Name: Thermostabilization, expressie, zuivering en kristallisatie van het Human serotonine transporter Gebonden aan S citalopram (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: Leer thermostabilisatie, expressie en kristallisatie van de menselijke serotoninetransporter gebonden aan S-citalopram. Deze methode biedt inzicht in membraaneiwitten als belangrijke medicijndoelen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We bedanken D. Cawley voor het genereren van monoklonale antilichamen. We bedanken A. Penmatsa en K. Wang voor het delen van ideeën en expertise ontwikkeld vanuit de dopamine-transporter. L. Vaskalis voor assistentie met figuren, H. Owen voor hulp bij het voorbereiden van het manuscript en andere leden van het Gouaux-laboratorium voor nuttige discussies. J.A.C. heeft ondersteuning van een Banting postdoctorale fellowship van de Canadian Institutes of Health Research. E.M.G. wordt ondersteund door de National Science Foundation Graduate Research Fellowship. We zijn bijzonder dankbaar aan Bernie en Jennifer LaCroute voor hun genereuze steun, evenals voor financiering van de NIH (5R37MH070039). E.G. is een onderzoeker van het Howard Hughes Medical Institute.

<ol><li>Kristensen, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLC6+neurotransmitter+transporters%3A+structure%2C+function%2C+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">SLC6 neurotransmitter transporters: structure, function, and regulation.</a> Pharmacol Rev. 63 (3), 585-640 (2011).</li>
<li>Broer, S., Gether, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+solute+carrier+6+family+of+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The solute carrier 6 family of transporters.</a> Br J Pharmacol. 167 (2), 256-278 (2012).</li>
<li>Andersen, J., Kristensen, A. S., Bang-Andersen, B., Stromgaard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+understanding+of+the+interaction+of+antidepressant+drugs+with+serotonin+and+norepinephrine+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Commun+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the understanding of the interaction of antidepressant drugs with serotonin and norepinephrine transporters.</a> Chem Commun (Camb). 25 (25), 3677-3692 (2009).</li>
<li>Hahn, M. K., Blakely, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+impact+of+SLC6+transporter+genetic+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pharmacol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">The functional impact of SLC6 transporter genetic variation.</a> Annu Rev Pharmacol Toxicol. 47, 401-441 (2007).</li>
<li>Abdul-Hussein, S., Andrell, J., Tate, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermostabilisation+of+the+serotonin+transporter+in+a+cocaine-bound+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Thermostabilisation of the serotonin transporter in a cocaine-bound conformation.</a> J Mol Biol. 425 (12), 2198-2207 (2013).</li>
<li>Green, E. M., Coleman, J. A., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermostabilization+of+the+human+serotonin+transporter+in+an+antidepressant-Bound+Conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Thermostabilization of the human serotonin transporter in an antidepressant-Bound Conformation.</a> Plos One. 10 (12), e0145688(2015).</li>
<li>Goehring, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+and+large-scale+expression+of+membrane+proteins+in+mammalian+cells+for+structural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies.</a> Nat Protoc. 9 (11), 2574-2585 (2014).</li>
<li>Kawate, T., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography+for+precrystallization+screening+of+integral+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins.</a> Structure. 14 (4), 673-681 (2006).</li>
<li>De Becker, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adjuvant+monophosphoryl+lipid+A+increases+the+function+of+antigen-presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">The adjuvant monophosphoryl lipid A increases the function of antigen-presenting cells.</a> Int Immunol. 12 (6), 807-815 (2000).</li>
<li>Coleman, J. A., Green, E. M., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+structures+and+mechanism+of+the+human+serotonin+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">X-ray structures and mechanism of the human serotonin transporter.</a> Nature. , (2016).</li>
<li>White, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+progress+of+membrane+protein+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">The progress of membrane protein structure determination.</a> Protein Sci. 13 (7), 1948-1949 (2004).</li>
<li>Gambotto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogenicity+of+enhanced+green+fluorescent+protein+%28EGFP%29+in+BALB%2Fc+mice%3A+identification+of+an+H2-Kd-restricted+CTL+epitope%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Immunogenicity of enhanced green fluorescent protein (EGFP) in BALB/c mice: identification of an H2-Kd-restricted CTL epitope.</a> Gene Ther. 7 (23), 2036-2040 (2000).</li>
<li>Galfre, G., Howe, S. C., Milstein, C., Butcher, G. W., Howard, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+major+histocompatibility+antigens+produced+by+hybrid+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Antibodies to major histocompatibility antigens produced by hybrid cell lines.</a> Nature. 266 (5602), 550-552 (1977).</li>
<li>Deller, M. C., Kong, L., Rupp, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+stability%3A+a+crystallographer%27s+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+F+Struct+Biol+Commun%22%5BJournal%5D)">Protein stability: a crystallographer's perspective.</a> Acta Crystallogr F Struct Biol Commun. 72, 72-95 (2016).</li>
<li>Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography-based+thermostability+assay+for+membrane+protein+precrystallization+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening.</a> Structure. 20 (8), 1293-1299 (2012).</li>
<li>Tate, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+seven+different+heterologous+protein+expression+systems+for+the+production+of+the+serotonin+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Comparison of seven different heterologous protein expression systems for the production of the serotonin transporter.</a> Biochim Biophys Acta. 1610 (1), 141-153 (2003).</li>
<li>Rigaud, J. L., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of membrane proteins into liposomes.</a> Methods Enzymol. 372, 65-86 (2003).</li>
<li>Caffrey, M., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallizing+membrane+proteins+using+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases.</a> Nat Protoc. 4 (5), 706-731 (2009).</li>
<li>Faham, S., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bicelle+crystallization%3A+a+new+method+for+crystallizing+membrane+proteins+yields+a+monomeric+bacteriorhodopsin+structure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Bicelle crystallization: a new method for crystallizing membrane proteins yields a monomeric bacteriorhodopsin structure.</a> J Mol Biol. 316 (1), 1-6 (2002).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Bepaling van membraaneiwit structuur door biofysische technieken blijft een enorme onderneming voor veel medisch significante transporters, receptoren en kanalen 11. Hier delen we gedetailleerde kennis ontwikkeld voor de structuur bepaling van de menselijke serotonine transporter gebonden aan S-citalopram. We verwachten dat deze methoden nuttig zijn om structuren van SERT bepalen in andere conformationele staten, alsook structuren van andere moeilijke membraaneiwitten zal zijn. Bovendien is de biochemische technieken die hier beschreven kunnen ook worden gebruikt om de functie van gezuiverd SERT schoonmaakmiddel en een bijna-natieve lipide omgeving bestuderen. SERT kristallisatie scharnierend op de ontwikkeling van diverse tools en technieken. Ten eerste, verbeteringen in de transporter thermostabiliteit geproduceerd SERT varianten die werden goed gedragen in verschillende detergent micellen na extractie van de vervoerder van membranen 6. Ten tweede, het gebruikvan de hoge affiniteit ligand S-citalopram gedurende zuivering en kristallisatie verder verbeterde stabiliteit en verminderde conformationele heterogeniteit. Ten derde, de ontwikkeling van het expressiesysteem BacMam 7 toegelaten voor de productie van grote hoeveelheden SERT in een korte periode van 2 weken, vergemakkelijkt zowel immunisatie en kristallisatie. Tenslotte, de ontwikkeling van strategieën om te selecteren op antilichamen met hoge affiniteit die 3D epitopen toegelaten voor de ontdekking van het 8B6 antilichaam dat geordende pakking van SERT-antilichaamcomplexen in kristallen bevordert herkennen. Er zijn een aantal kritische stappen en reagentia alsmede gemeenschappelijke problemen die vaak optreden gedurende het protocol. Ten eerste kan de vorming van hoge titer virus SERT P2 problematisch zijn. Toevoegen van lage concentraties van P1 tot P2 virus virus te genereren zoals beschreven in dit protocol vermindert meestal dit probleem, en wanneer de P2 virustiter laag is, kan P3 virus usin wordeng virus bij een MOI van 0,0001. Virussen met een titer van minder dan 1 x 10 8 virusdeeltjes / ml mag niet worden gebruikt en zullen vrijwel altijd tot lage eiwitopbrengsten. Voor expressie, HEK293S GNTI - cellen werden gekozen omdat ze geen N -acetylglucosaminyltransferase I-activiteit en daardoor niet synthetiseren complexe N-glycanen, maar uitsluitend hoog- mannose N-glycanen. EndoH splitst N-gebonden glycosylering van hoge mannose glycanen op twee locaties in de extracellulaire lus 2 (EL2), waardoor een N-acetylglucosamine gekoppeld aan asparagine. Vertering van N-gebonden suikers vermindert oppervlak entropie van EL2 die waarschijnlijk belangrijk is voor kristallisatie. Voor het genereren van antilichamen, zou de SERT IC worden gebruikt voor immunisatie. GFP zeer immunogeen 12 en mag niet worden gebruikt als een fusie-tag antilichamen omdat het moeilijk volledig te verwijderen door SEC. De flexibele N- en C-terminus van SERT waren evenminin het construct om antilichamen tegen deze gebieden te voorkomen. Muizen kunnen worden geïmmuniseerd met 30 ug opgeloste eiwit; verder immuniseren van muizen tot hoge serumconcentraties van antilichamen kan worden gedetecteerd en produceren hybridoomcellen zoals beschreven 13. Een thermostabilized construct is meestal de beste keuze voor immunisatie; indien de vervoerder is goed gedragen en behoudt biologische activiteit na zuivering, is dit vaak voldoende om antilichamen op te wekken. De 8B6 antilichaam werd opgewekt tegen WT SERT. Kristallisatieoplosmiddel moet alleen het piekfracties van SEC met monodisperse complex zoals beoordeeld door FSEC worden gecombineerd en geconcentreerd. SERT-8B6 kristallen groeien in een beperkt aantal omstandigheden en er zijn een aantal stappen die moeten worden genomen om specifieke problemen in verband met SERT kristalgroei lossen. Tris-base ingesteld met HCl mag niet worden gebruikt in de reservoiroplossing, aangezien deze buffer ondersteunt geen kristalgroei; het is dus crische gebruiken in plaats Tris ingesteld met NaOH. SERT kristallen groeien in een smal concentratiegebied van PEG 400, dus als kristallen niet groeien of als er veel kleine kristallen worden waargenomen, zou zelfs een kleine toename of afname van de concentratie PEG 400 worden geadviseerd. Verder werd het additief 6-aminohexaanzuur ook gebruikt in de geoptimaliseerde scherm om kiemvorming te verbeteren. De daling verhouding eiwit: goed oplossing ook een belangrijke bepalende factor voor kristalgroei. Daling verhouding van 1,5-2: 1 de voorkeur, met drop ratio dichter bij 2: 1 typisch ondersteunen van de groei van grote 3-dimensionale kristallen. Tenslotte, het gebruik van lage profile 24-well platen is ook cruciaal richting kristalgroei, waarschijnlijk als gevolg van wijziging van de snelheid van dampdiffusie. Een alternatieve benadering voor de SPA methode ontwikkeld voor het screenen voor mutanten die de rat serotonine transporter stabiliseren in een cocaïne gebonden conformatie met een filter bindingsbepaling 5. Daarentegen is de SPA based-test zorgt voor sequentiële verwarming stappen gevolgd door het bepalen van de fractie van SERT, die gebonden is aan ligand blijft. Aldus maakt dit de snelle bepaling van de smelttemperatuur van een klein aantal monsters. De SPA werkwijze berust op de beschikbaarheid van een radioactief gemerkte hoge affiniteit ligand en als er geen liganden bekend die binden submicromolaire affiniteit dan een alternatieve benadering nodig. Vele andere werkwijzen worden gewoonlijk toegepast om eiwitstabiliteit meten zoals binding van fluorescente kleurstoffen en calorimetrie 14 maar zijn laag-throughput en hetzij niet rechtstreeks functie te meten of vereisen grote hoeveelheden eiwit. Indien de SPA methode niet kan worden gebruikt, een alternatieve high-throughput benadering is een FSEC gebaseerde thermostabiliteit test 15 (FSEC-TS), waarbij het monster wordt verwarmd en vervolgens afscheiding van de fractie van overblijvende transporter. FSEC-TS is een nuttige aanpak voor de toegang tot chromatografisch gedrag en oligomere staat en is apowerful aanvullend instrument die naast de SPA-werkwijze kan worden gebruikt. Een vergelijking van verschillende gemeenschappelijke eiwitexpressiesystemen bleek ook het gebruik van zoogdiercellen voor expressie SERT 16 bevorderen en verrassend is dit waarschijnlijk het geval is voor veel eiwitten van zoogdieren. De methoden die we hebben gebruikt voor expressie zijn op maat gemaakt voor SERT, maar zijn waarschijnlijk gemakkelijk aan te passen. Omstandigheden die hoge expressieniveaus bevorderen moeten zorgvuldig worden geïdentificeerd door het variëren van het tijdstip van expressie, temperatuur, virusconcentratie en aanwezigheid van histon deacetylase inhibitoren zoals natriumbutyraat. Wij zijn voorstander van het algemeen affiniteit zuivering in een milde lange-keten detergent zoals C12M samen met CHS vóór reconstitutie met hoge affiniteit ligand binding te behouden. Reconstructie met behulp van hydrofobe absorptie is een milde techniek die we hebben gevonden effectief voor een aantal andere vervoerders en receptoren te zijn. Als ditis niet succesvol, verwijdering of detergentia aan hoge kritische micelconcentratie door dialyse, verdunning of SEC worden toegepast 17 verschaft het antigeen voldoende stabiel in dergelijke wasmiddelen. In gevallen waarin geen geschikte antistoffen worden gevonden, vinden we bijna altijd het probleem is te wijten aan het verlies van functie of denaturatie van het antigeen en in dergelijke gevallen hebben we met succes nieuwe vaccinaties met speciale aandacht voor eiwit biochemie uitgevoerd. Tenslotte liganden en antilichamen die binden met hoge affiniteit zou de basis voor een rationeel geplande kristallisatie experiment vormen en door gebruik te maken van een thermostabiel variant kan men een grotere verscheidenheid van omstandigheden screenen door het variëren van de eigenschappen van verschillende detergentia. Verder kristallisatie in een lipide mesofase 18 of via bicelles 19 moet altijd worden beschouwd als een alternatief voor kristallisatie in micellen. Deze principes en werkwijzen kunnen worden gebruikt met bepaalde wijzicatie voor vele andere transmembraan eiwitten die moeilijk uit te drukken en te zuiveren van andere expressiegastheren en zullen bijzonder nuttig zijn voor de structuurbepaling van doelwitten met hoge affiniteit drugs zijn.

De serotonine transporter (SERT) een integraal membraaneiwit dat het transport van serotonine in celmembranen 1 vergemakkelijkt. SERT behoort tot een familie van Neurotransmitter Natrium symporter (NSS), die ook de dopamine en noradrenaline transporters 2. SERT is het moleculaire doelwit van veel voorgeschreven antidepressiva en anxiolytica die werken competitief remmen serotonine transport 3. SERT exploiteert de energetisch gunstige cotransport natrium om neurotransmitter uit de synaptische spleet verwijderen. Uitgebreide karakterisering van het serotonerge systeem blijkt dat veranderingen in serotonine metabolisme beïnvloeden blijken vrijwel alle neurologische processen zoals stemmingswisselingen, slaapstoornissen, pijn, cognitie en agressie gedragingen 4. SERT functie kan worden aangepast door het gebruik van antidepressiva en selectieve serotonineheropnameremmers (SSRI&#39;s) zoals S-citalopram, alsmede door psychostimulagen en drugs van verslaving zoals amfetamine en 3,4-methylenedioxy- N -methylamphetamine of &quot;ecstasy&quot; 1,2. SSRIs zijn enorm belangrijk voor de behandeling van stemmingsstoornissen, maar de exacte structurele basis voor hun werking wordt niet goed begrepen. WT SERT instabiel in detergens micellen, waardoor de voortgang belemmeren naar een driedimensionale (3D) structuur van SERT 5,6. Onlangs ontwikkelden we varianten SERT die robuust stabiel in een breed scala van detergentia en behouden SSRI bindingsactiviteit 6. Deze thermostabiele SERT varianten werden geselecteerd onder toepassing van een scintillatie proximity-gebaseerde assay thermostabiliteit. Hier beschrijven we een werkwijze voor het opwekken van antilichamen met hoge affiniteit die SERT kunnen binden, en de zuivering en kristallisatie van thermostabiele SERT, in complex met antilichamen en S-citalopram. Dit protocol wordt ervan uitgegaan dat de SERT en 8B6 genen succesvol zijn geweesty gekloneerd in de BacMam 7 en insecten expressievectoren respectievelijk. Om antilichamen cDNA dat codeert residuen 73-616 van WT SERT werd gekloneerd in de vector BacMam met een C-terminaal StrepII-aanhangsel (SERT IC). Voor de thermostabiliteit scherm, werd SERT resten 73-616 met C-terminale GFP, Strep II, en 10-His-tags (SERT TC) gebruikt. Afzonderlijke puntmutaties werden gegenereerd in de SERT TC achtergrond. Voor de kristallisatie-protocol, was de SERT-GFP-fusie-eiwit gebruikt met Twin-Strep [TrpSerHisProGlnPheGluLys (GlyGlyGlySer) 2 GlyGlySerAlaTrpSerHisProGlnPheGluLys] en 10-His-tags, het dragen van de thermostabiele mutanten, Y110A, I291A, en T439S en mutaties van het oppervlak cysteines C554A, C580A en C622A (SERT CC). Trombinesplitsing sequenties (LVPRGS) werden ook opgenomen in de SERT CC na Q76 en T618 om verwijdering van de N- en C-termini mogelijk. Het plasmide codeert voor het 8B6 Fab is ontworpen om zowel de zware als lichte expressketens van het antilichaam met GP67 secretie sequenties onder de controle van twee afzonderlijke polyhedrine promoters. Het C-uiteinde van de zware keten van het 8B6 antilichaam werd gelabeld met een 8-His tag en een thrombine splitsingsplaats werd ingebracht tussen de zware keten en de tag.

<table><tbody><tr><td>DH10Bac</td><td>Invitrogen</td><td>10361-012</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Fisher</td><td>BP906-5</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Fisher</td><td>BP918-1</td><td></td></tr><tr><td>Tetracycline</td><td>Sigma</td><td>T-7660</td><td></td></tr><tr><td>Bluo-gal</td><td>Invitrogen</td><td>15519-028</td><td>5-Bromo-3-indolyl &beta;-D-galactopyranoside</td></tr><tr><td>Isopropyl beta-D-1-thiogalactopyranoside</td><td>Anatrace</td><td>I1003</td><td>IPTG</td></tr><tr><td>Miniprep kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>Cellfectin II</td><td>Invitrogen</td><td>10362-100</td><td>Sf9 transfection reagent</td></tr><tr><td>Sf9</td><td>ATCC</td><td>CRL-1711</td><td></td></tr><tr><td>Sf-900 III SFM media</td><td>Life Technologies</td><td>12658-027</td><td></td></tr><tr><td>HEK-293S GnTI-</td><td>ATCC</td><td>CRL-3022</td><td></td></tr><tr><td>Freestyle 293 media</td><td>Life Technologies</td><td>12338-018</td><td>293 expression media</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>0984018DJ</td><td></td></tr><tr><td>Sodium butyrate</td><td>Sigma</td><td>303410</td><td></td></tr><tr><td>S-citalopram</td><td>Sigma</td><td>E4786</td><td>Anagrade</td></tr><tr><td>n-Dodecyl-beta-D-Maltopyranoside</td><td>Anatrace</td><td>D310</td><td></td></tr><tr><td>Cholesteryl hemmisuccinate</td><td>Sigma</td><td>C6013</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850457P</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850757P</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840457P</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Sigma</td><td>L2884</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin A</td><td>Sigma</td><td>P5318</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Sigma</td><td>A1153</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Desthiobiotin</td><td>Iba Life Sciences</td><td>2-1000-05</td><td></td></tr><tr><td>Asolectin</td><td>Sigma</td><td>11145</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma</td><td>C-8667</td><td></td></tr><tr><td>Lipid A</td><td>Sigma</td><td>L5399</td><td></td></tr><tr><td>Brain polar lipid</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>141101C</td><td></td></tr><tr><td>Biobeads</td><td>Biorad</td><td>152-3920</td><td>Hydrophobic absorption resin</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IRDye 680RD</td><td>Odyssey</td><td>926-68070</td><td>Used as secondary antibody for western blotting</td></tr><tr><td>Lauryl maltose neopentyl glycol</td><td>Anatrace</td><td>NG310</td><td>Anagrade</td></tr><tr><td>Serotonin</td><td>Sigma</td><td>H9523</td><td></td></tr><tr><td>pFastBac 8B6</td><td></td><td></td><td>Available from authors</td></tr><tr><td>pEG Bacmam SERT Strep II</td><td></td><td></td><td>SERTIC, Available from authors</td></tr><tr><td>pEG Bacmam SERT GFP twin Strep His</td><td></td><td></td><td>SERTTC, Available from authors</td></tr><tr><td>pEG Bacmam SERT ts3 GFP twin Strep His</td><td></td><td></td><td>SERTCC, Available from authors</td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma</td><td>56749</td><td></td></tr><tr><td>n-Octyl &beta;-D-maltoside</td><td>Anatrace</td><td>O310</td><td>Anagrade</td></tr><tr><td>Thrombin</td><td>Haematologic Technologies</td><td>HCT-0020</td><td></td></tr><tr><td>EndoH</td><td>New England Biolabs</td><td>P0702</td><td></td></tr><tr><td>Trizma-HCl</td><td>Sigma</td><td>T5941</td><td>Tris is used for preparation of crystallization reservoirs</td></tr><tr><td>PEG 400</td><td>Sigma</td><td>91893</td><td></td></tr><tr><td>6-aminohexanoic acid</td><td>Sigma</td><td>7260</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Fisher</td><td>MT25052CV</td><td></td></tr><tr><td>Isoplate-96 TC</td><td>PerkinElmer</td><td>6005070</td><td></td></tr><tr><td>PolyJet</td><td>SignaGen</td><td>SL100688</td><td>Polymer transfection reagent for mamalian cells</td></tr><tr><td>Copper HIS-Tag YSI SPA Beads</td><td>PerkinElmer</td><td>RPNQ0096</td><td>His-tag affinity SPA beads</td></tr><tr><td>Citalopram, [N-Methyl-3H]</td><td>PerkinElmer</td><td>NET1039250UC</td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer C</td><td>Eppendorf</td><td>5382000023</td><td>heating block for thermostability assay</td></tr><tr><td>ThermoTop</td><td>Eppendorf</td><td>5308000003</td><td></td></tr><tr><td>SmartBlock PCR 96, thermoblock for PCR plates</td><td>Eppendorf</td><td>5306000006</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &micro;m syringe filter</td><td>Olympus Plastics</td><td>25-243</td><td></td></tr><tr><td>1 L filter system</td><td>Corning</td><td>430517</td><td></td></tr><tr><td>2 L flat bottom tissue culture flask</td><td>Genemate</td><td>F-5909-2000</td><td></td></tr><tr><td>2 L baffled tissue culture flask</td><td>Genemate</td><td>F-5909-2000B</td><td></td></tr><tr><td>CO2 incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>3950</td><td></td></tr><tr><td>Forma Orbital Shaker</td><td>Thermo Scientific</td><td>416</td><td></td></tr><tr><td>Strep-Tactin resin</td><td>Iba Life Sciences</td><td>2-1208-025</td><td>Strep affinity resin</td></tr><tr><td>Extruder</td><td>Northern Lipids</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Li-Cor imaging system</td><td>Odyssey</td><td></td><td>western blot imaging system</td></tr><tr><td>XK16 column</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9889-37</td><td>column used for Strep-Tactin and Talon purificaiton</td></tr><tr><td>100 kDa MWCO protein concentrator</td><td>Millipore</td><td>UFC910096</td><td></td></tr><tr><td>30 kDa MWCO protein concentrator</td><td>Millipore</td><td>UFC903024</td><td></td></tr><tr><td>&Auml;kta FPLC</td><td>GE Healthcare</td><td>UPC-900</td><td></td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Shimadzu</td><td>51476</td><td></td></tr><tr><td>Superose 6 (10/300) column</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5172-01</td><td>Used for FSEC</td></tr><tr><td>Tangential flow apparatus</td><td>Pall Filtron</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 &micro;m filter tangential flow cell</td><td>Pall Filtron</td><td>PSM20C11</td><td></td></tr><tr><td>30 kDa MWCO tangential flow concentrator</td><td>Pall Filtron</td><td>OS030T12</td><td></td></tr><tr><td>Talon resin</td><td>Clonetech</td><td>635504</td><td>His-tag

thermostabilization, expressie, zuivering en kristallisatie van het human serotonine transporter gebonden aan<em&gt; s</em&gt; citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

De serotonine transporter is een natrium en chloride gekoppeld transporter dat &quot;pompen&quot; extracellulair serotonine in cellen. S-citalopram is een geneesmiddel dat gebruikt wordt voor de behandeling van depressie en angst door binding aan de serotonine transporter met een hoge affiniteit, het blokkeren van serotonine heropname. Hier melden wij een efficiënte procedure en een set van tools te stabiliseren, express, zuiveren en kristalliseren serotonine transporter antilichaam-complexen gebonden aan S-citalopram en andere antidepressiva. Mutaties die de serotonine transporter stabiliseren werden geïdentificeerd met een S-citalopram bindingsassay. Serotonine transporter tot expressie gebracht in baculovirus-getransduceerde HEK293S GNTI - cellen werd gereconstitueerd in proteoliposomen en gebruikt om hoge-affiniteit-antilichamen opwekken. Wij hebben een strategie ontwikkeld om antilichamen die bruikbaar zijn voor structurele studies ontdekt. Een eenvoudige benadering voor de expressie van antilichaamfragmenten in Sf9-cellen werd ook vastgesteld.Transporter-antilichaam complexen gezuiverd door het gebruik van deze procedure zijn goed gedragen en gemakkelijk te kristalliseren, het produceren van complexen met S-citalopram dat X-stralen breken tot 3-4 resolutie Å. De ontwikkelde strategieën kunnen worden gebruikt om de structuur van andere uitdagende membraaneiwitten bepalen.

Een bibliotheek van enkel punt mutanten in het SERT TC achtergrond is gemaakt om het scherm voor thermostabilizing mutaties. Individuele mutanten werden gegenereerd onder gebruikmaking van standaard mutagenese. De screening protocol maakt gebruik van tijdelijk getransfecteerde HEK293S cellen en een scintillatie nabijheid gebaseerde thermostabiliteit scherm snel identiteit nuttig mutaties voor kristallisatie zoals in Figuur 1A. Plotten Tm-waarden tegen gebonden [3H] citalopram bij kamertemperatuur onthult constructen met hoge thermostabiliteit en expressieniveaus geschikt voor eiwitzuivering (Figuur 1B). Drie mutanten (Y110A, I291A en T439S) werden gecombineerd om een zeer stabiele constructie (figuur 1C) te genereren. De thermostabiliteit is ook gecorreleerd met verhoogde stabiliteit in kortketenige detergentia noodzakelijk is voor de kristallisatie van de SERT-Fab complex. De grootschalige expressie van humaan SERT gebruik van baculovirus-transduced HEK293S GNTI - cellen minder dan 2 weken en kan milligram hoeveelheden produceren, zoals geïllustreerd in figuur 2A. Gebruik van het GFP-gelabeld eiwitten SERT CC laat SERT gemakkelijk te volgen tijdens expressie en zuivering door fluorescentie (figuur 2B). Onze zuiveringsstrategie betrokken 1) oplossen van SERT gebonden aan S-citalopram uit HEK293S GNTI - cellen C12M in aanwezigheid van CHS als stabiliserende lipide; 2) de binding van SERT een Strep affiniteitsmatrix; 3) verwijdering van verontreinigende eiwitten door uitgebreid wassen; en 4) elutie van de functionele SERT met buffer bevattende desthiobiotine (figuur 2C). Het geëlueerde eiwit grotendeels vrij van andere eiwitten gedetecteerd door Coomassie blauwkleuring en monodisperse zoals beoordeeld door FSEC (figuur 2D, E). Een soortgelijke strategie werd naar SERT zuiveren met StrepII die is gebruikt voor reconstitution en immunisatie (Figuur 3A, B). Incorporatie van SERT in proteoliposomen verhoogt het serum halfwaardetijd en stabiliteit van SERT en verbetert de kans isolatie van hoge affiniteit-antilichamen. Bovendien opname van lipide A, een component van de bacteriële celwand dient als een krachtig adjuvans 9. Multilamellaire liposomen werden bereid door de toevoeging van buffer tot een gedroogde lipidemengsel in glazen buizen en geresuspendeerd in buffer. Extrusie van de liposomen door middel van 200 nm poriegrootte filters produceert monodisperse unilamellaire liposomale suspensies. De liposomen worden vervolgens verzadigd met detergens, gevolgd door de toevoeging van gezuiverd SERT in detergens. Tenslotte wordt detergens verwijderd door toevoeging van hydrofobe absorptie hars om de lipide: detergensmengsel. Aanvullende ligand worden toegevoegd aan het opgeloste monster antilichamen te selecteren die het antidepressivum conformatie herkennen. De aanwezigheid van SERT in de proteoliposomen moet worden bevestigd doorsolubiliserende een klein monster met SDS-PAGE loading dye of C12M en actief is op SDS-PAGE en FSEC (Figuur 3C, D). Hybridoma cellijnen SERT antilichamen kunnen worden gescreend op hoge-affiniteit binders die 3D-epitopen herkennen. Deze eigenschappen zijn belangrijk voor het uiteindelijke succes van kristallisatie, als het antilichaam verankerd moet blijven gebonden aan een gestructureerd regio pakkingspatronen homogene, goed geordende domeinen bevorderen. In de eerste stap worden antilichamen die ongestructureerde regio herkennen geïdentificeerd. SERT is gedenatureerd en geblot op een nitrocellulose membraan; antilichamen die gedenatureerde SERT binden zal western-positief zijn en waarschijnlijk herkennen lineaire epitopen. In figuur 4A tonen wij 2 voorbeelden van antilichamen die western-positieve en waarschijnlijk niet nuttig crystallogenesis bevorderen zijn. In figuur 4B, worden de resterende western-negatieve antilichamen geïncubeerd met 100 nM SERT-GFP en gescheiden doorFSEC. Antilichamen die binden SERT de GFP-positieve piek verschuiven naar een eerdere positie. De SERT-antilichaam complexen kunnen verder worden verdund reinigingsmiddel te bepalen of zij met nanomolaire affiniteit gevolgd door analyse door FSEC kan binden. Toevoeging van serotonine leidt tot conformatieveranderingen in de transporter en dus de antilichamen worden gescreend om te bepalen of ze specifiek de SSRI-gebonden conformatie kan herkennen. In figuur 4C worden de antilichamen aangetoond SERT binden in de aanwezigheid van serotonine, waaruit blijkt dat de epitoop (en) niet veranderen van de SSRI gebonden toestandsubstraat. Tenslotte in figuur 4D combinaties van antilichamen getest op hun vermogen om verschillende epitopen binden, wat resulteert in een verdere verschuiving naar links. Hier de 15B8 of antilichamen 8A11 herkennen een epitoop die verschilt van 8B6. De 8B6 antilichaam werd gekozen voor verdere structurele analyse op basis van voorlopige kristal screening met papaïne Treated Fab. De genen van de 8B6 Fab gekloneerd in een insectencel expressievector. Fab kan worden uitgedrukt en afgescheiden door Sf9-cellen in suspensie te groeien. De 8B6 Fab kan worden gezuiverd uit Sf9 celsupernatant door His-tag affiniteit (Figuur 5A, B) en kationenuitwisselingschromatografie (figuur 5C, D) resulteert in eiwit dat vrij is van verontreinigingen op SDS-PAGE gelen weergegeven. In figuur 5E is de recombinante 8B6 Fab aangetoond SERT binden en in aansluitende biochemische en biofysische experimenten. De affiniteit gezuiverde SERT CC wordt gedigereerd met thrombine en EndoH en gemengd met 8B6 Fab van een complex in de aanwezigheid van S-citalopram te vormen. De transporter-antilichaamcomplex wordt vervolgens gescheiden door SEC C8M (figuur 6A) en de piekfracties bevatten zowel SERT en Fab zoals getoond door SDS-PAGE (Figuur 6B). Het gebruik van C8M is cruciaal voor kristalvorming waarschijnlijk omdatde korte keten wasmiddel mogelijk maakt betere verpakking tussen moleculen in het kristalrooster. FSEC wordt gebruikt om te bepalen welke fracties worden samengevoegd voor kristallisatie (figuur 6C); fracties die niet monodispers zijn en / of grote hoeveelheden vrije SERT of Fab mag niet worden gecombineerd. Prismavormige kristallen SERT-antilichaam kan worden gekweekt in aanwezigheid van S-citalopram met dit protocol door opknoping druppel dampdiffusie (Figuur 7A). De resulterende kristallen buigen röntgenstralen een resolutie van 3,15 A 10 (figuur 7B). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig1.jpg" /> Figuur 1: Scintillation Proximity-gebaseerde Thermostabiliteit Assay A.. Overzicht protocol voor het screenen thermostabiliteit in aanwezigheid van [3H] citalopram. B. Maximale gebonden [3 </sup&gt; H] citalopram versus schijnbare smelttemperatuur (Tm). De gestippelde lijnen geven waarden voor de WT transporter. De 3 meest thermostabiele mutanten zijn gelabeld. Grijze gebied representeert mutanten die minder dan 10% van [3H] citalopram binding ten opzichte van WT en dus onnauwkeurig Tm waarden als gevolg van een lage signaal-ruis. C. Thermostabiliteit curves voor WT SERT TC en de top 3 mutanten. Fout balken geven de standaarddeviatie (SD). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig2.jpg" /> Figuur 2: Overzicht van Mammalian heterologe eiwitexpressie A.. Schematisch overzicht van BacMam virus generatie en expressie van SERT in HEK293S GNTI -. Cellen B. HIJK293S GNTI - cellen die het SERT CC (GFP fluorescentie) C.. Elutieprofiel van SERT CC op Strep affiniteit hars. Groene spoor geeft de concentratie van desthiobiotine, 0-100% (0-5 mM) D.. Analyse van affiniteit gezuiverd SERT CC op een 4-15% SDS-PAGE gel E.. FSEC van affiniteit gezuiverd SERT CC gedetecteerd door GFP-fluorescentie (excitatie: 480 nm; Emissie: 510 nm). De piek eluerend bij 15 ml is SERT (#) en 18 ml is gratis GFP (*). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 3" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig3.jpg" /> Figuur 3: Representatieve Affiniteit Zuivering en Reconstructie van het SERT IC A.. Schematisch overzicht van generatie antilichaam. &lt;strong&gt; B. Elutieprofiel waargenomen bij 280 nm van de affiniteitszuivering van SERT IC op Strep affiniteitshars. Groene spoor geeft de concentratie van desthiobiotine, 0 - 100%. (0-5 mM) C. Analyse van affiniteit gezuiverd en opnieuw SERT op een 4-15% SDS-PAGE gel D.. FSEC van opgeloste SERT na reconstitutie. De fluorescentie van tryptofaan residuen werd gebruikt om SERT (excitatie: 280 nm; Emissie: 335 nm) te detecteren. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 4" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig4.jpg" /> Figuur 4:. Analyse van representatieve SERT antilichamen A. Screening van antilichamen door western blot. Ongeveer 1 ug SERT CC met of zonder GFP werd op een 4-15% SDS-PAGE gel en geblot op een nitrocellulose membraan. Binding werd gedetecteerd met een geit anti-muis-antilichaam geconjugeerd met IR Dye. 2G4 en 10F2 zijn westerse positief. B. Binding van antilichamen tegen 100 nM GFP-gelabeld SERT en detectie door FSEC gedetecteerd met GFP-fluorescentie. C. Binding van geselecteerde Fabs tot 100 nM GFP-gelabeld SERT in aanwezigheid van 1 mM serotonine. D. Binding van 8A11 of 15B8 Fabs aan SERT-8B6 Fab. Kleine pieken eluerend bij 18 ml zijn gratis GFP. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 5" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig5.jpg" /> Figuur 5: Representatieve Zuivering van de 8B6 Fab van Sf9 cellen A.. Elutieprofiel waargenomen bij 280 nm van de zuivering van de 8B6 Fab door His-tag affiniteit chromatograp<html> hy. Groen trace vertegenwoordigt de concentratie van imidazool, 0-50% (0-250 mM) B.. Niet-reducerende en reducerende SDS-PAGE gel na His-tag affiniteitszuivering. Eiwit dat wordt uitgevoerd in de buurt van 50 kDa is niet-gereduceerde Fab (#) en kleinere soorten bij 25 kDa wordt gereduceerd Fab (*). C. Elutieprofiel waargenomen bij 280 nm van de zuivering van de 8B6 Fab door kationenuitwisseling tonen een symmetrische piek die elueerde onder een lineaire natriumchloridegradiënt. Groene spoor geeft de concentratie van NaCl, 0 - 100%. (0-500 mM) D. Analyse van de 8B6 Fab op een 12,5% SDS-PAGE-gel na zuivering door kationenuitwisseling. E. Binding van de 8B6 Fab tot 10 nM-GFP-tag SERT, gedetecteerd met behulp van fluorescentie van GFP. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> e 6 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54792 / 54792fig6.jpg &quot;/&gt; Figuur 6: Representatieve gelfiltratiechromatografie van de SERT-8B6 complex in aanwezigheid van S-citalopram A.. Gelfiltratie elutieprofiel gezuiverd SERT-complex 8B6. Hoofdpiek elueerde bij 11,5 ml is het SERT-8B6 complex. Piek bij 15-17 ml bevat GFP en Fab B.. Analyse van het gezuiverde SERT-8B6 complex op een 4-15% SDS-PAGE gel. De posities van SERT en de zware en lichte ketens van het Fab wordt getoond door een streepje. C. FSEC van het formaat gescheiden fracties. SERT-8B6 complexen werden gedetecteerd met behulp tryptofaan fluorescentie. Fractie 17 bevat een grotere hoeveelheid SERT die niet complex deed met Fab. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 7"src = &quot;/ files / ftp_upload / 54792 / 54792fig7.jpg&quot; /&gt; Figuur 7: kristallisatie van het SERT-8B6 Complex Bound to S-citalopram A.. Lichtmicroscopie van parallellepipedum gevormde kristallen van de SERT-complex 8B6 na 2 weken groei. Schaal bar is gelijk aan 200 pm. B. SERT-8B6 kristallen buigen X-stralen tot 3,15 Å. Blauwe ring vertegenwoordigt 3,15 Å. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig7large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> Tabel 1:. Kristallisatie scherm voor de SERT-8B6 Complex Bound to S-citalopram <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792table1.xlsx">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>

Dit manuscript beschrijft hoe om te screenen op thermostabilizing mutaties, zuiveren de menselijke serotonine transporter, het genereren van antilichamen met hoge affiniteit, en kristalliseren de serotonine transporter antilichaam-complex gebonden aan het antidepressivum citalopram S. Dit protocol kan worden aangepast aan de studie van andere uitdagende membraantransporteiwitten, receptoren en kanalen.

Thermostabilization, expressie, zuivering en kristallisatie van het Human serotonine transporter Gebonden aan<em&gt; S</em&gt; citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Het algemene doel van deze procedure is om een transporter te genereren die voldoende stabiel is voor structurele studies, en deze gemodificeerde transporter te gebruiken om kristallen te produceren die met hoge resolutie diffracteren via röntgencrystallografie. Deze methode kan kernvragen in het veld van de structurele biologie beantwoorden, zoals hoe de structuur van membraaneiwitten, die belangrijke drugtargets zijn, kan worden opgelost. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze kan worden gebruikt om, middels een functionele assay, te selecteren uit een medicijngebonden conformatie.Hoewel deze methode inzicht kan bieden in neurotransmittertransporters, kan deze ook worden toegepast op receptoren, kanalen en oplosbare eiwitten die kleine moleculen met een hoge affiniteit binden. Resuspendeer trypsiniseerde HEK293S GnTI minus cellen grondig in DMEM aangevuld met 10% foetaal runderserum tot een dichtheid van 0,5 miljoen cellen per milliliter in een wegwerp pipetreservoir. Voeg met een meerkanaals pipet 100 microliters cellen toe aan elke put van een met poly-D-lysine gecoate plaat.Resuspendeer de cellen in het pipetreservoir na het vullen van elke plaat om een gelijkmatige verdeling van de cellen te waarborgen. Incubeer de cellen in de 37 °C incubator met 8% CO2. Vervang het celmedium één uur vóór de transfectie.Bereid de DNA-transvectiereagenscomplexen door 450 nanogram DNA te mengen met 45 microliter serumvrij DMEM voor elk construct in de cert TC-achtergrond dat gescreend moet worden. Voeg vervolgens 1,6 microliter transvectiereagens toe aan 45 microliter serumvrij DMEM en meng dit. Voeg de verdunde transvectiereagensoplossing onmiddellijk toe aan de DNA-oplossing en meng.Meng de oplossingen niet in omgekeerde volgorde. Wacht 10 tot 15 minuten voordat u 20 µL van het transfectiereagens DNA-mengsel aan vier van de wells toevoegt. Incubeer de cellen met 200 nM citalopram en 25 µL TBS gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.Om de cellen te solubiliseren, voegt u 25 µL van 8 mM C12M, 1 mM CHS en protease-inhibitorcocktail in TBS toe. Incubeer de cellen gedurende één uur bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens aan drie wells voor elk construct 50 µL TBS toe met 20 nM getritieerd citalopram, 0,1% bovine serum albumine en mg/mL his-tag affiniteit scintillation proximity assay of SPA-beads.Voeg aan de laatste put dezelfde TBS-oplossing toe, maar vul deze aan met 100 micromolar sertraline om aspecifieke binding te bepalen. Zorg ervoor dat de his-tag affiniteit SPA-beads grondig zijn gemengd voordat ze aan de 96-putjesplaat worden toegevoegd. Meet de binding van getritieerd citalopram met een 96-putjes scintillatieteller bij kamertemperatuur met een telttijd van één minuut per putje.Ga door met het tellen van de plaatjes totdat de totale tellingen na ongeveer 36 uur een plateau bereiken. Verwarm de plaatjes na de meting gedurende 15 minuten in een heating block met een verwarmd deksel bij 33 °C. Meet de binding van getriteerd citalopram na het verwarmen opnieuw.Herhaal deze stappen met een aanpassing van de verhittingstap. Pas de verhittingstemperaturen aan op basis van de schijnbare smelttemperatuur van het doeleiwit en de thermostabiliteit van het meest stabiele construct. Ga door met het verhitten van de platen totdat alle constructen lage specifieke tellingen vertonen.Kweek HEK293S GnTI minus cellen in suspensie bij 37 °C met 8% CO2 en 85% luchtvochtigheid op een schudmachine bij 130 RPM in 293 expressiemedium aangevuld met 2% foetaal runderserum. Infecteer 10 liter van de cellen met het P2-virus bij een multiplicity of infection van twee en een dichtheid van drie miljoen cellen per milliliter. Voeg 12 tot 16 uur na infectie natriumbutyraat toe tot een concentratie van 10 mM vanuit een 1 M voorraadoplossing.Oogst de cellen 48 tot 60 uur na infectie door centrifugatie bij 4.000 ×g gedurende 15 minuten. Verwijder het supernatant. Resuspendeer de cellen in 150 milliliter TBS met 2 µM escitalopram of andere SERT-remmers.Was de cellen uit 10 liter kweek in warm water van ongeveer 30 °C en resuspendeer deze door de cellen snel door een pipet van 10 ml te halen tot een homogeen mengsel. Voeg alle cellen toe aan een bekerglas met een roerstaf en voeg alle detergentoplossing toe aan de cellen onder constant roeren. Solubiliseer de cellen gedurende één uur bij 4 °C onder roering.Centrifugeer het lysaat 15 minuten bij 8.000 ×g bij vier graden Celsius. Giet het supernatant over in schone ultracentrifugebuisjes en gooi de pellet weg. Centrifugeer het supernatant vervolgens gedurende één uur bij 100.000 ×g in een ultracentrifuge.Filter na ultracentrifugatie het supernatant door een 0,2 micron filter en gooi de pellet weg. Laat het lysaat vervolgens met een peristaltische pomp over 10 milliliters strep-affiniteithars lopen, die in een kolom is gepakt en geëquilibreerd in washbuffer. Sluit daarna een strep-affiniteitskolom aan op een fast protein liquid chromatography-systeem en was de kolom met 66 milliliters washbuffer bij een snelheid van twee milliliters per minuut.Elueer het gezuiverde eiwit in dezelfde wasbuffer aangevuld met vijf millimol desthiobiotine met een stroomsnelheid van 0,5 milliliter per minuut met gebruik van 33 milliliter buffer. Verzamel fracties van één milliliter. De piekfracties zullen ongeveer 10 milliliter bedragen.Om de transporter-antilichaamcomplexen te vormen, wordt het gezuiverde eiwit eerst overnacht bij kamertemperatuur behandeld met trombine om de tags te verwijderen en met Endo H voor deglycosylering. Concentreer het eiwit tot een concentratie van 10 mg/mL en een volume van 250 tot 300 µL met behulp van een centrifugale eiwitconcentrator met een molecular weight cutoff van 100 kDa. Meng het geconcentreerde SERT-eiwit met 8B6 Fab in een molaire ratio van 1:1,2 in een volume van minder dan 500 µL.Centrifugeer het mengsel bij 100,000 ×g en vier graden Celsius gedurende 20 minuten. Verzamel na centrifugatie de supernatant die het SERT Fab-complex bevat en gooi het pellet weg. Scheid het complex met behulp van fast protein liquid chromatography op een size exclusion-kolom.Equilibreer dit met gesupplementeerde TBS met een snelheid van 0,5 milliliters per minuut. Concentreer vóór de kristallisatie de piekfracties van de scheiding van het complex tot twee milligrams per milliliter met behulp van een centrifuge-proteïneconcentrator met een molecular weight cutoff van 100 kilodalton. Een absorbentie van twee AU bij 280 nanometers komt overeen met één milligram per milliliter.Voeg extra Fab toe in een verhouding van één tot 0,05 complex ten opzichte van vrije Fab. Voeg daarnaast 10 micromolar vrije S citalopram toe. Verzamel na het centrifugeren van het monster het supernatant dat het SERT Fab-complex bevat en gooi het pellet weg.Stel een hanging drop 24-well screen op bij vier graden Celsius volgens tabel één in het tekstprotocol. Pipetteer 500 microliters van elke reservoir-oplossing in een low-profile 24-well plaat waarbij elk well is voorzien van sealant. Pipetteer 1,5, 1,75 en twee microliters van het SERT Fab-complex op een 18 millimeter gesiliconiseerd glazen dekglas.Pipetteer vervolgens één µL van de reservoir-oplossing bovenop het eiwitmonster. Enkristallen zullen binnen ongeveer drie dagen verschijnen en groeien tot 100 tot 175 µm na 14 dagen. Hier worden representatieve resultaten getoond voor het screenen van de thermostabiliteit in aanwezigheid van getritieerd citalopram.De gesette smelttemperatuurwaarden tegenover de maximale binding tonen mutanten met een hoge thermostabiliteit en expressie. Hier worden de thermostabiliteitscurves weergegeven voor wild-type SERT TC en de drie beste mutanten, Y110A, I291A en T439S. Deze microscopieopname toont HEK293S GnTI minus-cellen die SERT CC tot expressie brengen, waarbij groene fluorescentie aanwezig is op het celmembraan.Fluorescentiedetectie bij grootte-uitsluitingschromatografie van SERT CC vertoont een hoofdpiek bij 15 milliliter. Analyse via SDS-PAGE toont een enkele proteinesoort die grotendeels vrij is van contaminanten. Een representatieve scheiding van transporter-antilichaamcomplexen via grootte-uitsluitingschromatografie wordt weergegeven.De belangrijkste piek die elueerde bij 11,5 milliliter bevatte zowel SERT als Fab, zoals aangetoond op een SDS-PAGE gel. Lichtmicroscopie van het SERT-antilichaamcomplex gebonden aan S-citalopram na twee weken groei toont prisma-vormige kristallen van ongeveer 100 tot 175 micron. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u mutaties kunt identificeren die een membraaneiwit stabiliseren in een ligand-gebonden conformatie en hoe u kristallisatiescreens opzet met eiwit-antilichaamcomplexen.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat liganden noodzakelijk zijn voor de stabilisatie van SERT TC en essentieel zijn voor de kristallisatie van SERT CC. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie van psychiatrische aandoeningen, aangezien SERT het moleculaire doelwit is van veel antidepressiva. Na deze procedure kan de functie van gezuiverd SERT worden gekenmerkt met behulp van biochemische en biofysische methoden.

thermostabilization-expression-purification-crystallization-human

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

De protocollen beschrijven de essentiële stappen voor het verkrijgen van diffractie kwaliteit kristallen van een membraaneiwit vanaf reconstructie van het eiwit in een lipidische kubieke fase (LCP), het vinden van de eerste voorwaarden met LCP-FRAP pre-kristallisatie assays, het opzetten van LCP kristallisatie onderzoeken en oogsten kristallen .

Kristallisatie van membraaneiwitten in lipide mesofasen

Heterologe expressie en zuivering van het cystische fibrose transmembraan geleiding regulator (CFTR) zijn belangrijke uitdagingen en beperkende factoren in de ontwikkeling van geneesmiddelen therapieën voor cystic fibrosis. Dit protocol beschrijft twee werkwijzen voor de isolatie van milligram hoeveelheden CFTR voor functionele en structurele studies.

Zuivering van het Cystic Fibrosis transmembrane conductance regulator eiwit dat tot expressie in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Dit is een snel, kosteneffectief protocol voor de productie van uitgescheiden, geglycoseerde zoogdier-eiwitten en daaropvolgende eenstapszuivering met voldoende opbrengsten van homogeen eiwit voor röntgenkristallografie en andere biofysische studies.

Efficiënte zoogdiercelexpressie en Single-step Zuivering van extracellulaire Glycoproteïnen voor kristallisatie

Een eenvoudig protocol voor overexpressie en zuivering van codon-geoptimaliseerde, humane cis -prenyltransferase, onder niet-denaturerende omstandigheden, van Escherichia   Coli , wordt beschreven, samen met een enzymatische activiteitstest. Dit protocol kan worden genegaliseerd voor de productie van andere cis- prenyltransferase eiwitten in hoeveelheid en kwaliteit geschikt voor mechanistische studies.

Overexpressie en zuivering van het menselijk Cis -prenyltransferase in Escherichia coli

Dit artikel wordt beschreven specifieke methoden voor biochemische hoeveelheid wasmiddel-ontbindend TRPV1 spectroscopische p.a.. De gecombineerde protocollen bieden biochemische en biofysische hulpmiddelen die kunnen worden aangepast om de structurele en functionele studies voor zoogdieren ionenkanalen in een membraan-gecontroleerde omgeving.

Zuivering en reconstructie van TRPV1 spectroscopische p.a.

Dit protocol beschrijft technieken gebruikt om te bepalen van ion kanaal structuren door cryo-elektronenmicroscopie, met inbegrip van een systeem van de baculovirus gebruikt om genen in zoogdiercellen met minimale inspanning en toxiciteit, eiwit winning, zuivering, efficiënt en kwaliteit controleren, Raster monstervoorbereiding en screening, evenals gegevensverzameling en verwerking.

Meningsuiting en zuivering van de TRPC3 mens lipide-gevoelige catie kanaal voor structurele bepaling door Single-deeltje Cryo-elektronenmicroscopie

Hier presenteren we een protocol om express, solubilize en zuiveren van diverse eukaryotic boraat vervoerders met homologie aan de SLC4 transporter familie met behulp van gist. Ook beschrijven we een chemische cross-linking test om te beoordelen van de gezuiverde homomeric eiwitten voor montage van de multimeric. Deze protocollen kunnen worden aangepast voor andere uitdagende membraaneiwitten.

Meningsuiting, solubilisatie en zuivering van eukaryotische boraat Transporters

Dit artikel presenteert een reeks opeenvolgende methoden voor de expressie en zuivering van Salmonella typhimurium tryptofaan synthase comp dit protocol een snel systeem om het eiwitcomplex in een dag te zuiveren. Behandelde methoden zijn site-gerichte mutagenese, eiwitexpressie in Escherichia coli,affiniteitschromatografie, gelfiltratiechromatografie en kristallisatie.

PCR Mutagenese, Klonen, Expressie, Snelle Eiwitzuiveringsprotocollen en Kristallisatie van het Wilde Type en Mutante Vormen van Tryptofaan Synthase

Structurele en biochemische studies van menselijke membraantransporters vereisen milligramhoeveelheden stabiel, intact en homogeen eiwit. Hier beschrijven we schaalbare methoden om transporteurs van menselijke opgeloste stoffen te screenen, tot expressie te brengen en te zuiveren met behulp van codon-geoptimaliseerde genen.

High-Throughput expressie en zuivering van menselijke opgeloste stoffen voor structurele en biochemische studies

Hier presenteren we een methode om S100A12 (Calgranulin C) uit te drukken en te zuiveren. We beschrijven een protocol om zijn antimicrobiële activiteit tegen het menselijke pathogeen H. pylori te meten.

Expressie, zuivering en antimicrobiële activiteit van S100A12

Leer thermostabilisatie, expressie en kristallisatie van de menselijke serotoninetransporter gebonden aan S-citalopram. Deze methode biedt inzicht in membraaneiwitten als belangrijke medicijndoelen.

Thermostabilization, expressie, zuivering en kristallisatie van het Human serotonine transporter Gebonden aan

Meer video's verkennen