Name: Histologische kwantificering van chronische hartinfarct bij ratten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Leer histologische kwantificering van myocardinfarct bij ratten met systematische bemonstering en beeldanalyse. Deze methode beoordeelt infarctgrootte en linkerventrikelremodellering voor cardiaal onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De studie werd ondersteund door de Swiss National Foundation [SNF 310030-149986 naar MNG], de Universiteit van Fribourg en het ziekenhuis van Fribourg.

Alle dieren kregen humane zorg in overeenstemming met het Europees Verdrag voor de Animal Care. Chirurgische ingrepen werden uitgevoerd in overeenstemming met de Zwitserse wet Animal Protection na het verkrijgen van toestemming van de Staat Veterinair Bureau, Fribourg, door het Zwitserse Federaal Veterinair Bureau, Zwitserland goedgekeurd. 1. Heart Oogsten LET OP: Alle chirurgische ingrepen werden uitgevoerd onder isofluraananesthesie. De inspanningen werden gedaan om het lijden van dieren te verminderen. In het bijzonder kregen alle dieren een subcutane injectie van 0,1 mg / kg buprenorfine pre-anesthesie. De chirurgische protocol voor het induceren myocardinfarct eerder elders 13 beschreven. <ol><li> Voer een sternotomie op een myocardially infarct dier onder narcose (geïntubeerd dier, 2,5% isofluraan, goede anesthesie bevestigd door poot snuifje reflex). <ol><li> Open het dier door het snijden van de huid en de spierenmet chirurgische schaar. Snij de ribben aan de linker- en rechterzijde, en verwijder vervolgens de borst. </li><li> Verwijder de verklevingen resteert na de eerdere operatie (LAD ligatie). Snijd de aorta en verwijder het hart. Doe het materiaal in 1 M KCl (in PBS), en vervolgens wassen met PBS. </li></ol></li></ol> 2. Tissue Voorbereiding <ol><li> Zet het infarct hart in de lengte in een acryl rattehart matrix. Bewaren bij -20 ° C gedurende 1 uur. </li><li> Snijd het hart direct in de matrix met behulp van een scheermesje met een transversale. Zorg ervoor dat elk segment is 2 mm dik. Snij ongeveer 5-7 dia&#39;s voor elk hart (op basis van de verbouwing-niveau); dit heet een systematische bemonstering. </li><li> Bij deze stap het uitvoeren van de 2,3,5-trifenyltetrazoliumchloride (TTC) kleuring optioneel (houd de oriëntatie van de hartcoupes base-to-apex). <ol><li> Incubeer in 1% TTC in PBS gedurende 50 minuten bij 37 ° C. Incubeer in 4% paraformaldehyde (PFA) gedurende 20 min tot 1 uur. Leg de secties between twee glasplaten met een 2-mm spacers en foto&#39;s maken met een stereologische microscoop in combinatie met een camera op 15X vergroting. VOORZICHTIGHEID! Paraformaldehyde is giftig. </li></ol></li><li> Slide bevriezing (1e optie) <ol><li> Plaats elke dia in een plastic mold (10 x 10 x 5 mm) met montage medium voor Cryotomie (optimale snijtemperatuur OCT), handhaven de oriëntatie (plaats de apex gerichte zijde van het gedeelte neer op de bodem van de vorm). Bevriezing van de blokken met 2-methylbutaan dampen onder vloeibare stikstof koeling gedurende 10 - 15 min. Tenslotte worden opgeslagen weefsel bij -80 ° C. </li></ol></li><li> Paraffinization (2e optie) <ol><li> Plaats elke dia in inbedden cassettes (handhaven van de oriëntatie door het plaatsen van de top-georiënteerde zijde van het gedeelte neer op de bodem van de cassette) en in 4% PFA gedurende 24 uur. Zet het in een tissue processor machine &#39;s nachts. <ol><li> Incubeer in ethanol 70% voor 2 uur. Incubate in Ethanol 95% voor 2 uur. Incubeer in ethanol 100% voor 3 uur. Incubeer in xyleen gedurende 4 uur. Incubeer in paraffine (gesmolten bij 60 ° C in een oven) gedurende 5 uur. Tot slot, zorg blokken door het inbedden van elk hart dia in paraffine. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Masson-Goldner trichroomkleuring <ol><li> Voeg weefselsecties uit paraffineblokken met een handmatige microtoom (dikte: 5 pm) of oktober blokken met een cryostaat ingesteld op -18 ° C (dikte: 7 urn). </li><li> Vlek één dia uit elk hart gedeelte voor elke rat (3-4 transversale secties per slide) met Masson-Goldner trichroomkleuring (zie bijlage). LET OP: Start van deze stap voor de paraffine secties. <ol><li> Smelt de objectglaasjes bij 60 ° C in een oven. Onder een zuurkast, deparaffinize ze in xyleen tweemaal gedurende 10 min elk. Rehydrateren ze in 100% ethanol, 95% ethanol, 70% ethanol en gedestilleerd water gedurende 3 min elk. LET OP: Start van deze stap voor de cryosecties. </li><li> Ze op te lossen in Bouin oplossing &#39;s nachts. Dan, spoel ze onder stromend leidingwater gedurende 10 - 15 min. Spoel ze in gedestilleerd water. Incubeer ze in hematoxyline Mayer voor 3 minuten. </li><li> Verwijder de dia&#39;s en laat ze in gedestilleerd water gedurende 5 minuten. Dan, incubeer ze in zuur fuchsine-Ponceau gedurende 5 min. Spoel ze in 1% azijnzuur gedurende 1 min. </li><li> Vervolgens incubeer ze in fosfomolybdeenzuur Orange G gedurende 1 min. Spoel ze in 1% azijnzuur gedurende 1 min, incubeer ze in licht groene kleurstof gedurende 10 min en spoel ze in 1% azijnzuur gedurende 1 min. </li><li> Dehydrateren ze in 70% ethanol (30 seconden), 95% ethanol (30 sec), en 100% ethanol (5 min). Doe een druppel van een harsachtige montage medium op het weefsel secties, bedek ze met dekglaasjes, en laat ze drogen. </li></ol></li></ol> 4. infarctgrootte Analyse <ol><li> Verwerven één beeld uit elke dia een stereomicroscoop (vergroting 15X) gekoppeld met een camera. Fotografeer een liniaal met dezelfde instellings. </li><li> Met beeldanalyse software om het litteken dikte in het midden van het infarct, het septum dikte, de linker ventrikel (LV) holte gebied, het infarctgebied en het weefselgebied LV behulp meten. <ol><li> Zet de schaal met de liniaal afbeelding (Figuur 1A). <ol><li> Klik op Metingen selecteer vervolgens Set Conversion Factor. Trek een lijn op de kalibratie bar. Klik met de rechtermuisknop op de foto en klik op End kalibratie. Let op de bar waarde, en klik op OK. </li></ol></li><li> Selecteer de LV van de gebrandschilderde hart afbeelding (Figuur 1B). Gebruik het hulpprogramma Meerdere segment. Selecteer de LV point-by-point, en dan klik met de rechtermuisknop Copy / Paste overal. </li><li> Meet het litteken en het septum dikte met behulp van de enkel segment meetinstrument (figuur 1C </strong&gt;). </li><li> Detecteert automatisch de LV holte, infarct, en LV gebieden met behulp van de automatische gebied meetinstrument in de RGB-modus (figuur 1D). <ol><li> Klik op het gereedschap. Activeer Alleen Borders en Aaneengesloten in de RGB-modus. Ten slotte, klikt u in het gebied van belang om het te ontdekken. Gebruik indien nodig precisie-instrumenten. </li></ol></li></ol></li><li> Bereken de infarctgrootte als de verhouding van de infarct zone van de LV gebied. </li><li> Bereken de expansie-index als volgt: [LV holte gebied / LV hele gebied] / [infarct dikte / septum dikte], met het hele gebied met inbegrip van LV zowel de LV holte en LV weefsel gebieden. </li><li> Bereken tenslotte een &quot;gemiddelde&quot; voor elk hart als volgt: [gemiddelde van de expansie-index van het infarct dia&#39;s] * [Aantal infarct slides / Totaal aantal dia&#39;s]. </li></ol>

<ol><li>Amsterdam, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AHA%2FACC+Guideline+for+the+Management+of+Patients+with+Non-ST-Elevation+Acute+Coronary+Syndromes%3A+a+report+of+the+American+College+of+Cardiology%2FAmerican+Heart+Association+Task+Force+on+Practice+Guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Coll+Cardiol%22%5BJournal%5D)">AHA/ACC Guideline for the Management of Patients with Non-ST-Elevation Acute Coronary Syndromes: a report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Practice Guidelines.</a> J Am Coll Cardiol. 64, e139-e228 (2014).</li>
<li>Konstam, M. A., Kramer, D. G., Patel, A. R., Maron, M. S., Udelson, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Left+ventricular+remodeling+in+heart+failure%3A+current+concepts+in+clinical+significance+and+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22JACC+Cardiovasc+Imaging%22%5BJournal%5D)">Left ventricular remodeling in heart failure: current concepts in clinical significance and assessment.</a> JACC Cardiovasc Imaging. 4, 98-108 (2011).</li>
<li>Frobert, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+Value+of+Troponin+I+for+Infarct+Size+to+Improve+Preclinical+Myocardial+Infarction+Small+Animal+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">Prognostic Value of Troponin I for Infarct Size to Improve Preclinical Myocardial Infarction Small Animal Models.</a> Front Physiol. 6, 353(2015).</li>
<li>Redfors, B., Shao, Y., Omerovic, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+infarct+size+and+area+at+risk+assessment+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Clin+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Myocardial infarct size and area at risk assessment in mice.</a> Exp Clin Cardiol. 17, 268-272 (2012).</li>
<li>Guex, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma-functionalized+electrospun+matrix+for+biograft+development+and+cardiac+function+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Plasma-functionalized electrospun matrix for biograft development and cardiac function stabilization.</a> Acta Biomater. 10, 2996-3006 (2014).</li>
<li>Landa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+injectable+alginate+implant+on+cardiac+remodeling+and+function+after+recent+and+old+infarcts+in+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Effect of injectable alginate implant on cardiac remodeling and function after recent and old infarcts in rat.</a> Circulation. 117, 1388-1396 (2008).</li>
<li>Valente, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+heart+sampling+and+systematic+evaluation+of+cardiac+therapies+inmouse+models+of+ischemic+injury%3A+Assessment+of+cardiacremodeling+and+semi-automated+quantification+of+myocardial+infarctsize%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Mouse+Biol%22%5BJournal%5D)">Optimized heart sampling and systematic evaluation of cardiac therapies inmouse models of ischemic injury: Assessment of cardiacremodeling and semi-automated quantification of myocardial infarctsize.</a> Curr. Protoc. Mouse Biol. 5, 359-391 (2015).</li>
<li>Csonka, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+myocardial+infarct+size+in+preclinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Toxicol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Measurement of myocardial infarct size in preclinical studies.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 61, 163-170 (2010).</li>
<li>Zornoff, L. A., Paiva, S. A., Minicucci, M. F., Spadaro, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+myocardium+infarction+in+rats%3A+Analysis+of+the+model%5BTitle%5D)+AND+%22Arq.+Bras+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Experimental myocardium infarction in rats: Analysis of the model.</a> Arq. Bras Cardiol. 93, 434-440 (2009).</li>
<li>Lichtenauer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+infarct+size+measurement+using+geometric+angle+calculation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Myocardial infarct size measurement using geometric angle calculation.</a> Eur J Clin Invest. 44, 160-167 (2014).</li>
<li>Lutgens, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+myocardial+infarction+in+the+mouse%3A+cardiac+structural+and+functional+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Chronic myocardial infarction in the mouse: cardiac structural and functional changes.</a> Cardiovasc Res. 41, 586-593 (1999).</li>
<li>Frobert, A., Valentin, J., Cook, S., Lopes-Vicente, L., Giraud, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-based+therapy+for+heart+failure+in+rat%3A+double+thoracotomy+for+myocardial+infarction+and+epicardial+implantation+of+cells+and+biomatrix%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Cell-based therapy for heart failure in rat: double thoracotomy for myocardial infarction and epicardial implantation of cells and biomatrix.</a> J Vis Exp. , e51390(2014).</li>
<li>Takagawa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+infarct+size+measurement+in+the+mouse+chronic+infarction+model%3A+comparison+of+area-+and+length-based+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol+%281985%29%22%5BJournal%5D)">Myocardial infarct size measurement in the mouse chronic infarction model: comparison of area- and length-based approaches.</a> J Appl Physiol (1985). 102, 2104-2111 (2007).</li>
<li>Fishbein, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+phase+acute+myocardial+infarct+size+quantification%3A+validation+of+the+triphenyl+tetrazolium+chloride+tissue+enzyme+staining+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Am+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Early phase acute myocardial infarct size quantification: validation of the triphenyl tetrazolium chloride tissue enzyme staining technique.</a> Am Heart J. 101, 593-600 (1981).</li>
<li>Weisman, H. F., Bush, D. E., Mannisi, J. A., Weisfeldt, M. L., Healy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+mechanisms+of+myocardial+infarct+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Cellular mechanisms of myocardial infarct expansion.</a> Circulation. 78, 186-201 (1988).</li>
<li>Mannisi, J. A., Weisman, H. F., Bush, D. E., Dudeck, P., Healy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steroid+administration+after+myocardial+infarction+promotes+early+infarct+expansion.+A+study+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Steroid administration after myocardial infarction promotes early infarct expansion. A study in the rat.</a> J Clin Invest. 79, 1431-1439 (1987).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Kritische stappen in het protocol Fibrotisch weefsel kan nauwkeurig worden bepaald in een chronische MI rat model met behulp van een systematische bemonstering van de geoogste hart en het imago analyses van trichromatische-gekleurde histologische secties verkregen van basis tot apex. Twee stappen zijn vooral van belang voor een succesvolle implementatie protocol. Ten eerste, het gebruik van KCl voor hart oogsten kan de hartspier in een ontspannen toestand worden gehandhaafd....

Myocardinfarct (MI) is een belangrijke oorzaak van overlijden en invaliditeit wereldwijd. Coronaire hartziekten is de belangrijkste oorzaak; MI het gevolg is van ischemie opeenvolgende coronaire gebeurtenissen, zoals occlusie. Wanneer reperfusie niet binnen de eerste 6 uur wordt uitgevoerd, ischemie veroorzaakt onomkeerbare myocardiale necrose. Bij patiënten, de karakterisering van MI berust op verschillende diagnostische instrumenten, met inbegrip van de klinische symptomen, elektrocardiografie, evaluatie van de plasma niveaus van biomarkers, echocardiografie, MRI, en histologische analyses 1. Acute en chronische MI worden als twee verschillende fasen van de schade van het tijdstip van de myocardiale necrose in verhouding tot de tijd van de coronaire occlusie. De acute fase die gedurende de eerste 7 dagen, wordt het verloren gaan van cardiomyocyten, uitgebreide ontsteking en de rekrutering van fibroblasten. De sub-acute fase, gekenmerkt door de genezing van hartweefsel en de vorming van een litteken, treedttussen 1 en 4 - 6 weken. Uitbreiding van het infarct, ventrikel wand dunner, en ventrikel dilatatie karakteriseren de chronische fase. Uitgebreide herinrichting van de linker hartkamer geleidelijk leidt tot ernstig hartfalen 2. MI geïnduceerd door permanente linker anterior afdalende arterie (LAD) geeft ligatie standaard knaagdiermodel van chronische myocardiaal infarct. De coronaire ligatuur bootst de coronaire occlusie. De grootte van het infarct afhankelijk van de plaats van de ligatuur. Karakterisering van ischemische verwonding in een knaagdier model is klassiek uitgevoerd met behulp van biomarker plasma niveaus, zoals troponine I en T 3, echocardiografie, MRI en histologie 4,5. Biomarker niveaus zijn gecorreleerd met de mate van cardiomyocyten dood. Echocardiografie beoordeelt de linker ventrikel functie impairment die door de regionale wandbeweging afwijkingen. Bovendien, niet-invasieve beeldvormingstechnieken, zoals MRI of hoge resolutieechocardiografie, laat de beoordeling van de vermindering van de wandbeweging, het volume van het litteken met verminderde perfusie en levensvatbaar myocardium en de wandverdunning. LV bouwvorm maken een nauwkeurige beoordeling van infarctgrootte. Tenslotte kan de kwantificering van levensvatbare en dode myocardium worden uitgevoerd postmortem gebruikmaking van specifieke vlekken van histologische secties van geoogste hart en maakt controle van de infarctgrootte (IS). Een ander belangrijk kenmerk is de evaluatie van het infarct expansie-index (EI) 6. De EI wordt geassocieerd met de transmurale infarct en begint binnen de eerste 3 dagen. De EI wordt gekenmerkt door een geleidelijke vermindering van de wanddikte, een verhoging van de LV holtegrootte, en veranderingen in LV vorm. Om de therapeutische werkzaamheid van nieuwe behandelingen te evalueren - in het bijzonder, de regeneratieve strategieën op basis van cellen, matrices en genafgifte-nauwkeurige vaststelling van de MI bij knaagdieren is van het allergrootste belang.Gemeten over een dwarsdoorsnede verkrijgen op de papillaire spier niveau, kan de grootte is vertekend door de grote variabiliteit in infarct ontwikkeling bestaat na LAD ligatie; de apex infarct kan dan worden afgedekt. Belangrijk is dat nauwkeuriger methodologieën bepaald MI maat beschreven voor muizen of ratten 7-9 10. Toch is onvoldoende is om nauwkeurig te kwantificeren LV remodeling of therapeutisch geïnduceerde reducties (of ziektes te voorkomen) van de verbouwing. Inderdaad, wordt gewoonlijk uitgedrukt als percentage van de totale LV volume beoordeeld op dwarsdoorsneden van het hart. Hoewel deze methode geldt voor acuut MI, het dunner worden van de LV wand optreedt tijdens verbouwing blijft onder geëvalueerd 11,12. Een volledige morfometrische kwantificatie van infarctgrootte en structurele veranderingen moeten verschillende parameters, zoals endocardiale en epicardiale lengtes en diameters, en infarct en gezonde gebieden te kwantificeren. We beschrijven een methodologisch ca.oach om nauwkeurig te beoordelen MI en verbouwing in een chronische rat model.

<table><tbody><tr><td>Acrylic rat heart matrix 2 mm</td><td>72-5015</td><td>Harvard Apparaat</td><td></td></tr><tr><td>Inspira advanced volume controlled ventilator</td><td>Harvard Apparatus</td><td>557058</td><td></td></tr><tr><td>Catheter Insyte 14 G</td><td>BD</td><td>381267</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T</td><td>BDHA361603E</td><td>VWR</td><td></td></tr><tr><td>TTC</td><td>T8877-10G</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Mayer hematoxyline</td><td>MHS32-1L</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Acid Fuchsin CI 42685</td><td>F8129-50G</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau Xylidin CI 16150</td><td>P2395-25G</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Orange G CI 16230</td><td>O3756-100G</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Light green CI 42095</td><td>L5382-25G</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>P9333-500G</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Xylol</td><td>10315083</td><td>HoneyWell</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol absoluut</td><td>10303990</td><td>HoneyWell</td><td></td></tr><tr><td>2-methylbutaan</td><td>M32631-1L</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Stereogische microscoop</td><td>SM2800</td><td>Nikon</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>99340</td><td>Reactolab</td><td></td></tr><tr><td>Inbeddingscassette</td><td>K113.1</td><td>Carl Roth</td><td></td></tr><tr><td>Bersoft Image meting software</td><td></td><td>Bersoft.com</td><td>Gelicentieerde software</td></tr></tbody></table>

histologische kwantificering van chronische hartinfarct bij ratten

Histological Quantification of Chronic Myocardial Infarct in Rats

Myocardinfarct wordt gedefinieerd als dood van cardiomyocyten als gevolg van langdurige ischemie; een ontstekingsreactie en littekenvorming (fibrose) volgen op de ischemische verwonding. Na de initiële acute fase wijzigt chronisch remodelleren van de linkerventrikel (LV) de structuur en functie van het hart. Permanente coronaire ligatie bij kleine dieren is veel gebruikt als referentiemodel voor een chronisch model van MI. Het verdunnen van de infarcteerde wand ontwikkelt zich progressief tot transmurale fibrose. Histologische beoordeling van infarctgrootte wordt vaak uitgevoerd; niettemin ontbreekt een standaardisatie van de methoden voor kwantificering. Inderdaad worden belangrijke methodologische aspecten, zoals het aantal geanalyseerde secties en de bemonsterings- en kwantificeringsmethoden, meestal niet beschreven en sluiten daarom vergelijking tussen onderzoeken uit. Te vaak wordt kwantificering uitgevoerd op een enkele sectie verkregen op het niveau van de papillaire spieren. Omdat nieuwe strategieën gericht op het verminderen van infarctexpansie en remodellering onder onderzoek staan, is er een belangrijke behoefte aan standaardisatie van nauwkeurige hartbemonsteringsprotocollen. We beschrijven een nauwkeurige methode om de infarctgrootte te kwantificeren met behulp van een systematische bemonstering van geoogst hart van ratten en beeldanalyses van trichroom gekleurde histologische secties verkregen van basis tot apex. We leveren ook bewijs dat het berekenen van de expansie-index (EI) toeliet voor infarctgrootte beoordeling, rekening houdend met veranderingen van de linkerventrikel gedurende het remodelleren.

Zes weken na de LAD ligatie werden geoogst harten van Lewis ratten. 2-mm coupes werden verkregen uit de top naar de basis. Een TTC kleuring procedure werd uitgevoerd om de infarct zone, die in wit wordt weergegeven, en de gezonde myocardium, die rood weergegeven (figuur 2) te visualiseren. Afhankelijk van de plaats van ligatie van de LAD, de infarctgrootte varieert. Voor grote MI, werden transmurale infarcten waargenomen vanuit apex tot basis (Figuur 2A).</strong...

De post-mortem beoordeling van myocardinfarct (MI) bij knaagdieren is gebaseerd op kwantificering van het infarct op gekleurde hartsecties. We beschrijven een nauwkeurige methode om de infarctgrootte te kwantificeren door systematische bemonstering van geoogste rattenharten van basis tot apex en beeldanalyse van trichrome-gekleurde histologische secties.

Histologische kwantificering van chronische hartinfarct bij ratten

Myocardial infarction is defined as cardiomyocyte death due to prolonged ischemia; an inflammatory response and scar formation (fibrosis) follow the ...

Het algemene doel van deze histologische procedure is het uitvoeren van een morfometrische kwantificering van de infarctexpansie-index en structurele hartparameters met gebruik van een ratmodel voor myocardinfarct, om zo de infarctgrootte en de remodellering van de linker ventrikel te beoordelen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het cardiologische veld, zoals het effect van regeneratieve therapie na een myocardinfarct of nieuwe strategieën die gericht zijn op het verminderen van de infarctexpansie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is het gebruik van systematische steekproeven van het geoogste rattenhart om de infarctgrootte nauwkeurig vast te stellen en rekening te houden met de veranderingen in de linker ventrikel gedurende de remodellering.Het volgen van deze methode kan inzicht bieden in de infarctgrootte in een chronisch ratmodel van myocardinfarct. Het kan ook worden toegepast op muizen of andere ischemische modellen, zoals acuut myocardinfarct of ischemie-reperfusie. Om deze procedure te starten, voert u een sternotomie uit bij een dier met een myocardinfarct onder anesthesie.Maak met een chirurgische schaar een incisie in de huid en de spieren langs het borstbeen. Knip vervolgens de ribben aan de linker- en rechterzijde door om de borstkas te verwijderen. Verwijder daarna de adhesies die zijn overgebleven na de LAD-ligatie.Snijd de aorta door en verwijder het hart, plaats het weefsel vervolgens gedurende minder dan één minuut in PBS met één molair kaliumchloride voordat het met PBS wordt gewassen. Om het weefsel te behouden, moet het PBS in de ventrikels voorzichtig worden verwijderd. Plaats het geïnfarceerde hart vervolgens op een acrylaatmatrix voor rattenharten en positioneer het longitudinaal.Bewaar het vervolgens één uur bij -20 °C. Voor systematische bemonstering na een uur wordt het hart direct in de matrix doorgesneden met een scheermesje. Zorg dat elke sectie twee millimeter dik is.Voer vervolgens TTC-kleuring uit door de coupes 15 minuten bij 37 °C te incuberen in 1% TTC, en incubeer ze daarna 20 tot 60 minuten bij kamertemperatuur in 4% PFA. Plaats de coupes daarna tussen twee glasplaten met spacers van twee millimeter en maak foto's met een stereomicroscoop gekoppeld aan een camera bij een 15x vergroting. Er werd een TTC-kleuringsprocedure uitgevoerd om het infarctgebied, dat wit verschijnt, en het gezonde myocardium, dat rood verschijnt, te visualiseren.Bij een groot myocardinfarct werden transmurale infarcten waargenomen van de apex tot de basis. Kleinere infarcten vertoonden wit infarctweefsel dat zichtbaar was van de apex tot het middengedeelte van het hart. Bij kleine, niet-transmurale infarcten werd fibrotisch weefsel waargenomen in slechts één of twee secties vanaf de apex.Om de secties te bevriezen, plaatst u elke sectie in een plastic mal met insluitmedium voor cryotomie en positioneert u de apex naar beneden in de mal. Bevries de blokken met 2-Methylbutaan-dampen onder koeling met vloeibare stikstof gedurende 10 tot 15 minuten. Bewaar de weefsels daarna bij min 80 °C.Voor de paraffinatie wordt elke sectie in een inbedcassette geplaatst met de punt naar beneden, waarna de cassettes 24 uur in 4% PFA worden bewaard. Plaats ze vervolgens gedurende de nacht in een weefselprocessor. Zodra de processing is voltooid, worden de blokjes gemaakt door elke hartsectie in paraffine in te bedden.In deze procedure worden met een handmatige microtoom weefselcoupes van 5 µm dikte bereid vanuit de paraffineblokken. Vervolgens wordt voor elke rat één slide van elke hartsectie gekleurd met Masson-Goldner trichroomkleuring. Voor de paraffinecoupes worden de weefsels gesmolten bij 60 °C in een oven.Deparaffiniseer de coupes onder een zuurkast tweemaal in xylol gedurende telkens tien minuten. Rehydrateer ze vervolgens in 100% ethanol, 95% ethanol, 70% ethanol en daarna in gedestilleerd water gedurende telkens drie minuten. Fixeer zowel de gedeparaffiniseerde coupes als de cryocoupes een nacht in Bouin-oplossing.Spoel ze de volgende ochtend 10 tot 15 minuten af onder stromend kraanwater en spoel ze vervolgens opnieuw af met gedestilleerd water. Fixatie met Bouin is de belangrijkste stap om een uitstekende Goldner-kleuring te garanderen. Incubeer ze gedurende drie minuten in Mayers hematoxylline.Verwijder na drie minuten de coupes en laat ze vijf minuten in gedestilleerd water rusten. Incubeer ze vervolgens vijf minuten in ponceau-zuurfuchsine voordat ze gedurende één minuut worden gespoeld met 1% azijnzuur. Incubeer de secties daarna één minuut in fosfomolybdeenzuur-oranje G en spoel ze vervolgens één minuut met 1% azijnzuur.Incubeer tien minuten in lichtgroene kleurstof en spoel vervolgens één minuut met 1% azijnzuur. Dehydrateer de coupes vervolgens opeenvolgend in 70% ethanol gedurende 30 seconden, 95% ethanol gedurende 30 seconden en 100% ethanol gedurende vijf minuten. Breng één druppel harsachtig montagemedium aan op de weefselcoupes, dek ze af met dekglasplaatjes en laat ze drogen.Neem in deze stap van elke dia één afbeelding op met een stereomicroscoop gekoppeld aan een camera bij een vergroting van 15x. Fotografeer een liniaal onder dezelfde instellingen. Er werden coupes van vijf micron dik gesneden van elke hartsnede en gekleurd met Masson-Goldner trichroom.Gezonde weefsels verschenen in het rood en het bindweefsel in het groen. Gebruik vervolgens de software voor beeldanalyse om de litteken dikte in het midden van het infarct, de septumdikte, het oppervlak van de linkerventrikelholte, het infarctoppervlak en het LV-weefseloppervlak te meten. Stel hiervoor de schaal in met de afbeelding van de liniaal.Klik op metingen en selecteer het instellen van de conversiefactor. Trek een lijn over de kalibratiebalk. Klik met de rechtermuisknop op de afbeelding en klik op kalibratie beëindigen.Noteer de balkwaarde en klik vervolgens op OK. Gebruik de tool voor meerdere segmenten om de LV punt voor punt te selecteren en klik daarna met de rechtermuisknop om deze ergens te kopiëren en plakken. Meet vervolgens de dikte van het litteken en het septum met de tool voor enkelvoudige segmentmeting. Detecteer daarna automatisch de LV-caviteit, het infarct en de LV-oppervlakken met de tool voor automatische oppervlaktemeting in RGB-modus.Activeer alleen 'borders' en 'contiguous' in de RGB-modus. Klik tot slot binnen het gebied van belang om dit te detecteren. Bereken daarna de infarctgrootte als de verhouding tussen het infarctgebied en het LV-gebied.Bereken vervolgens de expansie-index met behulp van deze formule. Bereken tot slot een gemiddelde voor elk hart met de getoonde formule. De expansie-index berekend op basis van Goldner-kleuring is een goede index om de ontwikkeling van het infarct te evalueren.Zoals in de figuur is weergegeven, correleert dit met de grootte van het infarct, uitgedrukt als percentage van de linker ventrikel, en met de ejectiefractie gemeten via echocardiografie. Op de grafieken zijn de lineaire regressie en de 95%betrouwbaarheidsintervallen weergegeven. De infarctexpansie-index werd berekend volgens de hier beschreven formule.Het totale LV-oppervlak werd gemeten als het gecombineerde oppervlak van de LV-caviteit en het LV-weefsel. Het percentage van het infarct werd berekend zoals weergegeven. De functie werd zes weken na de LAD-ligatie beoordeeld met behulp van hogeresolutie-echocardiografie.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een systematische bemonstering van het hart uitvoert en hoe u de infarctgrootte bepaalt op basis van een beeldanalyse van gekleurde coupes.

histological-quantification-of-chronic-myocardial-infarct-in-rats

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Tal van genetische manipulaties en / of intramyocardial injecties van genen, eiwitten, cellen en / of biomaterialen wordt toegevoegd aan de dimensie van de tijd in studies van de acute ischemie / reperfusie schade en chronische remodeling bij muizen. Deze video illustreert de microchirurgische procedures voor ischemie / reperfusie, permanent coronaire ligatie, en intramyocardial injectie studies.

Kransslagader Ligatie en Intramyocardial Injectie in een muizenmodel van Infarction

Dit protocol beschrijft varkens myocardiaal infarct (MI)-model met een 90 min gesloten borst coronaire ballon occlusie van de LAD (LAD), gevolgd door reperfusie. Bovendien is het protocol voor meerdere uitkomstparameters, zoals hartfunctie, hemodynamica, microvasculaire weerstand en infarctgrootte, worden ook gepresenteerd.

Myocardinfarct en Functional Outcome Assessment in Pigs

Een zeer reproduceerbaar model voor myocardinfarct bij muizen met minimale invasieve manipulaties wordt beschreven. Het model kan eenvoudig worden uitgevoerd, wat resulteert in een hoge reproduceerbaarheid en overlevingsgraad. Daarom zal het beschreven model het aantal benodigde dieren verminderen zoals gevraagd door het 3R-principe (Vervanging, Verfijning en Vermindering).

Minimaal invasieve chirurgische procedure voor het induceren van Myocardinfarct in Muizen

Deze methode beschrijft het gebruik van Quantum Micro-Computed Tomography (MicroCT) om de hartmorfologie, functie, perfusie, metabolisme en levensvatbaarheid te beoordelen met behulp van een gejodeerd contrastmiddel bij muizen met experimenteel geïnduceerde myocardischemie. De techniek kan worden toegepast voor niet-destructieve, longitudinale in vivo beeldvorming met hoge doorvoer van verschillende diermodellen van menselijke hartaandoeningen.

In vivo kwantitatieve beoordeling van myocard structuur, functie, perfusie en levensvatbaarheid Met behulp van Cardiac Micro-computertomografie

Betrouwbare en nauwkeurige uitkomst evaluatie is de sleutel voor de vertaling van preklinische therapieën in de klinische behandeling. De huidige paper beschrijft hoe drie klinisch relevante primaire uitkomstmaten van cardiale prestaties en de schade op te nemen in een varken acuut hartinfarct model.

Primaire Outcome Assessment in een Varken Model acuut myocardinfarct

Hier tonen we een protocol om te standaardiseren bemonsteringsprocedures van een gevestigde varkens model van acuut myocardinfarct teneinde haar translationeel waarde in de kennis van de pathofysiologie van myocardiale ischemie/reperfusie letsel en het testen van nieuwe drugkandidaten.

Verbetering van een gesloten borst varkens myocardiaal infarct Model door standaardisatie van weefsel en bloed bemonsteringsprocedures

Hierin beschrijven we een chirurgische ingreep die laat zien hoe u permanente ligatie van de linker-anterieure aflopende coronaire slagader bij muizen bereikt. Dit model is van groot belang om de pathofysiologie van myocardiaal infarct en de gelijktijdige biologische processen te onderzoeken.

Murine myocardinfarct model met behulp van permanente Ligatie van linker anterieure aflopende coronaire slagader

Onder adequate anesthesie werd het muizenhart geëxternaliseerd door de intercostale ruimte en werd een myocardinfarct met succes geïnduceerd door de linker voorste dalende slagader (LAD) af te binden met behulp van materialen die in de meeste laboratoria gemakkelijk verkrijgbaar zijn.

Een aangepaste eenvoudige methode voor het opwekken van een hartinfarct bij muizen

De huidige 2,3,5-Trifenyltetrazoliumchloride (TTC) test introduceert een verfijnd TTC-kleuringsprotocol dat de analyse van myocardletsel met microscopische resolutie mogelijk maakt, waardoor hoogwaardige beelden worden geproduceerd die een nauwkeurige en betrouwbare beoordeling van infarctgrootte en levensvatbaarheid van cardiomyocyten op cellulair niveau mogelijk maken.

Een microscopische 2,3,5-triphenyltetrazoliumchloride-assay voor nauwkeurige en betrouwbare analyse van myocardschade

De rat model van acuut myocard infarct (AMI) is nuttig om het gevolg van een MI op cardiale pathofysiologische en fysiologische functie te bestuderen.

Acuut myocardinfarct in ratten

Leer histologische kwantificering van myocardinfarct bij ratten met systematische bemonstering en beeldanalyse. Deze methode beoordeelt infarctgrootte en linkerventrikelremodellering voor cardiaal onderzoek.

Histologische kwantificering van chronische hartinfarct bij ratten

Meer video's verkennen