Analyse van de Ambient Particulate Matter-geïnduceerde chromosomale afwijkingen met behulp van een In Vitro Systeem

Het algemene doel van dit experiment is om chromosomaal beschadiging te detecteren die wordt veroorzaakt door blootstelling van cellen aan fijnstof, geëxtraheerd uit omgevingslucht. Deze methode kan helpen om een sleutelvraag in het veld van fijnstof te beantwoorden, namelijk of blootstelling aan fijnstof chromosomaal beschadiging veroorzaakt. Het grote voordeel van deze techniek is dat het een directe visualisatie van de schade veroorzaakt in het genetisch materiaal mogelijk maakt.

Na het verzamelen en analyseren van deeltjes volgens het protocol, voer de deeltjesblootstelling uit door compleet groeimedium, 0,25% trypsine en PBS in een waterbad te verwarmen tot 37 graden Celsius, gedurende minimaal 30 minuten voorafgaand aan het starten van de cultuur. Na het wassen van de ruwe 264.7 cellen, voeg een milliliter van de warme trypsinoplossing toe aan de schaal en los de cellen van de bodem van het weefselkweekvat los door te schrapen. Verzamel vervolgens de cellen en maak een enkele cel suspensie door herhaaldelijk te pipetteren.

Met trypanblauw tel het aantal cellen, gebruik vervolgens voorverwarmd compleet medium om ze op een dichtheid van 8000 per vierkante centimeter in een 100 millimeter weefselkweekschaal te plateren. Gebruik vervolgens compleet medium om het volume aan te passen tot 10 milliliter voor een uiteindelijke concentratie van 50.000 cellen per milliliter. Incubeer de cellen bij 37 graden Celsius en 5% CO2 gedurende 24 uur om ze de tijd te geven om zich te hechten.

Gebruik in een bioveiligheidskast steriele PBS om gefilterde deeltjes te verdunnen tot een concentratie van 0,5 milligram per milliliter, voor een behandelingsdosis van 5 microgram per milliliter, en tot 5 milligram per milliliter, voor een behandelingsdosis van 50 microgram per milliliter. Om cellen met fijnstof te behandelen, controleer de gekweekte cellen onder een microscoop met 10x vergroting op celgroei, celmorfologie, kweekconditie en besmetting. De cellen moeten in dit stadium minimaal 30% confluent zijn.

Gebruik een steriele pipette om asseptisch het medium af te zuigen en gebruik twee milliliter PBS van 37 graden Celsius om het kweekvat twee keer te wassen. Voeg een vooraf bepaalde dosis fijnstof toe met vers medium en incubeer de culturen bij 37 graden Celsius en 5% CO2 om de blootstelling te parallelliseren die wordt gebruikt voor gelijktijdige genotoxische en epigenotoxische analyse. Om cellen in metafase te arresteren, voeg na het wassen van de cellen twee milliliter voorverwarmd medium met vijf microliter per milliliter colcemid oplossing toe aan de cultuur en incubeer gedurende twee uur bij 37 graden Celsius en 5% CO2.

Na de incubatie, verwijder het medium volledig en was de cellen twee keer met warm PBS. Voeg vervolgens trypsinoplossing toe en incubeer de culturen bij 37 graden Celsius gedurende één minuut. Gebruik een celschraper om de cellen los te maken en voeg 10 milliliter PBS toe om de trypsin te inactiveren.

Pipetteer vervolgens de cellen minstens tien keer op en neer om een enkele cel suspensie te maken en breng de cellen over in een 15 milliliter, conische centrifugeerbuis. Plaats de buizen in een swing out centrifuge en centrifugeer de celsuspensie bij 400 keer g en kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Om een hypotone behandeling uit te voeren, verwijder de supernatant van de buizen zonder de cellenpellet te verstoren en laat ongeveer 0,5 milliliter PBS achter.

Breek voorzichtig de cellenpellet en gebruik een P200 pipette om een enkele cel suspensie te maken. Voeg vervolgens vier milliliter voorverwarmde kaliumchloride oplossing druppelsgewijs toe met zacht schudden. Incubeer de celsuspensie in een waterbad van 37 graden Celsius gedurende 20 minuten.

Na de hypotone behandeling, fixeer de cellen door een gelijk volume fixeermiddel aan de buis toe te voegen en zachtjes te mengen door de buis te kantelen. Centrifugeer de buizen bij 400 keer g bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten en verwijder de supernatant. In dit stadium zal de cellenpellet in omvang zijn toegenomen en witter van kleur en zichtbaarder zijn geworden.

Verwijder de supernatant. Voeg vier milliliter vers fixeermiddel toe en incubeer de buizen bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Centrifugeer vervolgens de buizen, verwijder de supernatant en gebruik vier milliliter fixeermiddel om de cellen nog twee keer te wassen.

Dompel glasplaten volledig gedurende 30 minuten in 10% vloeibaar wasmiddel. Spoel de platen vervolgens grondig af onder koud stromend kraanwater gedurende 30 minuten. Gebruik gedistilleerd water om de platen drie keer te spoelen om het wasmiddel volledig te verwijderen.

Dompel ze vervolgens in gedistilleerd water en bewaar de platen 's nachts in de koelkast. Laat tien microliter celsuspensie druppelen op een gekoelde natte glasplaat en laat het een nacht bij kamertemperatuur drogen. Om de monsters te kleuren en te monteren, bereid 50 milliliter giemsa kleuroplossing voor door één deel giemsa kleuroplossing te mengen met één deel PBS en giet het in een Coplin pot.

Dompel de platen 20 minuten in de kleuroplossing, spoel de platen vervolgens in gedistilleerd water om overtollig kleurmiddel te verwijderen en droog de platen onmiddellijk met een föhn. Laat de platen 's nachts op kamertemperatuur. De volgende ochtend breng je een enkele druppel montagemiddel aan op de glasplaat.

Leg voorzichtig een dekglas erop en laat het montagemiddel langzaam over de glasplaat verspreiden. Gebruik vervolgens een papieren handdoek om overtollig middel te verwijderen. Gebruik ten slotte een helderveldmicroscoop met 100x vergroting om de structurele chromosomale afwijkingen in de metafase verspreidingen te onderzoeken.

Deze afbeelding toont dat een normale muis metafase verspreiding 40 acentrische chromosomen zal hebben. Behandeling met fijnstof induceert verschillende chromosomale afwijkingen, zoals een chromatidenbreuk, een acentrisch fragment, een ringchromosoom, een dicentrisch chromosoom, dubbele minuten, een Robertsoniaanse translocatie en een endoredulatie. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat alleen proliferatieve cellen m