-Peptide afgeleide methode om genen en eiwitten Across Cellulaire en organellen Barriers in Planten Transport

Het algemene doel van deze op peptiden gebaseerde methode is het transporteren van genen en eiwitten door cellulaire en organellaire barrières in planten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen door middel van de modificatie van planten via rationeel ontworpen peptideconjugaten, die diverse genen en eiwitten afleveren om de expressie van specifieke genen te mediëren. Het directe voordeel van deze techniek is dat er gebruik wordt gemaakt van een eenvoudige, met een spuit ondersteunde transfectieprocedure van plantenbladeren, gebaseerd op peptiden die cellulaire en organellaire grenzen kunnen passeren.

We hebben deze eenvoudige, effectieve en innovatieve methode voor planttransformatie ontwikkeld omdat conventionele methoden kostbaar zijn, niet toepasbaar zijn op sommige plantensoorten en geen intracellulaire organellen kunnen targeten. Jo-Ann Church zal de procedure demonstreren samen met Yoko Horii, een technicus uit mijn laboratorium. Bereid de peptide-plasmadna-formulering voor zoals beschreven in het tekstprotocol.

Wanneer het peptide aan het plasma-DNA wordt toegevoegd, vormt zich een troebele oplossing. Het mengsel wordt helder na verdunning met ultrapuur water tot het in het tekstprotocol gespecificeerde eindvolume. Breng 800 µL van de verdunde oplossing over in een cuvette voor dynamische lichtverstrooiingsanalyse.

Bepaal de hydrodynamische diameter en de polydispersiteitsindex van de gevormde complexen met een zetananosizer. Gebruik hiervoor een helium-neonlaser van 633 nanometer bij 25 °C met een backscatter-detectiehoek van 173 graden. Breng de oplossing na de groottemetingen over naar een gevouwen capillaire cel voor zetapotentiaalmetingen met de standaardparameters voor de diëlektrische constante, brekingsindex en viscositeit van water bij 25 °C.

Om de complex-oplossing via atomkrachtmicroscopie te observeren, brengt u 10 µL aan op het vers blootgestelde gespleten oppervlak van een mica-plaat en laat u de mica gedurende de nacht aan de lucht drogen in een afgedekte plastic Petri-schaal. Neem een afbeelding van de complexen in lucht bij 25 °C op met behulp van een silicium cantilever met een veerconstante van 1,3 N/m in tapping-modus. Gebruik drie weken oude Arabidopsis thaliana, gekweekt onder een cyclus van 16 uur licht en 8 uur donker bij 22 °C.

Kies ten minste drie bladeren voor transfectie om als triplikaat te dienen voor de kwantificering van de genexpressie. Vul een naaldloze plastic spuit van 1 ml met 100 µL complexe oplossing voor de transfectie van één blad. Plaats vervolgens de punt van de spuit op het abaxiale oppervlak van het blad.

Druk de tip van de spuit voorzichtig tegen het blad en duw de zuiger langzaam in, terwijl u met de wijsvinger van een met een latex handschoen beklede hand van de tegenovergestelde zijde tegendruk uitoefent. Een succesvolle infiltratie is zichtbaar als het uitspreiden van een waterverzadigd gebied in het blad. Label de geïnfiltreerde bladeren voor een eenvoudige identificatie.

Incubeer de met peptide-plasma-DNA getransfecteerde plant gedurende 12 uur in een groeikamer. Om de transfectie-efficiëntie te evalueren, wordt eerst het volledig getransfecteerde blad uitgesneden. Bepaal voor transfectie-experimenten met de Renilla Luciferase reportervector de transfectie-efficiëntie kwantitatief met behulp van een Renilla Luciferase assay kit.

Plaats eerst elk uitgesneden blad in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Voeg 100 microliters 1X Lysis Buffer per buis toe. Bereid op dezelfde wijze lysaten van niet-getransfecteerde controlebladeren in drievoud.

Maal het blad fijn met een homogenisatievijzer en incubeer het resulterende lysaat bij 25 °C gedurende zes tot 10 uur. Centrifugeer na incubatie het lysaat 1 minuut bij 12.470 ×g in een microcentrifuge. Breng 20 µL van het geklaarde lysaat over naar een well in een 96-well microplaat.

Gebruik het resterende volume voor de kwantificering van de totale eiwitconcentratie met behulp van een BCA-eiwitassaykit volgens het protocol van de fabrikant. Voeg vervolgens 100 µL van een 1x Renilla Luciferase assay-substraat toe aan de put en meng dit door langzaam te pipetteren. Plaats de microplaat in een multi-mode microplaatlezer en start de meting.

Voor transfectie-experimenten met een reportervector voor groen fluorescerend eiwit wordt de fluorescentie waargenomen met behulp van een confocale laserscanmicroscoop. Snijd eerst de randen van een heel blad af om de verwijdering van luchtbellen te vergemakkelijken. Verwijder vervolgens de zuiger uit een spuit van 10 milileter en plaats elk uitgesneden blad of bladafsnede in de spuit.

Plaats de zuiger terug en druk deze voorzichtig naar de bodem van de spuit zonder het blad te beschadigen. Trek water in de spuit tot deze ongeveer halfvol is. Richt de spuit omhoog en druk op de zuiger om de lucht via de tip uit de spuit te verwijderen.

Dek vervolgens de punt van de spuit af en trek de zuiger langzaam naar beneden om de lucht uit het blad te verdrijven. Herhaal dit proces meerdere keren totdat het blad doorschijnend lijkt. Bedek daarna het oppervlak van een objectglas met plakband.

Snijd met een mesje een vierkant gedeelte uit de tape dat groot genoeg is voor het bladmonster en verwijder het vierkante stuk tape met een pincet om een monsterkamer te creëren. De tape dient als afstandhouder tussen het dekglas en het objectglas. Plaats het blad in de kamer met de abaxiale zijde naar boven gericht en vul de resterende ruimte in de kamer met water.

Sluit het blad in de kamer af met een glazen dekglas en zet de randen van het dekglas vast met plakband. Onderzoek het bladsample met een confocale laser-scanningmicroscoop onder een 40x objectief of een 63x waterimmersie-objectief. GFP-fluorescentie kan worden gevisualiseerd bij een excitatiegolflengte van 488 nanometer.

Een optimale preparatie van de peptide-plasma-DNA-formulering bij een peptide-naar-DNA-ratio van 0,5 zou een gemiddelde diameter van ongeveer 290 nanometer moeten hebben en een lage polydispersiteitsindex van ongeveer 0,3, wat duidt op een uniforme grootteverdeling. Daarnaast moeten de complexen een zetapotentieel van ongeveer 30 millivolt vertonen. Een representatieve afbeelding van de peptide-plasma-DNA-complexen gemaakt met een atoomkrachtmicroscoop wordt hier getoond.

Er werden homogene globulaire complexen waargenomen. Met behulp van de peptide-plasmadna-formulering kunnen kern-gerichte aflevering en expressie van plasmadna worden bereikt in Arabidopsis thaliana, met een geschatte waarde van Renilla-luciferase per milligram van ongeveer 100.000. Microscopische observatie werd uitgevoerd op bladeren die behandeld waren met complexen geprepareerd met plasmadna, coderend voor de GFP-reporter, om de genexpressie te beoordelen.

De beelden onthulden dat in cellen die waren getransfecteerd met niet-gerichte peptide-plasmadna-complexen, diffuse groene fluorescentie die overeenkwam met GFP-expressie duidelijk werd waargenomen en gelokaliseerd was in het cytosol. Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van de plantbiotechnologie om diverse eiwit- en nucleïnezuurgebaseerde ladingen in levende planten af te leveren. Na het bekijken van deze video en het lezen van het tekstprotocol zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u diverse geoptimaliseerde formuleringen voor elk type lading, waaronder plasmadna, dubbelstrengs dna of rna en eiwitten, kunt bereiden, karakteriseren en toepassen.