Name: -Peptide afgeleide methode om genen en eiwitten Across Cellulaire en organellen Barriers in Planten Transport (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Ontdek een peptide-afgeleide methode voor het transport van genen en eiwitten door celmembranen in planten met behulp van Arabidopsis thaliana. Deze eenvoudige spuitgeassisteerde transfectietechniek biedt een efficiënt alternatief voor conventionele plantentransformatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag tot financiering uit Japan Science and Technology Agency Exploratory Research for Advanced Technology (JST-ERATO), de Nieuwe Energie en Industriële Technologie Development Organization (NEDO), en de Cross-ministeriële Strategic Innovation Promotion Program (SIP), Japan erkennen .

1. Bereiding van peptide-gebaseerde formuleringen <ol><li> Bereid voorraadoplossingen van elk peptide als volgt: (KH) 9 -BP100 (1 mg / ml of 800 nM), Cytcox- (KH) 9 (1 mg / ml), BP100 (1 mg / ml) en (BP100) 2 K 8 (70 uM). Weeg de vereiste hoeveelheid van elk peptide in een 1,5 ml microcentrifugebuis en voeg geautoclaveerd ultrazuiver water aan het peptide lossen. Meng goed door herhaaldelijk pipetteren totdat een heldere oplossing wordt verkregen. </li><li> Versterken en zuiveren het plasmide DNA (pDNA), dubbelstrengs DNA (dsDNA) en dubbelstrengs RNA (dsRNA) volgens standaard moleculaire methoden. In 1,5 ml microcentrifuge buizen, maak voorraadoplossingen met een concentratie van 1 mg / ml (pDNA en dsDNA) of 400 nM (dsRNA). </li><li> Bereid de eiwit voorraadoplossing met een concentratie van 7 uM, door het oplossen van 1 mg eiwit (bijv., Alcohol dehydrogenase, ADH) poeder in 1 ml natriumcarbonaatoplossing (0,1 M, pH 9). Label het eiwit met fluorescent probes zoals rhodamine B (RhB) volgens standaardprotocollen microscopische visualisatie van de geleverde proteïne in cellen mogelijk. </li><li> Combineer de respectieve componenten in een 1,5 ml microcentrifugebuis. <ol><li> Voor peptide-pDNA formuleringen gericht het cytoplasma, voeg 6,4 pl (KH) 9 -BP100 (1 mg / ml) tot 20 gl pDNA (1 mg / ml) en goed mengen door pipetteren. Laat het mengsel stabiliseren 15 minuten bij 25 ° C. Voeg 773,6 ul van geautoclaveerd ultrazuiver water aan de oplossing tot een eindvolume van 800 pl verdund. Gebruik de pDNA construct ontworpen voor nucleair expressie (P35S-RLuc-Tnos, tabel 1). </li><li> Voor peptide-pDNA samenstellingen gericht op de mitochondriën, voeg 6,6 pl Cytcox- (KH) 9 (1 mg / ml) tot 20 gl pDNA (1 mg / ml) en goed mengen door pipetteren. Laat het mengsel stabiliseren 15 minuten bij 25 ° C en voeg 2,4 pl BP100 (1 mg / ml). Laat het mengsel stabiliseren 15 minuten bij 256, C voor nog eens 15 min. Voeg 771 ul van geautoclaveerd ultrazuiver water aan de oplossing tot een eindvolume van 800 pl verdund. Gebruik de pDNA construct ontworpen voor mitochondriële expressie (pDONR-Cox2: rluc, tabel 1). </li><li> Voor peptide-dsDNA formuleringen, voeg 5,1 pl (KH) 9 -BP100 (1 mg / ml) tot 8 pl dsDNA (1 mg / ml) en goed mengen door pipetteren. Laat het mengsel stabiliseren 15 minuten bij 25 ° C. Voeg 786,9 ul van geautoclaveerd ultrazuiver water aan de oplossing tot een eindvolume van 800 pl verdund. </li><li> Voor peptide-dsRNA formuleringen, voeg 50 pl (KH) 9 -BP100 (800 nM) aan 50 pl dsRNA (400 nM) en meng door pipetteren. Laat het mengsel stabiliseren 15 minuten bij 25 ° C. Voeg 700 gl RNase-vrij water aan de oplossing tot een eindvolume van 800 pl verdund. </li><li> Voor peptide-eiwitformuleringen, voeg 16 pl (BP100) 2 K 8 (70 uM) aan 16 pl ADH (7 uM) en menggoed door pipetteren. Laat het mengsel stabiliseren 15 minuten bij 25 ° C. Voeg 768 ul van geautoclaveerd ultrazuiver water aan de oplossing tot een eindvolume van 800 pl verdund. </li></ol></li><li> Laat de formuleringen te stabiliseren 15 minuten bij 25 ° C. </li></ol> 2. Karakterisering van peptide-gebaseerde formuleringen <ol><li> Transfer elke oplossing (800 pl) in een cuvette voor dynamische lichtverstrooiing analyse (DLS). Bepaal de hydrodynamische diameter en polydispersiteitsindex gevormde complexen met een zeta nanosizer, met een 633 nm He-Ne-laser bij 25 ° C met een backscatter detectiehoek van 173 °. </li><li> Na omvangmetingen transfer elke oplossing (800 pl) in een gevouwen capillaire cel zeta potentiaal metingen op standaardparameters diëlektrische constante, brekingsindex en de viscositeit van water bij 25 ° C. </li><li> Zich aan een kleine hoeveelheid complex, gebruikt bij DLS analyse van atomaire kracht microscopie (AFM). Aanbetaling van 10 ul van complexe oplossing op de vers blootgestelde gesplitst oppervlak van een mica plaat en laat de mica droog &#39;s nachts in een overdekte plastic petrischaal lucht. </li><li> Verwerven van een afbeelding van de complexen in lucht bij 25 ° C onder toepassing van een silicium cantilever met een veerconstante van 1,3 N / m tapping mode 27,28. </li></ol> 3. Infiltratie van bladeren van de planten <ol><li> Gebruik 3 weken oude bodem geteelde planten (Arabidopsis thaliana 24, Nicotiana benthamiana 24 of populier 26). Transfecteren tenminste 3 blaadjes dienen als drievoud voor de kwantificering van genexpressie of eiwit aflevering. </li><li> Laad een 1 ml plastic naaldloze spuit met 100 ul van complexe oplossing voor de transfectie van een blad. Plaats de punt van de spuit op de abaxiale oppervlak van het blad. </li><li> Druk de spuit tegen het blad iets op en druk de spuit zuiger langzaam tijdens het uitoefenen van een tegendruk met de index vinger van een latex-gehandschoende hand van de andere kant. Succesvolle infiltratie kan worden waargenomen als de verspreiding van water doordrenkte gebied in het blad. Label de geïnfiltreerde bladeren voor het gemak van identificatie. </li><li> Incubeer de getransfecteerde blad voor optimale perioden na infiltratie met peptide-pDNA (12 uur), peptide-dsDNA (12 uur), peptide-dsRNA (9-48 uur) en peptide-eiwit (6 uur) formuleringen onder de volgende omstandigheden: 16 uur licht / 8 uur donker bij 22 ° C naar A. thaliana en populier, of 24 uur constant licht bij 29 ° C voor N. benthamiana. </li></ol> 4. Evaluatie van transfectie efficiëntie <ol><li> Accijnzen de hele getransfecteerde blad kleinere installaties (bijv., A. thaliana) of een 1 cm 2 sectie van het geïnfiltreerde gebied voor grotere installaties (bijv., N. benthamiana). </li><li> Voor transfectie-experimenten met Renilla luciferase (Rluc) reporter vector, bepalen de transfection efficiency kwantitatief met behulp van een Rluc Assay Kit. <ol><li> Plaats elk uitgesneden blad of blad sectie in een 1,5 ml microcentrifugebuis. Voeg 100 ul van 1 × Rluc Assay Lysis Buffer per buis. Op dezelfde wijze bereid lysaten van ongetransfecteerde control bladeren (drievoud). </li><li> Maal het blad met behulp van een homogenisatie stamper en incubeer het resulterende lysaat bij 25 ° C gedurende 6-10 uur. </li><li> Centrifugeer het lysaat bij 12.470 x g in een microcentrifuge gedurende 1 minuut. Overdracht 20 ul van het lysaat geklaard een putje in een 96-well microplaat, en gebruik het resterende volume voor het kwantificeren van de totale eiwitconcentratie onder toepassing van een BCA Protein Assay Kit volgens het protocol van de fabrikant. </li><li> Voeg 100 ul van 1 × Rluc Assay Substrate (verdund met behulp van de Rluc Assay Buffer) in de put en meng door langzaam pipetteren. Plaats de microplaat in een multimode microplaat lezer en start de meting. </li><li> Trek de achtergrond luminescentie (gemiddelde van de no-N getransfecteerde drievoud) van luminescentie elke experimentele monster. Bereken de verhouding van fotoluminescentie (relatieve lichteenheden, RLU) de hoeveelheid eiwit (mg). </li></ol></li><li> Voor transfectie-experimenten met groen fluorescerend eiwit (GFP) reporter vector of fluorescent gemerkt eiwit (bijv., ADH-RhB), acht de fluorescentie met behulp van een confocale laser scanning microscoop. <ol><li> Snijd de randen van een hele blad (het verwijderen van luchtruimten steun), terwijl een doorsnede blad kan als zodanig worden gebruikt. Verwijder de zuiger uit een 10 ml spuit en plaats elk uitgesneden blad of blad sectie in de spuit. </li><li> Vervang de zuiger en duw voorzichtig naar de bodem van de spuit zonder aandrukken het blad. Trekken water in de spuit totdat het is ongeveer de helft gevuld. </li><li> Richt de spuit in te drukken en de zuiger om lucht uit de spuit door de punt te verwijderen. Bedek de punt van de spuit en trek de zuiger langzaam naar beneden om de lucht te verdrijven uit de leaf. Herhaal dit proces meerdere keren totdat het blad verschijnt doorschijnend. </li><li> Bedek het oppervlak van een microscoopglaasje met plakband. Snij een vierkant gebied op de band groot genoeg om de bladmonster met een mes tegemoet en schil de vierkant stuk tape met een tang om een ​​specimen kamer te creëren. De band zal dienen als een afstandhouder tussen de glijbaan en dekglaasje. </li><li> Leg het blad in de kamer met de abaxiale oppervlak naar boven en vul de resterende ruimte met water. Verzegel het blad binnen de kamer met een glazen dekglaasje en zet de randen van het dekglaasje met plakband. </li><li> Onderzoek het blad monster met behulp van de confocale laser scanning microscoop onder een 40x objectief of een 63x water immersie objectief. GFP of RhB fluorescentie kan worden gevisualiseerd op golflengten van 488 nm of 555 nm. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Altman, A., Hasegawa, P. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAltman%2C+A+%22Plant+biotechnology+and+agriculture%3A+Prospects+for+the+21st+century%22">Plant biotechnology and agriculture: Prospects for the 21st century</a>. , Academic Press. Cambridge, MA. (2011).</li>
<li>Horn, M. E., Woodard, S. L., Howard, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+molecular+farming%3A+systems+and+products%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Plant molecular farming: systems and products.</a> Plant Cell Rep. 22, 711-720 (2004).</li>
<li>Gelvin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-mediated+plant+transformation%3A+the+biology+behind+the+%26%2334%3Bgene-jockeying%26%2334%3B+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Mol.+Biol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the &#34;gene-jockeying&#34; tool.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 67, 16-37 (2003).</li>
<li>Klein, T. M., Wolf, E. D., Wu, R., Sanford, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-velocity+microprojectiles+for+delivering+nucleic+acids+into+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">High-velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells.</a> Nature. 327, 70-73 (1987).</li>
<li>Fromm, M., Taylor, L. P., Walbot, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+genes+transferred+into+monocot+and+dicot+plant+cells+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Expression of genes transferred into monocot and dicot plant cells by electroporation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 82, 5824-5828 (1985).</li>
<li>Krens, F. A., Molendijk, L., Wullems, G. J., Schilperoort, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+transformation+of+plant+protoplasts+with+Ti-plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro transformation of plant protoplasts with Ti-plasmid DNA.</a> Nature. 296, 72-74 (1982).</li>
<li>Birch, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+transformation%3A+problems+and+strategies+for+practical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Plant+Physiol.+Plant+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Plant transformation: problems and strategies for practical application.</a> Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48, 297-326 (1997).</li>
<li>Newell, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+transformation+technology.+Developments+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Plant transformation technology. Developments and applications.</a> Mol. Biotechnol. 16, 53-65 (2000).</li>
<li>Nielsen, K. M., Bones, A. M., Smalla, K., van Elsas, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Horizontal+gene+transfer+from+transgenic+plants+to+terrestrial+bacteria--a+rare+event%3F%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Horizontal gene transfer from transgenic plants to terrestrial bacteria--a rare event?</a> FEMS Microbiol. Rev. 22, 79-103 (1998).</li>
<li>Chuah, J. A., Kaplan, D., Numata, K. Chapter 25, Engineering peptide-based carriers for drug and gene delivery. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChuah%2C+JA+%22Engineering+in+Translational+Medicine%22">Engineering in Translational Medicine</a>. Cai, W. , Springer. 667-689 (2014).</li>
<li>Nitta, S., Numata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biopolymer-based+nanoparticles+for+drug%2Fgene+delivery+and+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Biopolymer-based nanoparticles for drug/gene delivery and tissue engineering.</a> Int. J. Mol. Sci. 14, 1629-1654 (2013).</li>
<li>Numata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28amino+acid%29s%2Fpolypeptides+as+potential+functional+and+structural+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Polym.+J%22%5BJournal%5D)">Poly(amino acid)s/polypeptides as potential functional and structural materials.</a> Polym. J. 47, 537-545 (2015).</li>
<li>Numata, K., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silk-based+delivery+systems+of+bioactive+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Silk-based delivery systems of bioactive molecules.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 62, 1497-1508 (2010).</li>
<li>Numata, K., Subramanian, B., Currie, H. A., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineered+silk+protein-based+gene+delivery+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Bioengineered silk protein-based gene delivery systems.</a> Biomaterials. 30, 5775-5784 (2009).</li>
<li>Chugh, A., Eudes, F., Shim, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-penetrating+peptides%3A+nanocarrier+for+macromolecule+delivery+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">Cell-penetrating peptides: nanocarrier for macromolecule delivery in living cells.</a> IUBMB Life. 62, 183-193 (2010).</li>
<li>Eggenberger, K., Mink, C., Wadhwani, P., Ulrich, A. S., Nick, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+the+peptide+Bp100+as+a+cell-penetrating+tool+for+the+chemical+engineering+of+actin+filaments+within+living+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Using the peptide Bp100 as a cell-penetrating tool for the chemical engineering of actin filaments within living plant cells.</a> ChemBioChem. 12, 132-137 (2011).</li>
<li>Numata, K., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silk-based+gene+carriers+with+cell+membrane+destabilizing+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Silk-based gene carriers with cell membrane destabilizing peptides.</a> Biomacromolecules. 11, 3189-3195 (2010).</li>
<li>Numata, K., Hamasaki, J., Subramanian, B., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+delivery+mediated+by+recombinant+silk+proteins+containing+cationic+and+cell+binding+motifs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">Gene delivery mediated by recombinant silk proteins containing cationic and cell binding motifs.</a> J. Control. Release. 146, 136-143 (2010).</li>
<li>Numata, K., Mieszawska-Czajkowska, A. J., Kvenvold, L. A., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silk-based+nanocomplexes+with+tumor-homing+peptides+for+tumor-specific+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Silk-based nanocomplexes with tumor-homing peptides for tumor-specific gene delivery.</a> Macromol. Biosci. 12, 75-82 (2012).</li>
<li>Numata, K., Reagan, M. R., Goldstein, R. H., Rosenblatt, M., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spider+silk-based+gene+carriers+for+tumor+cell-specific+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chem%22%5BJournal%5D)">Spider silk-based gene carriers for tumor cell-specific delivery.</a> Bioconjugate Chem. 22, 1605-1610 (2011).</li>
<li>Chuah, J. A., Yoshizumi, T., Kodama, Y., Numata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+introduction+into+the+mitochondria+of+Arabidopsis+thaliana+via+peptide-based+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Gene introduction into the mitochondria of Arabidopsis thaliana via peptide-based carriers.</a> Sci. Rep. 5, 7751(2015).</li>
<li>Plant transformation method. Patent. , WO2015133652 A1 (2015).</li>
<li>Ng, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+delivery+of+proteins+in+intact+plants+via+fusion+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Intracellular delivery of proteins in intact plants via fusion peptides.</a> PLoS ONE. 11, e0154081(2016).</li>
<li>Lakshmanan, M., Kodama, Y., Yoshizumi, T., Sudesh, K., Numata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+gene+delivery+into+plant+cells+using+designed+peptide+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient gene delivery into plant cells using designed peptide carriers.</a> Biomacromolecules. 14, 10-16 (2012).</li>
<li>Lakshmanan, M., Yoshizumi, T., Sudesh, K., Kodama, Y., Numata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-stranded+DNA+introduction+into+intact+plants+using+peptide-DNA+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Double-stranded DNA introduction into intact plants using peptide-DNA complexes.</a> Plant Biotechnol. 32, 39-45 (2015).</li>
<li>Numata, K., Ohtani, M., Yoshizumi, T., Demura, T., Kodama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+gene+silencing+in+plants+via+synthetic+dsRNA+and+carrier+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Local gene silencing in plants via synthetic dsRNA and carrier peptide.</a> Plant Biotechnol. J. 12, 1027-1034 (2014).</li>
<li>Numata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+degradation+processes+of+poly%5B%28R%29-3-hydroxybutyric+acid%5D+and+poly%5B%28R%29-3-hydroxybutyric+acid-co-%28R%29-3-hydroxyvaleric+acid%5D+single+crystals+revealed+by+atomic+force+microscopy%3A+effects+of+molecular+weight+and+second-monomer+composition+on+erosion+rates%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Enzymatic degradation processes of poly[(R)-3-hydroxybutyric acid] and poly[(R)-3-hydroxybutyric acid-co-(R)-3-hydroxyvaleric acid] single crystals revealed by atomic force microscopy: effects of molecular weight and second-monomer composition on erosion rates.</a> Biomacromolecules. 6, 2008-2016 (2005).</li>
<li>Numata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adsorption+of+biopolyester+depolymerase+on+silicon+wafer+and+poly%5B%28R%29-3-hydroxybutyric+acid%5D+single+crystal+revealed+by+real-time+AFM%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Adsorption of biopolyester depolymerase on silicon wafer and poly[(R)-3-hydroxybutyric acid] single crystal revealed by real-time AFM.</a> Macromol. Biosci. 6, 41-50 (2006).</li>
<li>Kawai, S., Nishizawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+procedure+for+DNA+transfection+with+polycation+and+dimethyl+sulfoxide%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">New procedure for DNA transfection with polycation and dimethyl sulfoxide.</a> Mol. Cell. Biol. 4, 1172-1174 (1984).</li>
<li>Liu, F., Song, Y., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamics-based+transfection+in+animals+by+systemic+administration+of+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA.</a> Gene Ther. 6, 1258-1266 (1999).</li>
<li>Luo, D., Saltzman, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+transfection+by+physical+concentration+of+DNA+at+the+cell+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Enhancement of transfection by physical concentration of DNA at the cell surface.</a> Nat. Biotechnol. 18, 893-895 (2000).</li>
<li>Boynton, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloroplast+transformation+in+Chlamydomonas+with+high+velocity+microprojectiles%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chloroplast transformation in Chlamydomonas with high velocity microprojectiles.</a> Science. 240, 1534-1538 (1988).</li>
<li>Sikdar, R. S., Serino, G., Chaudhuri, S., Maliga, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plastid+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Arabidopsis+thaliana+Plant+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Plastid transformation.</a> Arabidopsis thaliana Plant Cell Rep. 18, 20-24 (1998).</li>
<li>Svab, Z., Hajdukiewicz, P., Maliga, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+transformation+of+plastids+in+higher+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Stable transformation of plastids in higher plants.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 87, 8526-8530 (1990).</li>
<li>Liu, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementation+of+plant+mutants+with+large+genomic+DNA+fragments+by+a+transformation-competent+artificial+chromosome+vector+accelerates+positional+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Complementation of plant mutants with large genomic DNA fragments by a transformation-competent artificial chromosome vector accelerates positional cloning.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 6535-6540 (1999).</li>
<li>Park, H. S., Lee, B. M., Salas, G. M., Srivatanakul, M., Smith, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shorter+T-DNA+or+additional+virulence+genes+improve+Agrobactrium-mediated+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Theor.+Appl.+Genet%22%5BJournal%5D)">Shorter T-DNA or additional virulence genes improve Agrobactrium-mediated transformation.</a> Theor. Appl. Genet. 101, 1015-1020 (2000).</li>
<li>Frary, A., Hamilton, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficiency+and+stability+of+high+molecular+weight+DNA+transformation%3A+an+analysis+in+tomato%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: an analysis in tomato.</a> Transgenic Res. 10, 121-132 (2001).</li>
<li>Que, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maize+transformation+technology+development+for+commercial+event+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Maize transformation technology development for commercial event generation.</a> Front. Plant Sci. 5, 379(2014).</li>
<li>Miranda, A., Janssen, G., Hodges, L., Peralta, E. G., Ream, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium+tumefaciens+transfers+extremely+long+T-DNAs+by+a+unidirectional+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium tumefaciens transfers extremely long T-DNAs by a unidirectional mechanism.</a> J. Bacteriol. 174, 2288-2297 (1992).</li>
<li>Loeb, T. A., Spring, L. M., Steck, T. R., Reynolds, T. L. Transgenic wheat (Triticum spp.). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLoeb%2C+TA+%22Transgenic+Crops+I%22">Transgenic Crops I</a>. Bajaj, Y. P. S. , Springer. 14-36 (2000).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Kritische stappen in het protocol dat empirisch geïdentificeerd worden besproken. Injectiespuit infiltratie, worden de peptide-gebaseerde formuleringen ingebracht in de luchtruimten in de plant via de bladeren huidmondjes. Om maximale opname van de oplossing te waarborgen, moet de infiltratie werkwijze worden uitgevoerd als de planten onder omstandigheden die bevorderlijk zijn voor stomatale opening dwz. Zijn voorzien van voldoende water en tijdens de lichtperiode. Met betrekking tot de bereiding van transfectie complexen van formuleringen die een combinatie van twee peptiden (voor mitochondriale target DNA afgifte) omvatten, de volgorde van toevoeging van elke component is belangrijk en moet niet worden omgekeerd. Er zijn veel plausibele aanpassingen aan de procedure. Een andere optie voor de infiltratie van plantencellen is het gebruik van vacuüm infiltratie, die in staat is de complexoplossing nemen in gehele planten en / of gedeeltelijke weefsels waaronderapicale meristemen. Voor deze alternatieve procedure wordt zaailingen ondergedompeld in de transfectie oplossing, en gebaseerd op de druk die door het vacuüm, worden de peptide-complexen lading gedwongen door de huidmondjes en in de plantencellen (Yoshizumi, T., ongepubliceerde gegevens). Transiënte genexpressie, gebaseerd op studies met dierlijke cellen, is aangetoond dat DNA toe met hogere concentraties 29-31. Het is belangrijk op te merken dat de verhouding van peptide tot DNA invloed op de biofysische eigenschappen (grootte, oppervlaktelading) complexen (figuur 4), die transfectie-efficiëntie beïnvloedt; vandaar, de optimale verhouding moet worden gehandhaafd, zelfs met verhoogde DNA-concentratie. Een van de belangrijkste voordelen van het gebruik peptiden als een gen / eiwit toedieningsagens is dat de sequentie vatbaar is voor het afstemmen op een gewenste functie. Bijvoorbeeld, de mitochondriale doeldomein van de drager peptide in dit study kan worden vervangen chloroplast of peroxisomale targeting sequenties voor lokalisatie naar deze organellen. Terwijl chloroplastentransformatie in verschillende fabrieken kan via biolistiek 32-34, kan noch de Agrobacterium of de biolistische werkwijze genen in de mitochondriën of andere organellen naast de kern (tabel 2) te introduceren. Er zijn geen starre gastheerbereik beperkingen voor peptide-gebaseerde transfectie, in tegenstelling tot de Agrobacterium gebaseerde methode (tabel 2). Tot nu toe hebben formuleringen voor de transfectie van A. thaliana, N. benthamiana en populier geoptimaliseerd (Tabel 1), maar de werkwijze kan ook worden toegepast Nicotiana tabacum, tomato cultivar Micro-Tom, rijst (gebaseerd op inleidende experimenten), en andere mono- en dicotyle planten. Tot dusver is er geen bekende beperking transgen grootte wanneer peptiden worden gebruikt eens transfectievectoren. Daarentegen hebben grote DNA-moleculen is gevonden dat de transformatie-efficiëntie van Agrobacterium-gemedieerde werkwijzen 35,36, en een bovenste limiet voor transgenen van ongeveer 200 kb gerapporteerd 37-39 verminderen. Gebruik biolistiek, anderzijds, grote DNA fragmenten kunnen worden afgeschoven gedurende de bereiding of aflevering in planten 38. Hoewel er geen bovengrens voor biolistische transformatie nu toe is gedaan, zijn fysieke bedwingt gevonden dat de grootte van DNA die kan worden overgedragen naar minder dan 150 kb 40 beperken. De belangrijkste voordelen van het peptide gebaseerd systeem voor genoverdracht vergeleken met bestaande benaderingen die gebruikmaken van Agrobacterium of microprojectielen, hierboven besproken, zijn samengevat in Tabel 2. Een paar beperkingen bestaan ​​voor deze methode in zijn huidige vorm. Enerzijds gerichte afgifte van pDNA specifieke organellen, zoals mitochondria is mogelijk bewezen door een eenvoudige combinatie van DNA-bindende, cel-penetrerende en organel-transit-sequenties, hoewel het rendement laag was. Transgenexpressie worden gedetecteerd door confocale microscopie, slechts een kleine populatie van mitochondria in cellen. Dus verdere wijzigingen nodig om: (i) verbetering van de translocatie van meer complexen in de cel / organellen membraan, en (ii) het verbeteren van de dissociatie en overdracht van pDNA uit de drager peptide in het doelorganel voor expressie. Ten tweede het gebruik van dit DNA-afgiftesysteem, de tijdelijke expressie van exogene reportergenen werd succesvol bereikt in de cytosolische en mitochondriale compartiment van cellen. Stabiele integratie en expressie van de ingebrachte genen in de plant nucleaire / organellen genoom nog niet vastgesteld, maar vanwege het ontbreken van geschikte selectiestrategieën. Hoewel zij erkent dat er ruimte voor verbetering of verdere development, de-peptide afgeleide strategie die hier beschreven blijft een eenvoudige en veelzijdige techniek die de weg voor de levering van verschillende ladingen in diverse plantensoorten heeft gebaand.

Plant genetic engineering wordt conventioneel gebruikt voor het overbrengen van gunstige eigenschappen naar planten. In de afgelopen jaren is deze technologie toegepast om planten om te zetten in bio-fabrieken voor de productie van farmaceutisch belangrijke en commercieel waardevolle eiwitten, waarvan vele niet chemisch kunnen worden gesynthetiseerd en erg duur zijn om te produceren met behulp van dierlijke of microbiële systemen1. Door de introductie van nieuwe genen kan het eigen metabolisme van de plant worden gemanipuleerd voor de productie van verschillende biofarmaceutische producten zoals antilichamen, metabolische enzymen, hormonen, antigenen of vaccins2.
Gevestigde genoverdrachttechnologieën voor planten zijn de Agrobacterium-gemedieerde levering3, bombardement met DNA-gecoate microprojectielen (biolistiek)4, en elektroporatie5 of polyethyleenglycol6 behandeling van protoplasten. Technieken die protoplasten vereisen, worden over het algemeen vermeden omdat ze tijdrovend, omslachtig zijn en inconsistente resultaten opleveren7. Als gevolg hiervan maakt vrijwel al het huidige werk aan plantenmodificatie gebruik van Agrobacterium of microprojectielen voor genoverdracht. De Agrobacterium-methode wordt het meest gebruikt, maar is niet toepasbaar op veel economisch belangrijke plantensoorten. Ondertussen is microprojectielbombardement veelzijdiger vanwege een breed scala aan vatbare planten, maar vereist gespecialiseerde apparatuur en veroorzaakt vaak ernstige weefselschade. Bovendien omvatten deze methoden ofwel een willekeurig (biolistiek) of complex (Agrobacterium) afleveringsmechanisme en hebben variabele transformatiesnelheden8. Daarom is een nieuwe planttransformatietechnologie die eenvoudig maar effectief is, en toepasbaar op verschillende plantensoorten, noodzakelijk.
Momenteel worden planten onderworpen aan genetische modificatie voornamelijk door de levering van exogeen DNA dat een gewenste eigenschap codeert, in plaats van door directe levering van een doelwiteiwit. De hogere stabiliteit van DNA ten opzichte van eiwitten is een belangrijk voordeel; niettemin omvatten potentiële problemen geassocieerd met DNA-levering de willekeurige invoeging van exogeen DNA in het plantengenoom en onbedoelde overdracht van antibioticaresistentiegenen naar pathogene bacteriën via horizontale genoverdracht9. Voor doeleinden van genoombewerking kan de mogelijkheid om plantengenooms te bewerken zonder vreemd DNA in cellen te introduceren, regelgevende zorgen met betrekking tot genetisch gemodificeerde planten omzeilen. Daarom zal een alternatieve DNA-vrije strategie voor de modificatie van planten door directe levering van eiwitten in staat zijn om aan deze behoeften te voldoen.
Hier introduceren we een op peptiden gebaseerd systeem, oorspronkelijk ontwikkeld voor humane gentherapie10-14, voor de gerichte levering van exogene genen of eiwitten in intacte planten. Peptiden zijn in staat om DNA te beschermen tegen nuclease-afbraak en kunnen genoverdracht mediëren over cel- en organellaire membranen15-17. Ze hebben ook diverse en afstembare eigenschappen, naast het feit dat ze niet-cytotoxisch zijn18-20. Belangrijker nog, met behulp van peptiden kunnen genen precies worden gericht op intracellulaire organellen zoals de mitochondriën21 of plastiden (chloroplasten)22 voor expressie - een taak die niet haalbaar is door biolistische of Agrobacterium-gemedieerde transformatie. Afhankelijk van het type vracht, kan deze nieuwe plantenmodificatietechnologie worden gebruikt om eiwitten23 te leveren en specifieke genen binnen de plant, in zijn cytosolische ruimte24-26 of binnen een specifiek organellaire compartiment21 tot expressie te brengen (plasmide21,24 of dubbelstrengs DNA25) of te onderdrukken (dubbelstrengs RNA26). De ontworpen carrierpeptiden bestaan uit een kationische domein in de vorm van polylysine (K8) of polylysine-co-histidine (KH)9 voor binding en/of condensatie van negatief geladen vracht, die is geconjugeerd aan celdoordringende (BP100-peptide) of mitochondriëntransit (Cytcox-peptide) sequenties.

<table><tbody><tr><td>(KH)9-BP100 peptide</td><td>Custom-gesynthetiseerd door RIKEN Brain Science Institute</td><td>N/A</td><td>Sequence: KHKHKHKHKHKHKHKH- KHKKLFKKILKYL</td></tr><tr><td>(BP100)2-K8 peptide</td><td>Custom-gesynthetiseerd door RIKEN Brain Science Institute</td><td>N/A</td><td>Sequence: KKLFKKILKYLKKLFKKIL- KYLKKKKKKKK</td></tr><tr><td>BP100 peptide</td><td>Custom-gesynthetiseerd door RIKEN Brain Science Institute</td><td>N/A</td><td>Sequence: KKLFKKILKYL</td></tr><tr><td>Cytcox-(KH)9 peptide</td><td>Custom-gesynthetiseerd door RIKEN Brain Science Institute</td><td>N/A</td><td>Sequence: MLSLRQSIRFFKKHKHKH- KHKHKHKHKHKH</td></tr><tr><td>P35S-GFP(S65T)-TNOS en P35S-RLuc-TNOS</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Codeert voor groen fluorescerend eiwit en Renilla luciferase genen, respectievelijk, onder controle van CaMV 35S constitutieve promotor (Ref: Lakshmanan et al. Biomacromolecules 2013, 14, 10)</td></tr><tr><td>pDONR-cox2:gfp en pDONR-cox2:rluc</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Codeert voor groen fluorescerend eiwit en Renilla luciferase genen, respectievelijk, onder controle van cox2 mitochondriaal-specifieke promotor (Ref: Chuah et al. Sci Rep 2015, 5, 7751)</td></tr><tr><td>dsDNA (PCR-versterkt van pBI221-P35S-Rluc-TNOS)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Codeert voor groen fluorescerend eiwit en Renilla luciferase genen, respectievelijk, onder controle van CaMV 35S constitutieve promotor (Ref: Lakshmanan et al. Plant Biotechnol 2015, 32, 39)</td></tr><tr><td>GFP5 siRNA</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Voor RNA interferentie-gemedieerde silencing van groen fluorescerend eiwit (Ref: Numata et al. Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027)</td></tr><tr><td>CHS siRNA</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Voor RNA interferentie-gemedieerde silencing van chalcone synthase (Ref: Numata et al Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027)</td></tr><tr><td>1 ml en 10 ml plastic spuiten</td><td>TERUMO Corporation</td><td>SS-01T, SS-10ESZ</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml microcentrifugebuisje</td><td>AS ONE Corporation</td><td>151212</td><td></td></tr><tr><td>96-Well platte bodem plaat</td><td>Asahi Glass Co., Ltd.</td><td>3860-096</td><td></td></tr><tr><td>Kleefband</td><td>Sekisui Chemical Co., Ltd.</td><td>No. 835</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol dehydrogenase</td><td>Sigma-Aldrich Co., LLC.</td><td>A-7011</td><td></td></tr><tr><td>Atomaire krachtmicroscoop</td><td>Seiko Instruments Inc.</td><td>SPI3800, SPA 300HV</td><td></td></tr><tr><td>Atomaire krachtmicroscoop</td><td>Hitachi High-Tech Science Corporation</td><td>AFM5300E</td><td></td></tr><tr><td>BCA eiwit assay kit</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Cantilever</td><td>Hitachi High-Tech Science Corporation</td><td>K-A102001593</td><td></td></tr><tr><td>Confocal Laser Scanning Microscoop</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM700</td><td></td></tr><tr><td>Kurksponer</td><td>Sigma-Aldrich Co., LLC.</td><td>Z165220</td><td>Voor het uitsnijden van bladeren in 1-cm diameter schijven</td></tr><tr><td>Dekglas</td><td>Matsunami Glass Ind., Ltd.</td><td>C02261</td><td></td></tr><tr><td>Cuvet</td><td>Sarstedt</td><td>759116</td><td></td></tr><tr><td>Geplooid capillair cel</td><td>Malvern Instruments, Ltd.</td><td>DTS1070</td><td></td></tr><tr><td>Pincet</td><td>Shimizu Akira Inc.</td><td>Stainless pincet 150</td><td></td></tr><tr><td>Homogenisatie stamper</td><td>Ieda Trading Corp.</td><td>9993</td><td></td></tr><tr><td>Mica</td><td>Nisshin EM Co., Ltd.</td><td>LC23Z</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>BKA46472</td><td></td></tr><tr><td>Microplate lezer</td><td>Molecular Devices Corporation</td><td>Spectra MAX M3</td><td></td></tr><tr><td>Microscoop glaasje</td><td>Matsunami Glass Ind., Ltd.</td><td>S011120</td><td></td></tr><tr><td>Pipet</td><td>Eppendorf Research&reg; plus</td><td>3120000909</td><td></td></tr><tr><td>Pipet tips</td><td>AS ONE Corporation</td><td>2-5138-01, 2-5138-02, 2-5138-03</td><td></td></tr><tr><td>Kunststof petrischaal</td><td>AS ONE Corporation</td><td>1-7484-01</td><td></td></tr><tr><td>Renilla luciferase assay kit</td><td>Promega corporation</td><td>E2810</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine B isothiocyanate</td><td>Sigma-Aldrich Co., LLC.</td><td>283924</td><td></td></tr><tr><td>RNase-vrij water</td><td>Qiagen</td><td>129112</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcarbonaat</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>199-01585</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische mes en handvat</td><td>FEATHER Safety Razor Co., Ltd.</td><td>Roestvrij staal No. 14 (mes), No. 3L (handvat)</td><td></td></tr><tr><td>Spuit tip dop</td><td>Musashi Engineering Inc.</td><td>NC-3E</td><td></td></tr><tr><td>Weegschaal</td><td>Sartorius</td><td>CPA225D</td><td></td></tr><tr><td>Zeta potentiometer</td><td>Malvern Instruments, Ltd.</td><td>Zetasizer Nano-ZS</td><td></td></tr></tbody></table>

-peptide afgeleide methode om genen en eiwitten across cellulaire en organellen barriers in planten transport

Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants

De capaciteit om exogene eiwitten te introduceren en specifieke genen in planten tot expressie te brengen (of te onderdrukken) biedt een krachtig hulpmiddel voor fundamenteel onderzoek evenals nieuwe toepassingen op het gebied van plantenbiotechnologie. De haalbare methoden die momenteel bestaan voor eiwit- of genoverdracht naar plantencellen, namelijk Agrobacterium en microprojectielbombardement, hebben nadelen zoals een lage transformatiefrequentie, een beperkt gastheerbereik of hoge kosten voor apparatuur en microcarriers. Het volgende protocol schetst een eenvoudige en veelzijdige methode, die rationeel ontworpen peptiden gebruikt als leveringsmiddelen voor een verscheidenheid aan op nucleic zuur- en eiwit gebaseerde ladingen in planten. Peptiden worden geselecteerd als hulpmiddelen voor de ontwikkeling van het systeem vanwege hun biologisch afbreekbaarheid, verminderde grootte, diverse en aanpasbare eigenschappen, evenals de mogelijkheid om intracellulair/organellair toegang te verkrijgen. De bereiding, karakterisering en toepassing van geoptimaliseerde formuleringen voor elk type van het brede scala aan geleverde ladingen (plasmide DNA, dubbelstrengs DNA of RNA en eiwit) worden beschreven. Kritische stappen binnen het protocol, mogelijke aanpassingen en bestaande beperkingen van de methode worden ook besproken.

Een serie van nucleïnezuur en eiwit ladingen werden met succes geïntroduceerd in verschillende planten met behulp van de ontworpen peptiden als levering vectoren. Elektrostatische interacties tussen kationische peptiden en negatief geladen lading resulteerde in de vorming van transfectie complexen die direct kunnen worden geïnfiltreerd in bladeren van de planten met behulp van een naaldloze injectiespuit (figuur 1). Geoptimaliseerde formuleringen (empirisch bepaald in deze studies 21,23-26) voor de transfectie van plantencellen zijn samengevat in tabel 1, waarbij elk van de vele geleverde lading (pDNA, dsDNA, dsRNA en eiwit) wordt voorgesteld. De gemiddelde diameters van op peptide gebaseerde formuleringen waren in het bereik van ongeveer 150-300 nm. Op basis van DLS analyse getoond alle formuleringen betrekkelijk geringe omvang polydispersiteiten, wat aangeeft dat het gevormde peptide-aggregaten lading hebben een uniforme grootteverdeling. De morfologie vancomplexen tussen peptide en pDNA (figuur 2A) of eiwit (Figuur 2B), op mica werden afgebeeld door AFM. Homogene bolvormige complexen werden waargenomen voor zowel peptide-pDNA en peptide-eiwit combinaties, in overeenstemming met de gegevens van DLS metingen. In termen van het zeta potentieel van de complexen (tabel 1), pDNA- en dsDNA-afgeleide complexen had netto negatieve oppervlak ladingen terwijl dsRNA gebaseerde complexen had een bijna-neutrale oppervlakte lading. Peptide-eiwitcomplexen, daarentegen, zijn positief geladen. De rendementen van peptide-pDNA en peptide-dsDNA formuleringen in het bemiddelen van de transfectie van A. thaliana of N. benthamiana als modelplant systemen zijn kwantitatief als kwalitatief. De RLuc genexpressie test werd gebruikt voor de kwantificering van genexpressie niveaus (tabel 1), dus voor dit experiment pDNA ofdsDNA coderend voor het RLuc gen worden gebruikt voor het complexeren met de respectieve dragerpeptiden. Met toets (KH) 9 -BP100 / pDNA formulering kern gerichte aflevering en expressie van pDNA kan worden bereikt na een incubatietijd van 12 uur, voor een RLU / mg waarde heeft van ongeveer 1 x 10 5. Voor mitochondriale doelgerichte aflevering en expressie van pDNA, een combinatie van peptiden, Cytcox- (KH) 9 en BP100 is vereist voor complexvorming. Met dezelfde optimale incubatietijd van 12 uur, maar een veel lagere transfectie (ongeveer 1 x 10 3 RLU / mg) werd verkregen. Ondertussen soortgelijke incubatieperiode (12 uur) en genexpressie niveau (ongeveer 1 x 10 3 RLU / mg) was vereist / opgenomen voor dsDNA-gebaseerde complexen, formuleerde ook het gebruik van de (KH) 9 -BP100 peptide. Kwalitatieve beoordelingen van genexpressie werden uitgevoerd door directe microscopische observatie van de bladeren die werden behandeld met complexen prepar uitgevoerded gebruik pDNA of dsDNA coderend voor het GFP-reportergen. In cellen die met niet-gerichte peptide-pDNA complexen, diffuse groene fluorescentie die overeenkomt met GFP-expressie duidelijk waargenomen en bleek gelokaliseerd in het cytoplasma (Figuur 3A). Duidelijke verschillen in de lokalisatie patroon van GFP-fluorescentie in cellen zichtbaar waren geïnfiltreerd met mitochondriale gerichte peptide-complexen pDNA. Hier gestippelde groene fluorescentie die colocalize de mitochondriale vlek zichtbaar, hetgeen de specificiteit van genexpressie uitsluitend in het mitochondriale compartiment van cellen (Figuur 3B). Voor peptide-eiwitformuleringen wordt conjugatie van het proteïne lading (ADH) een fluorofoor (RhB) visualisatie van de afgegeven eiwit in de intracellulaire ruimte mogelijk. Binnen een korte incubatieperiode van 6 uur, ADH-RhB eiwit (blauw) werd gevonden door te verdelenhet cytosol en de vacuole van geïnfiltreerde cellen (Figuur 3C). Ondertussen kan snel en efficiënt neerwaartse regulatie van genexpressie worden uitgevoerd in verschillende installaties die peptide-dsRNA formuleringen. In het eerste experiment werd A. thaliana bladeren geïnfiltreerd met peptide-complexen dsRNA het chalcon synthase gen (CHS) belast anthocyaan (rood pigment) biosynthese bij droogte zwijgen. Het verschil in uiterlijk van A. thaliana bladeren onder normale (Figuur 3D, a) en droogte omstandigheden (figuur 3D, b) die een gemakkelijke manier om CHS zwijgen op te leggen met behulp van de geoptimaliseerde peptide-dsRNA formulering te evalueren (pijl 1 geeft de geïnfiltreerd regio). In het tweede experiment werden peptide-complexen dsRNA geïnfiltreerd in bladeren van transgene A. thaliana tot expressie geel fluorescerend eiwit (YFP). Een schijnbare vermindering van YFP expressie te zien in de epidermiscellen 9 hr post-transfectie (figuur 3E, F). De effectiviteit van de formulering beneden reguleren van genexpressie in een andere plant systeem (populier, 12 uur na transfectie) werd ook onderzocht (Figuur 3G-H). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/54972/54972fig1.jpg" /> Figuur 1: Peptide-gebaseerde formuleringen voor de levering van nucleïnezuur en eiwit Ladingen in levende planten. De ontworpen carrier peptiden bestaan ​​uit polykationen geconjugeerd naar cel penetrerende of organellen transit sequenties. Polykationen vrijgave binding en / of condensatie van negatief geladen lading evenals ontsnapping uit de endosomale compartiment volgende internalisatie in cellen. Levering van ladingen in cellen en vervolgens specifieke organellen wordt gemedieerd door celpenetrerende sequenties en organellen doorvoer sequenties, respectievelijk. Verschillende ladingen die successfu zou kunnen zijnlly in de plant afgeleverd omvatten nucleïnezuren zoals pDNA, dsDNA en dsRNA, alsook model eiwitten zoals runderserumalbumine (BSA), alcohol dehydrogenase (ADH) en citrien (een variant van geel fluorescerende proteïne). Biologisch actieve moleculen zijn in staat om transfectie complexen met peptidenconjugaten via elektrostatische interacties, die worden geïntroduceerd in bladeren van de planten met een injectiespuit infiltratie te vormen. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54972/54972fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/54972/54972fig2.jpg" /> Figuur 2: De morfologieën van de peptide-gebaseerde formuleringen. (A) AFM amplitude beeld van (KH) 9 -BP100 / pDNA formulering bij N / P 0,5. AFM hoogte van het beeld van (BP100) 2 K 8 / ADH formule bij mol rati (B)o 10. Overgenomen met toestemming uit gepubliceerde bronnen 23,24. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54972/54972fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 3" src="/files/ftp_upload/54972/54972fig3.jpg" /> Figuur 3: Microscopische evaluatie van de efficiëntie van de transfectie gebruik Geoptimaliseerde op peptiden gebaseerde formuleringen. (A) cytosolische GFP expressie (groen), duidelijk onderscheidt van chloroplast autofluorescentie (rood), werd waargenomen in het sponsachtige mesofylcellen van A. thaliana bladeren geïnfiltreerd (KH) 9 -BP100 / pDNA formulering (N / P 0,5; 12 uur ). (B) GFP expressie (groen) werd gedetecteerd in de mitochondria (rood) in de epidermale cellen van A. thaliana blad geïnfiltreerd met Cytcox- (KH) 9 / BP100 / pDNA formulering (N / P 0,5 voor elke peptide; 12 uur). Vergrote afbeeldingen van de mitochondria met GFP expressie worden weergegeven in de extreem-rechts paneel. (C) De levering van ADH-RhB (blauw) in de sponsachtige bladmoes cellen van A. thaliana bladeren gemedieerd door (BP100) 2 K 8 bij een peptide / proteïne molverhouding van 10, gevisualiseerd 6 uur na infiltratie. (D) A. thaliana blad vóór (a) en na (b) behandeling met (KH) 9 -BP100 / dsRNA formulering (molverhouding 2; 48 uur), waardoor de onderdrukking van anthocyanine biosynthese route. Een soortgelijke formulering met GFP5 dsRNA werd geïnfiltreerd in het blad als negatieve controle (c). Pijlen 1 en 3 geven het geïnfiltreerde gebied terwijl pijlen 2 en 4 geven de niet-geïnfiltreerde gebied binnen het blad. (E) A. thaliana bladeren expressie geel fluorescerend eiwit (YFP) en (F) de verminderde YFP fluorescentie na infiltratie met<html> (KH) 9 -BP100 / dsRNA formulering (molverhouding 2, 9 uur). (G) transgene populieren bladeren uitdrukken geel fluorescerend eiwit (YFP) en (H) de verminderde YFP fluorescentie na infiltratie met (KH) 9 -BP100 / dsRNA formulering (molverhouding 2; 12 uur). Overgenomen met toestemming van gepubliceerde bronnen 21,23,24,26. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54972/54972fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 4" src="/files/ftp_upload/54972/54972fig4.jpg" /> Figuur 4: Variatie in Peptide-to-DNA (N / P) Ratio en het effect op de biofysische eigenschappen van de complexen. Met toenemende peptide DNA verhouding peptide gebaseerde formuleringen in omvang afnemen terwijl hun zeta-potentiaal waarden overgang van negatief naar positief./files/ftp_upload/54972/54972fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken. <img alt="tafel 1" src="/files/ftp_upload/54972/54972table1.jpg" /> Tabel 1: Karakterisering en evaluatie van verschillende peptide-gebaseerde formuleringen. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54972/54972table1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze tabel te bekijken.</a> <img alt="tabel 2" src="/files/ftp_upload/54972/54972table2.jpg" /> Tabel 2: een vergelijking van Peptide-gebaseerde en andere bestaande DNA Delivery Technologies voor intacte planten. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54972/54972table2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze tabel te bekijken.</a>

Bestaande methoden voor het modificeren van planten hebben een beperkte toepasbaarheid. De nieuwe peptide-afgeleide technologie die hier wordt voorgesteld, belooft zowel eenvoud als efficiëntie in de introductie van exogeen eiwit of genen in de gewenste intracellulaire compartimenten van intacte planten.

-Peptide afgeleide methode om genen en eiwitten Across Cellulaire en organellen Barriers in Planten Transport

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as ...

Het algemene doel van deze op peptiden gebaseerde methode is het transporteren van genen en eiwitten door cellulaire en organellaire barrières in planten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen door middel van de modificatie van planten via rationeel ontworpen peptideconjugaten, die diverse genen en eiwitten afleveren om de expressie van specifieke genen te mediëren. Het directe voordeel van deze techniek is dat er gebruik wordt gemaakt van een eenvoudige, met een spuit ondersteunde transfectieprocedure van plantenbladeren, gebaseerd op peptiden die cellulaire en organellaire grenzen kunnen passeren.We hebben deze eenvoudige, effectieve en innovatieve methode voor planttransformatie ontwikkeld omdat conventionele methoden kostbaar zijn, niet toepasbaar zijn op sommige plantensoorten en geen intracellulaire organellen kunnen targeten. Jo-Ann Church zal de procedure demonstreren samen met Yoko Horii, een technicus uit mijn laboratorium. Bereid de peptide-plasmadna-formulering voor zoals beschreven in het tekstprotocol.Wanneer het peptide aan het plasma-DNA wordt toegevoegd, vormt zich een troebele oplossing. Het mengsel wordt helder na verdunning met ultrapuur water tot het in het tekstprotocol gespecificeerde eindvolume. Breng 800 µL van de verdunde oplossing over in een cuvette voor dynamische lichtverstrooiingsanalyse.Bepaal de hydrodynamische diameter en de polydispersiteitsindex van de gevormde complexen met een zetananosizer. Gebruik hiervoor een helium-neonlaser van 633 nanometer bij 25 °C met een backscatter-detectiehoek van 173 graden. Breng de oplossing na de groottemetingen over naar een gevouwen capillaire cel voor zetapotentiaalmetingen met de standaardparameters voor de diëlektrische constante, brekingsindex en viscositeit van water bij 25 °C.Om de complex-oplossing via atomkrachtmicroscopie te observeren, brengt u 10 µL aan op het vers blootgestelde gespleten oppervlak van een mica-plaat en laat u de mica gedurende de nacht aan de lucht drogen in een afgedekte plastic Petri-schaal. Neem een afbeelding van de complexen in lucht bij 25 °C op met behulp van een silicium cantilever met een veerconstante van 1,3 N/m in tapping-modus. Gebruik drie weken oude Arabidopsis thaliana, gekweekt onder een cyclus van 16 uur licht en 8 uur donker bij 22 °C.Kies ten minste drie bladeren voor transfectie om als triplikaat te dienen voor de kwantificering van de genexpressie. Vul een naaldloze plastic spuit van 1 ml met 100 µL complexe oplossing voor de transfectie van één blad. Plaats vervolgens de punt van de spuit op het abaxiale oppervlak van het blad.Druk de tip van de spuit voorzichtig tegen het blad en duw de zuiger langzaam in, terwijl u met de wijsvinger van een met een latex handschoen beklede hand van de tegenovergestelde zijde tegendruk uitoefent. Een succesvolle infiltratie is zichtbaar als het uitspreiden van een waterverzadigd gebied in het blad. Label de geïnfiltreerde bladeren voor een eenvoudige identificatie.Incubeer de met peptide-plasma-DNA getransfecteerde plant gedurende 12 uur in een groeikamer. Om de transfectie-efficiëntie te evalueren, wordt eerst het volledig getransfecteerde blad uitgesneden. Bepaal voor transfectie-experimenten met de Renilla Luciferase reportervector de transfectie-efficiëntie kwantitatief met behulp van een Renilla Luciferase assay kit.Plaats eerst elk uitgesneden blad in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Voeg 100 microliters 1X Lysis Buffer per buis toe. Bereid op dezelfde wijze lysaten van niet-getransfecteerde controlebladeren in drievoud.Maal het blad fijn met een homogenisatievijzer en incubeer het resulterende lysaat bij 25 °C gedurende zes tot 10 uur. Centrifugeer na incubatie het lysaat 1 minuut bij 12.470 ×g in een microcentrifuge. Breng 20 µL van het geklaarde lysaat over naar een well in een 96-well microplaat.Gebruik het resterende volume voor de kwantificering van de totale eiwitconcentratie met behulp van een BCA-eiwitassaykit volgens het protocol van de fabrikant. Voeg vervolgens 100 µL van een 1x Renilla Luciferase assay-substraat toe aan de put en meng dit door langzaam te pipetteren. Plaats de microplaat in een multi-mode microplaatlezer en start de meting.Voor transfectie-experimenten met een reportervector voor groen fluorescerend eiwit wordt de fluorescentie waargenomen met behulp van een confocale laserscanmicroscoop. Snijd eerst de randen van een heel blad af om de verwijdering van luchtbellen te vergemakkelijken. Verwijder vervolgens de zuiger uit een spuit van 10 milileter en plaats elk uitgesneden blad of bladafsnede in de spuit.Plaats de zuiger terug en druk deze voorzichtig naar de bodem van de spuit zonder het blad te beschadigen. Trek water in de spuit tot deze ongeveer halfvol is. Richt de spuit omhoog en druk op de zuiger om de lucht via de tip uit de spuit te verwijderen.Dek vervolgens de punt van de spuit af en trek de zuiger langzaam naar beneden om de lucht uit het blad te verdrijven. Herhaal dit proces meerdere keren totdat het blad doorschijnend lijkt. Bedek daarna het oppervlak van een objectglas met plakband.Snijd met een mesje een vierkant gedeelte uit de tape dat groot genoeg is voor het bladmonster en verwijder het vierkante stuk tape met een pincet om een monsterkamer te creëren. De tape dient als afstandhouder tussen het dekglas en het objectglas. Plaats het blad in de kamer met de abaxiale zijde naar boven gericht en vul de resterende ruimte in de kamer met water.Sluit het blad in de kamer af met een glazen dekglas en zet de randen van het dekglas vast met plakband. Onderzoek het bladsample met een confocale laser-scanningmicroscoop onder een 40x objectief of een 63x waterimmersie-objectief. GFP-fluorescentie kan worden gevisualiseerd bij een excitatiegolflengte van 488 nanometer.Een optimale preparatie van de peptide-plasma-DNA-formulering bij een peptide-naar-DNA-ratio van 0,5 zou een gemiddelde diameter van ongeveer 290 nanometer moeten hebben en een lage polydispersiteitsindex van ongeveer 0,3, wat duidt op een uniforme grootteverdeling. Daarnaast moeten de complexen een zetapotentieel van ongeveer 30 millivolt vertonen. Een representatieve afbeelding van de peptide-plasma-DNA-complexen gemaakt met een atoomkrachtmicroscoop wordt hier getoond.Er werden homogene globulaire complexen waargenomen. Met behulp van de peptide-plasmadna-formulering kunnen kern-gerichte aflevering en expressie van plasmadna worden bereikt in Arabidopsis thaliana, met een geschatte waarde van Renilla-luciferase per milligram van ongeveer 100.000. Microscopische observatie werd uitgevoerd op bladeren die behandeld waren met complexen geprepareerd met plasmadna, coderend voor de GFP-reporter, om de genexpressie te beoordelen.De beelden onthulden dat in cellen die waren getransfecteerd met niet-gerichte peptide-plasmadna-complexen, diffuse groene fluorescentie die overeenkwam met GFP-expressie duidelijk werd waargenomen en gelokaliseerd was in het cytosol. Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van de plantbiotechnologie om diverse eiwit- en nucleïnezuurgebaseerde ladingen in levende planten af te leveren. Na het bekijken van deze video en het lezen van het tekstprotocol zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u diverse geoptimaliseerde formuleringen voor elk type lading, waaronder plasmadna, dubbelstrengs dna of rna en eiwitten, kunt bereiden, karakteriseren en toepassen.

peptide-derived-method-to-transport-genes-proteins-across-cellular

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Macromoleculaire de handel tussen de plantencellen kan worden beoordeeld door kortstondig te drukken een fluorescent-gelabeld eiwit van belang en de analyse van de intra-en intercellulaire distributie door confocale microscopie.

Een cel-cel Macromoleculaire Transport Assay In Planta Door gebruik te maken biolistische Bombardement

Planten bieden een nieuw systeem voor de productie van farmaceutische eiwitten op commerciële schaal die is beter schaalbaar, kostenefficiënte en veilige dan de huidige expressie paradigma. In deze studie, rapporteren we een eenvoudig en handig, toch schaalbare aanpak van target-gen-bevattende...

Efficiënte Agroinfiltration van planten voor High-level Tijdelijke expressie van recombinante eiwitten

Dit werk beschrijft een nieuwe werkwijze voor het selectief richten subcellulaire organellen in planten, bepaald met de BioRad Gene Gun.

Voorbijgaande Gene Expression Tobacco gebruik Gibson Vergadering en de Gene Gun

Zinkvinger domeinen zijn intrinsiek cel permeabel en geschikt mediëren eiwit plaatsing in een breed scala aan zoogdier celtypen. Hier wordt een uitvoerige stap-voor-stap-protocol voor de uitvoering van zink-vinger-technologie voor intracellulaire eiwit levering gepresenteerd.

Direct Eiwit Levering aan zoogdiercellen behulp van Cell-permeabel Cys<sub&gt; 2</sub&gt; -Zijn<sub&gt; 2</sub&gt; Zinkvinger Domeinen

Plant intercellulaire verbindingen, de plasmodesmata (Pd), spelen een centrale rol in plant fysiologie en plant-virus interacties. Kritische Pd vervoer zijn signalen dat rechtstreekse eiwitten aan Pd sorteren. Onze kennis over deze sequenties is echter nog in de kinderschoenen. Beschrijven we een strategie om te identificeren Pd lokalisatie signalen in Pd-gerichte eiwitten.

Identificatie van Plasmodesmal lokalisatie sequenties in eiwitten In Planta

We ontwikkelden een eenvoudige en efficiënte protocol voor de voorbereiding van grote hoeveelheden soja protoplasten om te studeren van de ingewikkelde regelgeving en signalering mechanismen in levende cellen.

Een eenvoudige methode voor het isoleren van soja protoplasten en toepassing op voorbijgaande gen expressie Analyses

We hebben een nieuwe methode voor het uitdrukken van mede meerdere chimeer fluorescerende fusie-eiwitten in planten te overwinnen van de moeilijkheden van conventionele methoden ontwikkeld. Duurt het voordeel van het gebruik van een enkele uitdrukking plasmide waarin meerdere functioneel onafhankelijk eiwit uiting van cassettes om eiwituitdrukking mede.

Co expressie van meerdere chimeer fluorescerende Fusion eiwitten op een efficiënte manier in planten

We beschrijven een methode voor de karakterisering van protonen-gedreven membraan transporteurs in membraan vesikel preparaten geproduceerd door heterologeuze expressie in E. coli en Lysis van cellen met behulp van een Franse pers.

Karakterisering van membraan transporters door Heterologeuze expressie in E. coli en productie van membraan blaasjes

Dit manuscript beschrijft een nieuw direct planteninfuusapparaat voor het screenen van de effectiviteit van moleculen tegen de bacteriën (Candidatus Liberibacter asiaticus) of zijn insectenvector (Diaphorina citri, Kuwayama) die, in combinatie, geassocieerd zijn met Huanglongbing citrusziekte.

Direct infuusapparaat voor molecuulafgifte in planten

Dit protocol beschrijft de selectie van optimale plasmodesmale markers voor confocale microscopie-gebaseerde analyses van eiwit gericht op plasmodesmata tijdens virus-plasmodesmata interacties of plasmodesmaal transport.

Confocale microscopieanalyse van eiwitsortering naar plasmodesmata in Nicotiana benthamiana

Ontdek een peptide-afgeleide methode voor het transport van genen en eiwitten door celmembranen in planten met behulp van Arabidopsis thaliana. Deze eenvoudige spuitgeassisteerde transfectietechniek biedt een efficiënt alternatief voor conventionele plantentransformatie.

-Peptide afgeleide methode om genen en eiwitten Across Cellulaire en organellen Barriers in Planten Transport

Meer video's verkennen