Name: Induceerbare-LAP tag stabiele cellijnen voor het onderzoeken van eiwitfunctie, Spatiotemporal Localization en Protein Interaction Networks (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 4 s
Description: Leer hoe je inducible LAP-tagged stabiele cellijnen genereert voor het bestuderen van eiwitfunctie, lokalisatie en interactienetwerken in HEK293-cellen. Deze methode maakt hoogdoorvoeranalyse van eiwitcomplexen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door een National Science Foundation Grant NSF-MCB1243645 (JZT), eventuele meningen, bevindingen en conclusies of aanbevelingen die in dit materiaal worden uitgedrukt, zijn die van de auteurs en weerspiegelen niet noodzakelijk de opvattingen van de National Science Foundation. De financiers hadden geen rol in het ontwerp van de studie, gegevensverzameling en -analyse, de beslissing om te publiceren of de voorbereiding van het manuscript.

OPMERKING: Een overzicht van de vorming van induceerbare-LAP hebben stabiele cellijnen voor een eiwit van interesse is in figuur 1 en het overzicht van LAP-gemerkt eiwit expressie, zuivering en bereiding voor de massa proteomische analyses wordt weergegeven in figuur 3. 1. Klonen van het open leeskader (ORF) van het gen van belang in het LAP-tag Vector <ol><li> Het kloneren van het ORF van het gen van belang in de shuttlevector. <ol><li> Met polymerasekettingreactie (PCR) om het ORF van belang te amplificeren met de juiste attB1 en attB2 plaatsen in de primers voor zowel N-terminale fusie of C-terminale fusie. Zie Tabel 1 voor de primersequenties en tabel 2 voor PCR omstandigheden. </li><li> Gel zuiveren de PCR producten door oplossing ervan op een 1% agarose gel. Accijnzen de versterkte band, dat is de juiste maat uit de gel en pak het uit de gel slice met behulp van een DNA-gel extractie kit volgens instructies van de fabrikant. </li><li> Incubeer de gezuiverde attB PCR producten bevatten een attP bevattende shuttle vector en het recombinase waarmee de PCR producten om te vermengen met de vector volgens de instructies van de fabrikant (zie M ateriaal tabel). LET OP: Lege shuttle vectoren en LAP-tagging vectoren bevatten de CCD B-gen en moeten worden gepropageerd in CCD B-resistente bacteriële cellen (zie Materials tabel). Maar de ccdB gen gerecombineerd wanneer een ORF in deze vectoren wordt geplaatst, dus gebruik maken van standaard DH5a E. coli-cellen bij het propageren van vectoren met gekloonde ORF. </li><li> Transformeren van DH5a E. coli-cellen met 1 pi van het reactieproduct en de plaat de getransformeerde cellen op een Luria-bouillon (LB) agarplaat met 50 mg / ml kanamycine 13. </li><li> Selecteer de kanamycine resistente kolonies. </li><li> Groeien de geselecteerde kolonies in LB media met 50 mg / ml kanamycine, maak een mini-prep DNA en bevestig genintegratie door DNA sequentiebepaling via de sequencing primers in tabel 3 vermeld. </li></ol></li><li> Het overbrengen van het gen van belang uit de Shuttle Vector in het LAP-tag Vector. <ol><li> Incubeer de shuttle vector die de sequentie geverifieerd gen van belang ORF met de LAP-tag vector (pGLAP1 voor N-terminale fusie) en de recombinase dat de overdracht van het gen van interesse van de shuttle vector in het LAP-tag vector volgens medieert instructies van de fabrikant (zie Materials). OPMERKING: Een reeks LAP / TAP vectoren die kunnen worden gebruikt op basis van de gewenste promoter, epitoop-tag, en N of C-terminale tagging kan worden in tabel 4. </li><li> Transformeren van DH5a E. coli-cellen met 1 pi van het reactieproduct en de plaat de getransformeerde cellen op een LB agar plaat met 100 mg / ml Ampicilline 13. </li><li> Selecteer de Ampicilline resistente coloven. </li><li> Groeien de geselecteerde kolonies in LB-medium met 100 mg / ml Ampicilline, maak een mini-prep DNA en bevestig genintegratie door DNA sequentiebepaling via de sequencing primers in Tabel 5 opgesomd. </li></ol></li></ol> 2. Genereren van een induceerbare stabiele cellijn dat de LAP-tag gen van belang spreekt <ol><li> Selecteer de cellijn het best geschikt voor het project van belang zijn. Als alternatief, maak een gastheercel lijn van een bestaande cellijn die constitutief uitdrukt de TetR en bevat een FRT-plaats die het mogelijk maakt de LAP-tag gen van belang stabiel worden geïntegreerd in het genoom (zie Materials). Opmerking: In dit protocol wordt een HEK293 cellijn dat TetR en een FRT-plaats, dat gekweekt in -Tet DMEM / F12 media [gemaakt met 10% foetaal runderserum (FBS) dat zonder tetracycline (-Tet)] 4 bevat . </li><li> Bepaal de minimumconcentratie van hygromycine vereist om de gastheercellijn binnen 1 tot 2 doden weeks na drugsverslaving. De concentratie kan variëren tussen gastheer cellijnen, met de meeste variërend tussen 100 ug / ml en 800 ug / ml. OPMERKING: HEK293 cellen die in -Tet DMEM / F12 medium met 100 ug / ml hygromycine bij 37 ° C en 5% CO 2 zal sterven binnen 1-2 weken. </li><li> Co-transfecteren van de vector die uitdrukt de flippase recombinase (medieert de integratie van het LAP-gemerkte gen van belang in de FRT-plaats in het genoom van de cel) met het LAP tag vector in HEK293 cellen onder toepassing van een transfectiereagens volgens de instructies van de fabrikant . Met een verhouding van 4: 1 van recombinase vector LAP vector 14. OPMERKING: De optimale verhouding is afhankelijk van de gastheercellijn en wijze van transfectie, en kan een titratie vereist. Een verhouding van 4: 1 werkt goed voor de meeste cellijnen. Onder meer een mock-getransfecteerde plaat als een negatieve controle. </li><li> Een dag na transfectie, vervang de -Tet DMEM / F12 media met verse media. </li><li> Twee dagen na de transfectiop, split cellen tot 25% samenvloeiing. Laat cellen ~ 5 uur te bevestigen, voeg dan hygromycine-bevattende -Tet DMEM / F12 media bij een concentratie vooraf in stap 2.2. Voor HEK293 cellen gebruiken 100 ug / ml hygromycine. OPMERKING: De FRT met HEK293 cellijn bevat ook de TetR die wordt geassocieerd met resistentie Blasticidine derhalve 5 ug / ml blasticidine wordt gebruikt in de stabiele cellijn selectieproces selecteren voor het TetR en lekkende expressie minimaliseren. </li><li> Vervang hygromycine-bevattende -Tet DMEM / F12 media als dat nodig is, totdat afzonderlijke cel foei erop dat ondoorzichtige vlekken tegen de transparante plaat lijken. </li><li> Voeg 20 ul trypsine bovenop elke cel foci en pipet op en neer 2 maal met 200 pi pipet tip. Plaats cellen in een plaat met 24 putjes en de cellen door voortdurende groei van de hygromycine-bevattende -Tet DMEM / F12 media uit te breiden. </li><li> Screen cellen voor induceerbare-LAP gelabeld eiwit expressie door vaste-cel of live-cell fluorescentie microscopie en / ofWestern blotting voor het GFP-tag in het LAP-tag 15. </li></ol> 3. Zuivering van LAP-tag eiwitcomplexen LET OP: De volgende LAP-gelabelde eiwit zuivering protocol gegevens aanbevelingen over de voorwaarden en volumes gebruikt voor een typische LAP-gelabelde eiwit zuivering op basis van eerdere ervaringen. Echter, moet voorzichtigheid worden betracht om ervoor te zorgen dat de empirische optimalisatie uit voor een eiwit complex en eiwit expressie niveau van de rente om de beste resultaten te leveren wordt uitgevoerd. <ol><li> Celgroei en Cell Oogst. <ol><li> Vouw de gevalideerde-LAP hebben cellijn TAP isolatie van eiwitcomplexen door continu passage alle HEK293 cellen tot grotere borden en / of rolflessen in -Tet DMEM / F12-medium bij 37 ° C en 5% CO2. </li><li> Voor Tet / Dox induceerbare cellijnen te induceren gedurende 10-15 uur bij een concentratie van 0,2 ug / ml Tet / Dox wanneer de cellen bereikt ~ 70% confluentie voordat harvesting cellen. OPMERKING: als inductie tijd moet worden bepaald voor elk eiwit, wordt een titratie van 0,1-1 ug / ml Tet / Dox gedurende 10-15 uur aanbevolen. </li><li> Oogst cellen door agitatie of behandeling met trypsine en pellet cellen op 875 xg gedurende 5-10 min. </li></ol></li><li> Koppeling anti-GFP antilichaam aan Proteïne A kralen <ol><li> Met 40 ug antilichaam voor immunoprecipitatie van een lysaat bereid uit een 0,5 ml celpellet, gepakte celvolume (PCV). OPMERKING: De hoeveelheid antilichaam die nodig is zal afhangen van de overvloed van het LAP-gelabeld eiwit, naast andere factoren, en optimalisatie vereisen. Een titratie van 10-40 ug aanbevolen. </li><li> Equilibreren 160 ui gepakte volume (PV) Proteïne A kralen in PBST (PBS + 0,1% Tween-20) in een 1,5 ml buis. Was 3 maal met 1 ml PBST. LET OP: Alle wast hierin worden uitgevoerd door centrifugeren de kralen bij 5.000 g gedurende 10 seconden uitgevoerd. </li><li> Resuspendeer kralen in 500 pi PBST en voeg 80 ug affiniteit-purified konijn anti-GFP antilichaam aan elke buis van 160 pi kralen. Meng gedurende 1 uur bij kamertemperatuur (RT). </li><li> Wassen kralen 2 maal met 1 ml PBST. Vervolgens wast kralen 2 maal met 1 ml 0,2 M natriumboraat, pH 9 (20 ml 0,2 M natriumboraat + 15 ml 0,2 M boorzuur). Na de laatste wasbeurt, voeg 900 ul van 0,2 M natriumboraat, pH 9 het uiteindelijke volume op 1 ml te brengen. </li><li> Voeg 100 ul van 220 mM dimethylpimelimidate (DMP) tot een eindconcentratie van 20 mM. Draai de buizen voorzichtig bij kamertemperatuur gedurende 30 min. 220 mM DMP, resuspendeer inhoud van een 50 mg fles in 877 gl 0,2 M natriumboraat, pH 9 en voeg onmiddellijk de parelsuspensie. </li><li> Na incubatie met DMP, wassen kralen 1 keer met 1 ml 0,2 M ethanolamine, 0,2 M NaCl pH 8,5 om de resterende verknopingsmiddel te inactiveren. Resuspendeer kralen in 1 ml van dezelfde buffer en draai gedurende 1 uur bij KT. Pellet kralen en resuspendeer kralen in 500 gl 0,2 M ethanolamine, 0,2 M NaCl pH 8,5. Kralen zijn stabiel several maanden bij 4 ° C. </li></ol></li><li> Bereiding van Buffers voor cellysis en zuivering Complex <ol><li> Bereid LAPX buffers (waarbij X de gewenste zoutconcentratie [mM KCl] van het LAP buffer; 300 mM voor cellysis, 200 mM meeste kralen wast, en 100 mM voor het wassen bolletjes vóór elueren proteïnen) door middel van een pH 7,4 oplossing bevattende 50 mM 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethaansulfonzuur (HEPES), X mM KCl, 1 mM ethyleenglycol-azijnzuur (EGTA), 1 mM MgCl2 en 10% glycerol. OPMERKING: De componenten van deze buffer gebruikt om het milieu te benaderen in levende cellen. HEPES wordt gebruikt als een buffer in het pH woede van 7,2-8,2. KCl een zout gebruikt om de ionsterkte van de buffer te handhaven. EGTA is een chelaatvormer die calciumionen bindt aan de niveaus van calcium ten opzichte van magnesium verminderen. Glycerol en MgCl2 worden gebruikt om de stabiliteit van eiwitten te verbeteren. </li><li> Bereid LAPX N buffer door het toevoegen van 0,05% nonyl phenoxypolyethoxylethanol de LAPX buffer. OPMERKING: Nonyl phenoxypolyethoxylethanol is een mild reinigingsmiddel dat eiwitten oplosbaar, maar handhaaft eiwit-eiwit interacties, waardoor een hogere concentratie wordt gebruikt tijdens het extractieproces en wordt dan verlaagd tijdens de binding en wasstappen. </li></ol></li><li> Bereiding van cellysaten <ol><li> Resuspendeer 500 pl PCV in 2,5 ml LAP300 met 0,5 mM dithiothreïtol (DTT) en proteaseremmers. Voeg 90 ul van 10% nonyl phenoxypolyethoxylethanol (0,3% eind) en meng door omkeren. </li><li> Plaats op ijs gedurende 10 min. Centrifugeer bij 21.000 xg gedurende 10 min. Verzamel deze lage snelheid supernatant (LSS). Neem een ​​10 ul monster van het LSS voor gel-analyse. </li><li> Transfer LSS een TLA100.3 buis centrifugeren bij 100.000 xg gedurende 1 uur bij 4 ° C. Verzamel deze hoge snelheid supernatant (HSS), in een buis en plaats op ijs. Neem een ​​10 ul monster van de HSS voor gel-analyse. LET OP: Vermijd het nemen van de top de meeste lipidelaag eend onderaan de meeste mobiele puin lagen. De lipidelaag worden verwijderd door afzuigen in vacuo voorafgaand aan het verzamelen van de HSS. </li></ol></li><li> Eerste Affiniteit Capture: Binding aan anti-GFP Beads <ol><li> Pre-elueren antilichaam gekoppelde korrels (gebruik 160 ul van kralen per 0,5 ml celpellet (PCV)) door ze te wassen 3 maal met 1 ml elutiebuffer [3,5 M MgCl2 met 20 mM Tris, pH 7,4] kwijt ontkoppeld antilichamen en verminderen achtergrond. Doe snel. Niet kralen in hoog zoutgehalte te verlaten voor een lange tijd. </li><li> Was beads 3 maal met 1 ml LAP200 N. Mengen HSS extraheer met antilichaam kralen voor 1 uur bij 4 ° C. Centrifugeer bij 21.000 xg gedurende 10 min. Pipetteer 10 ul monster van de supernatant (dat wil zeggen de stroom door (FT)) voor gelanalyse. </li><li> Was beads 3 maal met 1 ml N LAP200 met 0,5 mM DTT en proteaseremmers. Wassen kralen 2 maal (5 min elk) met 1 ml N LAP200 met 0,5 mM DTT en proteaseremmers. Was snel 2 times met 1 ml N LAP200 met 0,5 mM DTT en proteaseremmers geen voordat u de tabak etch virus (TEV) protease. </li></ol></li><li> TEV Splitsing <ol><li> Verdun 10 ug TEV protease in 1 ml N LAP200 en roteren buizen bij 4 ° C overnacht. Opmerking: Deze stap kan worden geoptimaliseerd voor LAP-gelabeld proteïne enkele uren te vullen door het aanpassen van de concentratie van TEV protease, die het behoud van LAP-gemerkt eiwit complexen kunnen helpen. </li><li> Pellet kralen en overdracht supernatant naar een nieuwe buis. Spoel kralen tweemaal met 160 ul LAP200 N met 0,5 mM DTT en proteaseremmers (triple concentratie) om het resterende eiwit te verwijderen. Pipetteer 10 ul monster van de bovenstaande voor gelanalyse. </li></ol></li><li> Tweede Affiniteit Capture: Binding aan S Protein Agarose <ol><li> Was 1 tube 80 ul proteïne S agarose suspensie (40 pl gepakte hars) 3 maal met 1 ml LAP200 N. LET OP: S protein binding aan de S-tag zal een actieve RNase reconstitueren en een alternatief tweede epitooplabel moet worden overwogen voor RNA-bevattende eiwitcomplexen. </li><li> TEV toevoegen geëlueerd supernatant S eiwit agarose korrels en Rock voor 3 uur bij 4 ° C. Pellet kralen en was 3 maal met 1 ml N LAP200 met 0,5 mM DTT en proteaseremmers. Wassen kralen 2 maal met 1 ml LAP100. </li></ol></li><li> eiwit Elutie <ol><li> Elueer eiwitten uit S proteïne-agarose door toevoeging van 50 ul van 4x Laemmli monsterbuffer en verwarm bij 97 ° C gedurende 10 minuten. OPMERKING: Eiwitten kunnen ook worden geëlueerd van de bolletjes met elutiebuffer (3,5 M MgCl2 met 20 mM Tris, pH 7,4). </li></ol></li></ol> 4. Identificeer interacterende eiwitten door massaspectrometrie Analyse <ol><li> Test de kwaliteit van de zuivering door het analyseren van de verzamelde monsters van natriumdodecylsulfaat polyacrylamidegel elektroforese (SDS-PAGE), zilverkleuring de gel (zie <strong&gt; Materialen Table) en door immunoblotting de eluaten en sonderen met anti-GFP antilichamen zodat de LAP hebben gewerkt zuivering 16, zie figuur 4. </li><li> Stoechiometrische en substoichiometrische medezuiverende species identificeren, neemt de uiteindelijke elutie monster en gescheiden door SDS-PAGE. Vlekken op de gel met een massaspectrometrie compatibel eiwit vlek. Uitsnijden de duidelijke banden en de ruimte tussen de gel en verwerken voor analyse met massaspectrometrie afzonderlijk 16. LET OP: Er zijn tal van manieren voor het scheiden van de uiteindelijke zuivering eluaten en hen voor te bereiden massaspectrometrie 5. Zo kan LAP-gezuiverde complexen worden geëlueerd van S-eiwit korrels met hoog zoutgehalte (3,5 M MgCl2) en het gehele eiwitpopulatie massaal kunnen worden geanalyseerd door massaspectrometrie 17. Alternatief kan definitieve eluaten worden gescheiden door 1 mm SDS-PAGE en een 1 mm band kan excised en geanalyseerd. Dit wist het complex mengsel van korrels of deeltjes die interfereren met de analyse. </li></ol>

<ol><li>Rigaut, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration.</a> Nat Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).</li>
<li>Puig, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tandem+affinity+purification+%28TAP%29+method%3A+a+general+procedure+of+protein+complex+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification.</a> Methods. 24, 218-229 (2001).</li>
<li>Cheeseman, I. M., Desai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combined+approach+for+the+localization+and+tandem+affinity+purification+of+protein+complexes+from+metazoans%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+STKE%22%5BJournal%5D)">A combined approach for the localization and tandem affinity purification of protein complexes from metazoans.</a> Sci STKE. , (2005).</li>
<li>Torres, J. Z., Miller, J. J., Jackson, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+generation+of+tagged+stable+cell+lines+for+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">High-throughput generation of tagged stable cell lines for proteomic analysis.</a> Proteomics. 9, 2888-2891 (2009).</li>
<li>LaCava, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity+proteomics+to+study+endogenous+protein+complexes%3A+pointers%2C+pitfalls%2C+preferences+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Affinity proteomics to study endogenous protein complexes: pointers, pitfalls, preferences and perspectives.</a> Biotechniques. 58, 103-119 (2015).</li>
<li>Landy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic%2C+structural%2C+and+regulatory+aspects+of+lambda+site-specific+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Dynamic, structural, and regulatory aspects of lambda site-specific recombination.</a> Annu Rev Biochem. 58, 913-949 (1989).</li>
<li>Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+cloning+using+in+vitro+site-specific+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">DNA cloning using in vitro site-specific recombination.</a> Genome Res. 10, 1788-1795 (2000).</li>
<li>ORFeome Collaboration. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ORFeome+Collaboration%3A+a+genome-scale+human+ORF-clone+resource%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">The ORFeome Collaboration: a genome-scale human ORF-clone resource.</a> Nat Methods. 13, 191-192 (2016).</li>
<li>Brasch, M. A., Hartley, J. L., Vidal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ORFeome+cloning+and+systems+biology%3A+standardized+mass+production+of+the+parts+from+the+parts-list%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">ORFeome cloning and systems biology: standardized mass production of the parts from the parts-list.</a> Genome Res. 14, 2001-2009 (2004).</li>
<li>Lamesch, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hORFeome+v3.1%3A+a+resource+of+human+open+reading+frames+representing+over+10%2C000+human+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">hORFeome v3.1: a resource of human open reading frames representing over 10,000 human genes.</a> Genomics. 89, 307-315 (2007).</li>
<li>Rual, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+ORFeome+version+1.1%3A+a+platform+for+reverse+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Human ORFeome version 1.1: a platform for reverse proteomics.</a> Genome Res. 14, 2128-2135 (2004).</li>
<li>Fiering, S., Kim, C. G., Epner, E. M., Groudine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+%26%2334%3Bin-out%26%2334%3B+strategy+using+gene+targeting+and+FLP+recombinase+for+the+functional+dissection+of+complex+DNA+regulatory+elements%3A+analysis+of+the+beta-globin+locus+control+region%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">An &#34;in-out&#34; strategy using gene targeting and FLP recombinase for the functional dissection of complex DNA regulatory elements: analysis of the beta-globin locus control region.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90, 8469-8473 (1993).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning+%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning : a laboratory manual</a>. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory. (1989).</li>
<li>Uyttersprot, N., Costagliola, S., Miot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+tool+for+efficient+transfection+of+dog+and+human+thyrocytes+in+primary+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">A new tool for efficient transfection of dog and human thyrocytes in primary culture.</a> Mol Cell Endocrinol. 142, 35-39 (1998).</li>
<li>Senese, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+insertion+in+STARD9%27s+motor+domain+regulates+its+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">A unique insertion in STARD9's motor domain regulates its stability.</a> Mol Biol Cell. 26, 440-452 (2015).</li>
<li>Gholkar, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+X-Linked-Intellectual-Disability-Associated+Ubiquitin+Ligase+Mid2+Interacts+with+Astrin+and+Regulates+Astrin+Levels+to+Promote+Cell+Division%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">The X-Linked-Intellectual-Disability-Associated Ubiquitin Ligase Mid2 Interacts with Astrin and Regulates Astrin Levels to Promote Cell Division.</a> Cell Rep. 14, 180-188 (2016).</li>
<li>Graumann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applicability+of+tandem+affinity+purification+MudPIT+to+pathway+proteomics+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Applicability of tandem affinity purification MudPIT to pathway proteomics in yeast.</a> Mol Cell Proteomics. 3, 226-237 (2004).</li>
<li>Connolly, J. A., Kalnins, V. I., Cleveland, D. W., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoflourescent+staining+of+cytoplasmic+and+spindle+microtubules+in+mouse+fibroblasts+with+antibody+to+tau+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Immunoflourescent staining of cytoplasmic and spindle microtubules in mouse fibroblasts with antibody to tau protein.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 74, 2437-2440 (1977).</li>
<li>Gholkar, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tctex1d2+associates+with+short-rib+polydactyly+syndrome+proteins+and+is+required+for+ciliogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Tctex1d2 associates with short-rib polydactyly syndrome proteins and is required for ciliogenesis.</a> Cell Cycle. 14, 1116-1125 (2015).</li>
<li>Cheung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+Analysis+of+the+Mammalian+Katanin+Family+of+Microtubule-severing+Enzymes+Defines+Katanin+p80+subunit+B-like+1+%28KATNBL1%29+as+a+Regulator+of+Mammalian+Katanin+Microtubule-severing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic Analysis of the Mammalian Katanin Family of Microtubule-severing Enzymes Defines Katanin p80 subunit B-like 1 (KATNBL1) as a Regulator of Mammalian Katanin Microtubule-severing.</a> Mol Cell Proteomics. 15, 1658-1669 (2016).</li>
<li>Torres, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+STARD9%2FKif16a+Kinesin+Associates+with+Mitotic+Microtubules+and+Regulates+Spindle+Pole+Assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The STARD9/Kif16a Kinesin Associates with Mitotic Microtubules and Regulates Spindle Pole Assembly.</a> Cell. 147, 1309-1323 (2011).</li>
<li>Garcia-Gonzalo, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transition+zone+complex+regulates+mammalian+ciliogenesis+and+ciliary+membrane+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">A transition zone complex regulates mammalian ciliogenesis and ciliary membrane composition.</a> Nat Genet. 43, 776-784 (2011).</li>
<li>Chih, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ciliopathy+complex+at+the+transition+zone+protects+the+cilia+as+a+privileged+membrane+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A ciliopathy complex at the transition zone protects the cilia as a privileged membrane domain.</a> Nat Cell Biol. 14, 61-72 (2012).</li>
<li>Leonetti, M. D., Sekine, S., Kamiyama, D., Weissman, J. S., Huang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+scalable+strategy+for+high-throughput+GFP+tagging+of+endogenous+human+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A scalable strategy for high-throughput GFP tagging of endogenous human proteins.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113, E3501-E3508 (2016).</li>
<li>Poser, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAC+TransgeneOmics%3A+a+high-throughput+method+for+exploration+of+protein+function+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">BAC TransgeneOmics: a high-throughput method for exploration of protein function in mammals.</a> Nat Methods. 5, 409-415 (2008).</li>
<li>Firat-Karalar, E. N., Stearns, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+mammalian+centrosome+structure+using+BioID+proximity-dependent+biotinylation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Probing mammalian centrosome structure using BioID proximity-dependent biotinylation.</a> Methods Cell Biol. 129, 153-170 (2015).</li>
<li>Roux, K. J., Kim, D. I., Burke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BioID%3A+a+screen+for+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">BioID: a screen for protein-protein interactions.</a> Curr Protoc Protein Sci. 74, (2013).</li>
<li>Gupta, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Dynamic+Protein+Interaction+Landscape+of+the+Human+Centrosome-Cilium+Interface%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Dynamic Protein Interaction Landscape of the Human Centrosome-Cilium Interface.</a> Cell. 163, 1484-1499 (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De geschetste protocol beschrijft de klonering van genen van belang in het LAP-tagging vector, het genereren van induceerbare-LAP hebben stabiele cellijnen en de zuivering van LAP-eiwitcomplexen geïdentificeerd voor proteomische analyse. Met betrekking tot andere LAP / TAP-tagging benaderingen, is dit protocol gestroomlijnd geschikt is voor high-throughput benaderingen eiwit lokalisatie en eiwit-eiwit interacties in kaart binnen een cellulaire rol zijn. Deze aanpak wordt algemeen toegepast op de functionele karakterisatie van eiwitten essentieel voor voortgang van de celcyclus, mitotische spoel montage spindle pole homeostase en ciliogenese te noemen en heeft begrijpen hoe misregulation van deze eiwitten kan leiden tot menselijke ziekten 15 geholpen, 16,19,20. Bijvoorbeeld, de groep onlangs gebruikt dit systeem om de functie en regulatie van de STARD9 mitotische kinesine (een kandidaat kanker doel) in de assemblage van de spoel 15,21 definiëren, om een te definiërennieuwe moleculaire verbinding tussen de Tctex1d2 dynein lichte keten en korte rib polydactyly syndromen (SRPS) 19, en een nieuwe moleculaire verbinding te definiëren om te begrijpen hoe mutatie van het Mid2 ubiquitine ligase kan leiden tot X-gebonden verstandelijke handicap 16. Andere laboratoria hebben ook met succes toegepast deze methode, waaronder een die vastgesteld dat Tctn1, een regulator van muis Hedgehog signalering, maakte deel uit van een ciliopathie geassocieerd eiwitcomplex dat gereglementeerde ciliaire membraansamenstelling en ciliogenese in een weefsel-afhankelijke manier 22,23. Daarom kan dit protocol breed worden toegepast op de dissectie van elke cellulaire rol. Een cruciale stap in dit protocol is de selectie van LAP-tag stabiele cellijnen die resistent tegen hygromycine. Speciale aandacht moet worden genomen om ervoor te zorgen dat alle cellen in de controle plaat dood voordat het selecteren van brandpunten in de experimentele plaat voor amplificatie zijn. Hygromycine kan ook worden Added tijdens routinematige celkweek of-LAP tag stabiele cellijnen om verder te zorgen dat alle cellen handhaven van de LAP-tag gen van belang op de FRT-plaats. Wij waarschuwen dat niet alle LAP-gemerkte eiwitten functioneel zal zijn en dat het belangrijk is om assays plaats die kan worden gebruikt om eiwitfunctie te testen. Voorbeelden van assays gebruikt om eiwit functie te testen omvatten de redding van siRNA-geïnduceerde fenotypes en in vitro activiteit assays. Om eventuele problemen de toevoeging van een grote LAP-tag te pakken, hebben we eerder gegenereerde TAP-tag vectoren compatibel met het systeem dat kleinere labels, zoals FLAG, die minder waarschijnlijk een functie en lokalisatie van het eiwit van interesse te remmen bevatten 4. Bovendien-LAP tagging vectoren aanwezig voor het genereren van C-eindstandige-LAP-gemerkte eiwitten of C-eindstandige TAP-gemerkte eiwitten die compatibel zijn met dit systeem, dat kan worden gebruikt wanneer een LAP / TAP tag niet ten N worden geduld terminus van een eiwit. Bovendien the zout en afwasmiddel concentraties van de zuivering buffers (LAPX N) kan worden gewijzigd te verhogen of de zuivering striktheid te verlagen als er geen of te veel interacties worden waargenomen. Ook de tandem affiniteitszuivering procedure is strenger dan één zuiveringswerkwijzen en zwakke interactors kunnen verloren gaan, waardoor een zuiveringsschema kan worden gebruikt als er weinig of geen interactoren geïdentificeerd. Het is belangrijk op te merken dat andere GFP epitoop tagging benaderingen bestaan die op grote schaal GFP-eiwit laten labelen voor eiwit lokalisatie en zuivering studies 24,25. Deze omvatten de BAC TransgenOmics aanpak die bacteriële kunstmatige chromosomen gebruikt om GFP-tag genen van interesse te tonen uit hun eigen omgeving dat alle regulerende elementen, die nabootst endogene genexpressie 24 bevat. Recenter zijn CAS9 / single-geleide RNA (sgRNA) ribonucleoproteïne complexen (RNP&#39;s) gebruikt om eindeogenously taggen genen van belang met een split-GFP-systeem dat de expressie van GFP-gelabeld genen maakt het mogelijk uit hun endogene genomische loci 25. Hoewel beide benaderingen de expressie van endogene gemerkte eiwitten onder omstandigheden, in vergelijking met het LAP-tagging protocol beschreven staat, zij niet zorgen voor induceerbare en afstembare expressie van de genen van belang hebben. Daarnaast hebben ze nog worden toegepast tandem epitoop labelen voor TAP. Het is ook belangrijk op te merken dat andere tagging systemen ook kunnen worden gemodificeerd verenigbaar met de hier beschreven voor het genereren induceerbare epitoop-gemerkte stabiele cellijnen systeem te worden. Zo heeft nabijheid biotine afhankelijke identificatie (BioID) veel aandacht getrokken vanwege zijn vermogen om ruimtelijke en temporele relaties tussen interagerende eiwitten 26 definiëren. Deze techniek maakt gebruik van proteïnefusies een promiscue stam van de Escherichia coli biotineligase BirA, die biotinylerenTussen elk eiwit in een ~ 10 nm straal van het enzym. De gebiotinyleerde eiwitten worden vervolgens affiniteit gezuiverd onder toepassing van biotine-affiniteitsinvangmiddel en geanalyseerd op samenstelling door massaspectrometrie. BirA zal elk eiwit biotinyleren dicht, zelfs tijdelijk, waardoor het bijzonder geschikt voor het detecteren van zwakke interactie partners binnen een complex 27 maakt. Bovendien wordt de zuivering regeling niet noodzakelijk dat endogeen eiwit-eiwit interacties intact blijven en kan onder denaturerende omstandigheden worden uitgevoerd, waardoor het aantal valse meldingen verminderen. In onze huidige protocol, zou de substitutie van de pGLAP1 vector een vector BirA-tagging dit systeem transformeren van identificeren eiwit-eiwit interacties op basis van affiniteit voor het detecteren van hen op basis van de nabijheid. Een dergelijk systeem zou voordelig zijn voor het detecteren van voorbijgaande proteïne interacties zoals het geval tussen verschillende enzym-substraat interacties en voor het afbeelden van de spatiotemporele eiwit-eiwit interactions binnen gedefinieerde structuren heeft uit voor de centrosome en cilia 26,28 uitgevoerd.

Om de cellulaire functie van een niet-gekarakteriseerd eiwit te onderzoeken, is het belangrijk om zijn in vivo ruimte-tijdelijke subcellulaire lokalisatie en zijn interagerende eiwitpartners te bepalen. Traditioneel zijn enkele en tandem epitoop-tags gefuseerd met het N- of C-uiteinde van een eiwit van belang gebruikt om eiwitlokalisatie en eiwitinteractiestudies te vergemakkelijken. De tandem affinity purificatie (TAP) technologie heeft bijvoorbeeld de isolatie van native eiwitcomplexen mogelijk gemaakt, zelfs die welke in lage abundantie voorkomen, in zowel gist- als zoogdiercellijnen1,2. De lokalisatie en affinity purificatie (LAP) technologie is een recentere ontwikkeling die de TAP procedure aanpast om een lokalisatiecomponent op te nemen door de introductie van het groen fluorescerend eiwit (GFP) als een van de epitoop-tags3. Deze aanpak heeft onderzoekers een dieper inzicht gegeven in de subcellulaire lokalisatie van een eiwit in levende cellen, terwijl ook de mogelijkheid behouden is om TAP complex purificaties uit te voeren om eiwit-eiwit interactienetwerken in kaart te brengen.
Er zijn echter veel problemen geassocieerd met het gebruik van TAP/LAP technologieën die hun wijdverbreide toepassing in zoogdiercellen hebben belemmerd. De lengte van de tijd die nodig is om een stabiele cellijn te genereren die een TAP/LAP getagd eiwit van belang tot expressie brengt; wat meestal afhankelijk is van het klonen van het gen van belang in een viraal vector en het selecteren van stabiele integranten uit één cel met het gewenste expressieniveau. Bovendien zijn veel cellulaire paden gevoelig voor constitutieve eiwitoverexpressie (zelfs op lage niveaus) en kunnen cellen arresteren of celdood veroorzaken in de loop van de tijd, waardoor het onmogelijk wordt om een TAP/LAP stabiele cellijn te genereren. Deze en andere beperkingen hebben LAP/TAP methodologieën ervan weerhouden om hoogdoorvoersystemen te worden voor eiwitlokalisatie en eiwitcomplexelucidatie. Daarom is er aanzienlijke belangstelling geweest voor de ontwikkeling van een induceerbare hoogdoorvoer LAP-tagging systeem voor zoogdiercellen dat profiteert van huidige innovaties in kloning en cellijntechnologieën.
Hier presenteren we een protocol voor het genereren van stabiele cellijnen met Doxycycline/Tetracycline (Dox/Tet) induceerbare LAP-getagde eiwitten van belang dat toepassingen van zowel kloning als zoogdiercellijntechnologieën combineert. Deze aanpak stroomlijnt het verkrijgen van gegevens met betrekking tot LAP-getagde eiwit subcellulaire lokalisatie, eiwitcomplex purificatie en identificatie van interagerende eiwitten4. Hoewel affiniteitsproteomics een breed scala aan technieken gebruikt voor eiwitcomplexelucidatie5, is onze aanpak gunstig voor het versnellen van de identificatie van deze complexen en hun native interactienetwerken en is geschikt voor hoogdoorvoer eiwit-tagging die noodzakelijk is om complexe biologische paden te onderzoeken die een veelvoud van eiwitconstituenten bevatten. Sleutel tot deze aanpak zijn vooruitgang in kloningsstrategieën die hoge trouw en versnelde kloning van doelgenen mogelijk maken in een reeks vectoren voor genexpressie in vitro, in verschillende organismen zoals bacteriën en baculovirus, en in zoogdiercellen6,7. Bovendien heeft de ORFeome samenwerking duizenden sequentiegevalideerde open leesframes gekloond in vectoren die deze vooruitgang in kloning bevatten, die beschikbaar zijn voor de wetenschappelijke gemeenschap8-11. In ons systeem maakt de pGLAP1 LAP-tagging vector de gelijktijdige kloning van een groot aantal klonen mogelijk, wat hoogdoorvoer LAP-tagging vergemakkelijkt. Deze versnelde kloningsprocedure is gekoppeld aan een stroomlijnde aanpak voor het genereren van cellijnen met LAP-getagde genen van belang geïnserteerd op een enkel vooraf bepaald genomisch locus. Dit maakt gebruik van cellijnen die een enkele flippase herkenningsdoelwit (FRT) site binnen hun genoom bevatten, wat de plaats van integratie is voor LAP-getagde genen. Deze cellijnen drukken ook de tetracycline repressor (TetR) uit die bindt aan Tet operatoren (TetO2) stroomafwaarts van de LAP-getagde genen en hun expressie dempt in de afwezigheid van Dox/Tet. Dit maakt Dox/Tet induceerbare expressie van het LAP-getagde eiwit op elk gewenst moment mogelijk. Het hebben van de mogelijkheid tot induceerbare LAP-getagde eiwitexpressie is cruciaal, aangezien veel cellulaire paden gevoelig zijn voor de niveaus van kritische eiwitten die het pad regelen en celgroei kunnen arresteren of celdood kunnen veroorzaken wanneer deze eiwitten constitutief overgeëxpresseerd worden, zelfs op lage niveaus, waardoor het genereren van niet-induceerbare LAP-getagde stabiele cellijnen onmogelijk wordt12.

<table><tbody><tr><td>Flp-In T-REx Core Kit</td><td>Invitrogen</td><td>K6500-01</td><td>Kit voor het genereren van cellijnen die een FRT-site en TrtR-expressie bevatten</td></tr><tr><td>PETG, 5x</td><td>Nunc, Inc. </td><td>73520-734</td><td>Rollerfles voor het kweken van cellen</td></tr><tr><td>PETG, 2.5x</td><td>Nunc, Inc. </td><td>73520-420</td><td>Rollerfles voor het kweken van cellen</td></tr><tr><td>Cell stackers</td><td>Corning CellSTACK</td><td>3271</td><td>Cell stacker voor het kweken van cellen</td></tr><tr><td>500 ml kegelcentrifugebuizen</td><td>Corning </td><td>431123</td><td>Buizen voor het oogsten van cellen</td></tr><tr><td>Anti-GFP antilichaam</td><td>Invitrogen</td><td>A11122</td><td>Konijnen anti GFP antilichaam</td></tr><tr><td>Affiprep Protein A kralen</td><td>Biorad</td><td>156-0006</td><td>Gebruikt als een matrix voor het koppelen van anti-GFP antilichamen</td></tr><tr><td>Dimethylpimelimidate (DMP)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21667</td><td>Gebruikt voor het koppelen van anti-GFP antilichamen aan Protein A kralen</td></tr><tr><td>TLA100.3 buizen</td><td>Beckman</td><td>349622</td><td>Buizen voor het centrifugeren van eiwitlysaten tijdens de opruimstap</td></tr><tr><td>TEV protease</td><td>Invitrogen</td><td>12575-015</td><td>Gebruikt voor het afsnijden van het GFP-label van N-terminal LAP-gelabelde eiwitten</td></tr><tr><td>Precession Protease</td><td>GE Healthcare</td><td>27-0843-01</td><td>Gebruikt voor het afsnijden van het GFP-label van C-terminal LAP-gelabelde eiwitten</td></tr><tr><td>S-proteïne agarose</td><td>Novagen</td><td>69704</td><td>Gebruikt als een tweede affiniteitsmatrix tijdens de zuivering van LAP-gelabelde eiwitcomplexen</td></tr><tr><td>QIAquick DNA gel extractiekit</td><td>Qiagen</td><td>28704/28706</td><td>Voor gebruik bij het zuiveren van PCR-producten uit een agarosegel</td></tr><tr><td>BP clonase II</td><td>Invitrogen</td><td>11789020</td><td>Gebruikt voor het klonen van ORF PCR-producten in de pDONR221 shuttle vector</td></tr><tr><td>LR clonase II</td><td>Invitrogen</td><td>11791020</td><td>Gebruikt voor het klonen van de ORF van het gen van belang in de pGLAP LAP-tagging vector</td></tr><tr><td>ccdB Survival 2 T1R E. coli</td><td>Invitrogen</td><td>A10460</td><td>Gebruikt voor het propageren van shuttle vectoren en pGLAP lege vectoren</td></tr><tr><td>Fugene 6</td><td>Promega</td><td>E2691</td><td>Transfectie reagens voor het transfecteren van vectoren in menselijke cellen</td></tr><tr><td>Tetracycline</td><td>Invitrogen</td><td>Q100-19</td><td>Geneesmiddel voor het induceren van Dox/Tet induceerbare eiwitexpressie&nbsp;</td></tr><tr><td>Doxycycline</td><td>Clontech</td><td>631311</td><td>Geneesmiddel voor het induceren van Dox/Tet induceerbare eiwitexpressie&nbsp;</td></tr><tr><td>Hygromycin B</td><td>Invitrogen</td><td>10687010</td><td>Geneesmiddel voor het selecteren van stabiele LAP-gelabelde integranten</td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Corning</td><td>61-176-RG</td><td>Geneesmiddel voor het selecteren van Kanamycin-resistente bacteriekolonies</td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Fisher</td><td>BP1760-5</td><td>Geneesmiddel voor het selecteren van Ampicilline-resistente bacteriekolonies</td></tr><tr><td>4-20% Tris Glycine SDS-PAGE gels</td><td>Biorad</td><td>4561094</td><td>Gebruikt voor het scheiden van eiwitmonsters en uiteindelijke LAP-tag zuivering eluaten</td></tr><tr><td>Silver Stain Plus Kit</td><td>Biorad</td><td>1610449</td><td>Gebruikt voor het zilverkleuren van de eluaten van LAP-gelabelde zuiveringen en monsters verzameld tijdens het zuiveringsproces&nbsp;</td></tr><tr><td>Coomassie Blue kleurstof</td><td>Invitrogen</td><td>LC6060</td><td>Gebruikt voor het kleuren van SDS-PAGE gels om LAP-gelabelde zuiveringen te visualiseren en om proteïnebanden uit te snijden, geschikt voor massaspectrometrie</td></tr><tr><td>Shuttle vector pDONR221</td><td>Invitrogen</td><td>12536017</td><td>Shuttle vector voor het klonen van de ORF's van genen van belang</td></tr><tr><td>Flippase expresserende vector pOG44</td><td>Invitrogen</td><td>V600520</td><td>Vector die de Flippase recombinase tot expressie brengt voor het integreren van LAP-gelabelde genen in het genoom van FRT-site bevattende cellijnen</td></tr><tr><td>Platinum Taq DNA Polymerase</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10966018</td><td>Gebruikt voor PCR-amplificatie van de ORF's van genen van belang</td></tr><tr><td>4x Laemmli monster buffer</td><td>Biorad</td><td>1610747</td><td>Monster buffer voor het elueren van gezuiverde LAP-gelabelde eiwitcomplexen uit de kralenmatrix</td></tr><tr><td>Luria bouillon (LB) media</td><td>Fisher</td><td>BP9723-2</td><td>Gebruikt voor het kweken van DH5α bacteriën</td></tr><tr><td>DNA miniprep kit</td><td>Promega</td><td>A1222</td><td>Gebruikt voor het maken van DNA plasmid minipreps</td></tr><tr><td>DMEM/F12 media</td><td>Hyclone</td><td>SH30023.01</td><td>Voor het kweken van Hek293 menselijke cellen</td></tr><tr><td>FBS zonder Tet</td><td>Altanta Biologicals</td><td>S10350</td><td>Gebruikt voor het maken van -Tet DMEM/F12 media voor het genereren en kweken van induceerbare LAP-gelabelde stabiele cellijnen</td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Hyclone</td><td>SH30042.01</td><td>Voor het verwijderen van Hek293 cel foci uit platen</td></tr><tr><td>Protease inhibitor tablets</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td>Gebruikt voor het maken van protocol buffers, EDTA-vrij</td></tr><tr><td>10% nonyl fenoxypolyethoxyleethanol&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11332473001</td><td>Gebruikt voor het maken van protocol buffers</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-CM</td><td>Gebruikt voor het maken van protocol buffers</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher</td><td>BP337-500</td><td>Gebruikt voor het maken van protocol buffers</td></tr><tr><td>Natriumboraat</td><td>Fisher</td><td>S249-500</td><td>Gebruikt voor het maken van protocol buffers</td></tr><tr><td>Boorzuur</td><td>Fisher</td><td>A78-500</td><td>Gebruikt voor het maken van protocol buffers</td></tr><tr><td>Ethanolamine</td><td>Calbiochem</td><td>34115</td><td>Gebruikt voor het maken van protocol buffers</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>

induceerbare-lap tag stabiele cellijnen voor het onderzoeken van eiwitfunctie, spatiotemporal localization en protein interaction networks

Inducible LAP-tagged Stable Cell Lines for Investigating Protein Function, Spatiotemporal Localization and Protein Interaction Networks

Multi-eiwitcomplexen, in plaats van enkele eiwitten die afzonderlijk werken, bepalen vaak moleculaire routes die cellulaire homeostase reguleren. Gebaseerd op dit principe heeft de zuivering van cruciale eiwitten die nodig zijn voor het functioneren van deze routes, samen met hun native interacterende partners, niet alleen de kaartlegging van de eiwitconstituenten van deze routes mogelijk gemaakt, maar ook een dieper begrip geboden van hoe deze eiwitten coördineren om deze routes te reguleren. In deze context kan het begrijpen van de ruimtelijk-tijdelijke lokalisatie van een eiwit en zijn netwerk van eiwit-eiwitinteracties helpen bij het definiëren van zijn rol binnen een route, evenals hoe de verkeerde regulering hiervan kan leiden tot ziekte-ontstaan. Om aan deze behoefte te voldoen, zijn verschillende benaderingen voor eiwitzuivering zoals tandem affiniteitszuivering (TAP) en lokalisatie en affiniteitszuivering (LAP) ontworpen en succesvol gebruikt. Niettemin, om deze benaderingen toe te passen op proteomische analyses op pad-schaal, moeten deze strategieën worden aangevuld met moderne technologische ontwikkelingen in het klonen en genereren van stabiele cellijnen van zoogdieren. Hier beschrijven we een methode voor het genereren van LAP-gelabelde menselijke inductibele stabiele cellijnen voor het onderzoeken van subcellulaire lokalisatie van eiwitten en netwerken van eiwit-eiwitinteracties. Deze benadering is met succes toegepast op de dissectie van meerdere cellulaire routes, inclusief celdeling, en is compatibel met hoogdoorvoerige proteomische analyses.

Om de bruikbaarheid van dit systeem te benadrukken, het open leeskader (ORF) van de Tau microtubuli bindende eiwit werd gekloneerd in de shuttle vector door het amplificeren Tau ORF met primers die attB1 en attB2 sites (Tabel 1) en incuberen van de PCR-producten met de shuttlevector en een recombinase dat de insertie van de PCR- producten bemiddelt in de shuttle vector. De reactieproducten werden gebruikt voor DH5a bacteriën 13 en plasmide-DNA transformeren van kanamycine resistente kolonies werd gesequenced Tau worden aangebracht. Een sequentie gevalideerde shuttle-tau vector werd vervolgens gebruikt om de Tau ORF zetten in de pGLAP1 vector, die Tau in frame gefuseerd met het LAP (EGFP-TEV-S-eiwit) tag door incuberen van de shuttle-Tau vector met pGLAP1 vector en het recombinase dat de overdracht van de ORF van de shuttlevector te pGLAP1 medieert. De reactieproducten werden gebruikt voor het transformeren van DH5a bacteriën13 en plasmide DNA van ampicilline resistente kolonies werd de sequentie bepaald om te garanderen dat de LAP-Tau-fusie was in frame. Sequentie gevalideerde pGLAP1-LAP-tau werd daarna gecotransfecteerd met een vector die de flippase recombinatie enzym in HEK293 cellen die één flippase herkenning target (FRT) plaats in hun genoom, die de plaats van integratie voor LAP hebben genen die tot expressie 14. Deze cellijn was ook van TetR die aan tet-operators bindt stroomopwaarts van het LAP hebben genen en stiltes hun expressie in de afwezigheid van Tet / Dox. Stabiele integranten werden geselecteerd -Tet DMEM / F12 medium met 100 ug / ml hygromycine gedurende 5 dagen. Individuele Hygromycine resistente cel foci werden geoogst door toevoeging van 20 ul trypsine geplaatst en op en neer pipetteren 2 maal. De cellen werden in een plaat met 24 putjes geplaatst en uitgebreid door voortdurende groei in -Tet DMEM / F12 media. Om te controleren of de Hygromycine resistente cels konden tot expressie LAP-Tau, werden HEK293 LAP-Tau cellen geïnduceerd met 0,1 ug / ml Dox gedurende 15 uur en proteïne extracten werden bereid uit niet-geïnduceerde en geïnduceerde cellen Dox. Deze extracten werden gescheiden door SDS-PAGE, overgebracht naar een PVDF membraan en aan immunoblotting voor GFP en tubuline als ladingcontrole. Zoals blijkt uit figuur 4A, LAP-Tau (zichtbaar gemaakt met anti-GFP antilichamen) voldeden werd enkel in aanwezigheid van Dox. Te valideren dat LAP-tau goed was gelokaliseerd aan de mitotische microtubuli spindle tijdens mitose, zoals eerder aangetoond voor endogene Tau 18 werden HEK293 LAP-Tau cellen geïnduceerd met 0,1 ug / ml Dox 15 uur en de cellen werden gefixeerd met 4% paraformaldehyde en co-gekleurd voor DNA (Hoechst 33342) en microtubuli (anti-tubuline antilichamen). Consequent werd LAP-Tau gelokaliseerd in het mitotische spindle tijdens metafase van mitose (figuur 4B). Om te controleren of LAP-Tau en de interactie eiwitten kunnen worden gezuiverd met dit system, HEK293 LAP-Tau-cellen werden gekweekt in rolflessen tot ~ 70% confluentie, geïnduceerd met 0,1 ug / ml Dox gedurende 15 uur, door roeren geoogst, gelyseerd met LAP300 buffer, en LAP-tau werd gezuiverd met behulp van het bovenstaande protocol. Eluaten van de LAP-Tau zuivering werden gescheiden door SDS-PAGE en de gel werd met zilver gekleurd. Figuur 4C toont het LAP-Tau zuivering, gemarkeerd met een asterisk is LAP-Tau en diverse andere bands indicatief Tau interactie eiwitten kunnen worden gezien. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/54870/54870fig1.jpg" /> Figuur 1: Overzicht van de generatie-LAP hebben induceerbare stabiele cellijnen voor een eiwit van interesse. Het open leeskader (ORF) van genen van belang worden geamplificeerd met attB1 en attB2 locaties aan weerszijden van de 5 &#39;en 3&#39; uiteinde sequenties, respectievelijk (primer sequenties worden in Tabel 1) en gekloneerd in<html> de shuttle vector. De sequentie geverifieerd shuttlevectoren met het gen van belang worden vervolgens gebruikt om het gen van belang dragen in de pGLAP1 vector. De sequentie geverifieerd pGLAP1 vector met het gen van belang dan gecotransfecteerd met de vector die het flippase recombinase in de gewenste cellijn die één flippase herkenning target (FRT) plaats in hun genoom, die de plaats van integratie LAP bevat gemerkte genen. Deze cellijnen ook drukken de Tet-repressor (TetR), die bindt aan tet-operators (TetO 2) stroomopwaarts van het LAP hebben genen en stiltes hun expressie in de afwezigheid van Tet / Dox. De LAP-tag gen van belang wordt vervolgens gerecombineerd in de FRT-plaats en stabiele integranten worden geselecteerd met hygromycine. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54870/54870fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <html> 2 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54870 / 54870fig2.jpg &quot;/&gt; Figuur 2: Overzicht van de aanvragen voor-LAP tag stabiele cellijnen. -LAP hebben induceerbare stabiele cellijnen worden geïnduceerd om de LAP-gemerkt eiwit plaats door Dox toevoeging expressie brengen en kunnen worden gesynchroniseerd in verschillende stadia van de celcyclus of kunnen worden gestimuleerd met chemicaliën of liganden elke gewenste signaalroute activeren. De subcellulaire lokalisatie van het LAP-gemerkt eiwit van belang kan worden geanalyseerd door levende cel of vaste cell imaging. LAP-gemerkte eiwitten kunnen ook tandem affiniteit gezuiverd en hun interagerende eiwitten kunnen worden geïdentificeerd door middel van vloeistofchromatografie tandem massaspectrometrie (LC-MS / MS). Tenslotte kan Cytoscape worden gebruikt om een ​​eiwit-eiwit interactie netwerk van het aas eiwit te genereren. Dox geeft Doxycycline, IP geeft immunoprecipitaat, EGFP geeft verbeterde groen fluorescerend eiwit, Tev geeft TEV protease-splitsingsplaats, en S geeft S-tag.http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54870/54870fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken. <img alt="figuur 3" src="/files/ftp_upload/54870/54870fig3.jpg" /> Figuur 3: Overzicht van LAP tag Protein Expression, zuivering en voorbereiding voor massaspectrometrie. Het protocol heeft 9 stappen: 1) de groei en inductie van LAP-gemerkt eiwit-expressie, 2) verzamelen van cellen en lysis, 3) de bereiding van lysaten, 4) de binding van lysaten anti-GFP beads, 5) TEV protease klieving van het GFP-tag, 6) de binding van lysaten naar S-eiwit kralen, 7) het uitwassen van het aas eiwit en interactie eiwitten en 8-9) de voorbereiding van de monsters voor de massa-spectrometrie gebaseerde proteomics analyses. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54870/54870fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> </p&gt; <img alt="figuur 4" src="/files/ftp_upload/54870/54870fig4.jpg" /> Figuur 4: Controle van de LAP-Tau expressie. (A) Western blot (WB) analyse van eiwit monsters van niet-geïnduceerde en Dox geïnduceerde LAP-Tau HEK293 cellen afgetast met anti-GFP en anti-tubuline antilichamen tegen het LAP hebben tau-eiwit en de tubuline laadcontrole sporen, respectievelijk. Merk op dat LAP-Tau wordt alleen tot uitdrukking wanneer de cellen worden geïnduceerd met Dox. (B) mitotische cellen die LAP-Tau werden gefixeerd en gekleurd voor co-DNA (Hoechst 33342) en Tubuline (bad) met anti-tubuline antilichamen en de subcellulaire lokalisatie van LAP-tau werd geanalyseerd door fluorescentie microkopie. Merk op dat LAP-Tau lokaliseert aan de mitotische spindle en spindle polen tijdens de mitose. (C) zilver gekleurde gel van het LAP-Tau zuivering. MW geeft moleculair gewicht, CL geeft ontruimd lysaten en E indicates uiteindelijke eluaten. Monsters werden op een 4-20% SDS-PAGE en de gel werd met zilver gekleurd om de gezuiverde eiwitten te visualiseren. Merk op dat een band die overeenkomt met LAP-Tau wordt gemarkeerd met een asterisk en diverse andere bands die overeenkomt met co-zuiveren van eiwitten kunnen worden gezien. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54870/54870fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> N-terminale fusie </td><td></td></tr><tr><td> vooruit </td><td> 5&#39;GGGGACAAGT TTGTACAAAAAAGCAGGCT TCATG - (&gt; 18gsn) -3 &#39; </td></tr><tr><td> Omgekeerde </td><td> 5&#39;GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT T TTATCA - (&gt; 18gsn) -3 &#39; </td></tr><tr><td> C-terminale fusie </td><td></td></tr><tr><td> vooruit </td><td> 5&#39;GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT TCACC - (&gt; 18gsn) -3 &#39; </td></tr><tr><td> Omgekeerde </td><td> 5&#39;GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT G - (&gt; 18gsn) -3 &#39; </td></tr></tbody></table> Tabel 1: Vooruit en achteruit primers voor het versterken ORF&#39;s of Interest voor het inbrengen in de Shuttle Vector. De attB locaties zijn vetgedrukt letters, GSN geeft aan dat meer dan 18 gen-specifieke nucleotiden worden toegevoegd aan de primer. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2"> Stap </td><td> Temperatuur </td><td> Tijd </td></tr><tr><td colspan="2"> initiële denaturatie </td><td> 94 ° C </td><td> 2 min </td></tr><tr><td rowspan="3"> PCR amplificatiecycli (35) </td><td> denatureren </td><td> 94 ° C </td><td> 30 sec </td></tr><tr><td> temperen </td><td> 55 ° C (afhankelijk van de primer Tm) </td><td> 30 sec </td></tr><tr><td> Uitbreiden </td><td> 72 ° C </td><td> 1 min / kb </td></tr><tr><td colspan="2"> Greep </td><td> 4 ° C </td><td> onbepaalde tijd </td></tr></tbody></table> Tabel 2: PCR Voorwaarden voor versterking van de ORF&#39;s of Interest. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Vector </td><td> Forward Sequencing Primer </td><td> Reverse Sequencing Primer </td></tr><tr><td> shuttle Vector </td><td> 5&#39;-TGTAAAACGACGGCCAGT-3 &#39; </td><td> 5&#39;-CAGGAAACAGCTATGAC-3 &#39; </td></tr></tbody></table> Tabel 3: Forward en Reverse Sequencing Primers voor de Shuttle Vector. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> ID </td><td> Structuur </td><td> ouderlijk </td><td> promotor </td><td> Bac Res </td><td> Mam Res </td><td> Tet reg? </td></tr><tr><td> pGLAP1 </td><td> N-term EGFP-TEV-S peptide </td><td> pcDNA5 / FRT / TO </td><td> CMV </td><td> amp </td><td> Hyg </td><td> Ja </td></tr><tr><td> pGLAP2 </td><td> N-term vlag-TEV-S peptide </td><td> pcDNA5 / FRT / TO </td><td> CMV </td><td> amp </td><td> Hyg </td><td> Ja </td></tr><tr><td> pGLAP3 </td><td> N-term EGFP-TEV-S peptide; C-term V5 </td><td> pEF5 / FRT-V5 </td><td> EF1a </td><td> amp </td><td> Hyg </td><td> Nee </td></tr><tr><td> pGLAP4 </td><td> N-term vlag-TEV-S peptide; ; C-term V5 </td><td> pEF5 / FRT-V5 </td><td> EF1a </td><td&gt; Amp </td><td> Hyg </td><td> Nee </td></tr><tr><td> pGLAP5 </td><td> C-term S peptide-PreProt x2-EGFP </td><td> pEF5 / FRT-V5 </td><td> EF1a </td><td> amp </td><td> Hyg </td><td> Nee </td></tr></tbody></table> Tabel 4: Lijst van beschikbare LAP / TAP vectoren met Variable Promotors, Epitoop-labels en Dox Induceerbare Expression Mogelijkheden voor N of C-terminale Protein Tagging. Vectoren zijn commercieel verkrijgbaar. Bac Res geeft aan bacteriële resistentie marker, Mam Res geeft zoogdiercellijnen weerstand marker, Tet reg? geeft aan of de expressie is Tet / Dox regelbaar. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Vector </td><td> Forward Sequencing Primer </td><td> Reverse Sequencing Primer </td></tr><tr><td> pGLAP1 </td><td> 5&#39;-ATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAG-3 &#39; </td><td> 5&#39;-TGGCTGGCAACTAGAAGGCACAGTCGAGGC-3 &#39; </td></tr><tr><td> pGLAP2 </td><td> 5&#39;-CGAACGCCAGCACATGGACAGGG-3 &#39; </td><td> 5&#39;-TGGCTGGCAACTAGAAGGCACAGTCGAGGC-3 &#39; </td></tr><tr><td> pGLAP3 </td><td> 5&#39;-AGAAACCGCTGCTGCTAA-3 &#39; </td><td> 5&#39;-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3 &#39; </td></tr><tr><td> pGLAP4 </td><td> 5&#39;-AGACCCAAGCTGGCTAGGTAAGC-3 &#39; </td><td> 5&#39;-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3 &#39; </td></tr><tr><td> pGLAP5 </td><td> 5&#39;-CGTAATACGACTCACTATAG-3 &#39; </td><td> 5&#39;-TCCAGGGTCAAGGAAGGCACGG-3 &#39; </td></tr></tbody></table> Tabel 5: Forward en Reverse Sequencing Primers voor pGLAP vectoren.

We beschrijven een methode voor het genereren van lokalisatie- en affiniteitszuivering (LAP)-getagde inductible stabiele cellijnen voor het onderzoeken van eiwitfunctie, ruimtelijk-tijdelijke subcellulaire lokalisatie en eiwit-eiwit interactie netwerken.

Induceerbare-LAP tag stabiele cellijnen voor het onderzoeken van eiwitfunctie, Spatiotemporal Localization en Protein Interaction Networks

Multi-protein complexes, rather than single proteins acting in isolation, often govern molecular pathways regulating cellular homeostasis. Based on this ...

Het algemene doel van deze procedure is om induceerbare lokalisatie en affiniteitszuivering, of LAP-gelabelde stabiele cellijnen, te genereren voor het onderzoeken van eiwitfunctie, ruimtelijk-tijdelijke lokalisatie en eiwitinteractienetwerken. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in moleculaire en celbiologie met betrekking tot eiwitfunctie, eiwitsub-nul lokalisatie in de celcyclus en eiwitinteracties. Het belangrijkste voordeel van deze methode is dat het geschikt is voor hoogdoorvoeranalyse van groepen eiwitten en kan worden gebruikt om de eiwitcomponenten van biologische paden te ontcijferen.Om deze procedure te beginnen, kloneren we het open leesraam van het gen van belang in de LAP-gelabelde vector en transfecteren het in HEK293-cellen zoals beschreven in het tekstprotocol. Een dag na transfectie vervangen we het minus Tet DMEM/F12-medium door vers medium. Twee dagen na transfectie verdelen we de cellen tot 25% confluency.Laat de cellen ongeveer vijf uur hechten. Voeg vervolgens hygromycine-bevattend minus Tet DMEM/F12-medium toe in de vooraf bepaalde concentratie. Voor HEK293-cellen gebruiken we 100 microgram per milliliter hygromycine.Vervang het medium indien nodig totdat er duidelijke cellijnen verschijnen die lijken op ondoorzichtige vlekken tegen de transparante plaat. Voeg 20 microliter trypsine toe bovenop elke cellijn en pipet het twee keer omhoog en omlaag met een 200 microliter pipettepunt. Breng de cellen over in een 24-wellsplaat en breid de cellen uit door continu groei in hygromycine-bevattend minus Tet DMEM/F12-medium.Breid de gevalideerde LAP-gelabelde cellijn uit voor tandem affiniteitszuivering, of TAP, isolatie van eiwitcomplexen. Om dit te doen, passageer alle HEK293-cellen continu in grotere platen en/of rollerflessen en minus Tet DMEM/F12-medium bij 37 graden Celsius en vijf procent koolstofdioxide. Voor Tet/Dox-induceerbare cellijnen, induceer de cellen gedurende 10 tot 15 uur door een concentratie van 0,2 microgram per milliliter Tet/Dox toe te voegen wanneer de cellen ongeveer 70% confluency bereiken.Verzamel de cellen door agitatie of trypsinisatie. Bepaal ze vervolgens bij 875 keer g gedurende vijf tot tien minuten. Om het anti-GFP-antilichaam aan proteïne A-kralen te koppelen, breng 160 microliter gepakt volume proteïne A-kralen in evenwicht met PBST in een 1,5 milliliter buisje.Was de kralen drie keer met 1 milliliter PBST. Na elke wasstap gedurende deze procedure, worden de kralen gecentrifugeerd bij 5000 keer g gedurende 10 seconden, en het supernatant wordt verwijderd. Nadat de kralen opnieuw zijn opgehangen in 500 microliter PBST, voeg je 80 microgram snel gezuiverd anti-GFP-antilichaam toe aan elke buis, die 160 microliter kralen bevat.Meng gedurende een uur bij kamertemperatuur. Was de kralen twee keer met één milliliter PBST, en was de kralen vervolgens twee keer met één milliliter 0,2 molair natriumboraat, pH Na de laatste wasstap, voeg je 900 microliter van de natriumboraatbuffer toe om het uiteindelijke volume op één milliliter te brengen. Voeg vervolgens 100 microliter 220 molair DMP toe aan de kralensuspensie, voor een uiteindelijke concentratie van 20 millimolair.Roteer de buisjes voorzichtig gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Na incubatie met DMP, was je de kralen een keer met één milliliter 0,2 molair ethanolamine, 0,2 molair natriumchloride pH 8,5, om de resterende crosslinker te inactiveren. Breng vervolgens de kralen opnieuw op in één milliliter van dezelfde buffer, en roteer gedurende één uur bij kamertemperatuur.Na het pelletten van de kralen, breng je ze opnieuw op in een aanvullende 500 microliter van de buffer. De bereide kralen zijn stabiel gedurende verschillende maanden bij vier graden Celsius. Om de cellysaten te bereiden, breng je 500 microliter gepakt celvolume opnieuw op in 2,5 milliliter LAP 300, met 0,5 millimolair DTT en proteaseremmers.Voeg 90 microliter 10%nonyl fenoxypolyethoxylethanol toe en meng door omkeren. Plaats het mengsel gedurende 10 minuten op ijs. Centrifugeer bij 21.000 keer g gedurende 10 minuten.Na centrifugatie, verzamel je dit laagsnelheidssupernatant en bewaar een 10 microliter monster voor gelanalyse. Na overbrenging van het laagsnelheidssupernatant naar een TLA 100.3-buis, centrifugeer je bij 100.000 keer g gedurende één uur bij vier graden Celsius. Verzamel dit hoogsnelheidssupernatant in een buis en plaats het op ijs, waarbij je een 10 microliter monster reserveert voor gelanalyse.Voor de eerste affiniteitsvangst door binding aan anti-GFP-kralen, pre-eluteer je de antilichaam-gekoppelde kralen door ze drie keer te wassen met één milliliter elutiebuffer om de ongekoppelde antilichamen te verwijderen en achtergrond te verminderen. Voer dit snel uit. Laat de kralen niet langdurig in hoog zout staan.Was vervolgens de kralen drie keer met één milliliter LAP 200 N. Meng vervolgens de hoogsnelheidssupernatantextract met antilichaamkralen gedurende één uur bij vier graden Celsius. Na centrifugatie van het extract bij 21.000 keer g gedurende 10 minuten, bewaar je een 10 microliter monster van het supernatant voor gelanalyse. Voer drie snelle wasbeurten uit van de kralen met één milliliter LAP 200 N, dat 0,5 millimolair DTT en proteaseremmers bevat.Gebruik dezelfde buffer om de kralen twee keer extra te wassen met een incubatietijd van vijf minuten voor elke wasbeurt. Was vervolgens de kralen snel nog twee keer met 1 milliliter LAP 200 N dat 0,5 millimolair DTT bevat en geen proteaseremmers, voordat je het Tobacco Etch Virus, of TEV, protease toevoegt. Voeg 10 microgram van het TEV-protease toe in één milliliter LAP 200 N aan de kralen, en roteer de buisjes gedur

inducible-lap-tagged-stable-cell-lines-for-investigating-protein

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

This video describes the proximity ligation assay to study in situ protein-protein interactions in nematode cells. The close proximity of the proteins of interest generates the circular DNA template with the help of a PLA probe attached to a secondary antibody. The probe is further amplified using the amplification solution, which produces a long single-stranded DNA followed by the hybridization of the detector probe, enabling the localization of protein-protein interactions in cells.

Proximity Ligation Assay to Study In Situ Protein-Protein Interactions

We beschrijven een live-cell imaging methode die inzicht geeft in eiwitdynamica tijdens de T-cel activatie proces. We tonen de totale gebruiksduur van de T-cel verspreiding assay, confocale microscopie en beeldanalyse te geven kwantitatieve resultaten volgen signalering complexvorming in T-cel activatie.

Real-time Live beeldvorming van T-cel signaleringscomplex Vorming

SILAC immunoprecipitatie experimenten vormen een krachtig middel voor het ontdekken van nieuwe eiwit: eiwit interacties. Doordat de nauwkeurige relatieve kwantificering van eiwitgehalte in zowel controle monsters, waar interacties gemakkelijk kan worden onderscheiden van experimenteel verontreinigingen en lage affiniteit interacties bewaard door het gebruik van minder stringente buffer omstandigheden.

Identificatie van eiwit interacties Partners in zoogdiercellen behulp SILAC-immunoprecipitaties Kwantitatieve Proteomics

Intercellulaire kruispunten zijn benodigdheden voor stadiumspecifieke functies en ontwikkeling van de borstklier. Dit manuscript biedt een gedetailleerd protocol voor de studie van eiwit-eiwit interacties (PPI's) en co-lokalisatie met behulp van muizenklinieken. Deze technieken maken het mogelijk om de dynamiek van de fysieke associatie tussen intercellulaire kruispunten in verschillende ontwikkelingsstadia te onderzoeken.

Analyse van eiwit-eiwitinteracties en co-lokalisatie tussen componenten van kloof-, strakke- en adherentie-knooppunten in muizenmammarysklieren

Wij bieden een stapsgewijze protocol voor split-BioID, een eiwit fragmenten-complementatie test gebaseerd op de nabijheid-labeling techniek BioID. Geactiveerd op de interactie tussen twee bepaalde eiwitten, hierdoor de proteomics analyse van context-afhankelijke eiwitcomplexen in hun inheemse cellulaire omgeving. De methode is eenvoudig, kosteneffectief en vereist alleen gebruikelijke laboratoriumbenodigdheden.

Split-BioID — Proteoom analyse van Context-specifieke eiwitcomplexen in hun inheemse cellulaire omgeving

Hier, laten we zien hoe een nabijheid afbinding Assay (PLA) gebruiken om te visualiseren van MST1/MST2 heterodimerization in vaste cellen met hoge gevoeligheid.

Detectie van Heterodimerization van eiwit Isoforms met behulp van een in Situ nabijheid afbinding Assay

Cognate J-Domain eiwitten werken samen met de Hsp70 chaperonne om te helpen bij een groot aantal biologische processen, variërend van eiwit vouwen tot afbraak. Hier beschrijven we een in-situ proximity ligatie test, die het mogelijk maakt om deze transitieve gevormde chaperonne machinerie in bacteriële, gist en menselijke cellen te monitoren.

In situ monitoring van transitieve gevormde moleculaire Chaperone-assemblages in bacteriën, gist en menselijke cellen

Hier presenteren we een gewijzigd CLIP-seq protocol genaamd FbioCLIP-seq met FLAG-biotine tandem zuivering om de RNA doelen van RNA-bindende eiwitten (RBPs) in zoogdiercellen te bepalen.

Transcriptome-Wide Profilering van Protein-RNA Interacties door Cross-Linking en Immunoprecipitatie Gemedieerd door FLAG-Biotine Tandem Purification

Dit protocol beschrijft hoe celtypespecifieke eiwitetikettering kan worden uitgevoerd met azidonorleucine (ANL) met behulp van een muislijn die een mutant L274G-Methionine-tRNA-synthetase (MetRS*) tot expressie brengt en de noodzakelijke stappen voor gelabelde celtypespecifieke eiwitisolatie. We schetsen twee mogelijke ANL-toedieningsroutes bij levende muizen door (1) drinkwater en (2) intraperitoneale injecties.

Celtypespecifieke eiwitzuivering en identificatie van complexe weefsels met behulp van een mutante methionine-tRNA-synthetasemuislijn

Een kort protocol voor eiwitkleuring met Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels wordt beschreven zonder gebruik te maken van organische oplosmiddelen of azijnzuur als in de klassieke kleuren procedures met CBB.

Kleuring van eiwitten in Gels met Coomassie G-250 zonder organisch oplosmiddel en azijnzuur

Leer hoe je inducible LAP-tagged stabiele cellijnen genereert voor het bestuderen van eiwitfunctie, lokalisatie en interactienetwerken in HEK293-cellen. Deze methode maakt hoogdoorvoeranalyse van eiwitcomplexen mogelijk.

Induceerbare-LAP tag stabiele cellijnen voor het onderzoeken van eiwitfunctie, Spatiotemporal Localization en Protein Interaction Networks (Video) | JoVE Journal

Induceerbare-LAP tag stabiele cellijnen voor het onderzoeken van eiwitfunctie, Spatiotemporal Localization en Protein Interaction Networks

Meer video's verkennen