Uitbreiding van nanopatterned Substrates met steek Techniek voor Nanotopographical Modulation of Cell Behavior
8 december 2016
Een protocol voor het produceren van een groot gebied van nanogepatterreerde substraten uit kleine nanogepatterreerde mallen voor studie van nanotopografische modulatie van celgedrag wordt gepresenteerd.
Het algemene doel van deze procedure is om een groot gebied van nanogepatternd substraat te produceren van kleine nanogepatternde mallen door een eenvoudige en betaalbare, maar veelzijdige hechttechniek te gebruiken. Deze methode kan helpen bij het bestuderen van de modulatie van substraatnanotopografie op celfenotype en functie op cellulair en moleculair niveau, zoals expressie van focale adhesie-eiwitten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het eenvoudig en kosteneffectief is.
Begin met het voorbereiden van de gesilaaniseerde siliciummal in het PDMS-prepolymeer, zoals beschreven in het tekstprotocol. Plaats de gesilaaniseerde siliciummal in een 60 millimeter Petrischaal. Giet het PDMS-prepolymeer op de siliciummal in de Petrischaal.
Plaats de Petrischaal in een plastic exsiccator en ontgas gedurende ongeveer 10 minuten, totdat alle bubbels verdwijnen. Breng de Petrischaal over naar een hotplate en laat het PDMS-prepolymeer gedurende vier uur drogen op 70 graden Celsius. Verwijder voorzichtig de PDMS-mal van de siliciummal met behulp van pincetten.
Bepaal de oriëntatie van anisotrope PDMS-nanopatronen, zoals nanogratingen, onder een optische microscoop en markeer deze op de achterkant van de PDMS-mallen met een markeerstift. Reinig het siliciumsubstraat met ethanol in een afzuigpunt en droog het vervolgens met perslucht. Snijd de ongepatternde gebieden van elke PDMS-mal af met een mes.
De PDMS-mallen moeten zo dicht mogelijk worden uitgelijnd, maar niet raken aan de omringende mal, om het ongepatternde gebied te minimaliseren en om te voorkomen dat het nanopatroondeformatie raakt wanneer de compressorkracht wordt toegepast. Plaats de afgesneden PDMS-mal met het nanopatroon naar beneden op de spiegelzijde van het siliciumsubstraat en lijn vervolgens andere mallen dicht bij, maar zonder aanraking met de omringende mallen. Het is van cruciaal belang om te proberen de PDMS op de basale laag te drogen, omdat ongedroogd PDMS door de opening tussen de meerdere mallen kan stromen en de nanopatronen kan beschadigen.
De volledig uitgeharde PDMS kan de meerdere mallen echter niet aan elkaar hechten. Om een PDMS-kleurlaag voor te bereiden, giet u één gram ontgast PDMS-prepolymeer op een schone glazen plaat om een laag van 0,5 millimeter dik te vormen. Bak de PDMS-laag gedurende drie tot vijf minuten op 100 graden Celsius op een hotplate.
Gebruik een naald om de laag aan te raken en zorg ervoor dat de laag gedeeltelijk, maar niet volledig is uitgehard. Plaats de PDMS-laag op de achterkant van de uitgelijnde PDMS-mallen, draai deze assemblage snel om en breng deze over naar de hotplate. Breng een druk op de assemblage aan met behulp van een metalen blok bovenop de assemblage om een goede contact tussen de PDMS-kleurlaag en de achterkant van de PDMS-mallen te garanderen.
Droog de PDMS-kleurlaag gedurende een uur op 100 graden Celsius. Schakel de hotplate uit, verwijder het metalen blok en verwijder de enkel-gehechte PDMS-mal van het siliciumsubstraat. Om de gehechte PDMS-mal in de PS-plaat te nano-imprinten, plaatst u de PS-plaat in een aluminium spacer op een drie inch siliciumwafer.
Verwarm de PS-plaat op een hotplate gedurende 30 minuten op 250 graden Celsius. Plaats vervolgens de gehechte PDMS-mal, met nanopatronen naar beneden, op de gesmolten PS-plaat. Plaats vervolgens een aluminium plaat op de glazen plaat van de gehechte PDMS-mal.
Breng een drukkracht aan door metalen blokken op de aluminium plaat te gebruiken en wacht drie minuten. Til en vervang het metalen blok van de aluminium plaat en verhoog de drukkracht tot 25 kilopascal. Herhaal vervolgens deze stap met de druk verhoogd tot 50 kilopascal.
Houd de temperatuur van de hotplate tussen 240 en 250 graden Celsius onder een consistente druk van 50 kilopascal gedurende 15 minuten. Schakel de hotplate uit en laat de hele setup afkoelen. Verwijder de metalen blokken nadat de temperatuur onder 50 graden Celsius is en verwijder voorzichtig de gehechte PDMS-mal van de PS-plaat.
Om de PDMS-mal op een PS-dunne film te nano-imprinten, plaatst u de gehechte PDMS-mal met nanotopografie naar beneden op de PS-dunne film, die op een hotplate is geplaatst. Breng een druk van 12 kilopascal op de PDMS-mal aan door metalen blokken op de glazen plaat van de PDMS-mal te gebruiken. Verhoog de temperatuur van de hotplate tot 180 graden Celsius en houd deze gedurende 15 minuten vast.
Schakel de hotplate uit en laat de hele setup afkoelen. Verwijder de metalen blokken nadat de temperatuur onder 50 graden Celsius is gedaald en verwijder voorzichtig de gehechte PDMS-mal van de PS-film. Snijd de nanogepatternde PDMS-substraten met behulp van een hol stalen boogsteun in schijven om ze te passen in de configuratie van een specifieke multi-well plaat.
Gebruik vervolgens pincetten om de PDMS-schijven in de putjes van de multi-well plaat te plaatsen. Steriliseer de PDMS-substraten door 30 minuten 70% ethanol te gebruiken. Aas vervolgens de ethanol op en volg dit op met UV-blootstelling gedurende 30 minuten.
Was de PDMS-substraten drie keer met 1X steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing. Bedek vervolgens de PDMS-substraten gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur met extracellulair matrixeiwit. Spoel de PDMS-substraten drie keer met steriele PBS, elk gedurende vijf minuten.
Suspendeer menselijke A549 longkankercellen in Dulbecco's Gemodificeerd Eagle Medium met 10% foetaal bovien serum en tel de cellen met behulp van een hemocytometer. Plaat de cellen op een zaaidichtheid van 2.000 cellen per vierkante centimeter op de PDMS-substraten. Kweek de cellen gedurende één dag op 37 graden Celsius in een bevochtigde atmosfeer met 5% kooldioxide en observeer ze daarna.
De gegenereerde nanopatroon op de PS-plaat en de dunne film worden hier getoond. De pijlen geven de polymeerverhoging in de interstices van de gehechte PDMS-mallen aan. Deze SEM-beelden tonen aan dat PDMS-werksubstraten getrouw
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het produceren van een groot gebied van nanogepatternde substraten vanuit kleine nanogepatternde mallen. De methode richt zich op de studie van nanotopografische modulatie van celgedrag.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Celgedrag
- Nanotopografie
- Substraatengineering
Achtergrond
- Nanogepatternde substraten beïnvloeden het celfenotype en de functie.
- Focaal adhesie-eiwitten zijn cruciaal voor het begrijpen van celinteracties met oppervlakken.
- Huidige methoden kunnen complex of duur zijn.
- Er is behoefte aan een eenvoudige en betaalbare techniek voor bredere toepassing.
Doel van het onderzoek
- Om een kosteneffectieve methode te ontwikkelen voor het maken van grote nanogepatternde gebieden.
- Om studies te faciliteren over hoe nanotopografie het cellulaire gedrag beïnvloedt.
- Om het begrip van cellulaire en moleculaire reacties op substraatveranderingen te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Bereiding van silanized silicium mallen.
- Gebruik van PDMS-prepolymeer voor substraatcreatie.
- Toepassing van een stiktechniek voor patroonoverdracht.
- Gebruik van petrischalen voor malplaatsing.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle productie van grote nanogepatternde substraten.
- Gedeemstreerde modulatie van celgedrag op basis van substraattopografie.
- De eenvoud en kosteneffectiviteit van de methode is gehighlight.
- Een basis geboden voor verdere studies over cel-substraatinteracties.
Conclusies
- De gepresenteerde methode is een haalbare aanpak voor het creëren van nanogepatternde substraten.
- Het opent nieuwe wegen voor onderzoek in celgedragsmodulatie.
- Toekomstige studies kunnen deze techniek gebruiken om verschillende cellulaire reacties te verkennen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Generating large-area, well-defined nanopatterned substrates enables robust phenotypic screening and mechanistic de-risking in early discovery. This approach supports target validation by providing reproducible, scalable models to assess how nanotopography influences cell spreading, adhesion, and signaling—key phenotypes in oncology and fibrosis research. The method’s affordability and versatility allow integration into multi-well formats, facilitating cross-functional collaboration between bioengineering, assay development, and translational teams.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of how nanotopography modulates focal adhesion protein expression and cell morphology, supporting hypothesis testing in mechanotransduction pathways.
- Operational Value: Provides standardized, large-area substrates for consistent cell seeding and imaging across replicates.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces reproducible nanotopographical cues that can be used to screen compounds or genetic perturbations affecting cell adhesion and spreading.
- Operational Value: Compatible with multi-well plate formats, enabling high-throughput preparation of PDMS discs for standardized assay conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant modeling using cell lines like A549 to study how substrate topography influences cancer cell behavior, informing preclinical target confidence.
- Operational Value: Allows extrapolation from discovery to preclinical workflows via reusable, sterilizable PDMS working substrates.
Pipeline & Workflow Integration
The stitch technique bridges nanofabrication and cell-based assays, positioning nanopattern generation as an enabling capability in the discovery-to-preclinical continuum for mechanobiology-focused targets.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis-driven testing of how topographical cues alter cell phenotype, supporting pathway clarification in integrin and FAK signaling.
- Screening: Yields quantifiable, topography-modulated cell spreading metrics that serve as phenotypic readouts for compound or target modulation.
- Analytics: Enables measurement of cell alignment, spreading area, and morphology as outputs for comparing experimental conditions.
- Translational Research: Uses cancer cell models (e.g., A549) to link nanotopography to phenotypic responses with potential relevance to tumor microenvironment modeling.
- Enterprise Reuse: The PDMS mold stitching and nanoimprinting workflow is reusable across projects, reducing redundant nanofabrication efforts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing variability in nanotopographical inputs across experiments.
- Operational Value: Enables low-cost, in-house generation of large-area nanopatterns without reliance on specialized nanofab facilities.
- Strategic Value: Supports go/no-go decisions in target validation by providing mechanistic insights into how physical cues modulate cell behavior.
- Portfolio Impact: De-risks early-stage targets by clarifying whether observed phenotypes are target-dependent or influenced by substrate artifacts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in soft lithography, PDMS handling, and nanoimprinting techniques.
- Depends on access to hot plates, vacuum desiccators, metal blocks for compression, and optical/SEM imaging for mold alignment and validation.
- Necessitates standardization of mold trimming, alignment, and adhesive layer curing to prevent nanopattern deformation.
- Adaptation to different polystyrene formats (thin film vs. plate) requires pressure and temperature optimization.
- Practical limitations include alignment precision at mold edges and potential interstice artifacts if compressive force is uneven.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:38
Stitching of Poly(dimethylsiloxane) (PDMS) Molds into a Large, Single Mold
3:51
Generation of a Master Mold on Polystyrene (PS) Substrates
6:01
Nanotopographical Modulation of Cell Behavior
7:33
Results: Generated PS Nanopatterns and Nanotopography Modulation of Cell Morphology
8:26
Conclusion
