kwantitatieve 3D In Silico Modeling (q3DISM) van cerebrale amyloid-beta Phagocytosis in diermodellen van de ziekte van Alzheimer
26 december 2016
We ontwikkelden een methode voor kwantitatieve 3D in silico modellering (q3DISM) van cerebrale amyloid-β (Aß) fagocytose door mononucleaire fagocyten in diermodellen van de ziekte van Alzheimer. Deze methode kan worden gegeneraliseerd voor de kwantificering van vrijwel elke fagocytische gebeurtenis in vivo.
Het algemene doel van deze kwantitatieve 3-D in silico-modellering, of q3DISM-techniek, is om de opname van amyloid-beta door mononucleaire fagocyten in de hersenen van knaagdiermodellen van de ziekte van Alzheimer te kwantificeren. Deze methode komt tegemoet aan een dringende behoefte op het gebied van Alzheimer-onderzoek om de klaring van amyloid-beta te kwantificeren die wordt afgezet in de hersenen van Alzheimer-patiënten en seniele plaques vormt. Voor het eerst maakt deze techniek ware 3-D reconstructie en kwantificering van amyloid-beta door macrofagen in vivo mogelijk. We begonnen cued 3-Dism te gebruiken om amyloid-beta afzetting te bestuderen omdat we een robuust hulpmiddel nodig hadden om fagocytose van microfagen in vivo te visualiseren en te kwantificeren.
Deze techniek kan nuttig blijken bij het testen van experimentele therapeutischa voor de ziekte van Alzheimer om te beoordelen welke geneesmiddelen macrofagen stimuleren voor de efficiënte klaring van amyloid-beta. Wanneer de weefselmonsters klaar zijn voor immunokleuring, vult u de met een hydrofobe barrièrepen omcirkelde weefsellesionale regio met blokkeerbuffer voor een incubatie van een uur bij kamertemperatuur in een bevochtigde kamer. Aan het einde van de incubatie, vervangt u de blokkeerbuffer door het eerste primaire antilichaam van belang overnacht bij 4 graden Celsius in de bevochtigde kamer.
De volgende ochtend, was de monsters in drie vijf minuten durende PBS-baden bij kamertemperatuur met lichte agitatie. Na de derde wasbeurt, incubeert u de slides met het juiste fluorescerende secundaire antilichaam bij kamertemperatuur beschermd tegen licht. Na een uur, wast u de secties nog drie keer in PBS beschermd tegen licht.
Label vervolgens de cellen met de andere weefsel-geëigende primaire en secundaire antilichamen van belang gedurende de volgende twee tot vier dagen zoals zojuist gedemonstreerd. Om cellulaire en supercellulaire compartimenten en amyloid-beta-afzettingen efficiënt te kleuren, is het cruciaal om met slechts één primair antilichaam tegelijk te labelen gevolgd door het corresponderende secundaire antilichaam. Een tijdrovend maar resultaatoptimaliserend proces.
Na de laatste wasbeurt van de secundaire antilichaamkleuring, laat de secties volledig drogen overnacht bij kamertemperatuur in het donker. Bedek vervolgens de gedroogde monsters met een dekglas dat is afgedicht met fluorescerend montagemedium dat DAPI bevat. Om de monsters te beeldvormen door confocale microscopie, selecteert u het 60x microscoopobjectief en voegt u immersieolie toe aan de lens.
Plaats het monster op de microscoopstage-slidehouder en breng het objectief omhoog totdat de olie contact maakt met de slide. Gebruik epifluorescente verlichting, pas het brandpunt aan om de amyloid-plaques in de hippocampus of hersenschors te lokaliseren. Vervolgens, verwerft u confocale beelden van de geactiveerde mononucleaire fagocyten rond de amyloid-afzettingen in de hippocampus of de cortex.
Voor kwalitatieve 3-D in silico-modellering, analyseert u eerst de confocale datasets met wetenschappelijke 3-D beeldverwerking in een analysesoftware-colocalisatiemodule voor ruimtelijke nabijheid van de geactiveerde macrofaagmarkerkleuring in alle Z-vlakken gelijktijdig. Maak colocalisatiekanalen die overeenkomen met de phagolysosomekleuring binnen de geactiveerde mononucleaire fagocyten. Selecteer TRITC voor Kanaal A en FITC voor Kanaal B. In het Mode Check-venster, selecteer Drempelwaarde.
Voor de colocalisatie-intensiteiten, selecteert u Bronkanalen. Klik op Bewerken om de colocalisatiekleur te selecteren. Pas vervolgens de drempelwaarden van elk kanaal onafhankelijk aan om de specifieke kleuring op te nemen en om de achtergrond en niet-specifieke signalen uit te sluiten.
De gecoloceerdde voxels zullen in de geselecteerde colocalisatie kleur in alle z-stacks gelijktijdig verschijnen. Klik vervolgens op Colocalisatiekanaal bouwen. Het gemaakte colocalisatiekanaal zal verschijnen in het Venster voor weergaveaanpassing.
Klik op het colocalisatiekanaal om de kanaalstatistieken te openen. Het percentage volume materiaal A boven de colocalisatiedrempel vertegenwoordigt het monocytvolume bezet door de phagolysosomen. Gebruik de Colocalisatiemodule om het colocalisatiekanaal te analyseren op ruimtelijke nabijheid met de amyloid-beta-signalen om de amyloid-beta gecapsuleerd binnen de phagolysosomen te kwantificeren.
Selecteer de colocalisatiedataset van Kanaal A en Cy5 voor Kanaal B en bouw een colocalisatiekanaal op zoals zojuist gedemonstreerd. Klik op het colocalisatiekanaal om de kanaalstatistieken opnieuw te openen. Het percentage volume materiaal A boven de colocalisatiedrempel vertegenwoordigt het phagolysosomale volume bezet door de amyloid-beta.
Gebruik de Surpass-module om de confocale beeldastacks te reconstrueren en 3-D modellen van de gecapsuleerde amyloid-beta binnen de monocytphagolysosomen te genereren. Selecteer in het Venster voor weergaveaanpassing TRITC om alleen de macrofaagkleuring te tonen, en klik toevoegen nieuw oppervlak in de volume-eigenschappen. Onder Instellingen, in stap een van vijf, algoritme, selecteer Oppervlak.
In kleur, selecteer het type kleur van belang en pas de transparantie aan zoals passend. Controleer vervolgens het selectievakje voor het gebied van belang en klik volgende. In stap twee van vijf, gebied van belang, pas de X, Y en Z coördinaten aan om een venster rond de cel van belang te tekenen en klik volgende.
In stap drie van vijf, bronkanaal, selecteert u het TRITC-bronkanaal en controleert u het vakje Soepel. Stel het oppervlaktedetailniveau in op 0,4 micron en klik volgende. In stap vier van vijf, drempelwaarde, pas de drempelwaarde aan zodat het gemaakte volume perfect overlapt met het TRITC-kanaal signaal en klik volgende.
Ten slotte, in stap vijf van vijf, oppervlakken classificeren, selecteert u in de sectie Filtertypen de objecten afhankelijk van hun grootte om op te nemen of uit te sluiten van de volumes die worden gemaakt. Herhaal dezelfde stappen om 3-D oppervlakken te maken voor phagolysosomen met het FITC-kanaal en amyloid-beta met het Cy5-kanaal. Na kwalitatieve 3-D in silico-modellering, zoals zojuist gedemonstreerd,
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een nieuwe kwantitatieve 3D in silico modelleringsmethode (q3DISM) voor het analyseren van de fagocytose van amyloïd-bèta door mononucleaire fagocyten in knaagdiermodellen voor de ziekte van Alzheimer. Deze methode maakt de kwantificering van fagocytische gebeurtenissen in vivo mogelijk, wat een kritieke behoefte in het Alzheimer-onderzoek adresseert.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Alzheimeronderzoek
- Immunologie
Achtergrond
- De accumulatie van amyloïd-beta is een kenmerk van de ziekte van Alzheimer.
- Mononucleaire fagocyten spelen een cruciale rol bij het opruimen van amyloïd-beta.
- Bestaande methoden missen het vermogen om fagocytose in drie dimensies te kwantificeren.
- Er is behoefte aan robuuste instrumenten om fagocytische activiteit in vivo te visualiseren en te kwantificeren.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een methodologie voor het kwantificeren van de opname van amyloïde-bèta door fagocyten.
- Het mogelijk maken van 3D-reconstructie van fagocytische gebeurtenissen in knaagdiermodellen.
- Het faciliteren van het testen van potentiële therapeutica tegen de ziekte van Alzheimer.
Gebruikte methoden
- Ontwikkeling van de q3DISM-techniek voor 3D-modellering.
- Immunokleuring van weefselmonsters voor visualisatie.
- Kwantitatieve analyse van amyloïde-beta fagocytose.
- Gebruik van knaagdiermodellen om het gedrag van fagocyten in vivo te bestuderen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle kwantificering van de opname van amyloïde-beta door macrofagen.
- Demonstratie van de effectiviteit van de q3DISM-techniek bij 3D-reconstructie.
- Identificatie van potentiële therapeutische effecten op de activiteit van macrofagen.
- Verbeterd begrip van fagocytische processen bij de pathologie van de ziekte van Alzheimer.
Conclusies
- De q3DISM-techniek biedt een waardevol instrument voor onderzoek naar de ziekte van Alzheimer.
- Deze methode kan worden gegeneraliseerd voor andere fagocytische processen in vivo.
- Toekomstige studies kunnen deze techniek benutten om nieuwe therapeutische wegen te verkennen.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor executives
Het kwantificeren van amyloid-beta fagocytose in vivo vult een kritisch gat in de zoektocht naar geneesmiddelen tegen Alzheimer door een objectieve beoordeling mogelijk te maken van de target-binding en het werkingsmechanisme van immunomodulerende therapieën. De q3DISM-methode levert reproduceerbare, ruimtelijk opgeloste gegevens die go/no-go beslissingen in de preklinische ontwikkeling ondersteunen door hypothesen over microglia-gemedieerde klaring te concretiseren. Deze mogelijkheid vergroot het voorspellende vertrouwen in vroege ontdekkingsfasen, waarin functionele validatie van neuro-immuun targets uitdagend blijft.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen over de fagocytische functie van microgliacellen bij de pathologie van de ziekte van Alzheimer te onderzoeken.
- Operationele waarde: Biedt kwantitatieve, 3D-opgeloste read-outs voor het beoordelen van doelwitmodulatie door experimentele verbindingen.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfolio-triage door verbindingen die de opname van amyloïd-beta daadwerkelijk verbeteren te onderscheiden van verbindingen met aspecifieke effecten.
Screening & Assayontwikkeling
- Assay-gereedheid: Genereert gestandaardiseerde, kwantitatieve resultaten die geschikt zijn voor high-content screening van agentia die fagocytose moduleren.
- Reproduceerbaarheid: Maakt gebruik van drempelwaarde-gebaseerde colocalisatie en 3D-reconstructie om gebruikersbias te minimaliseren en consistentie tussen experimenten te waarborgen.
- Schaalbaarheid: Compatibel met confocale imaging-pipelines en aanpasbaar aan geautomatiseerde workflows voor beeldanalyse.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziektebeelden: Modelleert fagocytische activiteit in rodentenhersenen die belangrijke kenmerken van menselijke neuro-inflammatie bij de ziekte van Alzheimer recapituleren.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen in vitro bevindingen en in vivo validatie door de fagolysosomale amyloïd-beta-inhoud in weefselcoupes te kwantificeren.
- Risicobeperking: Vermindert mechanistische ambiguïteit in preklinische studies door directe meting van de modulatie van het doelpaden.
Integratie van Pipeline & Workflow
De q3DISM-methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van doelwitvalidatie tot lead-optimalisatie en biedt mechanistische resultaten die bijdragen aan beslissingen over de verdere ontwikkeling van verbindingen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetesten van immunomodulerende mechanismen door phagocytische flux in situ te kwantificeren.
- Screening: Levert assay-klare, kwantitatieve colokalisatiemetrieken voor het evalueren van de effecten van verbindingen op fagocytose.
- Analytics: Genereert volumetrische en op intensiteit gebaseerde read-outs die statistische vergelijking van behandelingsgroepen mogelijk maken.
- Translationeel onderzoek: Verbindt cellulaire target-engagement met pathologie op weefselniveau via 3D-ruimtelijke mapping van amyloïde-beta-opname.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar imaging- en analysekader dat toepasbaar is op andere phagocytische targets bij neuro-inflammatie en daarbuiten.
Operationele en bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het vertrouwen in de validatie van het doelwit door direct bewijs te leveren van de modulatie van het fagocytosemechanisme.
- Operationele waarde: Standaardiseert de beoordeling van fagocytose tussen laboratoria door middel van gedefinieerde protocollen voor kleuring, beeldvorming en analyse.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door het percentage mislukkingen in latere stadia te verminderen als gevolg van onvoldoende mechanistische risicobeperking.
- Impact op de portfolio: Maakt datagestuurde prioritering van immunomodulerende kandidaten mogelijk op basis van functionele resultaten van fagocytose.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in confocale microscopie, immunokleuring en 3D-beeldanalyse-software.
- Afhankelijk van hoogwaardige fluorescente labeling en optimale weefselconservering voor nauwkeurige signaaldetectie.
- Necessiteert gestandaardiseerde thresholding- en colocalisatieparameters om vergelijkbaarheid tussen experimenten te garanderen.
- Aanpassing aan verschillende modelsystemen kan validatie van fagocytenmarkers en amyloïd-beta-epitopen vereisen.
- Praktische beperkingen omvatten de toegankelijkheid van weefsel en de noodzaak van gespecialiseerde vaardigheden in beeldbewerking.
