Name: Identificatie van vetzuren in Bacillus cereus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Leer vetzuren identificeren in bacteriën zonder zuivering met behulp van retentietijden en massaspectrometrie. Deze methode helpt onderzoekers bij het begrijpen van bacteriële adaptatie en taxonomie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Auteurs zijn dankbaar voor Thomas Mison voor zijn technische ondersteuning, en Rachel Kopec voor de herziening van het manuscript.

1. Bacteriële Culturen <ol><li> Bereid een grasveld van de bacterie (Bacillus cereus-stam ATCC 14579) door het verspreiden van een 100 pl overnachtkweek van de stam geïncubeerd bij 30 ° C in LB (Luria-Bertani medium), over het oppervlak van een plaat van LB-agarmedium. Incubeer de plaat overnacht bij 30 ° C. </li></ol> 2. ECL: Equivalent Chain Lengte <ol><li> Bereken ECL als volgt: <img alt="Vergelijking" src="/files/ftp_upload/54960/54960eq1.jpg" /> met: i, de opgeloste stof van belang; n het aantal koolstofatomen van de rechte keten verzadigd vetzuur methylester geëlueerd voordat opgeloste I; n + 1, het aantal koolstofatomen van de rechte keten verzadigd vetzuur methylester elueren na opgeloste I; Rti, Rtn, Rt (n + 1) de retentietijd FAME toppen boven beschreven. OPMERKING: Haal de retentietijd rechte keten verzadigde vetzuren methylesters door injectie van een mengsel van standaarden (BEEN MIJ). </li></ol> 3. FAME Voorbereiding en Analyse <ol><li> Om lipide vetzuren, oogst bacteriële cellen te verkrijgen door het afschrapen van kolonies van de agar plaat en de overdracht van 40 mg (vers gewicht, gelijk aan 10 9 levensvatbare cellen) van bacteriën in een 10 ml glazen buis met schroefdop en PTFE afdichtingen. </li><li> Voer transveresteringsreactie via de ester koppeling methode 14,15 hieronder beschreven. <ol><li> Voeg 5 ml 0,2 M KOH in methanol aan de verse bacteriële cellen en incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur. Deze reactie omvat alkalische methanolyse, het breken van de esterbinding in het lipide en het produceren van vetzuurmethylesters. </li><li> Voeg 1 ml van 1 M azijnzuur om de pH te verlagen tot 7,0. Controleer de pH met een pH-teststrips. </li><li> Voeg 3 ml hexaan te extraheren FAME. </li><li> Transfer supernatant (organische fase) naar schone buizen en geconcentreerd door verdampen bij kamertemperatuur onder een continue stikstofstroom tot ongeveer 200 pi vindenextract. Breng het monster in een GC flacon met insert. </li><li> Injecteren extracten in een gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS) systeem. </li></ol></li></ol> 4. GC / MS Voorwaarden <ol><li> Injecteer FAME monsters in een GC-MS instrument uitgerust met een capillaire kolom ZB-WAX (lengte 30 m, diameter 0,25 mm, filmdikte 0,25 pm). </li><li> Stel de injectiepoort (in splitless modus) temperatuur tot 250 ° C. Gebruik helium als draaggas, met een lineaire snelheid van 37 cm / sec. Houd de oventemperatuur bij 50 ° C gedurende 1 min, toenemen tot 190 ° C met een snelheid van 20 ° C / min, en verder toenemen tot een eindtemperatuur van 230 ° C met een snelheid van 2 ° C / min. </li><li> Voor de MS, noteer de massa spectra door electron ionisatie (EI) bij 70 eV, en stel de overname van de totale ionenstroom tussen de 50 en 400 atomaire massa eenheden (ame) (2 scans / sec). </li><li> Wanneer dat nodig is, te injecteren DMOX en picolinyl derivaten onder dezelfde omstandigheden, behalvet de oven temperatuurprogramma als volgt: DMOX: 50 ° C (1 min), 20 ° C / min tot 210 ° C en 2 ° C / min tot 240 ° C (5 min); Picolinyl: 6 ° C (1 min), 20 ° C / min tot 220 ° C en 2 ° C / min tot 250 ° C (20 min). </li></ol> 5. picolinyl Ester Bereiden uit FAME 16 <ol><li> Damp het FAME extract uit deel 3 met een stikstofstroom (ten minste 10 mg droog materiaal) en los op in 1 ml droge dichloormethaan. </li><li> Bereid een 1,0 M oplossing van kalium-ter-t-butoxide in tetrahydrofuran. </li><li> Voeg de FAME extract en 0,2 ml 3-pyridinemethanol tot 0,1 ml oplossing bereid in stap 5.2. </li><li> Verwarm de oplossing bij 40 ° C gedurende 30 min in een afgesloten buisje. </li><li> Na afkoelen tot kamertemperatuur, voeg gezuiverd gedeïoniseerd water (2 ml, zie Materialen tabel) en hexaan (4 ml). Meng met een vortex, laat fase te scheiden, en het verzamelen van de organische fase. </li><li> Dry door toevoeging van watervrij natriumsulfaat totdat de organische fase is volkomen duidelijk. Deze hoeveelheid in een schone buis. verdampen dan naar 200 ui. Breng het monster in een GC flacon met insert. </li></ol> 6. DMOX Bereiden uit FAME 17 <ol><li> Damp het FAME extract uit deel 3 met een stikstofstroom (ten minste 10 mg droog materiaal). </li><li> De FAME droge extract, voeg 250 mg 2-amino-2-methyl-1-propanol. Spoel het vat met stikstof, voeg een stopper, en plaats deze in een verwarmings-blok &#39;s nachts bij 190 ° C. </li><li> Na afkoelen tot kamertemperatuur, voeg 3 ml dichloormethaan aan de buis en 5 ml gezuiverd gedeïoniseerd water (zie tabel Materials). </li><li> Schud voor fasescheiding en verwijder de waterige fase. </li><li> Was de organische fase met 5 ml water. Schud voor fasescheiding en verwijder de waterige fase. </li><li> Drogen toevoeging watervrij natriumsulfaat totdat de organische fase volkomen helder endeze hoeveelheid in een schone buis. Verdamp onder een stikstofstroom, totdat de volume van 200 pl. Breng het monster in een GC flacon met insert. </li></ol>

<ol><li>Christie, W. W., Han, X. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChristie%2C+WW+%22Lipid+Analysis+4th+Edition%22">Lipid Analysis 4th Edition</a>. , Oily press. (2010).</li>
<li>HÜbschmann, H. -J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aH%C3%9Cbschmann%2C+H-J+%22Handbook+of+GC-MS%3A+fundamental+and+application.+Third+edition%22">Handbook of GC-MS: fundamental and application. Third edition</a>. , Wiley-vch. (2015).</li>
<li>Sasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Bacteria+by+Gas+Chromatography+of+Cellular+Fatty+Acids%5BTitle%5D)+AND+%22MIDI+Technical+note%22%5BJournal%5D)">Identification of Bacteria by Gas Chromatography of Cellular Fatty Acids.</a> MIDI Technical note. 101, 1-6 (1990).</li>
<li>Spitzer, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+analysis+of+fatty+acids+by+gas+chromatography+-+Low+resolution+electron+impact+mass+spectrometry+of+their+4%2C4-dimethyloxazoline+derivatives+-+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Structure analysis of fatty acids by gas chromatography - Low resolution electron impact mass spectrometry of their 4,4-dimethyloxazoline derivatives - A review.</a> Prog Lipid Res. 35 (4), 387-408 (1996).</li>
<li>Harvey, D. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHarvey%2C+DJ+%22Advances+in+lipid+methodology.+Volume+1%22">Advances in lipid methodology. Volume 1</a>. Christie, W. W. , Oily press. Dundee. 19-80 (1992).</li>
<li>Diomande, S. E., Nguyen-The, C., Guinebretière, M. -H., Broussolle, V., Brillard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+fatty+acids+in+Bacillus+environmental+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Role of fatty acids in Bacillus environmental adaptation.</a> Front Microbiol. 6, (2015).</li>
<li>Brillard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Bacillus+cereus+Genes+Specifically+Expressed+during+Growth+at+Low+Temperatures%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of Bacillus cereus Genes Specifically Expressed during Growth at Low Temperatures.</a> Appl Environ Microbiol. 76 (8), 2562-2573 (2010).</li>
<li>de Sarrau, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+Anaerobiosis+and+Low+Temperature+on+Bacillus+cereus+Growth%2C+Metabolism%2C+and+Membrane+Properties%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Influence of Anaerobiosis and Low Temperature on Bacillus cereus Growth, Metabolism, and Membrane Properties.</a> Appl Environ Microbiol. 78 (6), 1715-1723 (2012).</li>
<li>Diomandé, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+the+CasK%2FR+two-component+system+in+optimal+unsaturation+of+the+Bacillus+cereus+fatty+acids+during+low-temperature+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Food+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Involvement of the CasK/R two-component system in optimal unsaturation of the Bacillus cereus fatty acids during low-temperature growth.</a> Int J Food Microbiol. 213, 110-117 (2015).</li>
<li>Berkeley, R. C. W., Heyndrickx, M., Logan, N., De Vos, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBerkeley%2C+RCW+%22Applications+and+Systematics+of+Bacillus+and+Relatives%22">Applications and Systematics of Bacillus and Relatives</a>. Berkeley, R. C. W. , Blackwell Science Publ. 1-7 (2002).</li>
<li>Kämpfer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limits+and+Possibilities+of+Total+Fatty+Acid+Analysis+for+Classification+and+Identification+of+Bacillus+Species%5BTitle%5D)+AND+%22System.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Limits and Possibilities of Total Fatty Acid Analysis for Classification and Identification of Bacillus Species.</a> System. Appl. Microbiol. 17 (1), 86-98 (1994).</li>
<li>Kaneda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty-acids+of+genus+bacillus+-+example+of+branched-chain+preference%5BTitle%5D)+AND+%22Bacteriol+Rev%22%5BJournal%5D)">Fatty-acids of genus bacillus - example of branched-chain preference.</a> Bacteriol Rev. 41 (2), 391-418 (1977).</li>
<li>Chazarreta Cifre, L., Alemany, M., de Mendoza, D., Altabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+Biosynthesis+of+Unsaturated+Fatty+Acids+in+Bacillus+cereus+ATCC+14579+and+Functional+Characterization+of+Novel+Acyl-Lipid+Desaturases%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Exploring the Biosynthesis of Unsaturated Fatty Acids in Bacillus cereus ATCC 14579 and Functional Characterization of Novel Acyl-Lipid Desaturases.</a> Appl Environ Microbiol. 79 (20), 6271-6279 (2013).</li>
<li>Sasser, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Bacillus+anthracis+from+culture+using+gas+chromatographic+analysis+of+fatty+acid+methyl+esters%5BTitle%5D)+AND+%22J+AOAC+Int%22%5BJournal%5D)">Identification of Bacillus anthracis from culture using gas chromatographic analysis of fatty acid methyl esters.</a> J AOAC Int. 88 (1), 178-181 (2005).</li>
<li>Schutter, M. E., Dick, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+fatty+acid+methyl+ester+%28FAME%29+methods+for+characterizing+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Sci+Soc+Am+J%22%5BJournal%5D)">Comparison of fatty acid methyl ester (FAME) methods for characterizing microbial communities.</a> Soil Sci Soc Am J. 64 (5), 1659-1668 (2000).</li>
<li>Destaillats, F., Angers, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+methodology+for+the+synthesis+of+FA+picolinyl+esters+from+intact+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Oil+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">One-step methodology for the synthesis of FA picolinyl esters from intact lipids.</a> J Am Oil Chem Soc. 79 (3), 253-256 (2002).</li>
<li>Fay, L., Richli, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Location+of+double-bonds+in+polyunsaturated+fatty-acids+by+gas-chromatography+mass-spectrometry+after+4%2C4-dimethyloxazoline+derivatization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr%22%5BJournal%5D)">Location of double-bonds in polyunsaturated fatty-acids by gas-chromatography mass-spectrometry after 4,4-dimethyloxazoline derivatization.</a> J Chromatogr. 541 (1-2), 89-98 (1991).</li>
<li>Zhang, J. Y., Yu, Q. T., Liu, B. N., Huang, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+modification+in+mass+spectrometry+IV-2-alkenyl-4%2C4-dimethyloxazolines+as+derivatives+for+the+double+bond+location+of+long-chain+olefinic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Mass+Spect%22%5BJournal%5D)">Chemical modification in mass spectrometry IV-2-alkenyl-4,4-dimethyloxazolines as derivatives for the double bond location of long-chain olefinic acids.</a> Biol Mass Spect. 15 (1), 33-44 (1988).</li>
<li>de Sarrau, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unsaturated+fatty+acids+from+food+and+in+the+growth+medium+improve+growth+of+Bacillus+cereus+under+cold+and+anaerobic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Unsaturated fatty acids from food and in the growth medium improve growth of Bacillus cereus under cold and anaerobic conditions.</a> Food Microbiol. 36 (2), 113-122 (2013).</li>
<li>Miwa, T. K., Mikolajczak, K. L., Earle, F. R., Wolff, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gas+chromatographic+characterization+of+fatty+acids.Identification+constants+for+mono-+and+dicarboxylic+methyl+esters%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Gas chromatographic characterization of fatty acids.Identification constants for mono- and dicarboxylic methyl esters.</a> Anal Chem. 32 (13), 1739-1742 (1960).</li>
<li>van Den Dool, H., Kratz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generalization+of+the+retention+index+system+including+linear+temperature+programmed+gas-liquid+partition+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+A%22%5BJournal%5D)">A generalization of the retention index system including linear temperature programmed gas-liquid partition chromatography.</a> J Chromatogr A. 11, 463-471 (1963).</li>
<li>Stransky, K., Jursik, T., Vitek, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+equivalent+chain+length+values+of+monoenic+and+polyenic+%28methylene+interrupted%29+fatty+acids%5BTitle%5D)+AND+%22J+High+Res+Chromatogr%22%5BJournal%5D)">Standard equivalent chain length values of monoenic and polyenic (methylene interrupted) fatty acids.</a> J High Res Chromatogr. 20 (3), 143-158 (1997).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

De FA chromatogramprofielen getoond in Tabel 1 komen overeen met B. cereus ATCC 14579 gekweekt op een agarplaat oppervlak. Soortgelijke profielen werden verkregen wanneer de bacterie in beluchte vloeibare medium werd gekweekt bij dezelfde temperatuur 8. Voor bacteriën gekweekt in vloeibare media, is de bacteriële biomassa door centrifugeren van het kweekmedium en kan worden gewassen volgens de eerder beschreven protocollen afhankelijk van de groeiomstandigheden 8,19. De id...

Vetzure methylester (FAME) gaschromatografie (GC) is een belangrijke methode voor lipide karakterisering. Al snel scheidt en kwantificeert de verschillende vetzuren (FA) van een monster na een korte extractiestap. Derivaten van methylesters zijn zeer volatiel, stabiel en inert ten opzichte van de chromatografiekolom, waardoor pieken met staarten vermeden. Hun identificatie is vrij eenvoudig als het monster uit bekende FA omdat de chromatografische profielen ofwel gepubliceerd of in vergelijking met de normen. Bovendien wordt de herhaalde injectie van kalibratiestandaarden voor het kwantificeren van verschillende FA niet vereist, gezien hun nagenoeg constant reactie op vlamionisatiedetectie (FID) 1. Naast FID, massaspectrometrie (MS) detectie levert een reeks aanvullende informatie FAME bevestigen. Echter, wanneer FAME&#39;s worden opgeladen met behulp van electron ionisatie (EI), de resulterende spectra niet altijd mogelijk voor the identificatie van FA fijne structuur. Bijvoorbeeld, vertakking positie (dat wil zeggen een vertakte methylgroep) is moeilijk te voorspellen, omdat de diagnostische ionen zijn moeilijk op te sporen 1 en Karakteristiek doelion overvloed machine-afhankelijk, die het gebruik van massaspectra bibliotheken 2. Een andere uitdaging ligt in het identificeren van de dubbele binding positie, omdat EI veroorzaakt dubbele binding migratie. Zo kan FA isomeren met verschillende dubbele binding posities niet worden onderscheiden door hun massa spectra. Gelukkig zijn andere instrumenten ontwikkeld voor FA identificatie. Zo kan de aanwezigheid en de positie van vertakking of dubbele bindingen in FA worden gegist door berekening van de equivalente ketenlengte (ECL) 3. Derivatisering andere methoden resulteren in verschillende massaspectra, afhankelijk van de plaats van een dubbele binding of een vertakte methylgroep. 4,4-dimethyl oxazoline derivaten (DMOX) 4 zorgen voor EASy identificatie van de plaats van enkelvoudig onverzadigde vetzuren dubbele bindingen. 3-pyridylcarbinyl ester (picolinyl ester) derivaten zorgen voor de ondubbelzinnige identificatie van de locatie van methylvertakte FA 5. Combineren chromatografische (ECL) en massaspectra (DMOX en picolinyl) informatie kan bij de identificatie van de meeste FA zonder dat ingewikkelde zuiveringsmethoden gebruikt, zoals vereist voor kernspinresonantie (NMR) spectrum, het onbetwistbaar werkwijze voor structuurkarakterisering 1 . Bacteriën van het genus Bacillus, die een aantal menselijke en dierlijke pathogenen omvatten, kunnen zeer divers niches koloniseren en worden daarom op grote schaal in het milieu 6. Onder het geslacht Bacillus, wordt FA vorm beïnvloed door de ecologische niche van de diersoorten die modulaties in FA patronen aan te passen aan uiteenlopende omgevingsveranderingen (bijvoorbeeld groeimedium, temperatuur,pH, etc.) 7-9. Vanwege de relatieve homogeniteit van de FA patroon over species van het genus Bacillus tijdens de groei in gestandaardiseerde omstandigheden bepaling FA samenstelling is één van de belangrijkste criteria voor de Bacillus species definiëren. Een unieke eigenschap van de Bacillus genus is de overvloed van vertakte FA&#39;s met 12-17 koolstoffen 10-12 met de verhouding tussen iso en anteiso isomeren als een belangrijke determinant van de aanpassing aan de milieu-omstandigheden. Bacillus species tevens aan aan omgevingschommelingen door het veranderen van de hoeveelheid onverzadigde vetzuren. In sommige species, zoals Bacillus cereus, twee vetzuurdesaturasen maken dubbele bindingen in verschillende posities van de alkylketen 13 verschillende rollen in aanpassing 9. Het voorbeeld van de Bacillus genus illustreert het belang van de dubbele binding positie nauwkeurig identificeren en FA vertakking. Verzamelensluitend, de identificatie van Bacillus FA patronen heeft verschillende nuttige toepassingen. Hierin stellen we een nieuwe GC-MS benadering voor Bacillus FA patroonidentificatie dat de inherente beperkingen van een klassieke GC-MS analyse overwint. Deze innovatieve benadering kan direct worden gebruikt op ruw biologisch materiaal, en bestaat uit een combinatie van bestaande technieken: gegevens over retentietijden (ECL) en massaspectra van verschillende FA derivaten (FAME, DMOX en picolinyl-ester). We gebruiken de volgende FA nomenclatuur. i, een en n geven iso, anteiso methylgroep vertakt en onvertakt vetzuur, respectievelijk. Onverzadigde FA werden genoemd door C: d waarin C het aantal koolstofatomen in het vetzuur en d is het aantal dubbele bindingen. Δ x de positie van de dubbele binding, waarbij de dubbele binding zich op de xe koolstof-koolstofbinding, vanaf de carbonzuureindgroep.

<table><tbody><tr><td>GC/MS</td><td>Shimadzu</td><td>QP2010</td><td></td></tr><tr><td>capillary column ZB WAX</td><td>Phenomenex</td><td>7HG-G007-11</td><td>30 m x 0.25 mm x 0.25&nbsp;&micro;m</td></tr><tr><td>Methanol Lichrosolv</td><td>VWR</td><td>1.06018.2500</td><td></td></tr><tr><td>potassium hydroxide</td><td>Aldrich</td><td>P1767</td><td></td></tr><tr><td>THF</td><td>Hipersolv Chromanorm</td><td>28559.320</td><td></td></tr><tr><td>Dichloromethane</td><td>Hipersolv Chromanorm</td><td>23373.320</td><td></td></tr><tr><td>Hexane</td><td>Hipersolv Chromanorm</td><td>24575.320</td><td></td></tr><tr><td>3-pyridinemethanol</td><td>Aldrich</td><td>P6-680-7</td><td></td></tr><tr><td>potassium tertiobutoxide</td><td>Aldrich</td><td>156671</td><td></td></tr><tr><td>2-amino-2-methyl-1-propanol</td><td></td><td>A-9879</td><td></td></tr><tr><td>MilliQ Academic</td><td>Millipore</td><td>ZMQS50001</td><td></td></tr><tr><td>Bacterial Acid Methyl Ester (BAME) Mix</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47080-U Supelco</td><td></td></tr></tbody></table>

identificatie van vetzuren in<em&gt; bacillus cereus</em

Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus

Bacillus species bevatten vertakte keten en onverzadigde vetzuren (FA&#39;s) met verschillende posities van de methylvertakking (iso- of anteiso) en de dubbele binding. Veranderingen in FA samenstelling spelen een cruciale rol in de aanpassing van bacteriën aan hun omgeving. Deze veranderingen leiden tot een verandering in de verhouding van iso versus anteiso vertakte FA, en in de hoeveelheid onverzadigde FA opzichte van verzadigde FA&#39;s met dubbele bindingen gemaakt op specifieke posities. Nauwkeurige beschrijving van de FA profiel moet de aanpassingsmechanismen van Bacillus species begrijpen. Veel van de FA van Bacillus zijn niet commercieel beschikbaar. De hierin voorgestelde strategie identificeert FA&#39;s door het combineren van informatie over de retentietijd (door berekening van de equivalente ketenlengte (ECL)) met de massa spectra van drie soorten FA derivaten: vetzuurmethylesters (FAME), 4,4-dimethyl oxazoline derivaten (DMOX), en3-pyridylcarbinyl ester (picolinyl). Deze methode kan de FA identificeren zonder de noodzaak om de onbekende FA zuiveren. Vergelijking chromatografische profielen van FAME bereid uit Bacillus cereus met een commercieel mengsel van standaarden maakt de identificatie uit onvertakte verzadigde FA&#39;s, de berekening van de ECL en hypotheses over de identiteit van de andere FA. FAME vertakte verzadigde FA&#39;s, iso- of anteiso, vertonen een constante negatieve verschuiving in de ECL, vergeleken met lineaire verzadigde FA&#39;s met hetzelfde aantal koolstofatomen. FAME onverzadigde FA kan worden gedetecteerd door de massa van de moleculaire ionen en leiden tot een positieve verandering in de ECL vergeleken met de overeenkomstige verzadigde FA&#39;s. De vertakking positie van FA en de dubbele binding positie van onverzadigde FA kan worden geïdentificeerd door het elektron ionisatie massaspectra van picolinyl en DMOX derivaten, respectievelijk. Deze benadering identificeert alle onbekende verzadigde taked FA, onverzadigde rechte keten FA en onverzadigde vertakte FA uit de B. cereus extract.

De strategie van FA identificatie van bacteriële cellen is weergegeven in figuur 1. Elke stap geeft aanvullende spectrale informatie of informatie over chromatografische. Stap 1 bestaat uit voorlopige FA-identificatie door een standaardoplossing. Stap 2 zorgt voor de interpretatie van FAME EI spectra en de ECL, teneinde de producten voorlopig identificatie. Stap 3 identificeert de exacte vertakking locatie in vertakte-FA&#39;s. Tot slot, stap 4 identificeert de precieze ...

We stellen een protocol voor om vetzuren te identificeren zonder dat ze hoeven te worden gezuiverd. Het combineert informatie over de retentietijd met de massaspectra van drie soorten vetzuurderivaten: vetzuurmethylesters (FAME's), 4,4-dimethyloxazolinederivaten (DMOX) en 3-pyridylcarbinylester (picolinyl).

Identificatie van vetzuren in<em&gt; Bacillus cereus</em

The Bacillus species contain branched chain and unsaturated fatty acids (FAs) with diverse positions of the methyl branch (iso or anteiso) and of the ...

Het algemene doel van dit protocol is om vetzuren uit bacteriën te identificeren en de positie van methylvertakkingen en dubbele bindingen vast te stellen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen de bacteriologie, zoals de rol van vetzuren in de manier waarop bacteriën zich aanpassen aan hun omgeving. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat proliferatie van vetzuren niet vereist is.De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot bacteriële identificatie vanwege het belang van de vetzuursamenstelling in de bacteriële taxonomie. Hoewel deze methode is ontwikkeld met de bacterie Bacillus cereus, is het ook zeer relevant om andere soorten te bestuderen die vertakte keten vetzuren bevatten. Over het algemeen hebben we bij de ontwikkeling van deze methode te maken gehad met diverse uitdagingen.Omdat de huidige identificatiemethoden voor vetzuren geen methylvertakkingen in de positie van de dubbele binding identificeren. Om deze procedure te starten, wordt een bacteriegazon geprepareerd door 100 µL van een overnightcultuur van de stam, geïncubeerd bij 30 °C in LB, uit te strijken over het oppervlak van een plaat met LB-agarmedium. Incubeer de plaat overnight bij 30 °C.Om lipide vetzuren te verkrijgen, worden bacteriële cellen geoogst door kolonies van de agarplaat te schrapen. Breng vervolgens ongeveer 40 milligram over naar een glazen buis van tien milliliter met een schroefdop en een PTFE-afdichting. Voeg voor de transesterificatie vijf milliliter 0,2 molaire kaliumhydroxide in methanol toe aan de verse bacteriële cellen.Vortex en incubeer gedurende één uur bij 37 °C. Voeg vervolgens 1 mL 1 M azijnzuur toe om de pH te verlagen naar 7. Voeg nu 3 mL hexaan toe en vortex gedurende één minuut om de vetzuurmethylesters of FAMEs te extraheren.Overbreng de bovenste fase naar schone buisjes en concentreer deze door verdamping bij kamertemperatuur onder een continue stroom stikstof om ongeveer 200 microliters FAME-extract te verkrijgen. Overbreng vervolgens de extracten naar GC-vials met inserts. Injecteer de extracten in een gaschromatografie-massaspectrometriesysteem, of GC-MS-systeem, dat is uitgerust met een capillaire kolom.Stel de temperatuur van de injectiepoort in op 250 °C. Houd de oventemperatuur gedurende één minuut op 50 °C. Verhoog deze met een snelheid van 20 °C per minuut tot 190 °C en verhoog vervolgens met een snelheid van twee °C per minuut tot een eindtemperatuur van 230 °C.Voor de MS worden de massaspectra geregistreerd via elektronenimpactionisatie, of EI, bij 70 elektronvolt, waarbij de acquisitie van de totale ionenstroom wordt ingesteld tussen 50 en 400 atomaire massaeenheden, of AMU. Los een monster van het gedroogde FAME-extract op in één milliliter droog dichloormethaan. Voeg vervolgens de extractoplossing en 0,2 milliliter 3-pyridinemethanol toe aan 0,1 milliliter één molair kaliumtertbutoxide in tetrahydrofuran.Verhit de oplossing 30 minuten lang bij 40 °C in een gesloten vial. Nadat de oplossing is afgekoeld tot kamertemperatuur, voegt u twee milliliters gezuiverd gedeïoniseerd water en vier milliliters hexaan toe. Meng de oplossing gedurende één minuut met een vortexmixer.Nadat de fasen zich hebben gescheiden, wordt de bovenste organische fase opgevangen. Voeg vervolgens watervrij natriumsulfaat toe totdat de organische fase helder is. Overbreng de organische fase naar een schone buis en laat de organische fase vervolgens verdampen onder een stroom stikstof tot een volume van ongeveer 200 microliters is bereikt.Voeg 250 milligrams 2-amino-2-methyl-1-propanol toe aan een monster van gedroogd FAME-extract. Spoel de buis door met stikstof en sluit deze af met een stop. Verwarm de oplossing vervolgens gedurende de nacht bij 190 degrees Celsius.Nadat de oplossing is afgekoeld tot kamertemperatuur, voegt u drie milliliter dichloormethaan en vijf milliliter gezuiverd gedeïoniseerd water toe. Vortex het mengsel en laat de fasen scheiden. Verwijder vervolgens de waterige fase.Was daarna de organische fase met vijf milliliters water. Voeg watervrij natriumsulfaat toe totdat de organische fase helder is. Na het overbrengen van de organische fase naar een nieuwe reageerbuis, wordt deze onder een stroom stikstof ingedampd tot een volume van ongeveer 200 microliters is bereikt.Het massaspectrum van het I16 picolinaalderivaat bevestigt methylvertakking. Het verschil van 28 AMU tussen ionen bij 304 en 332 komt overeen met fragmenten die zijn gevormd vóór en na de vertakte koolstof. De diagnostische ionen, 113 en 126, die kenmerkend zijn voor DMOX-derivaten, worden hier weergegeven.Het moleculaire ion 307 is kenmerkend voor de 16:1 isomeer, en een verschil van 12 AMU tussen 196 en 208 duidt op een dubbele binding bij koolstof. Het verschil van 12 AMU is niet langer waarneembaar wanneer de dubbele binding vóór koolstof 7 ligt. Het intense 153-ion, kenmerkend voor een dubbele binding bij koolstof 5, en het 307 moleculaire ion in het massaspectrum van het DMOX-derivaat identificeerden deze verbinding als n16 one delta five.Het 307 ion van het DMOX-derivaat en het 345 ion van het picolinaalderivaat duiden op een 16:1 vetzuurisomeer. Een verschil van 28 AMU geeft de vertakkingspositie aan, en een verschil van 12 AMU voor DMOX en 26 AMU voor picolinaalester identificeert de dubbele binding. Vetzuren en de bijbehorende diagnostische ionen geïdentificeerd in Bacillus cereus zijn hier opgesomd.De diagnostische ionen identificeren de methylvertakkingen en de posities van de dubbele bindingen op de koolstofketen voor de DMOX- en picolinalester-derivaten. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in twee dagen worden voltooid, mits correct uitgevoerd. Na deze procedure kunnen vetzuren worden gekwantificeerd via GC-MS en de vrijgave van de FAME-derivaten.Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van de bacteriologie om bacteriële diversiteit en mechanismen van bacteriële adaptaties te onderzoeken. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe vetzuren in bacteriën bestudeerd kunnen worden, inclusief methylvertakte en onverzadigde vetzuren. Vergeet niet dat het werken met reagentia uiterst gevaarlijk kan zijn en dat er bij het uitvoeren van deze procedure altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals het werken in een laboratoriumafzuigkast en het dragen van handschoenen.

identification-of-fatty-acids-in-bacillus-cereus

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

We hebben onlangs melding gemaakt van een nieuwe benadering voor het genereren van fluorogene DNAzyme probes die kan worden toegepast op het opzetten van een eenvoudige, "mix-and-lezen" TL-test voor bacteriële detectie. Deze speciale DNA probes katalyseren de splitsing van een chromofoor gemodificeerde DNA-RNA chimère substraat in aanwezigheid van ruwe extracellulaire mengsel (CEM) door een bepaald bacterie, waardoor vertaling bacteriële detectie in fluorescentiesignaal generatie. In dit...

Detectie van bacteriën met behulp van fluorogene DNAzymes

Source: Ginies, C., et al. Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the process of preparing fatty acid methyl esters (FAMEs) from bacterial samples by treating the biomass with an alkaline solution, followed by phase separation and solvent evaporation for downstream analysis.

Preparation of Fatty Acid Methyl Esters (FAMEs) from Bacterial Biomass

Isolatie en karakterisering van het lipide Een domein van lipopolysaccharide (LPS) van gram-negatieve bacteriën geeft inzicht in celoppervlak gebaseerde mechanismen van resistentie tegen antibiotica, bacteriële overleving en fitness, en hoe chemisch diverse lipide Een moleculaire species verschillend moduleren gastheer aangeboren immuunrespons.

Isolatie en chemische karakterisering van Lipid A van Gram-negatieve bacteriën

Werkwijze voor de bepaling van vetzuren en samenstelling microalgen gebaseerd op mechanische celdisruptie, oplosmiddelhoudende vetextractie, verestering en kwantificatie en identificatie van vetzuren met gaschromatografie wordt beschreven. Een tripentadecanoin interne standaard wordt gebruikt ter compensatie van eventuele verliezen bij de winning en onvolledige omestering.

Analyse van vetzuurgehalte en Compositie in Microalgen

&lt;em&gt; Caenorhabditis elegan &lt;/ em&gt; is een bruikbaar model om de functies van meervoudig onverzadigde vetzuren verkennen in ontwikkeling en fysiologie. Dit protocol beschrijft een efficiënte methode van aanvulling van het &lt;em&gt; C. elegans &lt;/ em&gt; dieet van meervoudig onverzadigde vetzuren.

Aanvulling van de voeding van meervoudig onverzadigde vetzuren in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Het vetzuur trofische marker aanpak, dat wil zeggen, de assimilatie van vetzuren als hele molecuul en transfer in consument weefsel met geen of een kleine wijziging, wordt gehinderd door lacunes in de kennis in de vetzuurstofwisseling van kleine bodem-ongewervelde dieren. Isotopologue profilering wordt geleverd als een waardevol instrument te ontwarren trofische interacties.

Profilering van vetzuur 13C Isotopologue geeft inzicht in de trofische Carbon overdracht en lipide metabolisme van ongewervelde consumenten

Deze methode biedt een kader voor het bestuderen van de opname van exogene vetzuren uit complexe gastheer bronnen in bacteriële membranen, met name Staphylococcus aureus. Om dit te bereiken, protocollen voor de verrijking van lipoproteïne deeltjes uit kip eierdooier en daaropvolgende vetzuur profilering van bacteriële fosfolipiden met behulp van massaspectrometrie worden beschreven.

Isolatie van lipoproteïne deeltjes uit kippenei dooier voor de studie van bacteriële pathogeen vetzuur opname in membraan fosfolipiden

Er wordt een protocol gepresenteerd om het totale lipidegehalte van de celwand van een breed scala aan mycobacteriën te extraheren. Bovendien worden extractie- en analyseprotocollen van de verschillende soorten mycolzuren getoond. Een dunne-laag chromatografisch protocol om deze mycobacteriële verbindingen te controleren is ook aanwezig.

Analyse van de lipidesamenstelling van mycobacteriën door dunnelaagchromatografie

Hier presenteren we een protocol voor de snelle identificatie van eiwitten geproduceerd door genomisch gesequencede pathogene bacteriën met behulp van MALDI-TOF-TOF tandem massaspectrometrie en top-down proteomische analyse met in eigen huis ontwikkelde software. Metastabieuze eiwitionen fragmenteren vanwege het asparaginezuureffect en deze specificiteit wordt gebruikt voor eiwitidentificatie.

Identificatie van antibacteriële immuniteitseiwitten in Escherichia coli met behulp van MALDI-TOF-TOF-MS/MS en top-down proteomische analyse

Hier presenteren we een goedkope kwantitatieve methode die gebruik maakt van deuteriumoxide en gaschromatografie massaspectrometrie (GCMS) voor de analyse van totaal vetzuur de novo lipogenese in bruin vetweefsel in vivo.

Kwantitatieve bepaling van de novo vetzuursynthese in bruin vetweefsel met behulp van deuteriumoxide

Leer vetzuren identificeren in bacteriën zonder zuivering met behulp van retentietijden en massaspectrometrie. Deze methode helpt onderzoekers bij het begrijpen van bacteriële adaptatie en taxonomie.

Identificatie van vetzuren in

Meer video's verkennen