gezonde volwassen één zoogdiercellen voorbereiden druppel gebaseerde, hoge doorvoer eencellige RNA-Seq preparaten. Sequencing parameters, worden Lees uitlijning en downstream eencellige bioinformatic analyse ook geleverd.

Druppel Barcoding gebaseerde eencellige Transcriptomics van volwassen zoogdieren weefsels

Het huidige protocol beschrijft een eencellige methode voor iteratieve epigenomische analyses met behulp van een herbruikbare enkele cel. De herbruikbare enkele cel maakt analyses van meerdere epigenetische markeringen in dezelfde enkele cel en statistische validatie van de resultaten mogelijk.

Herbruikbare eencellige cel voor iteratieve epigenomische analyses

In dit protocol beschrijven we hoe zoogdiercellen kunnen worden voorbereid op eencellige proteomics-analyse via massaspectrometrie met behulp van in de handel verkrijgbare reagentia en apparatuur, met opties voor zowel handmatig als automatisch pipetteren.

Eencellige proteomics voorbereiding voor massaspectrometrie-analyse met behulp van freeze-heat lysis en een isobare drager

Het protocol biedt een betrouwbare en geoptimaliseerde benadering voor de isolatie van kernen uit solide tumormonsters voor multioomsequencing met behulp van het 10x Genomics-platform, inclusief aanbevelingen voor weefseldissociatieomstandigheden, cryopreservatie van eencellige suspensies en beoordeling van geïsoleerde kernen.

Geoptimaliseerde kernisolatie van verse en diepgevroren solide tumormonsters voor multioomsequencing

Dit protocol schetst de procedure voor het snel dissociëren van tumormonsters van mensen en muizen voor sequencing van enkelcellig RNA.

Dissociatie van tumorweefselmonsters van mensen en muizen voor eencellige RNA-sequencing

Dit protocol presenteert een praktische methode met Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) als voorbeeld om ongelijke deeltjesverdeling aan te pakken door optimalisatie van de monstervoorbereiding, en biedt een referentie voor onderzoekers om macromoleculaire structuren efficiënt op te helderen met behulp van cryogene elektronenmicroscopie (cryo-EM).

Optimalisatie van monstervoorbereiding voor cryogene elektronenmicroscopie

Hier presenteren we een protocol om single-cell histon posttranslationele modificatieanalyse te automatiseren met behulp van een isotopische twee-plex labelingstrategie en ArgC-digestie. Deze workflow maakt kwantitatieve, reproduceerbare en hooggevoelige profilering van chromatine-heterogeniteit en epigenetische responsen bij enkelcelresolutie mogelijk.

Geautomatiseerde monstervoorbereiding voor de multiplexanalyse van single-cel histon post-translationele modificaties (sc-hPTM2)

Leer een efficiënte methode voor TEM-analyse van monsters met weinig cellen, zoals 10.000 hematopoëtische stamcellen. Deze techniek levert reproduceerbare kwalitatieve en kwantitatieve resultaten voor celbiologisch onderzoek.

Een alternatieve benadering voor Monstervoorbereidingstesten met een lage aantal cellen voor TEM Analyse

Meer video's verkennen