Via röntgenkristallografie, Biophysics en functionele testen om de mechanismen van T-cel-receptorherkenning van kankerantigenen bepalen

Het algemene doel van deze procedure is om oplosbare recumbinate T-Cell receptoren en peptide HLA-eiwitten van voldoende kwaliteit te genereren voor gebruik in biofysische en structurele analyse. Deze methode zou kunnen helpen bij het beantwoorden van vragen op het gebied van T-cellen immunologie. Bijvoorbeeld, waarom reageren T-cellen niet krachtig op kanker?

Het grote voordeel van deze techniek is dat we extreem hoge resolutie mechanistische gegevens krijgen die verklaren hoe T-cellenreceptoren hun doelen herkennen, wat leidt tot door T-cellen gemedieerde immuunresponsen. De implicaties van deze techniek reiken tot therapie of diagnose van vrijwel elke menselijke ziekte omdat T-cellen een cruciale rol spelen in de meeste immuunresponsen. Hoewel deze methode inzicht kan geven in T-cel immuunresponsen, kan deze ook worden toegepast op andere systemen die worden aangestuurd door receptor ligand interacties.

Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn in deze methode worstelen omdat het erg moeilijk is om oplosbare, actieve eiwitten van voldoende kwaliteit te genereren voor biofysische en structurele experimenten. Om de peptide HLA hervouwingsprocedure te beginnen, voegt u zes milliliter guanidinebuffer toe met 10 milometer dithiothreitol, 30 milligram HLA-A2 inclusielichamen, 30 milligram beta 2-M inclusielichamen en vier milligram van het gewenste peptide van interesse. Incubeer het mengsel gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius.

Verdun vervolgens het mengsel met één liter HLA hervouwingsbuffer, voorgekoeld tot vier graden Celsius en roer het mengsel gedurende drie uur bij die temperatuur. Dialyseer het mengsel twee keer tegen 20 liter 10 millimolair tris, pH 8.1, voor 24 uur per keer. Om de TCR hervouwingsprocedure te beginnen, voegt u zes milliliter guanidinebuffer toe met 10 millimolair dithiothreitol, 30 milligram TCR Alpha en bèta ketting IB's.

Incubeer het mengsel gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius en verdun het mengsel in één liter voorgekoelde TCR hervouwingsbuffer. Roer en dialyseer het verdunde TCR hervouwingsmengsel op dezelfde manier als het peptide HLA mengsel. Filter beide gedialyseerde hervouwingsmengsels door een 0,45 micrometer membraanfilter.

Laad vervolgens een van de gefilterde hervouwingspreparaten op een 7,9 milliliter 50 micrometer anionenuitwisselingsresin kolom, voorgeëquilibreerd met 20 milliliter 10 millimolair tris, pH 8.1. Elueer het eiwit met een zoutgradiënt buffer systeem bij vijf milliliter per minuut. Verzamel één milliliter fracties en analyseer de fracties met SDS-Page.

Combineer de fracties die het hervouwde eiwit bevatten. Plaats het eiwitmengsel in een centrifugaal concentrator met een moleculair gewicht van 10 kilodalton. Centrifugeer het mengsel gedurende 20 minuten of hoe lang nodig is, bij 4000 keer g, om het mengsel tot 500 microliters te concentreren.

Gooi de doorstroming weg. Vorm de geconcentreerde eiwitpreparatie in een injectieloep van twee milliliter en injecteer het eiwit in een kolom voor grootte-exclusiechromatografie van 24 milliliter, voorgeëquilibreerd met de juiste elutiebuffer. Elueer het eiwit met één kolomvolume buffer bij 0,5 milliliter per minuut.

Verzamel één milliliter fracties, analyseer de fracties met SDS-Page en combineer de fracties die het eiwit van interesse bevatten. Bereid 10 seriële verdunningen van de TCR oplossing voor, in een concentratiebereik dat 10 keer hoger tot 10 keer lager is dan de KD van de specifieke TCR peptide HLA interactie, indien bekend. Anders, begin met een TCR concentratie van 200 micromolair.

Activeer vervolgens een carboxymethylgecoate dextransensorchip door een één op één mengsel van 100 millimolair en N-Hydroxysuccinimide en 400 millimolair EDC over de chip te laten stromen met een stroomsnelheid van 10 microliter per minuut gedurende 10 minuten, bij 25 graden Celsius. Laad vervolgens 110 microliter 200 microgram per milliliter streptavidin en 10 millimolair acetaat pH 4,5 in alle vier de stroomcellen om het chipoppervlak te functionaliseren. Deactiveer eventueel resterende reactieve groepen met 100 microliter van één molair ethanolamide hydrochloride.

Laat vervolgens een oplossing van ongeveer één micromolair peptide HLA in de door de chipfabrikant verstrekte buffer over het oppervlak van de chip stromen bij 10 microliter per minuut totdat het aantal respons eenheden met 500 tot 600 is toegenomen. Verzadig het oppervlak van de chip gedurende 60 seconden met één millimolair biotin en de door de fabrikant verstrekte buffer. Injecteer vervolgens de 10 seriële verdunningen van de TCR oplossing met 30 microliter per minuut bij 25 graden Celsius.

Bereken de evenwichtsbindingsconstante en voer een kineticaanalyse uit. Voer een reeks SPR-experimenten op deze manier uit, waarbij alleen de temperatuur waarbij de TCR verdunningen worden geïnjecteerd, wordt gevarieerd. Bepaal de evenwichtsbindingsconstante voor elke temperatuur en bereken de Gibbs energieën en andere thermodynamische parameters.

Pluk de Gibbs energieën tegen temperatuur met behulp van een niet-lineaire regressiefitting. Concentreer de peptide HLA oplossing tot 0,2 millimolair en kristallisatiebuffer door centrifugatie bij 3.000 keer g, in een centrifugaal concentrator met een moleculair gewicht van 10 kilodalton. Bereid een 0,1 millimolair oplossing van één op één TCR en peptide HLA voor voor co-complex kristallisatie.

Gebruik een kristallisatierobot en een screeningkit om kristallisatieproeven voor te bereiden met behulp van de zittende druppeltechniek in een 96-wellsplaat. Met 60 microliter kristallisatiebuffer in elk reservoir, en elke druppel bestaande uit 200 nanoliter elk van eiwit oplossing en buffer. Laat de kristallen groeien bij 18 graden Celsius.

Score op kristallen onder een microscoop na 24 uur, 48 uur, 72 uur en vervolgens wekelijks. Zodra er enkele kristallen van voldoende kwaliteit zijn gegroeid, oogst u de enkele kristallen met een cryogengemakelijke lus en bewaar de kristallen in vloeibare stikstof. Voer synchrotron röntgendiffractie uit onder een st