Gewijzigd MicroSecure Vitrificatie: Een veilige, eenvoudige en zeer effectieve cryopreservatie Procedure for Human Blastocysten

Het algemene doel van de MicroSecure embryo vitrificatiemethode is om een veilige, betrouwbare, eenvoudige maar effectieve aseptische gesloten vitrificatieprocedure voor menselijke embryo's te bieden. Deze methode is ontwikkeld om de kwaliteitscontrolevariabelen bij de vitrificatie van menselijke embryo's te minimaliseren, waardoor een betrouwbaar en reproduceerbaar succes wordt gegarandeerd. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het ernaar streeft technische variaties tussen biologen en laboratoria te elimineren.

Onze techniek is zo eenvoudig uit te voeren dat we vinden dat de grootste uitdaging voor onze stagiairs is om te leren pipetteren van embryo's zonder ze te verliezen. Het idee achter onze methode was om de behoefte aan gespecialiseerde apparaten te elimineren door twee veel gebruikte FDA-goedgekeurde items aan te passen. Een intern gelabelde ionomeren opslagbuis en een steriele flexipet.

Visuele demonstratie van deze techniek is uiterst nuttig omdat het de basistips benadrukt die zorgen voor een succesvolle toepassing. Plaats voor het begin van de procedure de steriele 0,3 ml zaadbuis op het teflonoppervlak van de elektrode van een eenvoudige tafelimpulssealer, net voor de plug, om een interne afdichting te creëren. Druk op de hendel om de warmte te activeren en laat de hendel los wanneer het rode licht is uitgeschakeld en een pieptoon wordt gehoord.

Duwt vervolgens de katoenen plug naar voren tegen de binnenste afdichting voordat u de setup voltooit. Voor cryo-dilutie en blastocyst-belasting van de monsters, verwijder de patiëntenkweekschaal uit de incubator en bevestig alle monsteridentificaties met een secundaire bron. Gebruik onder een stereomicroscoop een vitrificatie flexipet, ook wel vit tip genoemd, om de blastocysten in afzonderlijke houdendruppels in de bovenste rij van een overeenkomstige cryoschaal te verplaatsen.

Vul vervolgens de flexipet vooraf met 3 microliter V1-oplossing en doseer de helft van de inhoud op de eerste embryo. Aspireer het embryo en breng het over naar de eerste V1 wasdruppel. Pipetteer vervolgens het embryo twee tot drie keer rond de omtrek van de druppel en veeg de resterende pipetteninhoud buiten de druppel op het oppervlak van de schaal.

Verplaats vervolgens de blastocyst naar een individuele V1 houdendruppel en preload de vit tip met de volgende V2 oplossing voordat u de extra embryo's pipetteert met een nieuwe vit tip. Na het wassen van alle blastocysten in de V2 en V3 druppels zoals net gedemonstreerd, veeg de resterende oplossing en bubbels van de vit tip buiten de V3 houdendruppel en vul de tip volledig met schone V3 oplossing van rond het eerste embryo. Spuit ongeveer 1 microliter van het volume weg en aspireer de blastocyst en de resterende V3 oplossing volledig in de vit tip.

Verwijder nu de tip van de pipet en gebruik een steriele gaasdoek om de resterende V3 oplossing van de buitenoppervlakte van de vit tip te drogen. Het drogen van het buitenoppervlak van de tip is cruciaal en brengt geen extra risico op embryoverlies met zich mee. Steek vervolgens het tipuiteinde eerst in de open kant van de vooraf afgesloten buis en draai de buis om, labeleinde naar beneden.

Observeer de tip bij de binnenste plug. Laat een luchtrui van 1 cm op het open uiteinde en verzegel het vervolgens veilig. Wanneer alle buizen zijn afgesloten, dompel ze direct in vloeibare stikstof in een roestvrijstalen dewar fles en bewaar de buizen in de open kelk bevestigd aan de patiëntencane.

Plaats voor cryo-oplossing elutie en verdunning de overeenkomstige zes wel verdunningschaal in het midden van een stereomicroscoopplatform en een 60 mm petrischaal met een sucrose verwarmingsbad van 37 graden Celsius aan een zijde van de microscoop. Isoleer vervolgens de buis die moet worden verwarmd en houd de bovenste buisverbinding boven het vloeistofniveau om de identiteit van het monster te bevestigen. Gebruik mayo schaar om de buis onder de interne plug vast te zetten, om de vit tip ondergedompeld in de vloeibare stikstof te houden.

Tik stevig met de schaar tegen de dewar fles om de tip los te maken van de binnenste buiswand als kwaliteitscontrolemaatregel en til de buis in de omgevingslucht in een horizontale oriëntatie naast of onder het stereoscoopoppervlak. Grijp het niet-gelabelde uiteinde van de buis, snijd de buis bij de binnenste plug. Til vervolgens de buis boven de verwarmingsbadschaal en giet de vit tip in het bad onder een hoek van 60 graden, totdat de tip volledig is uitgedrukt.

De basis van de flexipet moet boven de wand van de schaal rusten. Na 5 tot 10 seconden, breng de basis van de pipet in een microcap pipetteerapparaat. Start een timer van vijf minuten.

Terwijl u de microscoop bekijkt, gebruikt u een wijsvinger om het bulbgat te bedekken en knijpt u zachtjes in de bulb om de gevitrificeerd blastocyst uit de vit tip in de T1 was te laten vrijkomen. Na het bevestigen van de vrijlating van de blastocyst, veegt u de resterende V3 oplossing en bubbels weg door middel van positieve druk, waarbij u de inhoud in het midden van een ongebruikte wegwerpschaal evacueert. Breng de vit tip over op een sterber pipet en verplaats het embryo in de tweede T1 druppel onder olie gedurende de resterende vier minuten.

Gedurende de incubatie, vult u de flexipet vooraf met de volgende oplossing en verdunt u de blastocyst in de T2, 3 en 4 druppels met intervallen van drie minuten. Eindelijk, brengt u de blastocysten in evenwicht in de T5 druppel gedurende vijf minuten op een oppervlak van 37 graden Celsius, voordat u ze terugbrengt naar de incubator. Het Gemodificeerde Gardner Blastocyst Grading System beschouwt volledige blastocysten als die met minder dan 10% herniatie van de trofectoderm cellen, terwijl blastocysten met maximaal 50% herniatie worden geclassificeerd als geëxpandeerd.

Blastocysten die meer dan 50% herniatie vertonen, worden beschouwd als het uitkomen. Met behulp van de gedemonstreerde cryo-bewarings- en opwarmmethoden, zijn consistent hoge niveaus van levendgeborenen per cyclusstart bere