High-resolution respirometrietest aan mitochondriale functie beoordelen in gepermeabiliseerde en intacte cellen
February 8th, 2017
Hoge-resolutie respirometrie wordt gebruikt om mitochondriale zuurstofconsumptie bepalen. Dit is een eenvoudige techniek om mitochondriale ademhalingsketen complexen (I-IV) ademhalingssnelheid, maximale mitochondriale elektronentransport systeemcapaciteit en buitenste mitochondriale membraan integriteit te bepalen.
Het algemene doel van deze procedure is om hoge resolutie respirometrie te gebruiken om de mitochondriale zuurstofconsumptie te bepalen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over syndromen en ziekten die geassocieerd zijn met mitochondriale disfunctie, zoals; sepsis, diverse neurologische ziekten en leeftijdsgerelateerde aandoeningen. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat het een hogere gevoeligheid heeft en de mogelijkheid om substraten op gekoppelde inhibitortitratie-experimenten uit te voeren met een klein aantal biologische monsters zoals intacte of gepermeabiliseerde cellen.
Het demonstreren van de procedure zal worden gedaan door Sandra Nansoz, een technicus uit mijn laboratorium. Voordat u met de procedure begint, kalibreer de polarografische zuurstofsensoren in de lucht en schud vervolgens de cellen op in ademhalingsbuffer tot een concentratie van één keer tien tot de zesde cellen per milliliter en vervang het ademhalingsmedium in één kamer van de oxygraaf met 2,1 milliliter van de celsuspensie. Sluit de kamer af met de stop en zet de magnetische roerstaaf in de kamer op 700 omwentelingen per minuut.
Neem vervolgens de cellulaire ademhaling gedurende 5 tot 10 minuten op totdat een stabiel zuurstoffluxsignaal is bereikt. Gebruik vervolgens een spuit om twee microliters rotenon via de titanium injectiepoort in de oxygraafkamer te injecteren en neem de cellulaire ademhaling gedurende nog eens 5 tot 10 minuten op. Wanneer een stabiel zuurstoffluxsignaal is bereikt, injecteer 20 microliters van één molair succinaat gevolgd door 10 microliters van 0,5 molair ADP.
Injecteer vervolgens twee volumes van twee microliters van twee millimolair digitonin en neem de cellulaire ademhaling gedurende twee tot vijf minuten na elke injectie op, gevolgd door de stapsgewijze injectie van twee tot vier microliters van twee millimolair digitonin totdat het zuurstoffluxsignaal het maximale niveau bereikt en verdere digitonin injecties de ademhalingssnelheid niet verhogen. Voor evaluatie van de integriteit van de mitochondriale buitenmembraan bereid een oxygraafkamer voor zoals zojuist is aangetoond en injecteer twee microliters van acht millimolair digitonin om de cellen te permeabiliseren. Na vijf minuten, injecteer 20 microliters van één molair succinaat en neem de cellulaire ademhaling gedurende 5 tot 10 minuten op totdat een stabiel zuurstoffluxsignaal is bereikt.
Injecteer vervolgens 10 microliters van 0,5 molair ADP om complex twee te stimuleren en om een toename van de zuurstofconsumptie te induceren. Wanneer een stabiel fluxsignaal is bereikt, injecteer vijf microliters van vier millimolair cytochroom c gevolgd door één microliter van vier milligram per milliliter ligamycine. Om de ADP-gestimuleerde ademhaling van de leverhepatocytcarcinoomcellen te meten, bereid een oygraafkamer voor zoals zojuist is aangetoond, en injecteer twee microliters van acht millimolair digitonin in de zuurstofkamer om de cellen gedurende vijf minuten te permeabiliseren, gevolgd door de injectie van 12,5 microliters van 0,8 molair mallade en 10 microliters van twee molair glutamaat.
Wanneer een stabiele zuurstofflux is bereikt, injecteer 10 microliters van 0,5 molair ADP om de zuurstofconsumptie te verhogen, gevolgd door twee microliters van 0,2 millimolair rotenon en 20 microliters van één molair succinaat. Injecteer vervolgens twee microliters van vijf millimolair antimycine en neem de cellulaire ademhaling op. Wanneer het signaal afneemt en stabiliseert, injecteer 2,5 microliters van 0,8 millimolair escorbaat gevolgd door de onmiddellijke injectie van 2,5 microliters van 0,2 millimolair TMPD, waarbij de cellulaire ademhaling wordt opgenomen totdat het zuurstoffluxsignaal toeneemt en stabiliseert.
Injecteer vervolgens 10 microliters van één molair natriumaziet in de oxygraafkamer en neem de cellulaire aspiratie op totdat het zuurstoffluxsignaal afneemt en stabiliseert. Om de zuurstofconsumptie van intacte cellen te meten, bereid een oxygraafkamer voor zoals zojuist is aangetoond en injecteer 1 microliter van vier milligram per milliliter aligimicyn gevolgd door één en drie microliter injecties van 0,2 millimolair FCCP. Titreer vervolgens het FCCP in stappen van 0,1 tot 0,3 micromolair door één tot drie microliters van 0,2 tot één millimolair FCCP te injecteren totdat het zuurstoffluxsignaal zijn maximale niveau bereikt zonder verdere toenames en vervolgens begint te dalen.
Injecteer vervolgens twee microliters van 0,2 millimolair rotenon en twee microliters van vijf millimolair antimycine A en neem de ademhaling op totdat het zuurstoffluxsignaal afneemt en stabiliseert. Bij afwezigheid van digitonin is de cellulaire ademhaling erg laag en de ademhaling van intacte, niet-permeabiliseerde cellen wordt niet gestimuleerd in aanwezigheid van mitochondriaal substraat en ADP. Bij stapsgewijze toevoeging van digitonin wordt echter de cellulaire plasmamembraan permeabiliseerd en neemt de mitochondriale ademhaling toe tot volledige permeabilisering, waarop succinaat en ADP de cellen binnendringen.
De integriteit van de mitochondriale buitenmembraan kan echter worden aangetast als er overmatige hoeveelheden digitonin worden gebruikt, wat leidt tot een vermindering van complexe afhankelijke toestand drie ademhaling. Cytochroom c verbetert de complexe afhankelijke toestand drie ademhaling niet in digitonin-behandelde cellen, wat aangeeft dat er geen verlies van cytochroom c is van de mitochondriale buitenmembraan en dat de mitochondriale integriteit behouden blijft, ook al kan cytochroom c de ademhaling van cellen verhogen die zijn behandeld met zeer hoge doses digitonin. De toevoeging van exogene substraten van mitochondriale complexactiviteit na digitonin permeabilisering induceert een toename van mitochondriale ademhalingsketencomplexen een, twee en vier maximale ademhalingssnelheden.
Het genereren van verlaagde ademhalingsniveaus kan te wijten zijn aan besmetting van de oxygraafkamers met mitochondriale inhibitoren van het vorige experiment. In aanwezigheid van alygimycine en de ope
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel bespreekt het gebruik van hoge-resolutie respirometrie om mitochondriale zuurstofconsumptie te meten. Het benadrukt de gevoeligheid van de techniek en de toepassing ervan bij het bestuderen van mitochondriale disfunctie in verschillende ziekten.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Biologie
- Mitochondriale functie
Achtergrond
- Hoge-resolutie respirometrie meet mitochondriale ademhalingssnelheden.
- Het beoordeelt de integriteit van mitochondriale buitenmembranen.
- Deze techniek helpt bij het begrijpen van mitochondriale disfunctie bij ziekten.
- Het is toepasbaar op verschillende biologische monsters.
Doel van het onderzoek
- Om mitochondriale zuurstofconsumptie te bepalen.
- Om mitochondriale disfunctie te onderzoeken bij aandoeningen zoals sepsis en neurologische ziekten.
- Om substraat te gebruiken bij gekoppeld inhibitor titraties.
Gebruikte methoden
- Luchtkalibratie van polarografische zuurstofsensoren.
- Resuspendering van cellen in ademhalingsbuffer.
- Gebruik van een oxigraph voor het meten van zuurstofconsumptie.
- Magneetsturing van de celsuspensie tijdens meting.
Belangrijkste resultaten
- Hoge-resolutie respirometrie biedt gedetailleerde inzichten in mitochondriale functie.
- De techniek toont een hoge gevoeligheid voor het detecteren van ademhalingssnelheden.
- Het maakt experimenten mogelijk met minimale biologische monsters.
- Resultaten kunnen informatie geven over mitochondriale integriteit en capaciteit.
Conclusies
- Hoge-resolutie respirometrie is een waardevol hulpmiddel in mitochondriale onderzoek.
- Het verbetert het begrip van mitochondriale rollen in gezondheid en ziekte.
- De precisie van de methode ondersteunt het gebruik ervan in klinische en onderzoeksomgevingen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
High-resolution respirometry enables precise quantification of mitochondrial oxygen consumption, supporting target validation in metabolic disease research. The technique provides mechanistic de-risking by assessing mitochondrial integrity and respiratory capacity in intact and permeabilized cells. It enhances predictive confidence in early discovery by linking respiratory phenotypes to disease-associated mitochondrial dysfunction.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring substrate-uncoupler-inhibitor titration responses to clarify mitochondrial electron transport system function.
- Operational Value: Enables functional target validation with high sensitivity using minimal biological samples, reducing assay variability.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by quantifying maximal respiratory electron transport system capacity as a biomarker of mitochondrial health.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream workflows through standardized permeabilization protocols using digitonin titration.
- Reproducibility: Delivers quantitative oxygen consumption rates in picomoles per second per cell, enabling cross-experiment comparison and assay standardization.
- Scalability: Supports platform reuse across cell types and tissues, facilitating high-throughput mitochondrial screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase mitochondrial phenotypes to preclinical validation by assessing outer membrane integrity via cytochrome c sensitivity tests.
- Mechanistic De-risking: Identifies compound-induced mitochondrial toxicity through inhibition titrations (e.g., rotenone, antimycin) that define safety margins.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by measuring ADP-stimulated respiration and maximal uncoupled rates under FCCP titration.
Pipeline & Workflow Integration
Positions high-resolution respirometry as a discovery-to-preclinical bridge for mitochondrial target validation, assay qualification, and mechanistic profiling.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by measuring oxygen flux changes in response to mitochondrial substrates, inhibitors, and uncouplers.
- Screening: Delivers assay-ready, permeabilized cell systems with reproducible substrate-driven respiration for compound library screening.
- Analytics: Generates quantitative dependent variable measurements (oxygen consumption rates) that enable statistical comparison of respiratory states across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical work by validating mitochondrial integrity and function in disease-relevant cellular models.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for mitochondrial profiling across therapeutic areas, reducing redundant assay development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in mitochondrial pathway engagement.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through calibrated polarographic sensors and controlled chamber conditions.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of mitochondrial liabilities, reducing late-stage attrition risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by quantifying mitochondrial respiratory capacity as a functional readout for lead optimization.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mitochondrial physiology and respirometry assay design.
- Dependent on high-resolution oxygraph instrumentation with polarographic oxygen sensors and temperature-controlled chambers.
- Necessitates cross-team standardization of substrate, inhibitor, and uncoupler titration protocols for reproducible results.
- Involves adaptation considerations for varying cell types, permeabilization efficiency, and mitochondrial substrate preferences.
- Includes practical limitations such as susceptibility to chamber carryover contamination and the need for extensive washing between experiments.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:51
High Resolution Respirometry and Intact Cell Digitonin Titration
2:13
Mitochondrial Outer Membrane Integrity Evaluation
3:03
Measurement of ADP-stimulated and Intact Cellular Respiration
5:11
Results: Representative HepG2 Cellular Respiration Analyses
6:47
Conclusion
