Thermostabilization, expressie, zuivering en kristallisatie van het Human serotonine transporter Gebonden aan

Het algemene doel van deze procedure is om een transporter te genereren die voldoende stabiel is voor structurele studies, en deze gemodificeerde transporter te gebruiken om kristallen te produceren die met hoge resolutie diffracteren via röntgencrystallografie. Deze methode kan kernvragen in het veld van de structurele biologie beantwoorden, zoals hoe de structuur van membraaneiwitten, die belangrijke drugtargets zijn, kan worden opgelost. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze kan worden gebruikt om, middels een functionele assay, te selecteren uit een medicijngebonden conformatie.

Hoewel deze methode inzicht kan bieden in neurotransmittertransporters, kan deze ook worden toegepast op receptoren, kanalen en oplosbare eiwitten die kleine moleculen met een hoge affiniteit binden. Resuspendeer trypsiniseerde HEK293S GnTI minus cellen grondig in DMEM aangevuld met 10% foetaal runderserum tot een dichtheid van 0,5 miljoen cellen per milliliter in een wegwerp pipetreservoir. Voeg met een meerkanaals pipet 100 microliters cellen toe aan elke put van een met poly-D-lysine gecoate plaat.

Resuspendeer de cellen in het pipetreservoir na het vullen van elke plaat om een gelijkmatige verdeling van de cellen te waarborgen. Incubeer de cellen in de 37 °C incubator met 8% CO2. Vervang het celmedium één uur vóór de transfectie.

Bereid de DNA-transvectiereagenscomplexen door 450 nanogram DNA te mengen met 45 microliter serumvrij DMEM voor elk construct in de cert TC-achtergrond dat gescreend moet worden. Voeg vervolgens 1,6 microliter transvectiereagens toe aan 45 microliter serumvrij DMEM en meng dit. Voeg de verdunde transvectiereagensoplossing onmiddellijk toe aan de DNA-oplossing en meng.

Meng de oplossingen niet in omgekeerde volgorde. Wacht 10 tot 15 minuten voordat u 20 µL van het transfectiereagens DNA-mengsel aan vier van de wells toevoegt. Incubeer de cellen met 200 nM citalopram en 25 µL TBS gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.

Om de cellen te solubiliseren, voegt u 25 µL van 8 mM C12M, 1 mM CHS en protease-inhibitorcocktail in TBS toe. Incubeer de cellen gedurende één uur bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens aan drie wells voor elk construct 50 µL TBS toe met 20 nM getritieerd citalopram, 0,1% bovine serum albumine en mg/mL his-tag affiniteit scintillation proximity assay of SPA-beads.

Voeg aan de laatste put dezelfde TBS-oplossing toe, maar vul deze aan met 100 micromolar sertraline om aspecifieke binding te bepalen. Zorg ervoor dat de his-tag affiniteit SPA-beads grondig zijn gemengd voordat ze aan de 96-putjesplaat worden toegevoegd. Meet de binding van getritieerd citalopram met een 96-putjes scintillatieteller bij kamertemperatuur met een telttijd van één minuut per putje.

Ga door met het tellen van de plaatjes totdat de totale tellingen na ongeveer 36 uur een plateau bereiken. Verwarm de plaatjes na de meting gedurende 15 minuten in een heating block met een verwarmd deksel bij 33 °C. Meet de binding van getriteerd citalopram na het verwarmen opnieuw.

Herhaal deze stappen met een aanpassing van de verhittingstap. Pas de verhittingstemperaturen aan op basis van de schijnbare smelttemperatuur van het doeleiwit en de thermostabiliteit van het meest stabiele construct. Ga door met het verhitten van de platen totdat alle constructen lage specifieke tellingen vertonen.

Kweek HEK293S GnTI minus cellen in suspensie bij 37 °C met 8% CO2 en 85% luchtvochtigheid op een schudmachine bij 130 RPM in 293 expressiemedium aangevuld met 2% foetaal runderserum. Infecteer 10 liter van de cellen met het P2-virus bij een multiplicity of infection van twee en een dichtheid van drie miljoen cellen per milliliter. Voeg 12 tot 16 uur na infectie natriumbutyraat toe tot een concentratie van 10 mM vanuit een 1 M voorraadoplossing.

Oogst de cellen 48 tot 60 uur na infectie door centrifugatie bij 4.000 ×g gedurende 15 minuten. Verwijder het supernatant. Resuspendeer de cellen in 150 milliliter TBS met 2 µM escitalopram of andere SERT-remmers.

Was de cellen uit 10 liter kweek in warm water van ongeveer 30 °C en resuspendeer deze door de cellen snel door een pipet van 10 ml te halen tot een homogeen mengsel. Voeg alle cellen toe aan een bekerglas met een roerstaf en voeg alle detergentoplossing toe aan de cellen onder constant roeren. Solubiliseer de cellen gedurende één uur bij 4 °C onder roering.

Centrifugeer het lysaat 15 minuten bij 8.000 ×g bij vier graden Celsius. Giet het supernatant over in schone ultracentrifugebuisjes en gooi de pellet weg. Centrifugeer het supernatant vervolgens gedurende één uur bij 100.000 ×g in een ultracentrifuge.

Filter na ultracentrifugatie het supernatant door een 0,2 micron filter en gooi de pellet weg. Laat het lysaat vervolgens met een peristaltische pomp over 10 milliliters strep-affiniteithars lopen, die in een kolom is gepakt en geëquilibreerd in washbuffer. Sluit daarna een strep-affiniteitskolom aan op een fast protein liquid chromatography-systeem en was de kolom met 66 milliliters washbuffer bij een snelheid van twee milliliters per minuut.

Elueer het gezuiverde eiwit in dezelfde wasbuffer aangevuld met vijf millimol desthiobiotine met een stroomsnelheid van 0,5 milliliter per minuut met gebruik van 33 milliliter buffer. Verzamel fracties van één milliliter. De piekfracties zullen ongeveer 10 milliliter bedragen.

Om de transporter-antilichaamcomplexen te vormen, wordt het gezuiverde eiwit eerst overnacht bij kamertemperatuur behandeld met trombine om de tags te verwijderen en met Endo H voor deglycosylering. Concentreer het eiwit tot een concentratie van 10 mg/mL en een volume van 250 tot 300 µL met behulp van een centrifugale eiwitconcentrator met een molecular weight cutoff van 100 kDa. Meng het geconcentreerde SERT-eiwit met 8B6 Fab in een molaire ratio van 1:1,2 in een volume van minder dan 500 µL.

Centrifugeer het mengsel bij 100,000 ×g en vier graden Celsius gedurende 20 minuten. Verzamel na centrifugatie de supernatant die het SERT Fab-complex bevat en gooi het pellet weg. Scheid het complex met behulp van fast protein liquid chromatography op een size exclusion-kolom.

Equilibreer dit met gesupplementeerde TBS met een snelheid van 0,5 milliliters per minuut. Concentreer vóór de kristallisatie de piekfracties van de scheiding van het complex tot twee milligrams per milliliter met behulp van een centrifuge-proteïneconcentrator met een molecular weight cutoff van 100 kilodalton. Een absorbentie van twee AU bij 280 nanometers komt overeen met één milligram per milliliter.

Voeg extra Fab toe in een verhouding van één tot 0,05 complex ten opzichte van vrije Fab. Voeg daarnaast 10 micromolar vrije S citalopram toe. Verzamel na het centrifugeren van het monster het supernatant dat het SERT Fab-complex bevat en gooi het pellet weg.

Stel een hanging drop 24-well screen op bij vier graden Celsius volgens tabel één in het tekstprotocol. Pipetteer 500 microliters van elke reservoir-oplossing in een low-profile 24-well plaat waarbij elk well is voorzien van sealant. Pipetteer 1,5, 1,75 en twee microliters van het SERT Fab-complex op een 18 millimeter gesiliconiseerd glazen dekglas.

Pipetteer vervolgens één µL van de reservoir-oplossing bovenop het eiwitmonster. Enkristallen zullen binnen ongeveer drie dagen verschijnen en groeien tot 100 tot 175 µm na 14 dagen. Hier worden representatieve resultaten getoond voor het screenen van de thermostabiliteit in aanwezigheid van getritieerd citalopram.

De gesette smelttemperatuurwaarden tegenover de maximale binding tonen mutanten met een hoge thermostabiliteit en expressie. Hier worden de thermostabiliteitscurves weergegeven voor wild-type SERT TC en de drie beste mutanten, Y110A, I291A en T439S. Deze microscopieopname toont HEK293S GnTI minus-cellen die SERT CC tot expressie brengen, waarbij groene fluorescentie aanwezig is op het celmembraan.

Fluorescentiedetectie bij grootte-uitsluitingschromatografie van SERT CC vertoont een hoofdpiek bij 15 milliliter. Analyse via SDS-PAGE toont een enkele proteinesoort die grotendeels vrij is van contaminanten. Een representatieve scheiding van transporter-antilichaamcomplexen via grootte-uitsluitingschromatografie wordt weergegeven.

De belangrijkste piek die elueerde bij 11,5 milliliter bevatte zowel SERT als Fab, zoals aangetoond op een SDS-PAGE gel. Lichtmicroscopie van het SERT-antilichaamcomplex gebonden aan S-citalopram na twee weken groei toont prisma-vormige kristallen van ongeveer 100 tot 175 micron. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u mutaties kunt identificeren die een membraaneiwit stabiliseren in een ligand-gebonden conformatie en hoe u kristallisatiescreens opzet met eiwit-antilichaamcomplexen.

Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat liganden noodzakelijk zijn voor de stabilisatie van SERT TC en essentieel zijn voor de kristallisatie van SERT CC. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie van psychiatrische aandoeningen, aangezien SERT het moleculaire doelwit is van veel antidepressiva. Na deze procedure kan de functie van gezuiverd SERT worden gekenmerkt met behulp van biochemische en biofysische methoden.