Thermostabilization, expressie, zuivering en kristallisatie van het Human serotonine transporter Gebonden aan S citalopram

Het algemene doel van deze procedure is om een transporteur te genereren die voldoende stabiel is voor structurele studies, en dit gemodificeerde transporteur te gebruiken om kristallen te produceren die tot hoge resolutie door röntgenkristallografie diffracteren. Deze methode kan sleutelvragen beantwoorden op het gebied van structurele biologie, zoals hoe de structuur van membraaneiwitten, die belangrijke doelwitten voor geneesmiddelen zijn, kan worden opgelost. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het kan worden gebruikt om een ​​drug-gebonden conformatie te selecteren met behulp van een functionele test.

Hoewel deze methode inzicht kan geven in neurotransmittertransporteurs, kan deze ook worden toegepast op receptoren, kanalen en oplosbare eiwitten die kleine moleculen met hoge affiniteit binden. Suspensieer grondig trypsiniseerd HEK293S GnTI-min-cellen in DMEM aangevuld met 10% foetaal runderserum tot een dichtheid van 0,5 miljoen cellen per milliliter in een wegwerpbare pipettenreservoir. Voeg met behulp van een multikanaals pipetten 100 microliter cellen toe aan elke put van een poly-D-lysine gecoate plaat.

Suspensieer de cellen in het pipettenreservoir na het vullen van elke plaat om een ​​gelijkmatige verdeling van cellen te garanderen. Incubeer de cellen in de 37 graden Celsius incubator met 8%koolstofdioxide. Vervang het cellenmedium een uur voorafgaand aan de transvectie.

Bereid de DNA-transvectie reagentiacomplexen voor door 450 nanogram DNA te mengen met 45 microliters serumvrij DMEM voor elk construct in de cert TC achtergrond om te screenen. Voeg vervolgens 1,6 microliters van het transvectiereagens toe aan 45 microliters serumvrij DMEM en meng. Voeg onmiddellijk de verdunde transvectiereagensoplossing toe aan de DNA-oplossing en meng.

Meng de oplossingen niet in omgekeerde volgorde. Wacht 10 tot 15 minuten voordat u 20 microliters van het transvectiereagens DNA-mengsel toevoegt aan vier van de putten. Incubeer de cellen met 200 nanomolair citalopram en 25 microliters TBS gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.

Om de cellen te solubiliseren, voeg 25 microliters van acht millimolair C12M, een millimolair CHS en proteaseremmercocktail toe in TBS. Incubeer de cellen gedurende één uur bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens 50 microliters TBS toe met 20 nanomolair tritieerd citalopram, 0,1% bovien serumalbumine en milligram per milliliter van zijn tag affiniteitsscintillatieproximiteitsassay of SPA Beads, aan drie putten voor elke constructie.

Voeg voor de laatste put dezelfde TBS-oplossing toe, maar vul aan met 100 micromolair sertraline om de niet-specifieke binding te bepalen. Zorg ervoor dat de zijn tag affiniteits SPA Beads grondig worden gemengd bij het toevoegen aan de 96-well plaat. Meet tritieerd citalopram binding met behulp van een 96-well scintillatieteller bij kamertemperatuur met een meettijd van één minuut per put.

Ga door met het tellen van platen totdat de totale tellen op ongeveer 36 uur plateau vormen. Na meting, verwarm de platen gedurende 15 minuten in een verwarmingsblok met een verwarmd deksel op 33 graden Celsius. Meet tritieerd citalopram binding opnieuw na verwarming.

Herhaal deze stappen met wijziging van de verwarmingsstap. Pas de verwarmingstemperaturen aan afhankelijk van de schijnbare smelttemperatuur van het doeleiwit en de thermostabiliteit van de meest stabiele constructie. Verwarm platen verder totdat alle constructies lage specifieke tellen hebben.

Laat HEK293S GnTI-min-cellen groeien in suspensie bij 37 graden Celsius met 8%koolstofdioxide en 85%vochtigheid op een schudder bij 130 RPM en 293 expressiemedia aangevuld met 2% foetaal runderserum. Infecteer 10 liter van de cellen met het P2-virus bij een infectiviteitsmultipliciteit van twee en een dichtheid van drie miljoen cellen per milliliter. 12 tot 16 uur na infectie, voeg natriumbutyraat toe tot een concentratie van 10 millimolair van een eenmolair voorraad.

48 tot 60 uur na infectie, verzamel de cellen door centrifugatie bij 4.000 keer G gedurende 15 minuten. Verwijder het supernatant. Suspensieer cellen in 150 milliliter TBS met 2 micromolair escitalopram of andere SERT-remmers.

de cellen van 10 liter kweek in warm water van ongeveer 30 graden Celsius en suspendeer ze door de cellen snel door een 10 milliliter pipette te passeren tot ze homogeen zijn. Voeg alle cellen toe aan een beker met een roerlat en voeg alle detergentoplossing toe aan de cellen terwijl geroerd wordt. Solubliseer de cellen gedurende één uur bij vier graden Celsius met roeren.

Slinger de lysate bij 8.000 keer G gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius. Decanteer het supernatant in schone ultracentrifugebuizen en gooi de pellet weg. Slinger vervolgens het supernatant bij 100.000 keer G gedurende één uur in een ultracentrifuge.

Na ultracentrifugering, filter het supernatant door een 0,2 micron filter en gooi de pellet weg. Voer vervolgens het lysate over 10 milliliter strep affiniteit resin in een kolom met behulp van een peristaltische pomp geëquilibreerd in wasbuffer. Verbind vervolgens een strep affiniteitskolom aan een fast protein liquid chromatografie systeem en was de kolom met twee milliliter per minuut met 66 milliliter wasbuffer.

Eluteer het gezuiverde eiwit in dezelfde wasbuffer aangevuld met vijf millimolair desthiobiotine bij 0,5 milliliter per minuut met behulp van 33 milliliter buffer. Verzamel een milliliter fracties. De piekfracties zullen ongeveer 10 milliliter zijn.

Om de transporteur antilichaamcomplexen te vormen, verteer eerst het gezuiverde eiwit gedurende één nacht bij kamertemperatuur met trombine om tags en Endo H voor deglycosylering te verwijderen. Concentreer het eiwit tot een concentratie van 10 milligram per milliliter en een volume van 250 tot 300 microliters met behulp van een 100 kilodalton moleculair gewicht afsluitende centrifuge-eiwit concentrator. Meng het geconcentreerde SERT-eiwit met 8B6 Fab bij een molaire verhouding van één op 1,2 in een volume van minder dan 500 microliter