Name: Mass histologie te kwantificeren Neurodegeneratie in Drosophila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 34 s
Description: Leer neurodegeneratie kwantificeren in Drosophila zonder specifieke kleuring. Deze methode minimaliseert systematische fouten door controle- en experimentele vliegen als één sample te verwerken.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door subsidies aan D.K. van de Medical Research Foundation of Oregon en van NIH/NINDS (NS047663). E.S. werd ondersteund door een opleidingssubsidie van de NIH (T32AG023477).

1. Vaststelling van de Hoofd op Kragen en insluiten in paraffine Opmerking: Alle stappen in het bevestigingsorgaan proces moet worden uitgevoerd in een zuurkast. Methylbenzoaat, terwijl niet het stellen van een risico voor de gezondheid, heeft een zeer aparte geur, die overweldigend kan zijn als niet in een zuurkast behandeld. <ol><li> Voordat verlamming de vliegen, make-up 50 ml Carnoy-oplossing door het toevoegen van 15 ml chloroform en 5 ml ijsazijn en 30 ml van 99% ethanol (niet de chloroform en azijnzuur niet mengen). Giet het in een glazen houder met een vlakke bodem, zoals kristalliseren schotel, zodat de kragen plat kan liggen en zijn volledig bedekt door de oplossing. </li><li> Verdoven de vliegen met CO 2 of ether. </li><li> Draad vliegen (maximaal 20 meeste kragen) van de nek in de kragen behulp van een tang. Probeer alle koppen uitgelijnd in dezelfde oriëntatie, zoals in figuur 1A en zijn jegens zodat er geen schade ontstaat aan het hoofd of ogen. </li><li> Omvatten sinus oculis vliegen (pijlen, Figuur 1A) op willekeurige posities zodat de volgorde van de vliegen gemakkelijk kunnen worden geïdentificeerd in de secties. Bovendien, als de experimentele vliegen hebben een lichte of witte kleur van je ogen en haal een paar rood-eyed vliegen, zoals wild-type, tussen hen om ervoor te zorgen dat er voldoende pigment aanwezig zijn om de dia vlek is. Noteer de volgorde van de vliegen op een protocol blad samen met de kraag nummer als u meer dan een kraag. </li><li> Zodra een kraag is afgerond, plaatst u deze in de voorbereide Carnoy oplossing voor 3,5-4 uur. </li><li> Dump de Carnoy oplossing in de juiste verwijdering bus en beginnen met het ethanol wasbeurten. Zorg ervoor langzaam gieten om niet de plaatsing van de kragen in de houder verstoren. </li><li> Was de kragen gedurende 30 minuten in 99% ethanol tweemaal. </li><li> Was de kragen in 100% ethanol gedurende 1 uur. Zorg ervoor dat u de wasbeurten op tijd veranderen overdehydration voorkomen. </li><li> Zet de kragen in methylbenzoaatO / N bij kamertemperatuur. Verzegel de container met parafilm de verdamping van de methylbenzoaat voorkomen. </li><li> Giet de methylbenozate in de juiste wegwerp container in de zuurkast. Voeg een eerder bereide mengsel van 1: 1 laag smeltpunt (56-57 ° C) paraffine en methylbenzoaat. Vanaf dit punt moeten de kragen in een incubator worden gehouden bij 65 ° C om ervoor te zorgen dat de paraffine niet verhard. </li><li> Giet de methylbenozate en paraffine mengsel in de juiste wegwerp container, en giet gesmolten pure paraffine, gehouden op 65 ° C, op de kragen. </li><li> Wijzig de paraffine na 30 min en herhaal dit ten minste 5 maal. Tenminste 6-8 wasbeurten worden uitgevoerd. </li><li> Zodra de wasbeurten zijn voltooid, zet de kragen in een rubber ijsblokjesvorm sleuven ongeveer ter grootte van de kragen. Giet gesmolten paraffine over hen tot het volledig bedekt en laat het O harden / N (proberen om luchtbellen te vermijden). </li><li> Verwijder de paraffineblokken containing de kragen van het ijsblokje lade. Scheid de paraffine blok van de kraag met behulp van een scheermesje, zachtjes breken van de kraag. De hoofden zullen in de paraffine blok, terwijl de lichamen zullen blijven in de kraag. De blokken kunnen bij kamertemperatuur worden bewaard. </li><li> Om de kragen schoon te maken, laat ze in een deparafinization middel bij 65 ° C om de paraffine, schoon met licht schrobben verwijderen en wassen in ethanol alvorens opnieuw te gebruiken. </li></ol> 2. Snijden en montage <ol><li> Verwarm een ​​verwarmingsplaat tot 50 ° C. Plaats het object houders (of metaal montage blokken) en scheermesjes op het bord en laat ze opwarmen. </li><li> Afhankelijk van de gewenste oriëntatie voor het snijden, bevestigt het paraffineblok hetzij met de kop naar de zijkant (voor horizontale secties) of naar boven (frontale secties) om een ​​verwarmde montageblok (kort smelt het blok aan de contactzijde). Verwijder het blok van de verwarming bord en laat hem afkoelen gedurende minstens 10 min dat de paraffine voldoende is uitgehard om een ​​goede afdichting op het montageblok. Houd de rij koppen lijn parallel aan het oppervlak van het blok zo veel mogelijk te oneffenheden te voorkomen. </li><li> Neem een ​​scheermesje en trim de overtollige paraffine uit de buurt van de vlieg hoofden zodat slechts een kleine rij met de embedded hoofden blijft (het scheermesje kan worden opgewarmd voor eenvoudiger trimmen). Zorg ervoor dat niet te veel te trimmen, zodat de paraffine niet breekt tijdens het snijden (meer trimmen kan worden gedaan tijdens het snijden). </li><li> Plaats het montageblok in de objecthouder van het microtoom en zodat de stand van de rij koppen zo evenwijdig mogelijk aan de rand van het blad. </li><li> Bereid microscoopglaasjes door bedekken met een dunne laag poly-L-lysine-oplossing (PLL) en laat ze drogen gedurende 5 minuten. Bedek ze met water kort voor gebruik. </li><li> Snijd 7 um secties en breng het lint van de punten aan de dia op het water drijven. &lt;br /&gt; OPMERKING: Om het hele brein voor horizontale secties te verkrijgen, verzamelen wij het lint uit bij het starten in het oog te snijden totdat het hoofd volledig is gesneden (het snijden van de snuit in de hersenen). Meer dan een slide kan nodig zijn voor de gehele kop. </li><li> Plaats het preparaat op een warmte plaat bij 37 ° C en laat het lint te breiden gedurende 1 min. </li><li> Verwijder het teveel aan water (door het gieten van het af of het gebruik van een weefsel) en droog de slides O / N. </li><li> Verwijder de paraffinewas van de schuif door het plaatsen van de objectglaasjes in een lange, verticale slide-kleuring pot gevuld met een deparafinization middel (volledig bedekken volgende secties). Voer 3 wasbeurten van 30 min - 60 min elk. </li><li> Verwijder de dia uit de laatste wasbeurt. Plaats 2 druppels van het inbedden van de media op de glijbaan en bedek het met een groot dekglaasje. </li></ol> 3. fotograferen en analyseren van de secties <ol><li> Laat de voorbereide dia&#39;s drogen 1-2 d. Daarna onderzoeken ze op een fluorescentie Microscope onder blauw licht. </li><li> Gebruik een lagere vergroting om de oriëntatie van de vliegen te bepalen en de regio van belang vinden als gericht op een specifieke regio. LET OP: Voor de SWS vliegen (zie figuur 2), vinden we het gedeelte dat de grote commissure bevat en neem een afbeelding (meestal op 40x vergroting). Bij het analyseren van de gehele hersenen (zoals in figuur 3), schuiven we door alle secties van een kop en ofwel fotograferen het gedeelte met de meest ernstige fenotype of alle secties die vacuolen vertonen. </li><li> Voor een dubbel-blinde analyse over te gaan en het aantal foto&#39;s zonder te weten het genotype en noteer de kraag aantal en de positie van het hoofd in de rij om ze later te identificeren. </li><li> Zodra de foto&#39;s zijn genomen, te analyseren met behulp van een imaging software. </li><li> Tel het aantal vacuolen per afdeling of per hoofd. Om de vacuole maat te meten, opent u de beelden in een softwareprogramma en selecteer de vacuolen met een selectie ookl. Bepaal het aantal pixels in de geselecteerde vacuolen. </li><li> Voor de conversie naar um 2, neem een foto van een podium micrometer kalibratie dia bij de vergroting wordt gebruikt voor het verwerven van foto&#39;s. Bepaal het aantal pixels in 100 urn 2 een conversiefactor te berekenen. </li><li> Converteren het totale aantal pixels in 2 urn door het aantal pixels te delen door de conversiefactor berekend in de bovenstaande stap. </li></ol>

<ol><li>Alexander, A. G., Marfil, V., Li, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Caenorhabditis+elegans+as+a+model+to+study+Alzheimer%27s+disease+and+other+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">Use of Caenorhabditis elegans as a model to study Alzheimer's disease and other neurodegenerative diseases.</a> Front Genet. 5, 279(2014).</li>
<li>Bonini, N. M., Fortini, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+neurodegenerative+disease+modeling+using+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Human neurodegenerative disease modeling using Drosophila.</a> Annu Rev Neurosci. 26, 627-656 (2003).</li>
<li>Calahorro, F., Ruiz-Rubio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+as+an+experimental+tool+for+the+study+of+complex+neurological+diseases%3A+Parkinson%27s+disease%2C+Alzheimer%27s+disease+and+autism+spectrum+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Invert+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans as an experimental tool for the study of complex neurological diseases: Parkinson's disease, Alzheimer's disease and autism spectrum disorder.</a> Invert Neurosci. 11, 73-83 (2011).</li>
<li>Chen, X., Barclay, J. W., Burgoyne, R. D., Morgan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+C.+elegans+to+discover+therapeutic+compounds+for+ageing-associated+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+Central+Journal%22%5BJournal%5D)">Using C. elegans to discover therapeutic compounds for ageing-associated neurodegenerative diseases.</a> Chemistry Central Journal. 9, 65(2015).</li>
<li>Gama Sosa, M. A., De Gasperi, R., Elder, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+human+neurodegenerative+diseases+in+transgenic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Modeling human neurodegenerative diseases in transgenic systems.</a> Hum Genet. 131, 535-563 (2012).</li>
<li>Jaiswal, M., Sandoval, H., Zhang, K., Bayat, V., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+mechanisms+that+underlie+human+neurodegenerative+diseases+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Probing mechanisms that underlie human neurodegenerative diseases in Drosophila.</a> Annu Rev Genet. 46, 371-396 (2012).</li>
<li>Konsolaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fruitful+research%3A+drug+target+discovery+for+neurodegenerative+diseases+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Fruitful research: drug target discovery for neurodegenerative diseases in Drosophila.</a> Expert Opin Drug Discov. 8, 1503-1513 (2013).</li>
<li>Kretzschmar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegenerative+mutants+in+Drosophila%3A+a+means+to+identify+genes+and+mechanisms+involved+in+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Invert+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurodegenerative mutants in Drosophila: a means to identify genes and mechanisms involved in human diseases.</a> Invert Neurosci. 5, 97-109 (2005).</li>
<li>Kretzschmar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swiss+cheese+et+allii%2C+some+of+the+first+neurodegenerative+mutants+isolated+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">Swiss cheese et allii, some of the first neurodegenerative mutants isolated in Drosophila.</a> J Neurogenet. 23, 34-41 (2009).</li>
<li>Li, J., Le, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+neurodegenerative+diseases+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Modeling neurodegenerative diseases in Caenorhabditis elegans.</a> Exp Neurol. 250, 94-103 (2013).</li>
<li>Prussing, K., Voigt, A., Schulz, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster+as+a+model+organism+for+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster as a model organism for Alzheimer's disease.</a> Mol Neurodegener. 8, (2013).</li>
<li>Wentzell, J., Kretzschmar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer%27s+disease+and+tauopathy+studies+in+flies+and+worms%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Alzheimer's disease and tauopathy studies in flies and worms.</a> Neurobiol Dis. 40, 21-28 (2010).</li>
<li>Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assaying+locomotor%2C+learning%2C+and+memory+deficits+in+Drosophila+models+of+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration.</a> J Vis Exp. , (2011).</li>
<li>Barone, M. C., Bohmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+neurodegenerative+phenotypes+in+Drosophila+dopaminergic+neurons+by+climbing+assays+and+whole+brain+immunostaining%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Assessing neurodegenerative phenotypes in Drosophila dopaminergic neurons by climbing assays and whole brain immunostaining.</a> J Vis Exp. , e50339(2013).</li>
<li>Dutta, S., Rieche, F., Eckl, N., Duch, C., Kretzschmar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+expression+of+Swiss-cheese+%28SWS%29%2C+the+Drosophila+orthologue+of+Neuropathy+Target+Esterase%2C+is+required+for+neuronal+ensheathment+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Glial expression of Swiss-cheese (SWS), the Drosophila orthologue of Neuropathy Target Esterase, is required for neuronal ensheathment and function.</a> Dis Model Mech. , (2015).</li>
<li>Iijima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abeta42+mutants+with+different+aggregation+profiles+induce+distinct+pathologies+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Abeta42 mutants with different aggregation profiles induce distinct pathologies in Drosophila.</a> PLoS One. 3, e1703(2008).</li>
<li>Krishnan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+circadian+clock+accelerates+aging+in+neurodegeneration-prone+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Loss of circadian clock accelerates aging in neurodegeneration-prone mutants.</a> Neurobiol Dis. 45, 1129-1135 (2012).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+rapid+iterative+negative+geotaxis+assay+and+its+use+in+a+genetic+screen+for+modifiers+of+Abeta%2842%29-induced+locomotor+decline+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Bull%22%5BJournal%5D)">Automated rapid iterative negative geotaxis assay and its use in a genetic screen for modifiers of Abeta(42)-induced locomotor decline in Drosophila.</a> Neurosci Bull. 31, 541-549 (2015).</li>
<li>Papanikolopoulou, K., Skoulakis, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporally+distinct+phosphorylations+differentiate+Tau-dependent+learning+deficits+and+premature+mortality+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Temporally distinct phosphorylations differentiate Tau-dependent learning deficits and premature mortality in Drosophila.</a> Hum Mol Genet. 24, 2065-2077 (2015).</li>
<li>Ping, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+abeta42-induced+hyperexcitability+to+neurodegeneration%2C+learning+and+motor+deficits%2C+and+a+shorter+lifespan+in+an+Alzheimer%27s+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Linking abeta42-induced hyperexcitability to neurodegeneration, learning and motor deficits, and a shorter lifespan in an Alzheimer's model.</a> PLoS Genet. 11, e1005025(2015).</li>
<li>Sujkowski, A., Rainier, S., Fink, J. K., Wessells, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+Induction+of+Human+NTE+%28PNPLA6%29+Rescues+Neurodegeneration+and+Mobility+Defects+of+Drosophila+swiss+cheese+%28sws%29+Mutants%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Delayed Induction of Human NTE (PNPLA6) Rescues Neurodegeneration and Mobility Defects of Drosophila swiss cheese (sws) Mutants.</a> PLoS One. 10, e0145356(2015).</li>
<li>Barone, M. C., Sykiotis, G. P., Bohmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+activation+of+Nrf2+signaling+is+sufficient+to+ameliorate+neurodegenerative+phenotypes+in+a+Drosophila+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Genetic activation of Nrf2 signaling is sufficient to ameliorate neurodegenerative phenotypes in a Drosophila model of Parkinson's disease.</a> Dis Model Mech. 4, 701-707 (2011).</li>
<li>Coulom, H., Birman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+exposure+to+rotenone+models+sporadic+Parkinson%27s+disease+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Chronic exposure to rotenone models sporadic Parkinson's disease in Drosophila melanogaster.</a> J Neurosci. 24, 10993-10998 (2004).</li>
<li>Navarro, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+dopaminergic+neuronal+dysfunction+in+genetic+and+toxin-induced+models+of+Parkinson%27s+disease+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Analysis of dopaminergic neuronal dysfunction in genetic and toxin-induced models of Parkinson's disease in Drosophila.</a> J Neurochem. 131, 369-382 (2014).</li>
<li>Heisenberg, M., Böhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+anatomical+brain+mutants+of+Drosophila+by+histological+means%5BTitle%5D)+AND+%22Zeitschrift+f%C3%BCr+Naturforschung+C%22%5BJournal%5D)">Isolation of anatomical brain mutants of Drosophila by histological means.</a> Zeitschrift für Naturforschung C. 34, 143(1979).</li>
<li>Han, P. L., Meller, V., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+brain+revisited+by+enhancer+detection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The Drosophila brain revisited by enhancer detection.</a> J Neurobiol. 31, 88-102 (1996).</li>
<li>Lin, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+in+situ+brain+imaging+for+mapping+the+Drosophila+connectome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">Automated in situ brain imaging for mapping the Drosophila connectome.</a> J Neurogenet. 29, 157-168 (2015).</li>
<li>Strausfeld, N. J., Sinakevitch, I., Vilinsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mushroom+bodies+of+Drosophila+melanogaster%3A+an+immunocytological+and+golgi+study+of+Kenyon+cell+organization+in+the+calyces+and+lobes%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">The mushroom bodies of Drosophila melanogaster: an immunocytological and golgi study of Kenyon cell organization in the calyces and lobes.</a> Microsc Res Tech. 62, 151-169 (2003).</li>
<li>Bettencourt da Cruz, A., Wentzell, J., Kretzschmar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swiss+Cheese%2C+a+protein+involved+in+progressive+neurodegeneration%2C+acts+as+a+noncanonical+regulatory+subunit+for+PKA-C3%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Swiss Cheese, a protein involved in progressive neurodegeneration, acts as a noncanonical regulatory subunit for PKA-C3.</a> J Neurosci. 28, 10885-10892 (2008).</li>
<li>Bolkan, B. J., Kretzschmar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Tau+results+in+defects+in+photoreceptor+development+and+progressive+neuronal+degeneration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Loss of Tau results in defects in photoreceptor development and progressive neuronal degeneration in Drosophila.</a> Dev Neurobiol. 74, 1210-1225 (2014).</li>
<li>Cook, M., Mani, P., Wentzell, J. S., Kretzschmar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+RhoA+prenylation+in+the+loechrig+%28loe%29+mutant+leads+to+progressive+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Increased RhoA prenylation in the loechrig (loe) mutant leads to progressive neurodegeneration.</a> PLoS One. 7, e44440(2012).</li>
<li>Wittmann, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tauopathy+in+Drosophila%3A+neurodegeneration+without+neurofibrillary+tangles%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tauopathy in Drosophila: neurodegeneration without neurofibrillary tangles.</a> Science. 293, 711-714 (2001).</li>
<li>Rasmuson, B., Green, M. M., Ewertson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((QUALITATIVE+AND+QUANTITATIVE+ANALYSES+OF+EYE+PIGMENTS+AND+PTERIDINES+IN+BACK-MUTATIONS+OF+THE+MUTANT+wa+IN+DROSOPHILA+MELANOGASTER%5BTitle%5D)+AND+%22Hereditas%22%5BJournal%5D)">QUALITATIVE AND QUANTITATIVE ANALYSES OF EYE PIGMENTS AND PTERIDINES IN BACK-MUTATIONS OF THE MUTANT wa IN DROSOPHILA MELANOGASTER.</a> Hereditas. 46, 635-650 (1960).</li>
<li>Bettencourt da Cruz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+MAP1B-related+protein+FUTSCH+leads+to+changes+in+the+neuronal+cytoskeleton%2C+axonal+transport+defects%2C+and+progressive+neurodegeneration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Disruption of the MAP1B-related protein FUTSCH leads to changes in the neuronal cytoskeleton, axonal transport defects, and progressive neurodegeneration in Drosophila.</a> Mol Biol Cell. 16, 2433-2442 (2005).</li>
<li>Kretzschmar, D., Hasan, G., Sharma, S., Heisenberg, M., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+swiss+cheese+mutant+causes+glial+hyperwrapping+and+brain+degeneration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The swiss cheese mutant causes glial hyperwrapping and brain degeneration in Drosophila.</a> J Neurosci. 17, 7425-7432 (1997).</li>
<li>Dutta, S., Rieche, F., Eckl, N., Duch, C., Kretzschmar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+expression+of+Swiss+cheese+%28SWS%29%2C+the+Drosophila+orthologue+of+neuropathy+target+esterase+%28NTE%29%2C+is+required+for+neuronal+ensheathment+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Glial expression of Swiss cheese (SWS), the Drosophila orthologue of neuropathy target esterase (NTE), is required for neuronal ensheathment and function.</a> Dis Model Mech. 9, 283-294 (2016).</li>
<li>Davis, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocerebrosidase+Deficiency+in+Drosophila+Results+in+alpha-Synuclein-Independent+Protein+Aggregation+and+Neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Glucocerebrosidase Deficiency in Drosophila Results in alpha-Synuclein-Independent Protein Aggregation and Neurodegeneration.</a> PLoS Genet. 12, e1005944(2016).</li>
<li>Dias-Santagata, D., Fulga, T. A., Duttaroy, A., Feany, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+mediates+tau-induced+neurodegeneration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress mediates tau-induced neurodegeneration in Drosophila.</a> J Clin Invest. 117, 236-245 (2007).</li>
<li>Kretzschmar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+and+neuronal+expression+of+polyglutamine+proteins+induce+behavioral+changes+and+aggregate+formation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Glial and neuronal expression of polyglutamine proteins induce behavioral changes and aggregate formation in Drosophila.</a> Glia. 49, 59-72 (2005).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+model+for+TDP-43+proteinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A Drosophila model for TDP-43 proteinopathy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 3169-3174 (2010).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De beschreven werkwijze verschaft een middel om neurodegeneratie te kwantificeren in de hersenen van Drosophila. Terwijl andere methoden, zoals het tellen van een bepaald celtype, kan worden gebruikt om neurodegeneratie te identificeren, het voordeel van deze methode is dat het algemeen kan worden toegepast. Tellen cellen vereist dat deze cellen op betrouwbare wijze kunnen worden geïdentificeerd met behulp van een specifiek antilichaam of de expressie van een cel-specifieke marker, die niet altijd beschikbaar i...

Met de stijging van de levensverwachting, hebben neurodegeneratieve ziekten als Alzheimer of Parkinson&#39;s een steeds grotere bedreiging voor de algemene bevolking gezondheid geworden. Volgens de National Institutes of Health, 115 miljoen mensen wereldwijd wordt voorspeld te worden getroffen door dementie in 2050. Hoewel aanzienlijke vooruitgang is geboekt bij de identificatie van genen en risicofactoren betrokken bij ten minste enkele van deze ziekten, voor velen van hen, de onderliggende moleculaire mechanismen zijn nog onbekend of niet goed begrepen. Eenvoudige ongewervelde modelorganismen zoals Caenorhabditis elegans en Drosophila melanogaster bieden een verscheidenheid aan experimentele voordelen aan de mechanismen van neurodegeneratieve ziekten, met inbegrip van een korte levenscyclus, groot aantal nakomelingen, en de beschikbaarheid van gevestigde en soms unieke genetische en moleculaire methoden 1 bestuderen -12. Bovendien zijn deze organismen vatbaar onbevooroordeeldeinteractie schermen die factoren die bijdragen aan deze ziekten door hun verzwarende of verbetering van effecten op neurodegeneratieve fenotypes kunnen identificeren. Het analyseren van dergelijke genetische interacties en de beoordeling van de vergrijzing effecten vereist kwantitatieve protocollen tot neurodegeneratie te detecteren en de ernst ervan te meten. Deze beoordeling kan relatief eenvoudig worden gedaan bij het meten van gedragsaspecten in Drosophila, zoals olfactorische leren, negatief geotaxis, of snel phototaxis, die een numerieke voorstelling waarde 13-21 te bieden. Het is ook mogelijk om de effecten op neuronale overleving te bepalen door het tellen van neuronen. Dit is echter alleen mogelijk wanneer gericht op een specifieke populatie, dat is duidelijk herkenbaar, net als de dopaminerge neuronen die worden beïnvloed in PD, en zelfs dan zijn de resultaten controversieel 22-24 geweest. De hier beschreven protocol gebruikt de kraag methode paraffine seriecoupes voeren, een werkwijzedat werd oorspronkelijk ontwikkeld door Heisenberg en Böhl, die het gebruikt om anatomische hersenen mutanten te isoleren in Drosophila 25. Het gebruik van de kraag methode is vervolgens aangepast, zoals in vriescoupes, vibratoomcoupes en plastic secties 26-28. Hier wordt deze werkwijze toegepast op opeenvolgende coupes van de hele vlieg kop, die vervolgens kunnen worden gebruikt om de vacuolen die zich ontwikkelen in vliegen met neurodegeneratieve fenotypes 16,21,29-32 meten verkrijgen. Deze metingen kunnen worden gedaan in specifieke hersengebieden of kan de gehele hersenen bedekken; de laatste benadering maakt het mogelijk om zelfs zwakke degeneratieve fenotypes te identificeren, zoals waargenomen tijdens veroudering. Tenslotte, bij gebruik van de kragen, tot 20 vliegen worden verwerkt als één preparaat, dat niet alleen minder tijdrovend, maar ook zorgt voor de analyse van controle en experimentele vliegen in hetzelfde preparaat, geminimaliseerd artefacten als gevolg van kleine veranderingen in de voorbereiding.

<table><tbody><tr><td>Naam van het Reagens/Apparatuur</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td></td></tr><tr><td>Halsband</td><td>Genesee Scientific</td><td>TS 48-100</td><td>We gebruiken op maat gemaakte halsbanden die gemaakt zijn uit één stuk metaal in plaats van lagen zoals die van Genesee. Een beschrijving hoe je halsbanden kunt maken, is te vinden op http://flybrain.neurobio.arizona.edu/Flybrain/html/atlas/fluorescent/index.html&nbsp;</td></tr><tr><td>Rubberen ijsblokjesbakje voor inbedden</td><td>Huishoudelijke winkel</td><td></td><td>De maat kan op maat gemaakt worden door extra wanden in te lijmen&nbsp;</td></tr><tr><td>Kristallerende schaal</td><td>Fisher Scientific company</td><td>08-762-3</td><td></td></tr><tr><td>Ether</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>E138-1</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon Laboratories Inc.</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>Chloorform</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>C298-500</td><td></td></tr><tr><td>Glacial Azijnzuur</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>A38-212</td><td></td></tr><tr><td>Methylbenzoaat</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>M205-500</td><td>Duidelijk reuk - Gebruik in afzuigkap!</td></tr><tr><td>Paraffine met Lage Smeltpunt</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>T565</td><td>Zorg ervoor dat je extra gesmolten bewaart in een waterbad van 65&deg;C</td></tr><tr><td>Microtoom</td><td>Leica Biosystems</td><td>Reichert Jung 2040 Autocut</td><td></td></tr><tr><td>Microscoopglas</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>12-550D</td><td></td></tr><tr><td>Microscoopdekje</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>12-545-M</td><td></td></tr><tr><td>SafeClear</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>314-629</td><td>Drie verschillende containers voor wasbeurten</td></tr><tr><td>Verticale Beitsbak met Deksel</td><td>Ted Pella Inc.&nbsp;</td><td>432-1</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine Oplossing (PLL)</td><td>Sigma Life Science</td><td>P8290-500</td><td></td></tr></tbody></table>

mass histologie te kwantificeren neurodegeneratie in<em&gt; drosophila</em

Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila

Progressieve neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Alzheimer (AD) en de ziekte van Parkinson (PD) is een toenemend gevaar voor de volksgezondheid wereldwijd. Hoewel zoogdierlijke modellen belangrijke inzichten verschaft in de onderliggende mechanismen van pathogeniciteit, de complexiteit van zoogdierlijke systemen met hun hoge kosten beperken het gebruik ervan. Daarom is de eenvoudige, maar goed ingeburgerde Drosophila model-systeem biedt een alternatief voor het onderzoeken van de moleculaire pathways die worden beïnvloed bij deze ziekten. Naast afwijkend gedrag, zijn neurodegeneratieve ziekten gekenmerkt door histologische fenotypes zoals neuronale dood en axonopathie. Neuronale degeneratie kwantificeren en te bepalen hoe deze wordt beïnvloed door genetische en omgevingsfactoren, gebruiken we een histologische benadering die is gebaseerd op het meten van de vacuolen bij volwassen vliegen hersenen. Om de effecten van systematische fout te minimaliseren en om direct te vergelijken secties van de bedienings- en experimental vliegen in één preparaat, gebruiken we de &#39;kraag&#39; methode voor paraffine secties. Neurodegeneratie wordt vervolgens beoordeeld door het meten van de afmeting en / of het aantal vacuolen die zijn ontstaan ​​in de vlieg hersenen. Dit kan worden gedaan door te focussen op een specifiek gebied van belang of door analyse van de hele hersenen door het verkrijgen van seriecoupes dat de volledige kop overspannen. Daarom is deze werkwijze kan men niet alleen de degeneratie maar ook relatief mild fenotypes die alleen detecteerbaar in enkele secties te meten, zoals optreedt tijdens normale veroudering.

Met behulp van de beschreven methode resulteert in seriecoupes gekleurd door het oog pigment 33 die de hele vlieg kop omvatten. Een gedeelte hiervan wordt getoond in figuur 1B, waarbij de secties van een individu kop getoond van boven naar beneden. De secties van verschillende vliegen worden gezien van links naar rechts in dit voorbeeld. Oriëntatie en identificatie van de vliegen te vergemakkelijken, is een eyeless fly (sinus oculis) ingevoegd als een...

Drosophila wordt veel gebruikt als een modelsysteem om neurodegeneratie. Dit protocol beschrijft een methode waarbij degeneratie, zoals bepaald door vacuole-vorming in de hersenen, kan worden gekwantificeerd. Het minimaliseert ook effecten als gevolg van de experimentele procedure van de verwerking en snijden controle en experimentele vliegen als een monster.

Mass histologie te kwantificeren Neurodegeneratie in<em&gt; Drosophila</em

Progressive neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease (AD) or Parkinson&#39;s disease (PD) are an increasing threat to human health ...

Het algemene doel van deze procedure is om neurodegeneratie in het brein van de Drosophila te kwantificeren, veroorzaakt door diverse factoren waaronder leeftijd, genetische modificaties of omgevingsinvloeden, zonder dat specifieke kleuring nodig is. Deze methode is zeer nuttig bij het analyseren van kernvragen op het gebied van neurodegeneratieve ziekten, zoals welke genen of omgevingsfactoren deze ziekten veroorzaken of daaraan bijdragen.Het belangrijkste voordeel van deze methode is dat systematische fouten worden vermeden of geminimaliseerd, omdat controlevliegen en experimentele vliegen als één monster worden behandeld. Over het algemeen kunnen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat er oefening nodig is om ervoor te zorgen dat het juiste hersengebied op het glaasje ligt en om schade te voorkomen die tijdens het snijden kan optreden. Begin eerst met het invoeren van de proefvliegen bij de nek in de collars met behulp van een pincet.Lijn alle koppen in dezelfde oriëntatie uit en zorg ervoor dat er geen schade aan de kop of de ogen ontstaat. Voeg op willekeurige, bekende posities Eyeless Senoculus-vliegen toe, zodat de volgorde van de vliegen in de coupes g

mass-histology-to-quantify-neurodegeneration-in-drosophila

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Gedrag assays voor het meten van motorische functies, leren en geheugen capaciteiten...

Het testen van Beweegwijzer, leren en geheugen Tekortkomingen in Drosophila Modellen van Neurodegeneratie

De beperkende factor in het gebruik van de...

Single Drosophila Ommatidium Dissection en Imaging

Hier beschrijven we twee testen die zijn opgericht om leeftijdsafhankelijke neurodegeneratie van de dopaminerge (DA) neuronen studeren...

Het beoordelen Neurodegenerative Fenotypes in<em&gt; Drosophila</em&gt; Dopaminerge neuronen reduceert door Klimmen Testen en Whole Brain Immunokleuring

Hier beschrijven we een eenvoudige en breed toegankelijke methode om segmentale zenuwen in Drosophila larven te beschadigen om neurodegeneratie van motorische neuronen bij de neuromusculaire verbinding (NMJ) van derde instar larven te visualiseren en te kwantificeren.

Een eenvoudige neurologische mechanische letselmethode om te bestuderen<em&gt; Drosophila</em&gt; Motor Neuron Degeneration

Dit protocol beschrijft de dissectie en immunokleuring van volwassen Drosophila melanogaster brain weefsels. Dit protocol benadrukt in het bijzonder het gebruik van Drosophila paddestoel lichaam en fotoreceptor neuronen als voorbeeld neuronale subsets kunt weergeven die nauwkeurig kunnen worden gebruikt voor het ontdekken van de algemene beginselen die ten grondslag liggen aan vele aspecten van neuronale ontwikkeling.

Dissectie en immunefluorescentie kleuring van Mushroom lichaam en fotoreceptor neuronen in de hersenen van de volwassen Drosophila melanogaster

Hebben we een eenvoudige en flexibele workflow om kwantitatieve gegevens extract van fluorescentie imaging-gebaseerde cel biologische studies van aggregatie van eiwitten en autophagic flux in het centrale zenuwstelsel van Drosophila modellen van neurodegeneratie.

Kwantitatieve celbiologie van neurodegeneratie in Drosophila door onbevooroordeelde analyse van Fluorescently Tagged eiwitten met behulp van ImageJ

We presenteren een protocol met een voorwaartse genetische benadering van het scherm voor mutanten die neurodegeneratie in Drosophila melanogastertentoonstellen. Het bevat een klim test, histologie analyse, genmapping en DNA-sequencing om uiteindelijk nieuwe genen te identificeren die verband houden met het neuroprotectie proces.

In vivo genetisch scherm naar voren om nieuwe neuroprotectieve genen in Drosophila melanogaster te identificeren

Hier bieden we protocollen om drie eenvoudige door verwondingen veroorzaakte axondegeneratie (axondood) tests in Drosophila melanogaster uit te voeren om het morfologische en functionele behoud van afgehakte axonen en hun synapsen te evalueren.

Morfologische en functionele evaluatie van Axons en hun Synapsen tijdens Axon Death in Drosophila melanogaster

Het doel van deze procedure is om het dorsale longitudinale spierweefsel (DLM) te ontleden om de structurele integriteit van DLM neuromusculaire knooppunten (NMJs) in neurodegeneratieve ziektemodellen te beoordelen met behulp van Drosophila melanogaster.

Synaptische degeneratie visualiseren bij volwassen drosofie in combinatie met neurodegeneratie

Deze studie presenteert een vereenvoudigd protocol voor weefselverwerking met onthoofding, fixatie, cryosectie, fluorescentiekleuring, immunokleuring en beeldvorming, dat kan worden uitgebreid tot confocale en multifotonbeeldvorming. De methode behoudt een werkzaamheid die vergelijkbaar is met complexe dissecties, waarbij de noodzaak van geavanceerde motorische vaardigheden wordt omzeild. Kwantitatieve beeldanalyse biedt een uitgebreid onderzoekspotentieel.

Directe cryosectie van Drosophila-koppen voor verbeterde kleuring en immunokleuring van de hersenen

Leer neurodegeneratie kwantificeren in Drosophila zonder specifieke kleuring. Deze methode minimaliseert systematische fouten door controle- en experimentele vliegen als één sample te verwerken.

Mass histologie te kwantificeren Neurodegeneratie in

Meer video's verkennen