Mouse Microchirurgie Infusion Techniek voor gerichte afgifte van een substantie in het centraal zenuwstelsel via De interne halsslagader

Het algemene doel van deze chirurgische techniek is om exogene stoffen in de muizenhersenen te brengen zonder het schedeldak te penetreren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de neurowetenschappen over de werking van geneesmiddelen, pathogenen en exosomen in de hersenen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het minimaal letsel veroorzaakt bij het dier, de integriteit van het neuronale netwerk behoudt en hoge concentraties van de stof in de hersenen bereikt.

Begin door isofluraan gemengd met zuurstof toe te dienen om de muis te anesthetiseren in een inductiekamer. Na inductie van de anesthesie, brengt u het dier over naar het operatietafeltje onder een stereomicroscoop en plaatst u de neuskonus om een chirurgisch niveau van anesthesie te handhaven. Zorg ervoor dat de ademhalingssnelheid ongeveer één tot twee ademhalingen per seconde is zonder naar lucht te happen.

Zorg er ook voor dat het dier niet reageert op snorhaarstimulatie of een teenprikken. Gebruik een steriele wattenstaafje om een druppel ooftlube op elk oog aan te brengen om uitdroging te voorkomen. Na het scheren van de operatieplaats met een scheermesje, bereidt u het gebied voor met 70% ethanol en chloorhexidine.

Terwijl u door de stereomicroscoop kijkt, gebruikt u chirurgische schaar en pincetten om een middenlijnsnede in de nek te maken van boven het borstbeen tot onder de kaak. Gebruik pincetten om voorzichtig vet- en bindweefsel te scheiden om de luchtpijp bloot te leggen. Plaats vervolgens een zacht, rond object van ongeveer halve centimeter diameter onder de achterkant van de nek om de nek te strekken en het gebied verder bloot te leggen.

Separeer vervolgens het weefsel rond de luchtpijp met behulp van haken of een weefselretractor. Aan de linkerkant van de luchtpijp, scheidt u voorzichtig het bindweefsel om de linker gemeenschappelijke halsslagader, of CCA, bloot te leggen. Gebruik pincetten om voorzichtig al het bindweefsel te verwijderen om de CCA-bifurcatie aan het begin van zowel de externe als interne halsslagader bloot te leggen.

Zodra de ECA en ICA blootliggen, gebruikt u pincetten om een segment van een centimeter nylondraad onder de externe halsslagader te plaatsen. Plaats vervolgens een tweede segment van een centimeter. Bind vervolgens een permanente knoop op het hoogste mogelijk punt van de ECA.

Op het laagste mogelijk punt van de ECA, onmiddellijk boven de CCA-bifurcatie, bindt u een lossere, verwijderbare knoop. Gebruik vervolgens vaatclips om de CCA op het laagst mogelijke punt te sluiten, en om de ICA te sluiten. Het juist sluiten van de interne halsslagader voordat u een kleine snede maakt in de externe halsslagader, voorkomt bloeding.

Maak nu, met behulp van microdissectiesprongschaar, een snede van twee millimeter in de ECA tussen de twee knopen. Het is belangrijk om de sneden klein te houden, omdat een grote snede lekkage van de te infunderen stof zal veroorzaken. Monteer het infuussysteem door zes centimeter capillaire buis aan te sluiten op een tuberculine-spuit bevattend 250 microliters van de te infunderen stof.

Breng vervolgens voorzichtig de punt van de capillaire buis in de snede in de ECA in. Blijf de punt voortschuiven tot deze halverwege tussen de bifurcatie en de clip op de CCA aankomt. Bind de onderste ECA-knoop vast.

Controleer of de knoop los genoeg is om capillaire vloeibaarheid toe te laten, en strak genoeg om lekkage te voorkomen. Verwijder vervolgens de clip van de ICA. Oefen voorzichtig druk uit op de spuitpomp, waardoor de stof ongeveer 10 microliters per seconde wordt ingespoten.

Na infusie van de testsubstantie, plaatst u de clip terug op de ICA. Verwijder voorzichtig de capillaire buis. Bind vervolgens de onderste ECA-knoop volledig vast.

Verwijder de clip van de ICA en de CCA. Verwijder vervolgens de retractor of weefselhaken en het kussen. Reinig het te naaien gebied met steriele zoutoplossing en sluit vervolgens de snede met nylondraad.

Na toediening van een goedgekeurd ontstekingsremmend middel en pijnstiller om postoperatieve ongemakken te verlichten, plaatst u het dier in een kooi op een verwarmingsmat gedurende minstens een uur en bewaakt u het herstel. Deze histogram toont HIV-detectie door real-time PCR's zeven dagen na virale infusie via de linker interne halsslagader. Zoals verwacht, zijn de virusniveaus hoger in de linker hersenhelft.

Deze immunofluorescence-afbeelding toont een muizenhersencel die GFP-tag CD63, een exosome marker, toont na infusie van extracellulaire vesikel via de interne halsslagader. De CD63-expresserende extracellulaire vesikels, getoond in groen, zijn geassocieerd met de muizenhersen microvaten. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in 20 minuten worden uitgevoerd als deze correct wordt uitgevoerd.

Na de ontwikkeling van deze techniek, heeft dit de weg gebaand voor onderzoekers op het gebied van neurodegeneratieve ziekten om geneesmiddelen, pathogenen en exosome interacties in muizen te onderzoeken.