Name: Chirurgische Procedures en Methodologie voor een Preklinisch Murine Model van De Novo Maagkanker Metastase (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Leer chirurgische resectie van primaire mammatumoren in een muismodel voor de novo borstkankermetastase. Dit protocol maakt onderzoek naar metastatische progressie en adjuvante therapieën mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs bedanken Jo Hill voor histopathologische bijstand, dr. John Gleysteen voor instructie in chirurgische techniek, Tessa Diebel voor videografische bijstand, alle leden van de laboratoria Wong and Coussens voor kritisch inzicht en discussies, en het OHSU Knight Cancer Institute voor financiële steun. De auteurs erkennen steun van T32GM071388-10 en T32CA106195-11 aan CEG, de NCI / NIH, het Ministerie van Defensie Borstkanker Onderzoeksprogramma, de Susan G Komen Foundation, de Stichting Stichting Borstkanker en een Staan op Kanker - Stichting Lustgarten Pancreatic Cancer Convergence Dream Team Translational Research Grant (SU2C-AACR-DT14-14) aan LMC, een Women&#39;s Health Circle of Foundation Foundation Award voor MHW, en het Brenden-Colson Center voor Pancreatic Health aan MHW en LMC.

Dieren die in het volgende protocol worden gebruikt, worden gedekt door de Institutional Animal Care and Use Committee van de Oregon Health &amp; Science University (IACUC), die is ontworpen om te voldoen aan de wetgeving inzake dierenwelzijnsregels en het PHS-beleid. Onderhoud van steriele omstandigheden: Steriliseerde instrumenten moeten gebruikt worden en tussen muizen schoon worden met steriel gaas, gespoeld in PBS, gevolgd door sterilisatie met 70% ethanol desinfectiemiddel gedurende tenminste 15 minuten. Een chirurgische pet, een facemask, een toga en een handschoen moet gedragen worden voor overlevingsoperaties. Pre-operatieve voorbereiding van het dier voor overlevingsoperaties is opgenomen in het volgende protocol. Raadpleeg tabel 1 voor een lijst met reagentia en apparatuur. 1. Isolatie en bereiding van enkelcelsuspensies uit primaire mammamomentoren <ol><li> Verdoof donorvrouw 100 dagen oude transgene MMTV-PyMT (FVB / n) muizen en onderhouden onder cOntwijkende sedatie door toediening van 2% isofluraan via een verdovingsmasker. Bevestig dat de muis goed verdoofd is met een afwezig voetreflexreflex. </li><li> In een steriele omgeving reserveert u primaire mammatumoren uit 100-dagen oude transgene vrouwelijke MMTV-PyMT (FVB / n) muizen door het uitdelen van de borsttumor van de overliggende huid en het omliggende vetweefsel en / of lymfeklieren door middel van steriele scharen. Euthanize de verdoofde muizen door cervicale dislocatie. </li><li> Met steriele schaar of een scalpel, maalgewassen primaire tumoren handmatig in kleine stukken (~ 1,0 mm 3 ). Plaats tumor stukken in 3,0 mg / ml collagenase A en 4,0 U / ml DNase I opgelost in DMEM. Gebruik ~ 10 ml van het bovenstaande verteermedium per 1,0 cm diameter tumor. <ol><li> Voer de spijsvertering uit in een steriele 25 ml fles met een steriele roerbalk bij ~ 125 rpm en 37 ° C gedurende 40 minuten. </li></ol></li><li> Stop de spijsvertering door foetaal runder serum (FBS) toe te voegen tot een uiteindelijke verdunning van 10% en plaats het gehele mengsel op wEt ijs waar het wordt gehandhaafd. </li><li> Filter de verteerde tumor suspensie door een 0,7 μm nylon zeef in een 50 ml conische buis en wis eventuele resterende tumor in de zeef. Centrifugeer het supernatant bij 300 xg bij 4 ° C. </li><li> Resuspendeer de pellet in 10 ml DMEM per 1,0 cm tumor en herfilter door een 0,7 μm nylon filter. Tel celconcentratie, centrifugeer vervolgens bij 300 xg bij 4 ° C. </li><li> Resulteer pellet in 10% dimethylsulfoxide met 90% FBS bij een concentratie van 2 x 107 levende cellen / ml. Bewaar single-cel suspensies van hele primaire tumor bij -80 ° C. </li></ol> 2. Orthotopic Injection of Mammary Tumor <ol><li> Gedeeltelijk ontdooide bevroren primaire tumor suspensies bij 37 ° C totdat de bevroren pellet uit de cryogene buis in 20 ml DMEM kan worden vrijgelaten en de cellen tellen. Centrifugeer bij 300 xg bij 4 ° C en resuspendeer cellen in een 1: 1 DMEM: groeifactor gereduceerde gesolubileerde keldermembraanpreparatie extracted van de Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) muizen sarcoma bij een concentratie van 1 x 10 7 cellen / ml (zie tabel of Materials). </li><li> Plaats de verdovende ontvanger van de vrouwelijke syngeneuze muis ventrale zijde omhoog en onderhoud onder continue sedatie door 2% isofluraan via een verdovingsmasker toe te dienen. </li><li> Steriliseer de juiste 4e borstklier injectieplaats met behulp van aerosolized 70% ethanol en aanbrengen van Poly (vinylpyrrolidon) -Iodine met een steriele katoenwabber. </li><li> Spuit 100 μL (1 x 10 6 levende cellen uit bevroren primaire tumorsuspensies) in de rechterkant van de 4e dikke klier van de 6 tot 10 week oude vrouwelijke FVB / n muis met een 29 G 0,3 ml insulinspuit. </li></ol> 3. Chirurgische Resectie van Orthotopische Mammary Tumor <ol><li> 38-60 dagen na de injectie van de tumorcel, euthaniseren muizen die geen orthotopische tumorvolumes vertonen, variërend tussen 172 en 450 mm 3 in volume [lengte x (breedte 2 </Sup&gt;) / 2] (ongeveer 75% geïnjecteerde muizen). </li><li> Plaats verdoofde muizen die de juiste tumorgrootte ventrale zijde laten zien onder continue sedatie door 2% isofluraan via een verdovingsmasker toe te dienen en bevestig dat de muis goed verdoofd is met een afwezig voetreflexreflex. Breng de vetsalf aan de ogen aan om droogte te voorkomen tijdens de sedatie. </li><li> Spuit 70% ethanol om het chirurgische gebied rond de primaire tumor te steriliseren, en voeg dan Poly (vinylpyrrolidon) -Iodine toe met een steriele katoenwabber. OPMERKING: Haarverwijdering op de chirurgische plaats leidde tot huiduitkalkingen en / of infecties bij ~ 5% muizen en werd derhalve uitgesloten van deze stap (gegevens niet getoond). </li><li> Zoals getoond in Figuur 1C , maak een eerste huidinsnijding met behulp van stompe schaar mediale-caudale aan de tumor. </li><li> Vervolgens maak je een superieure excisie van de huid ( Figuur 1C ) mediaal aan de tumor. Let op de noodzaak om vasculature feHet opbrengen van de tumor die op de huid ligt voordat u de incisie uitstrekt. </li><li> Ga de huidinsnijding lateraal (achter de tumor) door, en maak dan een superieure huiduitsnijding (lateraal naar tumor) en mediale excisie (superieur aan tumor) ( Figuur 1C ). </li><li> Nadat de huid omtrekt rond de tumor is gesneden ( Figuur 1C ), lig de overliggende huid aan de tumor vast aan de hand van de tang, terwijl de tumor onduidelijk wordt verwijderd van de buikwandmuskulatuur en de membraan intact blijft. </li><li> Identificeren (door stompe dissectie) en dichtschroeien grote vaten die door de 4de en 5de borstklieren. </li><li> Accijns ongeveer de helft van de 4de en 5de borstklieren aan de cauterisatie site om de tumor te bevrijden bovenliggende huid, en segmenten van de melkklieren (figuur 1C). </li><li> In geval van bloedingen, identificeer actief bloedenSchepen en onmiddellijk cauterize ze. Als meer dan 250 μL bloed verloren gaat, sluit de muis de studie uit en verwijder hem. </li><li> Sluit excisiesites met wondklemmen met behulp van een wondclip applicator ( Figuur 1C ). OPMERKING: Verwijder de wondklemmen 10 dagen na de operatie met een wondklemverwijderaar. </li><li> Geef warm steriele zoutoplossing subcutaan (4% van het lichaamsgewicht van het dier) en houd het dier warm met een warmtelamp. Controleer de dieren elke 5-10 minuten tijdens herstel van verdoving. OPMERKING: Toediening van bupivacaïne of lidocaïne verhoogde postoperatieve sterfte (data niet getoond). Muizen die tekenen van pijn toonden (hunching, onwillig om te verhuizen, niet-bruidegom) 1 uur na de operatie werden geëuthaniseerd. <ol><li> Zodra de muis volledig is hersteld, geef het terug naar het bedrijf van andere muizen. </li></ol></li></ol> 4. Isolatie en verwerking van bloed en long voor flowcytometrie en histologie &lt;ol&gt; <li> Berei bij de eindpunten van de muizen muizen op voor verschillende histopathologische evaluaties indien gewenst. 90 minuten voor euthanasie geven elke muis een intraperitoneale injectie van bromodeoxyuridine (BrdU, 50 μg / g muisgewicht) bij een concentratie van 6,25 μg / μL in 1x PBS. OPMERKING: Bevroren voorraden opgeloste bromodeoxyuridine worden binnen 1 maand na de bereiding gebruikt. </li><li> 10 minuten voor euthanasie, met de muis verdoofd, verzamelen retroorbital bloed (&gt; 500 μL) met behulp van gehardiniseerde capillaire buizen, en vervolgens overbrengen naar buizen die bedekt zijn met dicalium EDTA op ijs. </li><li> Longen en resterende borstweefsel te verwijderen, maak een middellijn incisie met een schaar van de onderbuik de mond naar de borst- en peritoneale holten (figuur 2A) bloot te leggen, en schil de huid lateraal ook bloot overblijvende juiste 4e en 5e mammaire klieren. </li><li> Accijns de resterende borstkankerweefsel en controleer ikT het terugdringen van de primaire tumor herwinnen door middel van seriaal gescheiden formalin-vast paraffine-ingebedde (FFPE) weefsel door hematoxyline en eosin (H &amp; E) kleuring te beoordelen ( aanvullend figuur 1 ). </li><li> Om de longen te verwijderen, open de buikwand naar het diafragma met een schaar en verwijder het dier dan door de buikorta te snijden om bloed uit te spoelen voor de perfusie van de longen ( Figuur 2B -2C ). </li><li> Knip het diafragma langs de ribbekap uit een buikbenadering, zodat u de long en het hart vermijdt. Ontsteek dan de thorax door de laterale zijden van de ribbeek te snijden ( Figuur 2D ). </li><li> Met een 23-gauge naald op een 20 ml spuit, perfuse longen met ~ 5,0 mL DPBS (~ 10 mL / min) door de rechter hart van de hart tot de longen helemaal wit worden ( Figuur 2E -2F ). Snijd het hart onmiddellijk van het hoofdvlees afZo wordt bloed niet opnieuw in de long geperfuseerd. </li><li> Voor het vaststellen en verwerken van longweefsel voor histopathologische beoordelingen, injecteer ~ 1,0 ml 10% formaline bij 4 ° C in de blootgestelde trachea-schuine zijde naar de longen met behulp van een 23-gauge naald ( Figuur 2G - 2H ). Stop de injectie zodra de longen volledig zijn uitgebreid en gevuld met fixatief ( Figuur 2I ). </li><li> Accijns lung lobbe uit luchtpijp, en emersie fix longweefsel in neutraal gebufferde formaline voor daaropvolgende paraffine inbedding of OCT-bevriezing medium, per standaard histopathologische procedures. </li><li> Kwantitatief evalueren de metastatische last in de longen door middel van seriële sectie van FFPE longweefsel en evalueren microtome secties (100 μm, dertien secties), door H &amp; E-kleuring ( Figuur 1B ). </li></ol>

<ol><li>Fantozzi, A., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+breast+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Mouse models of breast cancer metastasis.</a> Breast Cancer Res. 8, 212(2006).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22SEER+Cancer+Statistics+Review+1975-2008%22">SEER Cancer Statistics Review 1975-2008</a>. Howlader, N. N. A., Krapcho, M. , National Cancer Institute. Bethesda, MD. based on November 2010 SEER data submission, posted to the SEER web site. 
 <a target="_blank" href="http://seer.cancer.gov/csr/1975_2008/">http://seer.cancer.gov/csr/1975_2008/</a> (2011).</li>
<li>National Comprehensive Cancer Network. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Breast+Cancer+%28Version+3.2014%29%22">Breast Cancer (Version 3.2014)</a>. , Accessed November 25.
 <a target="_blank" href="http://www.nccn.org/professionals/physician_gls/pdf/breast.pdf">http://www.nccn.org/professionals/physician_gls/pdf/breast.pdf</a> (2016).</li>
<li>Kataja, V., Castiglione, M., Group, E. G. W. <a target="_blank" href="https://academic.oup.com/annonc/article/23/suppl_7/vii11/144433/Locally-recurrent-or-metastatic-breast-cancer-ESMO">Locally recurrent or metastatic breast cancer: ESMO clinical recommendations for diagnosis, treatment and follow-up.</a> Ann Oncol. 19 Suppl 2, 11-13 (2008).</li>
<li>Margolese, R. G., Hortobagyi, G. N., Buchholz, T. A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK13196/">Management of Metastatic Breast Cancer. Holland-Frei Cancer Medicine</a>. Kufe, D. W., Pollock, R. E., Weichselbaum, R. R., et al. , 6th, BC Decker. Hamilton (ON). (2003).</li>
<li>Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+mammary+tumors+by+expression+of+polyomavirus+middle+T+oncogene%3A+a+transgenic+mouse+model+for+metastatic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease.</a> Mol Cell Biol. 12, 954-961 (1992).</li>
<li>Kouros-Mehr, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GATA-3+links+tumor+differentiation+and+dissemination+in+a+luminal+breast+cancer+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">GATA-3 links tumor differentiation and dissemination in a luminal breast cancer model.</a> Cancer Cell. 13, 141-152 (2008).</li>
<li>Minn, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+that+mediate+breast+cancer+metastasis+to+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genes that mediate breast cancer metastasis to the lung.</a> Nature. 436, 518-524 (2005).</li>
<li>Qian, B. Z., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4548055/">FLT1 signalling in metastasis-associated macrophages activates an inflammatory signature that promotes breast cancer metastasis.</a> J Exp Med. 212 (9), 1433-1448 (2015).</li>
<li>Verkooijen, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patients%27+refusal+of+surgery+strongly+impairs+cancer+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Surg%22%5BJournal%5D)">Patients' refusal of surgery strongly impairs cancer survival.</a> Ann Surg. 242 (2), 276-280 (2005).</li>
<li>Peinado, H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28303905">Pre-metastatic niches: organ-specific homes for metastasis.</a> Nat Rev Cancer. 17 (5), 302-317 (2017).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen bekendmaking van conflicten met de hierin gepresenteerde gegevens.

Wijzigingen en probleemoplossing: Wanneer de tumor uit de buikwand los komt, kan de tumor aan de buikwand vasthouden. Dit werd waargenomen bij &lt;5% muizen geïnjecteerd met tumor (gegevens niet getoond). Voor muizen met tumoren die aan de buikwand hechten, moet de muis worden geëuthaniseerd, omdat resectie moeilijk is zonder primaire tumor hergroei. Beperkingen van model / techniek: Terwijl andere on...

Vrouwen in Noord-Amerika hebben een levensduur van 12% voor het ontwikkelen van borstkanker 2 ; Een meerderheid van deze personen zullen primaire tumoren hebben verwijderd via de operatie, en afhankelijk van het subtype van kanker, krijgen dan gerichte, endocriene, chemo- en / of stralingstherapie in de adjuvante instelling 3 . Voorbeelden zijn onder meer vrouwen met hormoonreceptor-positieve kanker die anti-oestrogeen therapieën ontvangen en vrouwen met HER2-positieve tumoren die HER2-gerichte therapieën ontvangen met straling / chemotherapie, terwijl er nog geen gerichte therapieën beschikbaar zijn voor drievoudige negatieve tumoren 3 . Ondanks de vooruitgang in straling, chemotherapie, gepersonaliseerde en hormoon gebaseerde therapieën die chirurgische resectie aanvullen, komt de ziekte terug bij 30-70% van de vrouwen die gediagnosticeerd zijn met fase II of III-ziekte 4 , aangezien therapieën grotendeels ondoeltreffend zijn bij het uitroeien van metastatische ziekte in verre organen, waaronder Long, bot, bRegen en / of lever 5 . Dit is vooral belangrijk gezien het feit dat wanneer metastatische ziekte optreedt bij afwezigheid van primaire tumor hergroei, dit impliceert dat verspreide kwaadaardige cellen waarschijnlijk al in secundaire organen aanwezig waren op het moment van definitieve operatie. Dientengevolge zijn therapieën die de groei van metastatische tumoren kunnen uitroeien of vertragen, dringend nodig. Terwijl de novo- muismodellen van mammary carcinogenese opvallend informatief zijn bij het onthullen van mechanismen die neoplastische progressie 1 regelen, hebben bestaande modellen ook verschillende beperkingen. Een hiervan is het feit dat transgenische modellen van de novo doorgaans primaire tumoren ontwikkelen in meervoudige borstklippen, waarbij de primaire tumorbelasting de duur van de studies beperkt. Terwijl primaire tumorcel ontsnappen en metastatische zaaien zich waarschijnlijk vroeg in neoplastische progressie in deze modellen voordoen, komt de franke ontwikkeling van metastatische tumoren te vroeg voor en hangt er af van oN het muismodel en de achtergrond van de stam, is vaak gedeeltelijk penetrant 1 . Dit beperkt verder het nut van de novo modellen voor het ontdekken van moleculen die de metastase reguleren in secundaire organen en voor het evalueren van de preclinische werkzaamheid van de therapeutica in de adjuvante omgeving. Om deze beperkingen te omzeilen, ontwikkelden we een de novo autochthonisch model van mammary carcinoom metastase naar longen. Oudertransgene vrouwen ( dwz MMTV-PyMT op de FVB / n-stamachtergrond voor studies die hierin beschreven zijn) met een latere stadium de novo- mammatumoren zijn ouder tot ~ 100 dagen 6 , op welk punt hun primaire tumoren chirurgisch worden gerececteerd en enzymatisch gedisocieerd in Enkelcel suspensies. Suspensies (1 x 10 6 cellen) worden op hun beurt orthotopisch geëxplanteerd in 6-7 weken oude ontvanger syngeneuze vrouwelijke muizen, waar enkele primaire mammertumoren zich ontwikkelen over een periode van 38 tot 60 dagen ( 3 ) worden ontvanger muizen verdoofd en worden primaire tumoren chirurgisch geresecteerd, zodat tumorhergroei op de chirurgische plaats minimaal is, consistent met de operatie bij vrouwen ( aanvullend figuur 1 ). Op de FVB / n stamachtergrond ontwikkelen muizen histologisch detecteerbare metastatische foci in de longen met 45% penetratie door ~ 115 dagen na de operatie ( Figuur 1B ). Met deze uitgebreide latentie van metastatische tumorgroei is het model uniek gepositioneerd voor adjuvante therapieafgifte en voor het ophelderen en evalueren van onderliggende biologie die de metastatische progressie beïnvloeden na chirurgische verwijdering van primaire tumoren.

<table><tbody><tr><td>Isofluoraan</td><td>Piramal Healthcare</td><td>N/A</td><td>Voorschriftbevel</td></tr><tr><td>Collagenase A</td><td>Roche</td><td>11088793001</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>12634010</td><td></td></tr><tr><td>25 mL Pyrex-fles</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS139525</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum</td><td>Atlanta Bio&nbsp;</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>0,7 &micro;m nylon zeef&nbsp;</td><td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>50 mL kegelbuis&nbsp;</td><td>VWR</td><td>89039-658</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Groeifactor-verminderde Matrigel&nbsp;</td><td>BD</td><td>354230</td><td>Groeifactor-verminderde gesolubiliseerde basaalmembraanvoorbereiding geëxtraheerd uit de Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) muissarcoom</td></tr><tr><td>Poly(vinylpyrrolidon)-joodcomplex</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PVP1</td><td></td></tr><tr><td>29 gauge 0,3 mL insulinespuit</td><td>BD</td><td>324702</td><td></td></tr><tr><td>Klein vaatcauterisatieset</td><td>FST</td><td>18000-00</td><td></td></tr><tr><td>Wondclips</td><td>Texas Scientific</td><td>205016</td><td></td></tr><tr><td>AutoClip wondclipapplicateur&nbsp;</td><td>BD</td><td>427630</td><td></td></tr><tr><td>AutoClip wondclipverwijderaar&nbsp;</td><td>BD</td><td>427637</td><td></td></tr><tr><td>Bromodeoxyuridine</td><td>Roche</td><td>10280879</td><td></td></tr><tr><td>Geheparineerde capillaire buisjes&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>22362566</td><td></td></tr><tr><td>Microtainerbuisjes met dikalium EDTA&nbsp;</td><td>BD</td><td>365974</td><td></td></tr><tr><td>20 mL spuit&nbsp;</td><td>BD</td><td>309661</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Thermo-Fisher</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>OCT-bevriezingsmedium&nbsp;</td><td>VWR</td><td>25608930</td><td></td></tr><tr><td>Formaline, gebufferd, 10% (fosfaatbuffer)</td><td>Fisher</td><td>SF100-4</td><td></td></tr><tr><td>23g naald</td><td>Fisher</td><td>14-826-6B</td><td></td></tr><tr><td>FVB/n-muis</td><td>Jackson Laboratories</td><td>001800</td><td></td></tr></tbody></table>

chirurgische procedures en methodologie voor een preklinisch murine model van de novo maagkanker metastase

Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis

Een beperkende factor van transgene muismodellen van mamma-adenocarcinoom is dat de primaire tumorbelasting in het mammaweefsel typisch de eindpunten van het onderzoek bepaalt. Daarom zijn onderzoeken die zich richten op het verduidelijken van mechanismen van late-stage de novo metastase gehinderd, net als onderzoeken die de effectiviteit van antikankertherapieën onderzoeken die zich richten op mediatoren van metastase in de adjuvante setting. Er zijn talloze muismodellen voor mammakanker ontwikkeld door gerichte expressie van dominante oncoproteïnen naar mamma-epitheelcellen, waardoor modellen ontstonden die histopathologische en transcriptome-gedefinieerde borstkankersubtypen die bij vrouwen vaak voorkomen, variabel nabootsten1. Hoewel er veel is geleerd over de biologie van mammacarcinogenese met deze modellen, is hun nut in het identificeren van moleculen die de groei van late-stadiummetastasen reguleren, beperkt omdat muizen typisch op vroegere tijdstippen worden geëuthanaseerd vanwege een significante primaire tumorbelasting. Bovendien, aangezien een aanzienlijk percentage vrouwen dat met borstkanker wordt gediagnosticeerd adjuvante therapie ontvangt na chirurgische resectie van primaire tumoren en vóór de aanwezigheid van detecteerbare metastatische ziekte, zijn preklinische modellen van de novo metastase dringend nodig als platform om nieuwe therapieën te evalueren die zijn gericht op het targeten van metastatische foci. Om deze tekortkomingen aan te pakken, ontwikkelden we een muismodel van de novo mammakankermetastase, waarbij primaire mammatumoren chirurgisch worden verwijderd en metastatische foci zich vervolgens ontwikkelen gedurende een periode van 115 dagen na de operatie. Deze lange latentie biedt een hanteerbaar model om functioneel significante regulatoren van metastatische progressie te identificeren bij muizen zonder primaire tumor, evenals een model om de preklinische therapeutische effectiviteit van agenten te evalueren die zijn gericht op het blokkeren van functioneel significante moleculen die helpen bij het overleven en de groei van metastatische tumoren.

Meer dan 75% van de ontvangende muizen die 1 x 10 6 cellen van primaire borsttumoren van MMTV-afgeleid PymT muizen ontwikkelen interne mammaire adenocarcinoom variërend in grootte 172-450 mm3 binnen 38-60 dagen (gegevens niet getoond). Muizen die in aanmerking komen voor randomisatie worden dan ingevoerd in studiegroepen na chirurgische resectie van primaire tumoren zoals getoond ( Figuur 1C ). Primaire tumor hergroei werd geïdentificee...

Preklinische modellen die adjuvante therapie beoordelen die gericht zijn op metastase van borstkanker, ontbreken. Om dit aan te pakken, ontwikkelden we een muizenmodel van de novo pulmonale mammary adenocarcinoma metastase, waarbij therapieën toegediend in de adjuvante omgeving (post-chirurgische resectie van primaire tumoren) kunnen worden geëvalueerd voor werkzaamheid bij het beïnvloeden van eerder gecoede pulmonale metastasen.

Chirurgische Procedures en Methodologie voor een Preklinisch Murine Model van De Novo Maagkanker Metastase

A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study ...

We hebben een nieuw muismodel ontwikkeld voor de novo mammakankermetastase dat de loop van borstkanker bij mensen nauwgezet nabootst en een preklinisch platform biedt voor het evalueren van de biologie, de onderliggende metastatische progressie van de ziekte en de werkzaamheid van therapieën die in het adjuvante stadium worden toegediend. Procedures met dierproeven zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee aan de Oregon Health and Science University. Ons muismodel wordt opgezet door enzymatisch gedissocieerde primaire tumoren te verzamelen van transgene 100 dagen oude muis mammaire tumor virus polyoma middle T of MMTV-PyMT muizen.Een keer 10 tot de zesde tumorcellen worden orthotopisch geïnjecteerd in syngene vrouwelijke muizen en primaire tumoren ontwikkelen zich gedurende een periode van 38 tot 60 dagen. Muizen met tumoren van 170 tot 450 millimeter kubiek worden ingeschreven voor chirurgische resectie van de primaire tumor. Analyse op 115 dagen na de operatie resulteerde in muizen met histologisch detecteerbare metastatische foci in de longen met een penetrantie van 45%.Deze video toont chirurgische resectie van de primaire mammaire tumor, een cruciale component van het preklinische muismodel. Muizen worden 2% isofluraan toegediend en de operatie kan beginnen zodra de voetkneespijnreflex afwezig is. Spuit de huid boven de primaire tumor in met 70% ethanol.Betadine wordt vervolgens aangebracht op het chirurgische gebied, beginnend op de huid boven de tumor, gevolgd door het gebied rond de primaire tumor met behulp van een steriele wattenstaafje. Gebruik stompe schaar om een eerste incisie in de huid te maken, mediaal en caudaal ten opzichte van de primaire tumor. De incisie wordt in een superieure richting uitgebreid, mediaal ten opzichte van de primaire tumor.Identificeer en cauteriseer potentiële vaten die de tumor voeden vanaf de huid erboven. Als er bloeding optreedt, moet verdere cauterisatie worden uitgevoerd. Bij het maken van een laterale huidsnede onder de primaire tumor, moet worden voorkomen dat de onderliggende borstklier wordt gesneden, aangezien er vaten kunnen zijn.De huidsnede wordt vervolgens cirkelvormig uitgebreid rond de primaire tumor. Dunne verklevingen in de borstklier mediaal ten opzichte van de tumor worden vervolgens voorzichtig gescheiden en scheiden de tumor van de buikwand. Er kunnen bloedvaten aanwezig zijn in deze verklevingen.Cauteriseer eventuele vaten die binnen de verklevingen worden geïdentificeerd voordat ze worden doorgesneden. Pijlen geven de vierde en vijfde rechter borstklier aan, boven en onder de tumor. De vijfde borstklier wordt vervolgens gecauteriseerd en verwijderd, omdat deze kleine vaten kan bevatten die moeilijk te visualiseren zijn.Nadat de tumor is gescheiden van de buikwand, kunnen grotere vaten worden geïdentificeerd. Het vat dat door de vierde borstklier loopt, wordt weergegeven door de bovenste pijl. De onderliggende femorale slagader wordt weergegeven door de middelste pijl.En het grote vat dat de tumor voedt tussen de vierde en vijfde borstklier, wordt aangegeven door de onderste pijl. Cauterisatie langs het grote vat dat tussen de vierde en vijfde borstklier loopt, wordt vervolgens uitgevoerd, waarbij moet worden voorkomen dat de onderliggende femorale slagader op het been wordt gecauteriseerd. Nadat de cauterisatie van het grote vat is voltooid, snijdt u door het vat tot aan de vierde borstklier.Lokaliseer en cauteriseer het tweede grote vat dat door de vierde borstklier loopt. Snijd door het vat zonder door de hele borstklier te snijden, zodat als er bloeding optreedt, het vat gemakkelijk kan worden geïdentificeerd en verder gecauteriseerd kan worden. De rest van de vierde borstklier wordt vervolgens verwijderd.De bovenliggende huid wordt vervolgens gesloten met wondklemmetjes met behulp van een AutoClip-wondklemapplicateur. Zorg ervoor dat de bovenliggende huid voldoende is gescheiden van de buikwand om te voorkomen dat de onderliggende spier wordt geklemd. Breng de laterale en mediale randen van de wond samen en til de huid in anterieure richting om de wondklem toe te passen.Zorg ervoor dat u het urogenitale kanaal of de onderliggende spier van de rechterpoot niet knijpt. Mobilisatie van de rechterpoot door het tape verwijderen kan een gemakkelijkere toepassing van wondklemmetjes mogelijk maken. Wondklemmetjes moeten 10 dagen na de operatie worden verwijderd.De chirurgische resectie van de primaire tumor die in deze video wordt weergegeven, maakt het mogelijk dat gedisseminateerde kankercellen zich ontwikkelen in de metastatische foci in de long 115 dagen na de operatie, waarbij een vertegenwoordiger van elk in de afbeelding van een metastatische focus wordt getoond. Aangezien een groot percentage vrouwen met de diagnose borstkanker een chirurgische verwijdering van de tumor ondergaan en kunnen overlijden aan metastatische ziekte na de operatie, hebben we een preklinisch muismodel opgesteld dat de loop van de ziekte en behandeling van de patiënt nabootst. Door de methodologie voor chirurgische verwijdering van de primaire mammaire tumor vast te leggen, kan dit belangrijke onderdeel van ons muismodel voor de novo mammakankermetastase eenvoudig worden gereproduceerd om de biologie van metastatische ziekte na tumorresectie en de werkzaamheid van adjuvante therapie te beoordelen.

surgical-procedures-methodology-for-preclinical-murine-model-de-novo

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Time-lapse imaging wordt gebruikt om het gedrag van primaire preneoplastische mammaire epitheelcellen afkomstig van genetisch gemanipuleerde muizen met borstkanker te bepalen of er correlaties tussen specifieke gedragsparameters en verschillende genetische laesies beoordelen.

Time-lapse imaging of Primary preneoplastische uier epitheelcellen afkomstig van de genetisch gemanipuleerde muis modellen van borstkanker

Een borstkanker hersenmetastasen muismodel wordt vastgesteld met echografie-imaging geleide intracardiale injectie van MDA-MB231/Br-GFP cellen. Ontwikkeling van multifocale intracraniële metastasen is longitudinaal gevolgd met behulp van hoge-resolutie 9.4 T MRI.

Ultrasound Imaging-begeleide Intracardiale Injection een muismodel van borstkanker hersenmetastasen Gevolgd door Longitudinale MRI Ontwikkelen

Activering van latente mutaties met adenovirus-Cre in de borstklier ductale systeem een ​​klinisch relevante metastatische borstkanker. Opneming van een YFP promotor maakt het volgen van distale metastatische tumorcellen. Dit model is nuttig om latente metastase, anti-tumor immuniteit, en voor het ontwerpen van nieuwe immunotherapieën behandeling van borstkanker bestuderen.

Initiatie van gemetastaseerd borstcarcinoom door Targeting van de Ductaal Epitheel met adenovirus-Cre: A Novel transgeen muismodel van de Breast Cancer

Een preklinische, muizenmodel van levermetastasen uitgevoerd via een hemispleen injectietechniek.

Een preklinisch muizenmodel van levermetastasen

Het doel van dit protocol is om borsttumorigenesis te bestuderen. Met deze techniek worden muisborsttumoren verwijderd en worden primaire cellen bereid uit tumoren. Er is een longextractieprotocol opgenomen voor het bestuderen van longmetastasen. Verder is er nog een protocol opgenomen voor het analyseren van muis embryonale fibroblasten van het muizenembryo.

Primaire tumor en MEF Cell Isolation om te studeren longmetastase

Het meerstaps proces van peritoneale verspreiding van ovariumcarcinoom verduidelijken de huidige studie beschrijft een murine experimenteel model van originele tumorontwikkeling en metastase via orthotope peritoneale inoculatie met deze tumorcellen.

Murine Experimental Model van de oorspronkelijke tumor Ontwikkeling en peritoneale metastase<em&gt; via</em&gt; Orthotope Inenting met ovariumcarcinoom Cells

Wij introduceren een lymfkliertest orthotopic borst kanker en radicale mastectomie model met bioluminescentie technologie te kwantificeren van de last van de tumor om na te bootsen menselijke borst kanker progressie.

Het genereren van een lymfkliertest Orthotopic uitgezaaide borst kanker Model en het uitvoeren van lymfkliertest radicale mastectomie

In dit protocol beschrijven we een muismodel van onvolledige chirurgische resectie van weke delen sarcoom voor het testen van (neo)adjuvante therapieën.

Een muismodel van onvolledig gereseceerde weke delen Sarcoom voor het testen van (Neo)adjuvante therapieën

Patient-derived xenograft (PDX) modellen en transplanteerbare genetisch gemanipuleerde muismodellen getrouw de menselijke ziekte samenvatten en zijn voorkeursmodellen voor fundamenteel en translationeel borstkankeronderzoek. Hier wordt een methode beschreven om borsttumorfragmenten orthotopisch in het borstvetkussen te transplanteren om tumorbiologie te bestuderen en de respons van geneesmiddelen te evalueren.

Orthotopische transplantatie van borsttumoren als preklinische modellen voor borstkanker

Intracraniale hersenen metastase modellering wordt gecompliceerd door een onvermogen om tumorgrootte en reactie op de behandeling met nauwkeurige en tijdige methoden te controleren. De gepresenteerde methodologie paren intracraniale tumor injectie met magnetische resonantie imaging analyse, die wanneer gecombineerd, cultiveert nauwkeurige en consistente injecties, verbeterde dier monitoring, en nauwkeurige tumor volume metingen.

Modellering van hersenmetastasen door middel van intracraniale injectie en magnetische resonantie beeldvorming

Het manuscript beschrijft een methodologie voor het opzetten en longitudinaal monitoren van spontane longmetastasen van orthotopisch geïnjecteerde borsttumoren, die vatbaar is voor interventie in alle stadia van de metastatische cascade.

In vivo Beeldvorming om spontane longmetastasen van orthotopisch geïnjecteerde borsttumorcellen te meten

Leer chirurgische resectie van primaire mammatumoren in een muismodel voor de novo borstkankermetastase. Dit protocol maakt onderzoek naar metastatische progressie en adjuvante therapieën mogelijk.

Chirurgische Procedures en Methodologie voor een Preklinisch Murine Model van De Novo Maagkanker Metastase

Meer video's verkennen