Wijze van Direct Segmentale Intra-lever Delivery Met behulp van een Rat Liver Hilar Clamp Model
2 april 2017
Een unieke rattenlever hilaire clamp model ontwikkeld voor het bestuderen van de effecten van farmacologische moleculen bij het verbeteren van ischemie-reperfusieletsel. Dit model omvat directe canulatie van het portaal toevoer naar het segment ischemische lever via een tak van de poortader, zodat hij direct hepatische afgifte.
Het algemene doel van dit unieke model voor hilare klemmen van rattenlever is om de studie van de impact van farmacologische moleculen van belang mogelijk te maken bij het verminderen van ischemie-reperfusie-letsel. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van levertransplantatie over welke moleculen direct in de lever kunnen worden geïnjecteerd om ischemie-reperfusie-letsel te bemiddelen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de belangrijke molecuul direct in de poortader wordt geïnjecteerd, waardoor het distributievolume wordt verkleind.
De implicaties van deze techniek breiden zich uit tot de transplantatie van alle organen, omdat het de test van moleculen mogelijk maakt die kunnen worden toegevoegd aan orgaanperfusaten voor het verminderen van ischemie-reperfusie-letsel. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal vanwege de kleine grootte van de poortadervertakking die voor canuleringen wordt gebruikt. Begin met het bevestigen van het juiste niveau van sedatie door een teenprik, plaats vervolgens de rat op een verwarmingskussen onder een disserpeermicroscoop en houd de ledematen vast.
Maak vervolgens een middenlijn buikhuidsnede van de pubis tot de xiphoid, gevolgd door een vergelijkbare snede in het buikvlies langs de linea alba. Gaat de buik in, zorg ervoor dat de blaas of darm niet worden beschadigd, en bevrijd de lever van het buikvlies anterieurelijk nabij het xiphoïde proces. Maak een transversale incisie door de huid en het buikvlies aan de onderrand van de rechterkwab van de lever, en gebruik een gebogen muizeklamp om de xiphoïde proces terug te trekken.
Gebruik ribbenspreiders om de ribben zo ver mogelijk van de middenlijn te openen en snijd de falciforme, frenicus en maagliggers door. Gebruik vervolgens bevochtigde steriele wattenstaafjes om de lever omhoog te draaien en snij extra ligamenten af zoals nodig is om toegang te krijgen tot de porta. Gebruik gaas bevochtigd met zoutoplossing om de lever visceraal te draaien, verwijder vervolgens het losse bindweefsel dat de poortaderhilum overspant, en het losse bindweefsel dat de lengte van de poortader overspant.
Gebruik forceps om door het losse bindweefsel achter de linker poortader, slagader en galgang te duwen om een venster te maken en om de vaten losjes te omcirkelen met een 4-0 Potts-naald. Maak vervolgens het losse bindweefsel aan de achtertak van de poortader bij de rechter nier schoon. Gebruik vervolgens een insulinespuit om 0,5 milliliter bloed uit de inferieure vena cava te trekken en breng het bloed over in een kleine flacon.
Centrifugeer het monster en verzamel het serum in een nieuwe flacon voor snap freezing in vloeibare stikstof. Snijd twee stukken 7-0 naald. Plaats de eerste 7-0 lus zo ver mogelijk mediaal rond de linker poortader en gebruik een gebogen muizeklamp om de ader terug te trekken.
Plaats een losjes gebonden tweede 7-0 lus op de achtertak naar de poortader nabij de kruising met de poortader. Laad nu de infuuspomp met een vijf milliliter spuit bevattend drie milliliter reagens in 0,9%zoutoplossing en prime de slang. Gebruik een microchirurgische klem om de distale poortader vast te grijpen om bloeding tijdens de canuleringen te verminderen en gebruik kleine microchirurgische schaar om een 0,5 millimeter gat in de ader te snijden tussen de 7-0 steunnaald en de kruising met de poortader.
Gebruik een 27-0 katheter om het linker poortvenaal systeem te canuleren, door de katheter voorbij de bifurcatie van de linker en rechter poortader te steken. Infundeer een milliliter fysiologische zoutoplossing om de plaatsing van de katheter te bevestigen en kijk of de linker laterale en mediane kwabben van de lever uitbleken. Controleer handmatig of de katheter voorbij de afsplitsing van de rechter poortader is, maar niet voorbij de afsplitsing van de poortader die de mediane kwab voedt, trek de Potts-naald vast, zet de katheter vast met de 7-0 naald en verwijder de klem van de distale poortader.
Begin onmiddellijk met de infusie van twee milliliter van het belangrijke reagens gedurende een leveringsperiode van 15 minuten, met continue monitoring van de vitale functies van het dier gedurende de infusie. Een uur na het begin van de ischemische tijd, verwijder de Potts-naald en de katheter, trek vervolgens de 7-0 naald op de achtertak naar de poortader vast. Twee uur na het begin van de reperfusion, trek langzaam 0,5 milliliter bloed uit de inferieure vena cava, gevolgd door langzame druppeltransfer van het bloed in een nieuwe flacon.
Oefen zachte druk uit om het bloeden van de ader te stoppen indien nodig. Centrifugeer vervolgens het bloed en vries het serum halverwege snel in vloeibare stikstof voor verdere verwerking, zoals zojuist is aangetoond. Bij het experimentele eindpunt, snijd het diafragma in een cirkel en snij eventueel overgebleven bindweefsel door dat de lever verbindt met de buikholte.
Verzamel de lever en haal vier grote monsters uit de linker en mediane kwabben, en vier grote monsters uit de rechterkwab. Plaats vervolgens de monsters in afzonderlijke gelabelde flacons en vries de weefsels snel in vloeibare stikstof voor verdere verwerking. Serum alanine aminotransferase meting in fysiologische zoutoplossing en PEG-SOD geïnfundeerde hilaire geklemde dieren toont een significant verschil tussen de serumcontrole en experimentele dier lever enzymexpressie niveaus op 120 minuten na reperfusion.
Weefsel malondialdehyde expressie in de rechter, niet-hilaire klemkwab vertoont geen significant verschil tussen de controle- en experimentele groepen. De linker post-hilaire klem en reperfusion kwab vertoont echter een significant hoger niveau van weefsel malondialdehyde expressie in vergelijking met de controle niet-reperfuseerde, niet-geïnfundeerde kwab, evenals met de rechter PEG-SOD geïnfundeerde kwab. Hetzelfde patroon wordt ook waargenomen voor weefsel glutathion expressie.
Western blot analyse geeft een verhoogd niveau van gekliefde caspase-3 expressie in de linkerkwab na hilaire klem en reperfusion dat verminderd is bij dieren behandeld door PEG-SOD infusie, verschillen die worden bevestigd als significant door densitometrie. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in drie uur en 30 minuten worden voltooid als deze go
Overzicht
Dit artikel presenteert een uniek model met een hilusklem van de rattenlever, ontworpen om de effecten van farmacologische moleculen op ischemie-reperfusieschade te bestuderen. Het model maakt directe hepatische toediening van stoffen via de vena portae mogelijk, wat gericht onderzoek naar levertransplantaties faciliteert.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Farmacologie
- Levertransplantatie
Achtergrond
- Ischemie-reperfusieschade is een kritiek aandachtspunt bij levertransplantaties.
- Inzicht in farmacologische interventies kan de resultaten van transplantaties verbeteren.
- Directe infusiemethoden kunnen de effectiviteit van therapeutische middelen verhogen.
- Een visuele demonstratie van chirurgische technieken is essentieel voor de reproduceerbaarheid.
Doel van de studie
- Om een model te ontwikkelen voor het bestuderen van farmacologische middelen bij ischemie-reperfusieschade van de lever.
- Om de directe effecten van geïnfuseerde moleculen op de gezondheid van de lever te beoordelen.
- Om een methodologie te bieden die toepasbaar is op andere scenario's van organtransplantatie.
Gebruikte methoden
- Ratlever-hilar clamp-model met portaaladercannulatie.
- Directe infusie van farmacologische middelen in de portaalader.
- Monitoring van vitale functies tijdens het infusieproces.
- Verzameling en analyse van serum- en weefselmonsters na reperfusie.
Belangrijkste resultaten
- Significante verschillen in serum alanine aminotransferase-spiegels na de behandeling.
- Verhoogde expressie van malondialdehyde in het weefsel van behandelde leverkwabben.
- Western blot-analyse toonde gewijzigde spiegels van gesplitste caspase-3 aan.
- Het potentieel van farmacologische middelen om letsel te beperken is aangetoond.
Conclusies
- Het model van de hilusklem bij de rattenlever is effectief voor het bestuderen van ischemie-reperfusieschade.
- Directe infusietechnieken kunnen de therapeutische effectiviteit verbeteren.
- De bevindingen kunnen toekomstige strategieën bij organtransplantaties informeren.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Leidinggevenden
Dit model met een hilusklem van de rattenlever maakt gerichte toediening van farmacologische middelen aan ischemische leversegmenten mogelijk, waardoor de systemische blootstelling wordt verminderd en het mechanisch inzicht in ischemie-reperfusieschade wordt vergroot. Door directe infusie in het portaalveneuze systeem mogelijk te maken, ondersteunt deze methode de preklinische evaluatie van cytoprotectieve verbindingen met een verbeterde signaal-ruisverhouding in weefselspecifieke eindpunten. Deze aanpak helpt bij het verminderen van risico's voor leidende kandidaat-geneesmiddelen voor levertransplantaties en andere organeperfusiestrategieën door hepatische effecten te isoleren van systemische storende factoren.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door testverbindingen direct in de ischemische leverkwab af te leveren, wat de on-target werkingsmechanismen verduidelijkt.
- Operationele waarde: Vermindert het benodigde volume van de verbinding en minimaliseert off-target effecten, waardoor de sensitiviteit van de assay en de doelspecificiteit worden verbeterd.
- Translationele waarde: Ondersteunt targetvalidatie in een ziekterelevant I/R-model, watHet vertrouwen in de pathofysiologische relevantie vergroot voordat er wordt overgegaan naar grotere diersoorten.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Genereert kwantificeerbare biochemische read-outs zoals serum-ALT- en weefsel-MDA-gehaltes, wat gestandaardiseerde screening van verbindingen op hepatoprotectieve activiteit mogelijk maakt.
- Reproduceerbaarheid: Het chirurgische model zorgt voor consistente ischemische letselpatronen, wat betrouwbare dosis-responsbeoordelingen over experimentele batches heen ondersteunt.
- Schaalbaarheid: Zodra de procedure onder knie is, maakt deze herhaald testen van meerdere farmacologische middelen mogelijk op een gecontroleerde, segmentspecifieke wijze.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziekten: Bootst klinische warme ischemie na tijdens orgaanwinning en transplantatie, waardoor een voorspellend model voor transplantaatschade en disfunctie wordt geboden.
- Mechanische risicoreductie: Maakt evaluatie mogelijk van antioxidatieve en anti-apoptotische middelen (bijv. PEG-SOD) op belangrijke schademarkers zoals gecleaved caspase-3 en lipideperoxidatie.
- Preklinische continuïteit: Faciliteert de optimalisatie van lead-verbindingen door target-interactie in de lever te koppelen aan functionele resultaten in enzymvrijgave en oxidatieve stress.
Integratie van pijplijnen en workflows
Het model past binnen het continuüm van ontdekking tot preklinisch onderzoek, waardoor mechanistische screening van cytoprotectieve middelen in een vroeg stadium mogelijk is voordat uitgebreidere farmacokinetische of toxicologische profilering plaatsvindt.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt de verduidelijking van pathways en doelwitvalidatie door drug-effecten te isoleren tot het hepatische segment dat I/R-letsel ondergaat.
- Screening: Maakt gestandaardiseerde beoordeling van de werkzaamheid van verbindingen mogelijk via kwantificeerbare resultaten zoals ALT-vrijgave en MDA-vorming.
- Analytiek: Biedt gemultiplexte read-outs (enzymatisch, oxidatief, apoptotisch) om de mechanismen en potentie van verbindingen te vergelijken.
- Translationeel onderzoek: Verbindt hepatische protectie met transplantatie-relevante uitkomsten, ter ondersteuning van go/no-go beslissingen voor strategieën voor orgaanconservering.
- Bedrijfsmatige hergebruik: Het chirurgische platform kan worden hergebruikt in meerdere testcampagnes voor verbindingen, waardoor de ROI op modelontwikkeling en training van operators wordt gemaximaliseerd.
Operationele en bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen door farmacokinetische variabiliteit te verminderen en zich te richten op leverspecifieke farmacodynamiek.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid door gestandaardiseerde vasculaire toegang en segmentale perfusie, waardoor inter-individuele variabiliteit tussen dieren wordt geminimaliseerd.
- Strategische waarde: Verhoogt de efficiëntie bij de identificatie van lead-verbindingen door snelle testen van de structuur-activiteitsrelatie in een relevante pathofysiologische context mogelijk te maken.
- Impact op portfolio: Ondersteunt de risico-gecorrigeerde prioritering van cytoprotectieve kandidaten voor transplantatieprogramma's door vroeg in de ontdekkingsfase mechanistische en effectiviteitsgegevens te verschaffen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in microsurgische vasculaire canulatie en de anatomie van de lever bij knaagdieren.
- Afhankelijkheid van precisie-instrumentarium, waaronder microspuiten, fijne hechtdraden en vergrotingssystemen.
- Vereist gestandaardiseerde perioperatieve zorg, inclusief temperatuurbehoud en monitoring van vitale functies.
- Aanpassing naar andere lobben of organen kan anatomische herberekening en aanpassing van de vaatdiameter vereisen.
- Praktische beperkingen omvatten de technische complexiteit en operatorafhankelijkheid, wat zonder grondige training de reproduceerbaarheid tussen laboratoria kan beïnvloeden.
