Inductie van ischemische beroerte en ischemie-reperfusie in Muizen met behulp van het Midden-slagader occlusie Techniek en Visualisatie van Infarct Area
2 februari 2017
We beschrijven een muismodel van een beroerte veroorzaakt door de occlusie van de middelste hersenslagader met behulp van een met siliconen omhulde naald. Het protocol kan worden toegepast om een permanente occlusie of een tijdelijke ischemie te induceren, gevolgd door reperfusion.
Het algemene doel van deze chirurgische ingreep is om officieel en betrouwbaar een ischemische beroerte teweeg te brengen, terwijl de externe cerebrale slagader intact blijft. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het gebied van beroerteonderzoek te beantwoorden, zoals de impact van behandeling op de ernst van een beroerte. Het grote voordeel van deze techniek is dat na inductie van de beroerte de externe cerebrale slagader beschikbaar blijft om behandeling rechtstreeks in het getroffen halfrond te infunderen.
Plaats een muis die is verdoofd met isofluraangeluidelijk op het voorbereide operatieoppervlak en plaats een neuskoker om isofluraangemengd met zuurstof toe te dienen. Zorg ervoor dat de ademhalingssnelheid ongeveer een tot twee ademhalingen per seconde is zonder naar adem te happen. Zorg er ook voor dat het dier geen reactie vertoont op snorharenstimulatie of de pedale reflex.
Plaats een druppel ooftlube op elk oog, met behulp van een steriel wattenstaafje om te voorkomen dat ze uitdrogen tijdens de procedure. Na het scheren van het incisiegebied, desinfecteer het operatiegebied grondig met 70%ethanol en een op chloorhexidine gebaseerde oplossing. Houd het dier op een warm chirurgisch oppervlak onder een stereomicroscoop.
Gebruik vervolgens chirurgische schaar en pincetten om een ondiepe middenlijnsnede in de nek uit te voeren van boven het borstbeen tot onder de kaak. Gebruik pincetten om vet- en bindweefsels voorzichtig te scheiden om de luchtpijp bloot te leggen. De weefsels moeten gemakkelijk en natuurlijk naar beide kanten scheiden.
Plaats vervolgens een kussen of ander rond object van ongeveer 0,5 centimeter in diameter onder de achterkant van de nek om de nek uit te strekken en het gebied verder bloot te leggen voor de operatie. Open de incisie met behulp van een weefselterrector of haken. Trek vervolgens aan de linkerkant van de luchtpijp voorzichtig het bindweefsel uit elkaar om de linkergemeenschappelijke halsslagader bloot te leggen zonder nabijgelegen zenuwen en grote aderen te beschadigen.
Breng vervolgens de gebogen pincetten onder de CCA aan om het bindweefsel te doorboren en laat ze vervolgens langzaam openen om de CCA los te laten. Maak de CCA los van het onderliggende weefsel en blootleg de bovenste Y-vertakking van de interne en externe cerebrale slagader. Zodra de CCA is blootgelegd, breng drie segmenten van nylondraad onder de CCA aan.
Zorg ervoor dat de CCA niet gedraaid is, omdat dit het inbrengen van de naald drastisch zou bemoeilijken. Sluit vervolgens de onderste naald zo dicht mogelijk bij het laagste punt met een permanente knoop. Bind de bovenste naald net onder de vertakking van de ICA en ECA met een verwijderbare glijbaan.
Bind vervolgens de middelste naald met een verwijderbare glijbaan, maar houd deze wijd open. Maak vervolgens met micro dissectiesprongen een opening van 0,2 millimeter in de CCA tussen de onderste en middelste naald, dichter bij de onderste naald. Breng met behulp van pincetten de MCAO-naald in de CCA-incisie aan en leid deze naar de bovenste naald.
Trek vervolgens voorzichtig de glijbaan van de middelste naald op de CCA aan zodat deze de bloedstroom rond de MCAO-naald beperkt, maar los genoeg is om de MCAO-naald vrij te laten bewegen. Maak nu voorzichtig de bovenste naald los en zorg ervoor dat de MCAO-naald niet uitglijdt. Breng de MCAO-naald een paar millimeter in de ICA in en sluit de bovenste naald opnieuw met een glijbaan zoals eerder.
Leid vervolgens de MCAO-naald naar het occlusiegebied, eerst door deze in de ICA langs de ECA te leiden, en zorg er vervolgens voor dat de naald in de ICA blijft en de pterygopalatine-slagader omzeilt. De inbrenging is succesvol als er weinig bloed terugvloeit uit de CCA-incisie en als de zilveren negen millimeter markering zich tussen de CCA-incisie en de vertakking van de ICA en ECA bevindt. Na succesvolle occlusie, bind de middelste en bovenste naald stevig vast en stop de naalden in het incisiegebied.
Na het verwijderen van de retractor of weefselhaken en het kussen, reinig het naadgebied met steriel zoutoplossing op een wattenstaafje. Sluit vervolgens de huid met nylondraad. Plaats de muis in een schone kooi op een verwarmde pad om hypothermie te voorkomen en zorg voor vrije toegang tot water en verzacht voedsel.
Bewaak het dier gedurende ten minste vijf tot tien minuten op tekenen van een beroerte. Afhankelijk van het ischemie-reperfusieprotocol, laat de MCAO-naald gedurende 30 tot 120 minuten of langer op zijn plaats. Nadat het dier opnieuw is verdoofd en de wondsluitnaden zijn verwijderd, gebruik pincetten en weefselscheiders om de incisie te heropenen en de CCA bloot te leggen.
Verwijder vervolgens voorzichtig de bovenste naald en trek voorzichtig aan de MCAO-naald totdat het met siliconen beklede gedeelte zich op de middelste knoop bevindt. Herhaal de bovenste knoop om te voorkomen dat bloed langs de MCAO-naald stroomt. Maak vervolgens voorzichtig de middelste knoop los en trek de MCAO-naald voorbij de bovenste knoop, waarbij deze in de CCA blijft.
Trek de bovenste knoop stevig dicht om de bloedstroom van de slagader te blokkeren. Trek vervolgens de MCAO-naald volledig uit en sluit de middelste knoop stevig. Sluit de wond en voer na de operatie zorg uit zoals eerder.
Dit schema toont het occlusiegebied dat resulteert uit de procedure die in deze video wordt gedemonstreerd in blauw. Het operatiegebied bevindt zich onderaan de figuur, aangegeven door de ovale vorm, en de naaldplaatsing wordt aangegeven door zwarte lijnen. De volgende afbeeldingen tonen TTC-kleuring van hersensecties.
Deze afbeelding vertegenwoordigt typische kleuring na schijninbreng. De afbeelding is representatief voor de weefselschade veroorzaakt door een 60 minuten MCAO, gevolgd door 90 minuten reperfusie. Meer weefselschade is te zien na 2
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een chirurgische procedure om een ischemische beroerte op te wekken in een muismodel door occlusie van de middelste hersenslagader. Deze methode laat de externe arteria cerebri intact, wat directe infusie van een behandeling in het aangetaste hemisfeer mogelijk maakt.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Beroerteonderzoek
- Diermodellen
Achtergrond
- Ischemische beroerte is een cruciaal onderzoeksgebied binnen de neurowetenschappen.
- Het begrijpen van de effecten van behandelingen op de ernst van de beroerte is essentieel.
- Het behouden van de arteria cerebri externa tijdens de occlusie is voordelig.
- Dit model kan worden gebruikt voor zowel permanente occlusie als tijdelijke ischemie.
Doel van de studie
- Om op betrouwbare wijze een ischemische beroerte bij muizen te induceren.
- Om de effecten van verschillende behandelingen op de uitkomsten van de beroerte te onderzoeken.
- Om een model te bieden voor het bestuderen van mechanismen en therapieën bij beroertes.
Gebruikte methoden
- Anesthesie van de muis met isofluraan en zuurstof.
- Plaatsen van een met siliconen gecoate hechtdraad voor arteriële occlusie.
- Monitoring van de ademhalingsfrequentie en reflexen tijdens de operatie.
- Infusie van de post-stroke behandeling via de arteria cerebri externa.
Belangrijkste resultaten
- De procedure induceerde met succes een ischemische beroerte.
- De arteria cerebri externa bleef intact voor de infusie van de behandeling.
- Potentieel voor verder onderzoek naar therapieën tegen beroertes.
- De methode bleek betrouwbaar en reproduceerbaar.
Conclusies
- Dit model is een waardevol instrument voor onderzoek naar beroertes.
- Het maakt directe toediening van behandelingen na de occlusie mogelijk.
- Verdere studies kunnen voortbouwen op deze fundamentele techniek.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Het model voor occlusie van de arteria cerebri media (MCAO) bij muizen biedt een betrouwbaar en reproduceerbaar systeem voor het induceren van een focale ischemische beroerte, wat de preklinische evaluatie van neuroprotectieve en trombolytische therapieën mogelijk maakt. Door de arteria cerebri externa te behouden, ondersteunt deze techniek de lokale toediening van behandelingen, waardoor het mechanistische inzicht in de pathologie van beroertes en herstelroutes wordt vergroot. De compatibiliteit van het model met genetische varianten en gestandaardiseerde gedragstesten versterkt het nut ervan bij de validatie van targets en het identificeren van lead-verbindingen binnen drug discovery-pipelines voor neurowetenschappen.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Target Validatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen in een gedefinieerde ischemische laesie mogelijk, wat bijdraagt aan de verduidelijking van signaalpaden en het biologische de-risking van targets voor beroertes.
- Operationele waarde: Faciliteert een consistente inductie van infarcten over verschillende studies heen, waardoor de reproduceerbaarheid van target-engagement en functionele validatie-assays wordt verbeterd.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantificeerbare metrieken voor weefselschade via TTC-kleuring en immunofluorescentie, wat dosis-responsanalyse van kandidaatverbindingen mogelijk maakt.
- Operationele waarde: Ondersteunt gestandaardiseerde reperfusietiming en occlusie op basis van hechtingen, waardoor schaalbare screening van therapieën tegen beroertes mogelijk is onder gecontroleerde chirurgische omstandigheden.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Modelleert ischemie-reperfusieschade met temporele controle, waardoor evaluatie van vertraagdebehandelingseffecten en biomarker-uitlijning (bijv. MAP2, GFAP) voor translationele relevantie mogelijk is.
- Operationele waarde: Maakt infusie van behandeling na occlusie mogelijk via de intacte arteria cerebri externa, wat klinische toedieningsroutes nabootst en preklinische continuïteit ondersteunt.
Integratie van Pipeline & Workflow
Het MCAO-model past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie via leadidentificatie tot preklinische efficiëntietests, in het bijzonder bij het beoordelen van neuroprotectieve middelen of reperfusietherapieën.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing van ischemische mechanismen en pathway-modulatie in een focaal letselmodel met een reproduceerbare laesietopologie.
- Screening: Maakt kwantitatieve beoordeling mogelijk van de effecten van verbindingen op de infarctgrootte en het neurologische deficit, in combinatie met gedragsmatige en histologische readouts.
- Analytics: Levert meetbare resultaten, waaronder infarctoppervlak (TTC), neuronaal verlies (MAP2) en astrogliose (GFAP) voor comparatieve analyse tussen behandelingsgroepen.
- Translational Research: Modelleert klinisch relevante ischemie-reperfusievolgordes, waardoor evaluatie van therapeutische vensters en biomarker-gestuurde patiëntenstratificatiebenaderingen mogelijk is.
- Enterprise Reuse: Vormt een gestandaardiseerd chirurgisch platform dat toepasbaar is op meerdere therapeutische modaliteiten en doelwitklassen bij de ontwikkeling van cerebrovasculaire geneesmiddelen.
Operationele en bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt de voorspellende betrouwbaarheid door focale ischemie te modelleren met behoud van arteriële toegang voor toediening van de behandeling, waardoor mechanische ambiguïteit in de pathofysiologie van beroertes wordt verminderd.
- Operationele waarde: Zorgt voor procedurele standaardisatie via hechtingsgebaseerde occlusie en controle over de timing van reperfusie, wat de vergelijkbaarheid tussen studies verbetert.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen door vroege beoordeling van de impact van de behandeling op de ernst van de beroerte en hersteltrajecten mogelijk te maken.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering van neurowetenschappelijke kandidaten door middel van betrouwbare modellering van ischemische schade en therapeutische respons.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in microsurgische technieken, waaronder vaatisolatie en hechtingmanipulatie onder stereomicroscopie.
- Is afhankelijk van gespecialiseerde instrumentatie, zoals microdissectie-veerschaartjes, pincetten en hechtmaterialen voor een precieze plaatsing van de MCAO-hechting.
- Necessiteert gestandaardiseerde anesthesie- en fysiologische monitoringsprotocollen (bijv. ademhalingsfrequentie, afwezigheid van reflexen) om consistente chirurgische resultaten te waarborgen.
- Omvat overwegingen met betrekking tot adaptatie tussen verschillende muizenstammen en genetische modellen om de getrouwheid van de occlusie en de reproduceerbaarheid van het infarct te behouden.
- Bevat praktische beperkingen, zoals het risico op het wegglijden van de hechting en variabiliteit in de effectiviteit van de reperfusie, die beheerst moeten worden door procedurele training en validatie.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:05
Title
0:37
Dissection of the Common Carotid Artery and Internal/External Branching
2:53
Preparation of the CCA for the MCAO Suture Insertion
3:51
Middle Cerebral Artery Occlusion
5:59
Reperfusion
7:07
Results: Characteristics of Brain Tissue Following Ischemia-Reperfusion
8:38
Conclusion
