Een alternatieve benadering voor Monstervoorbereidingstesten met een lage aantal cellen voor TEM Analyse

Het algemene doel van deze procedure is om monsters met een laag aantal cellen voor te bereiden om TEM-analyse op een efficiënte en reproduceerbare manier uit te voeren. Deze methode kan helpen om alle structuren van echte cellen en een betere fysiologische omgeving in het biomedische veld te onthullen. Het grote voordeel van deze techniek is dat zowel kwalitatieve als kwantitatieve resultaten kunnen worden verkregen van een laag aantal cellen op een reproduceerbare manier.

Gebruik om te beginnen feiten om 10.000 hematopoëtische stamcellen, of HSC's, in een 1,5 mL microcentrifugebuisje te sorteren. Bevat 600 microliter isocoves gemodificeerd dulbecco medium met 10% FBS. Gebruik een centrifuge met uitzwaaiende emmers om de gesorteerde HSC's 10 minuten lang bij 1.000 keer G naar beneden te centrifugeren.

Gebruik zachte aspiratie om alles behalve 200 microliter van het medium te verwijderen. Om de cellen te fixeren, voeg 0,2 mL vers bereide twee X fixeeroplossing toe en incubeer een uur op kamertemperatuur. Voeg vervolgens 600 microliter 0,1 molair cacodylaat buffer toe om de cellen te wassen.

Centrifugeer de cellen opnieuw, deze keer bij 30 graden Celsius. Na centrifugatie en het verwijderen van alles behalve 200 microliter buffer, voeg 200 microliter van twee milligram per milliliter evans blauw in cacodylaat buffer toe en incubeer 20 minuten op kamertemperatuur om de cellen te kleuren. Gebruik 600 microliter 0,1 molair cacodylaat buffer om de cellen drie keer te wassen.

Suspeneer de cellen vervolgens opnieuw in de resterende 200 microliter buffer voordat u de cellensuspensie overbrengt naar een 0,5 mL buisje. In deze stap zou het pellet zichtbaar moeten zijn in de buis. Met een tafelcentrifuge, centrifugeer de cellen 10 minuten bij 1.000 keer G.

Verwijder vervolgens voorzichtig het buffer zonder het nu zichtbare kleine cellenpellet te verstoren, waarbij 50 microliter buffer in de buis achterblijft. Bereid een 4% agaroseoplossing voor door 200 milligram laag smeltende agarose toe te voegen aan vijf milliliter 0,1 molair cacodylaat buffer in een 15 mL buisje. Smelt de agarose door de buis over te brengen naar kokend water in een 100 mL glazen fles.

Voeg 200 microliter van de agaroseoplossing toe aan het buisje met de cellensuspensie. Centrifugeer onmiddellijk bij 1.000 keer G en 30 graden Celsius gedurende 10 minuten. Nadat u hebt bevestigd dat de cellen in het semi-solide agarose op de bodem van het buisje zijn gepellet, brengt u het buisje onmiddellijk over naar vier graden Celsius of ijs gedurende 20 minuten om de agarose te laten stollen.

Gebruik een 27 gauge naald om de gestolde agarose, die het cellenpellet bevat, voorzichtig over te brengen naar een 35 mL plastic petrischaaltje met 0,1 molair cacodylaat buffer. Met een scalpel snijdt u het gestolde agarose dat het cellenpellet bevat, in één stuk van ongeveer een tot twee millimeter. Breng het vervolgens over naar een nieuw 1,5 mL buisje.

Voeg 600 microliter 0,1 molair cacodylaat buffer toe en was het agarose cellenpellet door met een pipet de buffer toe te voegen en te verwijderen. Verwijder de buffer van het agarose cellenpellet en voeg, terwijl u in een afzuigingskast beschermende kleding en handschoenen draagt, een milliliter 1% osmiumtetraoxideoplossing toe. Incubeer het cellenpellet een uur bij vier graden Celsius.

Na de incubatie, was het monster drie keer. Breng het over naar een 20 mL glazen scintillatieglas met een dop. Dehydrateer vervolgens het monster met een ethanol serie.

Infiltreer vervolgens het monster in toenemende concentraties van LX 112 hars in ethanol voordat u het twee keer gedurende 60 minuten in 100% hars incubeert. Gebruik pincetten om het monster voorzichtig over te brengen naar de bodem van een piramidevormige rubberen mal en voeg pure hars toe bovenop het monster om de mal te vullen. Incubeer het monster 72 uur bij 60 graden Celsius om de hars te polymeriseren.

Wanneer de hars is gepolymeriseerd, verwijdert u deze uit de mallen door de rubberen mal te draaien. Er zou een klein zwart cluster cellen zichtbaar moeten zijn in het gepolymeriseerde hars piramide. Gebruik cyanoacrylaat om het gepolymeriseerde hars piramide op een montagecilinder voor sectioeneren te bevestigen.

Nadat het blok op een ultramicrotoom is gemonteerd, gebruikt u een scheermesje en diamantmes om het piramideblok te trimmen, waardoor een korte, brede trapeziumvormige vorm ontstaat met de boven- en onderkant van het blok evenwijdig aan elkaar en met gelijkmatige hoekige zijden. Gebruik vervolgens het diamantmes om het blok rond het cellenpellet te trimmen en verwijder de plastic secties rond het cellenpellet agarose stuk. Snijd met de ultramicrotoom secties van één micrometer en gebruik een wimpertool en metalen lus om de secties van de waterboot naar een glasplaatje te verplaatsen.

Plaats vervolgens de plaatjes op een hotplate bij 37 graden Celsius om te drogen. Gebruik een spuit met een 0,22 micrometer filter om een druppel teluatine blauw oplossing op de secties toe te voegen en incubeer gedurende drie minuten. Spoel vervolgens met gedistilleerd water en laat de secties drogen.

Na het drogen controleert u de secties onder een lichtmicroscoop om de positie van de cellen te identificeren. Gebruik vervolgens een diamantmes om ultra dunne secties te snijden. Vervolgens verplaatst u met een wimpertool twee tot drie secties naar 200 mesh roosters van de waterboot en plaatst u deze in een glazen petrischaaltje.

Breng het schaaltje met roosters over naar een hotplate bij 30 graden Celsius gedurende 30 minuten om de secties te drogen. Voeg druppels van 1% uranylacetaat toe en incubeer gedurende 10 minuten op kamertemperatuur om de roosters te kleuren. Spoel vervolgens zes tot acht keer met gedistilleerd water.

Kleur met Reynolds loodcitrat op kamertemperatuur gedurende vijf minuten voordat u zes tot acht keer spoelt. Bren