Name: Via röntgenkristallografie, Biophysics en functionele testen om de mechanismen van T-cel-receptorherkenning van kankerantigenen bepalen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-06T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Leer hoe je oplosbare T-celreceptor- en peptide-HLA-eiwitten genereert voor biofysische en structurele analyse met röntgenkristallografie. Deze methode biedt inzicht in T-celherkenning van kankerantigenen voor immunologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

BM wordt ondersteund door een Cancer Research UK PhD studententijd. AG wordt ondersteund door een Life Science Research Network Wales PhD studententijd. VB wordt ondersteund door een Cancer Research Wales PhD studententijd. DKC is een Wellcome Trust Career Development Research Fellow (WT095767). AKS is een Wellcome Trust Investigator. GHM wordt gefinancierd door een gezamenlijke Life Science Research Network Wales en Tenovus Cancer Care PhD studententijd. Wij danken het personeel van Diamond Light Source voor het verstrekken van faciliteiten en ondersteuning.

1. eiwitexpressie <ol><li> Voeg genconstructen voor de productie van oplosbare TCRs en pHLAs, zoals eerder in detail beschreven 17, 18. Ontwerp elk construct met een 5 &#39;BamH1 en een 3&#39; EcoR1 restrictieplaats voor insertie in de vector pGMT7. </li><li> E. coli Rosetta (DE3) pLysS met pGMT7-afgeleide plasmide vector die de sequentie coderend voor het eiwit van belang door het incuberen van 1 pi van 50-200 ng / ul plasmide met 5 pi van E. coli gedurende 5 minuten bij 4 ° C , 2 min bij 42 ° C en 5 minuten bij 4 ° C en uitplaat nacht bij 37 ° C op een LB-agarplaat aangevuld met 50 mg / l carbenicilline. </li><li> Pick individuele kolonies en groeien bij 37 ° C en 220 rpm in 30 ml TYP medium (16 g / l trypton, 16 g / l gistextract en 5 g / l HK 2 O 4) aangevuld met 100 uM carbenicilline totdat de suspensie bereikt een optisch density (OD 600) tussen 0,4 en 0,6. </li><li> Induceren eiwitproductie in een 5 ml aliquot door invoering 0,5 mM isopropyl-β-D-1 (IPTG) gedurende 3 uur. Houd 20 pl suspensie met en zonder inductie van natriumdodecylsulfaat polyacrylamidegel elektroforese (SDS-PAGE) analyse en vlekken op de gel. </li><li> Voeg starterculturen aan 1 liter TYP gesupplementeerd met 100 uM carbenicilline en groeien cellen zoals hierboven beschreven in stap 1,3 totdat de suspensie een OD 600 tussen 0,4 en 0,6 bereikt. </li><li> Induceren eiwitexpressie gedurende 3 uur met 0,5 mM IPTG. Centrifugeer de cellen gedurende 20 minuten bij 3000 xg en giet het supernatant voorzichtig. </li><li> Los het pellet in 40 ml lysisbuffer (10 mM Tris, pH 8,1, 10 mM magnesiumchloride, MgCl2, 150 mM NaCl en 10% glycerol), ultrasone trillingen op ijs gedurende 30 minuten bij 60% vermogen onder toepassing van een 2 s interval en incubeer bij kamertemperatuur (KT) gedurende 30 min met 0,1 g / l DNase. </li><li> Behandel de suspensioen dat de eiwitten in de vorm van inclusielichamen (IB) met 100 ml wasbuffer (0,5% Triton X-100; 50 mM Tris, pH 8,1, 100 mM NaCl en 10 mM EDTA). </li><li> Centrifugeer het monster gedurende 20 minuten bij 4 ° C en 8000 x g en giet het supernatant voorzichtig. Resuspendeer de pellet in 100 ml resuspensie buffer (50 mM Tris, pH 8,1, 100 mM NaCl en 10 mM EDTA, pH 8,1), centrifuge zoals voorheen bij 8000 xg en giet het supernatant voorzichtig. </li><li> Tenslotte los de pellet in 10 ml guanidine buffer (6 M guanidine, 50 mM Tris, pH 8,1, 2 mM EDTA, pH 8,1, en 100 mM NaCl) en meet de eiwitconcentratie bij 280 nm met een spectrofotometer. </li></ol> 2. Phla en TCR hervouwing <ol><li> Voor de Phla refolds, meng 30 mg van HLA-A2 (of HLA-A2 met een biotine label) IB, 30 mg β2m IB en 4 mg van peptide gedurende 30 minuten bij 37 ° C in een waterbad in een eindvolume van 6 ml guanidine buffer gesupplementeerd met 10 mM dithiothreitol(DTT). </li><li> Initiëren proteïne hervouwing door verdunning van het voorgaande mengsel in 1 L van een voorgekoeld HLA opvouwen buffer (50 mM Tris, pH 8,1, 400 mM L-arginine, 2 mM EDTA, pH 8,1; 6 mM cysteamine en 4 mM cystamine). </li><li> Laat de HLA hervouwen roeren bij 4 ° C gedurende 3 uur en breng deze in een 12,4 kDa MWCO (molecuulgewicht cut-off) dialysebuis en dialyze tweemaal gedurende 24 h tegen 20 liter 10 mM Tris, pH 8,1. </li><li> Voor de TCR refolds, meng 30 mg TCR α-keten IB en 30 mg TCR β keten IB gedurende 30 minuten bij 37 ° C in een waterbad in 6 ml guanidine buffer gesupplementeerd met 10 mM DTT. </li><li> Initiëren proteïne hervouwing door verdunning van het gedenatureerde TCR mengsel in 1 L van een voorgekoeld TCR opvouwen buffer (50 mM Tris, pH 8,1, 2,5 M ureum, 2 mM EDTA, pH 8,1; 6 mM cysteamine en 4 mM cystamine) voor 3 h. </li><li> Breng het opvouwen in een 12,4 kDa MWCO dialysebuis en dialyze tweemaal gedurende 24 h tegen 20 liter 10 mM Tris, pH 8,1. </li><li> Filter zowel de Phla of TCR refjarigen met een 0,45 urn membraanfilter voor de zuiveringsstappen. </li></ol> 3. Zuivering door Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) <ol><li> Laad de gefilterde opvouwen preparaat (Phla of TCR) op een 7,9 ml, 50 urn anionenwisselaar kolom vooraf geëquilibreerd met 20 ml 10 mM Tris, pH 8,1 op een flexibele en intuïtieve chromatografiesysteem. </li><li> Elueer het eiwit op 5 ml / min met een zoutgradiënt (0-500 mM NaCI in 10 mM Tris, pH 8,1, over 8 kolomvolumes) en laat 1 ml fracties. </li><li> Analyseer de fracties overeenkomend met het gewenste eiwit door SDS-PAGE, bundelen de fracties samen met het eiwit van belang en concentreer ze naar 500 pl met 10-kDa MWCO 20 of 10 kDa MWCO 4 door centrifugatie gedurende 20 minuten bij 4000 xg , gooi de doorstroming. </li><li> Laad de geconcentreerde eiwit voorbereidingen in een 2 ml injectie lus naar een 24 ml size exclusion chromatografie kolom vooraf in evenwicht gebracht met de appropriate elutiebuffer: fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), HBS (10 mM HEPES, pH 7,4, 150 mM NaCl, 3,4 mM EDTA en 0,005% surfactant) of kristal buffer (10 mM Tris, pH 8,1, en 10 mM NaCl ). </li><li> Elueer het eiwit met een debiet van 0,5 ml / min via 1 kolomvolume; laat 1 mL fracties die het gewenste eiwit bevestigd door SDS-PAGE. Opmerking: Deze methoden zijn gebruikt om oplosbare PMEL17 TCR en gp100 TCRs, evenals alle in deze studie gebruikte pHLAs genereren: HLA-A * 0201 met YLEPGPVTA (A2-YLE), YLEPGPVTV (A2-YLE-9V), ALEPGPVTA (A2-YLE-1A), YLAPGPVTA (A2-YLE-3A), YLEAGPVTA (A2-YLE-4A), YLEPAPVTA (A2-YLE-5A), YLEPGAVTA (A2-YLE-6A), YLEPGPATA (A2-YLE- 7A), of YLEPGPVAA (A2-YLE-8A). </li></ol> 4. Surface Plasmon Resonance (SPR) Analyse <ol><li> Voer-equilibrium binding analyse of thermodynamische analyse met behulp van een moleculaire interactie analysesysteem uitgerust met een CM5 sensorchip 19. </li><li> Activeer de CM5 chip door fgende een 1: 1 mengsel van 100 mM N-hydroxysuccinimide (NHS) en 400 mM 1-ethyl-3- (3-dimethylpropyl) -carboiimide (EDC) gedurende 10 min bij een stroomsnelheid van 10 pl / min en bij 25 ° C. </li><li> Load ongeveer 5000 respons eenheden (RU) van streptavidine (110 pl 200 ug / ml in 10 mM acetaat, pH 4,5) door covalente koppeling van het chip oppervlak in vier stroom-cellen en gebruik 100 pl 1 M ethanolamine hydrochloride deactiveren resterende reactieve groepen. </li><li> Paar 500-600 RU van Phla op ~ 1 uM in commerciële buffer (geleverd door de fabrikant), aan de CM5 sensor chip met een lage stroomsnelheid van 10 pl / min om een ​​gelijkmatige verdeling op het chip oppervlak te verkrijgen. </li><li> Verzadigen chip oppervlak met 1 mM biotine in commerciële buffer (geleverd door de fabrikant) gedurende 60 s. </li><li> Injecteer tien seriële verdunningen van oplosbare TCRs via desbetreffende stroom-cellen bij een hoog debiet van 30 ul / min bij 25 ° C. </li><li> Bereken de-equilibrium bindingsconstante(K D (E)) waarden met behulp van een niet-lineaire curve fit (y = (P1X) / (P2 + x)) 20. LET OP: y = reactie units, x = analist concentratie, P1 = r max, P2 = K D. </li><li> Voer kinetiek analyse uitgaande van een 1: 1 Langmuir binding en passen bij de gegevens met behulp van een globale-fit-algoritme in het softwarepakket 2. </li><li> Uitvoeren thermodynamica experimenten door herhaling van deze werkwijze op de volgende temperaturen: 5 ° C, 12 ° C, 18 ° C, 25 ° C en 30 ° C 19. </li><li> Gebruik de KD-waarden bepaald door SPR bij verschillende temperaturen tot Ag berekenen ° met behulp van de standaard thermodynamische vergelijking (Ag ° = -RTlnK D) 19. LET OP: R = gasconstante, T = temperatuur in K, ln = natuurlijke log. </li><li> Bereken de thermodynamische parameters volgens de Gibbs-Helmholtz vergelijking (Ag ° = AH - TΔS °) 19. </li&gt; <li> Plot de binding vrije energieën, Ag ° (Ag ° = -RTlnK D) tegen temperatuur (K) met behulp van een niet-lineaire regressie om de drie-parameter vergelijking passen (y = AH + ΔCp * (x-298) -x * ΔS- x * ΔCp * ln (x / 298)) 19. LET OP: y = temperatuur in K, x = Ag °. </li></ol> 5. Isotherme Titratie Calorimetrie (ITC) <ol><li> Voeren ITC experimenten met een isothermische titratie calorimeter. Injecteren 30 uM Phla in de caloriemeter cel en de belasting 210 uM oplosbare TCR in de spuit. Gebruik de volgende voorwaarden buffer: 20 mM Hepes (pH 7,4) bevattende 150 mM NaCl. </li><li> Voer 20 TCR injecties, elk van een 2 pl volume. Bereken AH en K D met behulp van analytische software. </li></ol> 6. Kristallisatie, Diffraction Data Collection, en verfijning van modellen <ol><li> Voeren kristallisatie proeven met een kristallisatie-robot. </li><li> Grow kristallen door vapof diffusie bij 18 ° C via de zittende druppel techniek in een 96-wells plaat met een reservoir bevattende 60 pl kristallisatie buffer (moederloog) 21. </li><li> Concentreer het oplosbare Phla tot ongeveer 10 mg / ml (0,2 mM) in kristallijne buffer door het draaien bij 3000 xg in een 10-kDa molecuulgewicht cut-off centrifugale concentrator. </li><li> Voor de co-complexe structuren, meng de TCR en Phla op een 1: 1 molaire verhouding tot een eiwitoplossing bij ongeveer 10 mg / ml (0,1 mM) te verkrijgen. </li><li> Voeg 200 nL van Phla alleen, of 1: 1 molaire mengverhouding van TCR en Phla tot 200 nL van elk reservoir oplossing uit de kristallisatie-scherm met een kristallisatie robot en scoren voor kristallen onder een microscoop na 24 uur, 48 uur, 72 h, en dan een keer per week. </li><li> Harvest enkele kristallen door ze handmatig montage in cryo-lussen onder een microscoop en cryo-koelen hen door onderdompeling en ze op te slaan in vloeibare stikstof (100 K). LET OP: Het laden van kristallen duurt een beetje pracTice, en beslissen welke kristallen goed genoeg is voor het verzamelen van gegevens wordt geleverd met ervaring. Als vuistregel geldt, hoe groter en regelmatiger de kristallen, hoe beter. </li><li> Gegevens verzamelen in een stroom stikstofgas bij 100 K. LET OP: Deze gegevens werden verkregen op de Diamond Light Source (DLS) nationale synchrotron wetenschap faciliteit in het Verenigd Koninkrijk. </li><li> Analyseer de gegevens die door het schatten van de reflectie intensiteiten met xia2 met behulp van zowel MOSFLM 22 en XDS pakketten 23, en vervolgens de schaal van de data met SCALA of doelloos 24 en de CCP4 pakket 25. </li><li> Het oplossen van de structuren met moleculaire vervanging met behulp van PHASER 26. </li><li> Pas het model met KOET 27 en verfijnen van het model met REFMAC5 28. </li><li> Bereid grafische voorstellingen met PyMOL 29. </li><li> Bereken de contacten die met behulp van de &quot;contact&quot;programma in het CCP4-pakket. Gebruik een 4 een cut-off voor van der Waals contacten en een 3,4 een cut-off voor waterstofbruggen en zout bruggen. </li><li> Bereken oppervlak complementariteit met behulp van het programma &quot;SC&quot; in de CCP4 pakket. </li><li> Bereken de kruisingshoek van het TCR-complex Phla, zoals beschreven 30. LET OP: Voor deze studie werden de reflectie data en laatste model coördinaten neergelegd bij de VOB database (PMEL17 TCR-A2-YLE-9V PDB: 5EU6, A2-YLE PDB: 5EU3, A2-YLE-3A PDB: 5EU4 en A2 -YLE-5A PDB: 5EU5). </li></ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten of concurrerende financiële belangen.

De hier geschetste protocollen bieden een kader voor de moleculaire en cellulaire ontleding van T-cel responsen in het kader van een ziekte bij de mens. Hoewel kanker was het doel van dit onderzoek hebben we zeer soortgelijke processen voor T-celreacties op virussen 32, 33, 34, 35, onderzoeken 36, 37 en bij auto-immuniteit 38, 39, 40. Verder hebben we deze technieken breder de moleculaire principes die T-cel antigen herkenning 2, 19, 41, 42 beheersen begrijpen. Inderdaad, de onvoorspelbaarheid van wijzigingen residuen peptide, zelfs diebuiten de van de TCR contactresten, impacts T-cel herkenning heeft belangrijke implicaties voor het ontwerp van heteroclitic peptiden. Deze bevindingen hebben rechtstreeks bijgedragen aan de ontwikkeling van nieuwe T-celtherapie, waaronder peptide vaccins 6, 43 en kunstmatig hoge affiniteit TCR&#39;s 3, 4, 5, 20, 44, alsmede verbeterde diagnostische 45, 46, 47. Kritische stappen in het protocol Het genereren van een zeer zuiver, functioneel eiwit essentieel voor al de in dit document aangegeven methoden. Wijzigingen en het oplossen van problemen Moeilijkheden bij het genereren van zeer zuivere eiwitten hebben vaak betrekking op de expressie van zeer-Pure, onoplosbare IB van de E. coli expressiesysteem. Gewoonlijk modificeren van de expressie protocol (bijvoorbeeld het induceren van verschillende optische dichtheden, met verschillende E. coli-stammen, of verschillende media formaties) lost deze problemen. Beperkingen van de techniek Deze technieken oplosbare eiwitmoleculen (TCR en Phla) die normaal tot expressie worden gebracht op het celoppervlak. Aldus is het belangrijk dat structurele / biofysische bevindingen komen overeen met cellulaire benaderingen biologische betekenis bevestigen. Betekenis van de techniek met betrekking tot bestaande / alternatieve methoden Met behulp van röntgenkristallografie en biofysica onderbouwd door de functionele analyse hebben wij en anderen aangetoond dat TCR specifiek zijn voor kanker epitopen algemeen gekenmerkt door lage bindingsaffiniteiten 48. Deze lage TCR affiniteit kan helpen verklaren waarom T-cellen are nature niet effectief in clearing kanker. Hoge-resolutie atoomstructuren van complexen tussen anti-kanker TCRs en verwante tumorantigenen beginnen de moleculaire basis voor deze zwakke affiniteit tonen. Bovendien zijn deze studies zijn nuttig voor het bepalen van de mechanismen die de therapeutische interventies om dit probleem te overwinnen grondslag liggen, zaaien toekomstige verbeteringen 16. In dit onderzoek onderzochten we de eerste structuur van een natuurlijk voorkomend αβTCR in complex met een gp100 HLA-A * 0201-beperkte epitoop melanoom. De structuur, in combinatie met een diepgaand biofysische onderzoek bleek de totale bindingsmodus van de interactie. Wij ontdekt ook een onverwachte moleculaire schakelaar, die zich in een gemuteerde vorm van het peptide, dat ingetrokken TCR binding (bepaald met oppervlakte plasmon resonantie) en CD8 + T-cel herkenning (functionele experimenten). Was het alleen mogelijk om dit nieuwe mechanisme van HLA antigen Presentat tonenover het gebruik van hoge-resolutie methoden beschreven. Toekomstige toepassingen of aanwijzingen na het beheersen van deze techniek Overall, onze resultaten tonen het vermogen van röntgenkristallografie en biofysische werkwijzen in combinatie met krachtige functionele analyses. Met behulp van deze benaderingen kan men ontleden precieze moleculaire mechanismen die T-cel antigen herkenning regelen. Inderdaad is het ook mogelijk om deze benadering te gebruiken om de structuur van geligeerde TCRs lossen, zien hoe conformatieveranderingen een rol kan spelen tijdens antigen discriminatie 49, 50, 51. Een beter begrip van de zeer complexe en dynamische karakter dat TCR-Phla interacties ten grondslag ligt heeft ook duidelijke implicaties voor therapie design. In staat zijn om direct te &#39;zien&#39; de moleculen die worden therapeutisch gericht zijn, evenals het effect dat wijzigingen hebben op antigen recognition, zal duidelijk verbeteren van de ontwikkeling van deze geneesmiddelen voor de toekomst. In deze studie tonen we aan dat zelfs veranderingen in een enkel peptide residu dat niet sterk wordt aangegrepen door een TCR onvoorspelbaar structurele wijzigingen van andere resten in de HLA-gebonden peptide, die op zijn beurt verandert dramatisch T-cel herkenning kan uitzenden. Een meer volledig begrip van de moleculaire mechanismen toegepast tijdens T-cel-antigeen herkenning zal grote voordelen bij het ontwerpen toekomstige therapieën voor een breed spectrum van menselijke ziekten.

Röntgenkristallografie is en zal blijven, een zeer krachtige techniek om de aard van ligand-receptor interacties begrijpen. Door visualiseren deze interacties in atomic detail, niet alleen is het mogelijk om de moleculaire mechanismen van vele biologische processen verspreiden, maar het is ook mogelijk de contacten interfaces voor therapeutisch voordeel direct kan wijzigen. In combinatie met technieken zoals oppervlakte plasmon resonantie en isothermische titratie calorimetrie (om maar een paar), dergelijke modificaties kunnen vervolgens worden geanalyseerd om de biofysisch directe invloed op bindingsaffiniteit, interactie kinetiek en thermodynamica beoordelen. Tenslotte door het functioneel experimenten relevante celtypes, een gedetailleerd beeld van de moleculaire en functionele effecten van wijzigingen aan receptor-ligand interacties kunnen worden afgeleid, waardoor specifieke mechanistische informatie. Overall, dit soort werkwijzen atomaire resolutie beeld zodat het ontmoedigen<html> ling van hoe biologische systemen werken, met bijbehorende gevolgen voor diagnostische en therapeutische vooruitgang. Ons laboratorium gebruikt routinematig deze technieken de receptoren die menselijke T-cel immuniteit tegen pathogenen en kanker bemiddelen in auto-immuniteit bestuderen en tijdens transplantatie. Hier richten we ons op de humane CD8 + T-celreactie op kanker, gemedieerd door een interactie tussen de T-celreceptor (TCR) en humaan leukocyt antigeen (HLA) -beperkte tumor afgeleide peptiden (Phla). Dit is belangrijk omdat, hoewel CD8 + T-cellen kunnen richten op kankercellen, hebben wij en anderen eerder aangetoond dat anti-kanker TCRs suboptimaal binden aan hun verwante Phla 1, 2. Zo hebben veel laboratoria geprobeerd wijziging in van de TCR 3, 4, 5 of peptide ligand 6,class = &quot;xref&quot;&gt; 7, 8 om de immunogeniteit te verhogen en gerichter kankercellen. Maar deze benaderingen niet altijd effectief en kunnen ernstige bijwerkingen, zoals off-target toxiciteit 4, 9, 10 hebben. Verder onderzoek verkennen van de moleculaire mechanismen die T-cel herkenning van kanker antigenen regelen wezenlijk belang zijn voor deze tekortkomingen te overwinnen. In deze studie hebben we ons gericht op de responsen tegen autologe melanoomcellen door CD8 + T-cellen specifiek voor een fragment van de melanocyt differentiatie antigeen glycoproteïne 100 (gp100), gp100 280-288, gepresenteerd door HLA-A * 0201 (de meest -expressed menselijk Phla klasse I). Dit antigen heeft een uitgebreid bestudeerd doelwit voor melanoom immuuntherapie geweest en is ontwikkeld als een zogenaamde &quot;heteroclitic&quot; peptide waarin een alanine vervangt valinevoor anker positie 9 tot Phla stabiliteit 11 te verbeteren. Deze aanpak werd toegepast om de inductie van melanoom-reactieve CTLs in vitro verhogen en is met succes gebruikt in klinische studies 12. Echter, wijzigingen peptide residuen kunnen onvoorspelbare effecten op T-cel specificiteit aangetoond door de slechte werkzaamheid van de meeste heterolitic peptiden in de kliniek 6, 13 hebben. Inderdaad, een heteroclitic vorm van gp100 280-288, waarin peptiderest Glu3 werd vervangen door Ala, opgeheven erkenning door een polyklonale populatie van 280-288 gp100-specifieke T-cellen 14, 15. We hebben eerder aangetoond dat zelfs kleine veranderingen in peptide ankerresten aanzienlijk kan veranderen T-cel herkenning op onvoorspelbare wijze 6, 16. Zo is de studie concentreerde zich op te bouwening een gedetailleerder beeld van hoe CD8 + T-cellen herkennen gp100 en hoe wijzigingen van de interactie tussen TCR en Phla zou deze functie beïnvloeden. Hier genereerden wij zeer zuivere, oplosbare vormen van twee TCR specifiek voor gp100 280-288 door HLA-A * 0201 (A2-YLE), evenals natuurlijke en veranderde vormen van Phla. Deze reagentia werden gebruikt voor eiwitkristallen genereren om het ternaire atoomstructuur van een mens TCR in complex met de heteroclitic vorm van A2-YLE, en twee van de mutante pHLAs in geligeerde vorm. Vervolgens gebruikten een peptide scanning aanpak het effect van peptide substituenten aan TCR&#39;s tonen door het uitvoeren van een grondige biofysische experimenten. Tenslotte, genereerden we een genetisch gemodificeerde CD8 + T-cellijn, geherprogrammeerd één van de A2-YLE specifieke TCR&#39;s tot expressie, om functionele experimenten van de biologische effecten van de verschillende peptidemodificaties testen. Deze gegevens tonen aan dat zelfs Modicaties residuen die buiten de TCR bindende motief peptide kan onvoorspelbaar domino-effect op de aangrenzende peptide residuen die teniet TCR binden en T-cel herkenning te hebben. Onze bevindingen vormen het eerste voorbeeld van de structurele onderliggende mechanismen van T-cel herkenning van deze belangrijke therapeutische doel voor melanoma.

<table><tbody><tr><td>S.O.C. media</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Orbi-Safe New Orbit incubator</td><td>Sanyo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>carbenicillin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IPTG&nbsp;</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quick Coomassie Stain SafeStain&nbsp;</td><td>Generon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Legend RT centrifuge&nbsp;</td><td>Sorvall</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris&nbsp;</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>magnesium chloride&nbsp;</td><td>Arcos</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>glycerol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonopuls HD 2070&nbsp;</td><td>Bandelin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNAse&nbsp;</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA&nbsp;</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>guanidine&nbsp;</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop ND1000&nbsp;</td><td>Thermo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peptides</td><td>Peptide Protein Research</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dithiothreitol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-arginine&nbsp;</td><td>SAFC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cysteamine&nbsp;</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cystamine&nbsp;</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dialysis tubing&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>urea&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metricel 0.45 &mu;m membrane filter</td><td>Pall</td><td></td><td></td></tr><tr><td>POROS 10/100 HQ&nbsp;</td><td>Applied biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&Auml;KTA pure FPLC system&nbsp;</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 kDa MWCO Vivaspin 20&nbsp;</td><td>Sartorius</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 kDa MWCO Vivaspin 4&nbsp;</td><td>Sartorius</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 10/300 GL column&nbsp;</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffer Saline&nbsp;</td><td>Oxoid</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BIAcore buffer HBS&nbsp;</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biotinylation kit</td><td>Avidity</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BIAcore T200</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CM5 chip coupling kit</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>streptavidin&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcal VP-ITC&nbsp;</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hepes&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gryphon crystallisation robot</td><td>Art Robbins Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Intelli-plate&nbsp;</td><td>Art Robbins Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Crystallisation screens and reagents</td><td>Molecular Dimensions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 flask&nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22 &mu;m filters</td><td>Miller-GP, Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Clear ultracentrifuge tube&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optima L-100 XP with SW28 rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD8 microbeads&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-CD3/CD28 Dynabeads&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-PE microbeads&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CK medium, PHA</td><td>Alere Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-TCRV&beta; mAb&nbsp;</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dasatinib&nbsp;</td><td>Axon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MIP-1&beta; and TNF&alpha; ELISA&nbsp;</td><td>R&amp;D Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;51Cr&nbsp;</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1450 Microbeta counter</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

via röntgenkristallografie, biophysics en functionele testen om de mechanismen van t-cel-receptorherkenning van kankerantigenen bepalen

Using X-ray Crystallography, Biophysics, and Functional Assays to Determine the Mechanisms Governing T-cell Receptor Recognition of Cancer Antigens

Menselijke CD8+ cytotoxische T-lymfocyten (CTL's) staan erom bekend een belangrijke rol te spelen bij tumorcontrole. Om deze functie uit te voeren, moet het op het celoppervlak tot expressie gebrachte T-celreceptor (TCR) humaan leukocytenantigeen (HLA)-beperkte tumor-afgeleide peptiden (pHLA) functioneel herkennen. We en anderen hebben echter aangetoond dat de meeste TCR's suboptimaal binden aan tumorantigenen. Het onthullen van de moleculaire mechanismen die deze slechte herkenning definiëren, zou kunnen helpen bij de ontwikkeling van nieuwe gerichte therapieën die deze tekortkomingen omzeilen. Inderdaad, huidige therapieën die dit moleculaire begrip missen, zijn niet universeel effectief gebleken. Hier beschrijven we methoden die we gewoonlijk in het laboratorium toepassen om te bepalen hoe de aard van de interactie tussen TCR's en pHLA de functionaliteit van T-cellen bepaalt. Deze methoden omvatten het genereren van oplosbare TCR's en pHLA en het gebruik van deze reagentia voor röntgenkristallografie, biofysische analyse en antigeen-specifiek T-celkleuring met pHLA-multimeren. Met behulp van deze benaderingen en geleid door structurele analyse, is het mogelijk om de interactie tussen TCR's en pHLA te wijzigen en vervolgens te testen hoe deze wijzigingen de antigeenherkenning van T-cellen beïnvloeden. Deze bevindingen hebben al geholpen om het mechanisme van T-celherkenning van een aantal kankerantigenen te verduidelijken en zouden de ontwikkeling van gewijzigde peptiden en gemodificeerde TCR's voor nieuwe kankertherapieën kunnen sturen.

Hier beschrijven we methoden die we vaak toepassen in het laboratorium om te bepalen hoe de aard van de interactie tussen het T-celreceptor en tumorantigenen, gepresenteerd door humane leukocytenantigenen, de functionaliteit van T-cellen bepaalt; deze methoden omvatten eiwitproductie, röntgenkristallografie, biofysica en functionele T-celleproeven.

Via röntgenkristallografie, Biophysics en functionele testen om de mechanismen van T-cel-receptorherkenning van kankerantigenen bepalen

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell ...

Het algemene doel van deze procedure is om oplosbare recumbinate T-Cell receptoren en peptide HLA-eiwitten van voldoende kwaliteit te genereren voor gebruik in biofysische en structurele analyse. Deze methode zou kunnen helpen bij het beantwoorden van vragen op het gebied van T-cellen immunologie. Bijvoorbeeld, waarom reageren T-cellen niet krachtig op kanker?Het grote voordeel van deze techniek is dat we extreem hoge resolutie mechanistische gegevens krijgen die verklaren hoe T-cellenreceptoren hun doelen herkennen, wat leidt tot door T-cellen gemedieerde immuunresponsen. De implicaties van deze techniek reiken tot therapie of diagnose van vrijwel elke menselijke ziekte omdat T-cellen een cruciale rol spelen in de meeste immuunresponsen. Hoewel deze methode inzicht kan geven in T-cel immuunresponsen, kan deze ook worden toegepast op andere systemen die worden aangestuurd door receptor ligand interacties.Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn in deze methode worstelen omdat het erg moeilijk is om oplosbare, actieve eiwitten van voldoende kwaliteit te genereren voor biofysische en structurele experimenten. Om de peptide HLA hervouwingsprocedure te beginnen, voegt u zes milliliter guanidinebuffer toe met 10 milometer dithiothreitol, 30 milligram HLA-A2 inclusielichamen, 30 milligram beta 2-M inclusielichamen en vier milligram van het gewenste peptide van interesse. Incubeer het mengsel gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius.Verdun vervolgens het mengsel met één liter HLA hervouwingsbuffer, voorgekoeld tot vier graden Celsius en roer het mengsel gedurende drie uur bij die temperatuur. Dialyseer het mengsel twee keer tegen 20 liter 10 millimolair tris, pH 8.1, voor 24 uur per keer. Om de TCR hervouwingsprocedure te beginnen, voegt u zes milliliter guanidinebuffer toe met 10 millimolair dithiothreitol, 30 milligram TCR Alpha en bèta ketting IB's.Incubeer het mengsel gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius en verdun het mengsel in één liter voorgekoelde TCR hervouwingsbuffer. Roer en dialyseer het verdunde TCR hervouwingsmengsel op dezelfde manier als het peptide HLA mengsel. Filter beide gedialyseerde hervouwingsmengsels door een 0,45 micrometer membraanfilter.Laad vervolgens een van de gefilterde hervouwingspreparaten op een 7,9 milliliter 50 micrometer anionenuitwisselingsresin kolom, voorgeëquilibreerd met 20 milliliter 10 millimolair tris, pH 8.1. Elueer het eiwit met een zoutgradiënt buffer systeem bij vijf milliliter per minuut. Verzamel één milliliter fracties en analyseer de fracties met SDS-Page.Combineer de fracties die het hervouwde eiwit bevatten. Plaats het eiwitmengsel in een centrifugaal concentrator met een moleculair gewicht van 10 kilodalton. Centrifugeer het mengsel gedurende 20 minuten of hoe lang nodig is, bij 4000 keer g, om het mengsel tot 500 microliters te concentreren.Gooi de doorstroming weg. Vorm de geconcentreerde eiwitpreparatie in een injectieloep van twee milliliter en injecteer het eiwit in een kolom voor grootte-exclusiechromatografie van 24 milliliter, voorgeëquilibreerd met de juiste elutiebuffer. Elueer het eiwit met één kolomvolume buffer bij 0,5 milliliter per minuut.Verzamel één milliliter fracties, analyseer de fracties met SDS-Page en combineer de fracties die het eiwit van interesse bevatten. Bereid 10 seriële verdunningen van de TCR oplossing voor, in een concentratiebereik dat 10 keer hoger tot 10 keer lager is dan de KD van de specifieke TCR peptide HLA interactie, indien bekend. Anders, begin met een TCR concentratie van 200 micromolair.Activeer vervolgens een carboxymethylgecoate dextransensorchip door een één op één mengsel van 100 millimolair en N-Hydroxysuccinimide en 400 millimolair EDC over de chip te laten stromen met een stroomsnelheid van 10 microliter per minuut gedurende 10 minuten, bij 25 graden Celsius. Laad vervolgens 110 microliter 200 microgram per milliliter streptavidin en 10 millimolair acetaat pH 4,5 in alle vier de stroomcellen om het chipoppervlak te functionaliseren. Deactiveer eventueel resterende reactieve groepen met 100 microliter van één molair ethanolamide hydrochloride.Laat vervolgens een oplossing van ongeveer één micromolair peptide HLA in de door de chipfabrikant verstrekte buffer over het oppervlak van de chip stromen bij 10 microliter per minuut totdat het aantal respons eenheden met 500 tot 600 is toegenomen. Verzadig het oppervlak van de chip gedurende 60 seconden met één millimolair biotin en de door de fabrikant verstrekte buffer. Injecteer vervolgens de 10 seriële verdunningen van de TCR oplossing met 30 microliter per minuut bij 25 graden Celsius.Bereken de evenwichtsbindingsconstante en voer een kineticaanalyse uit. Voer een reeks SPR-experimenten op deze manier uit, waarbij alleen de temperatuur waarbij de TCR verdunningen worden geïnjecteerd, wordt gevarieerd. Bepaal de evenwichtsbindingsconstante voor elke temperatuur en bereken de Gibbs energieën en andere thermodynamische parameters.Pluk de Gibbs energieën tegen temperatuur met behulp van een niet-lineaire regressiefitting. Concentreer de peptide HLA oplossing tot 0,2 millimolair en kristallisatiebuffer door centrifugatie bij 3.000 keer g, in een centrifugaal concentrator met een moleculair gewicht van 10 kilodalton. Bereid een 0,1 millimolair oplossing van één op één TCR en peptide HLA voor voor co-complex kristallisatie.Gebruik een kristallisatierobot en een screeningkit om kristallisatieproeven voor te bereiden met behulp van de zittende druppeltechniek in een 96-wellsplaat. Met 60 microliter kristallisatiebuffer in elk reservoir, en elke druppel bestaande uit 200 nanoliter elk van eiwit oplossing en buffer. Laat de kristallen groeien bij 18 graden Celsius.Score op kristallen onder een microscoop na 24 uur, 48 uur, 72 uur en vervolgens wekelijks. Zodra er enkele kristallen van voldoende kwaliteit zijn gegroeid, oogst u de enkele kristallen met een cryogengemakelijke lus en bewaar de kristallen in vloeibare stikstof. Voer synchrotron röntgendiffractie uit onder een st

using-x-ray-crystallography-biophysics-functional-assays-to-determine

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Het chromium afgifte assay, een gemeenschappelijke test voor het detecteren cytotoxische T-celactiviteit, heeft verschillende beperkingen. Gebruikmakende van antigeen-specifieke CD8 + T-cellen en humane borsttumor lijn, SKBR3, in dit artikel is een impedantie-gebaseerde aanpak onderzocht kan detecteren celdoding.

Het bepalen van optimale cytotoxische activiteit van de mens Her2neu Specifieke CD8 T cellen door vergelijking van de Cr51 afgifte test aan de xCELLigence System

De compartimentering van eiwitten, hetzij binnen het plasma membraan of in de intracellulaire locaties is een regulerend mechanisme die sterk kunnen beïnvloeden signalering resultaten, vandaar dat te begrijpen signalering is het van belang het bestuderen van de ruimtelijke en temporele gedrag van de betrokken eiwitten. We beschrijven hier een TIRF microscopie gebaseerde systeem om signaaltransductie in T-cellen te bestuderen, maar is breed toepasbaar.

Een TIRF Microscopie Techniek voor Real-time, gelijktijdige beeldvorming van de TCR en de bijbehorende signaaleiwitten

We beschrijven een single-cell high-throughput assay voor cytotoxiciteit van T-cellen te meten wanneer geïncubeerd met tumor doelcellen. Deze werkwijze gebruikt een dichte, elastomeer reeks sub-nanoliter wells (~ 100.000 putjes / array) ruimtelijk beperken de T-cellen en doelcellen met gedefinieerde verhoudingen en is gekoppeld met fluorescentie microscopie effector-target conjugatie en daaropvolgende apoptose controleren.

Quantitative High-throughput Eencellige cytotoxiciteit T cellen

Een stroom cytometry gebaseerde cellulaire bindende test wordt beschreven die voornamelijk als een instrument voor screening gebruikt wordt ter identificatie van stoffen die een remmende werking van de binding van een fluorescently geëtiketteerde CXC chemokine ligand 12 (CXCL12) aan de CXC chemokine receptor 4 (CXCR4).

Een stroom Cytometry gebaseerde Assay te identificeren van verbindingen die Binding van Fluorescently-geëtiketteerden CXC Chemokine Ligand 12 aan CXC Chemokine Receptor 4 verstoren

Deze paper gebruikt een stroom cytometry-gebaseerde assay naar scherm bibliotheken van chemische inhibitoren voor de identificatie van remmers en de bijbehorende doelen die van invloed zijn T-cel receptor signalering. De hier beschreven methoden kunnen ook worden uitgebreid voor high-throughput screening.

Identificatie van bemiddelaars/Mediators van T-cel Receptor signalering via de Screening van chemische remmer bibliotheken

We beschrijven een kwantitatieve real-time in vitro cytolysis assay systeem om de potentie van chimere antigeen receptor T-cellen gericht op vloeibare en solide tumorcellen te evalueren. Dit protocol kan worden uitgebreid om andere immuuneffector cellen te beoordelen, evenals combinatie behandelingen.

Een real-time potentie test voor Chimerische antigeen receptor T-cellen gericht op vaste en hematologische kankercellen

Hier beschrijven we een in vitro co cultuur methode recursief uitdaging tumor-gerichte T-cellen, die het mogelijk voor fenotypische en functionele analyse van antitumorale T cel activiteit maakt.

In Vitro Tumor cel Rechallenge voor voorspellende evaluatie van chimeer antigeen Receptor T cel antitumorale functie

Het doel van dit protocol is om te laten zien hoe rooster Light-Sheet Microscopie te gebruiken om vierdimensionaal visualiseren oppervlakte receptor dynamiek in levende cellen. Hier worden T-celreceptoren op CD4+ primaire T-cellen weergegeven.

Visualiseren van Surface T-Cell Receptor Dynamics vierdimensionaal met behulp van Rooster Light-Sheet Microscopie

Hier presenteren we een protocol om de in vivo lokalisatie van antilichamen in muizen tumor xenograft modellen te bestuderen.

Analyse van tumor- en weefselverdeling van doelantigeen-specifiek therapeutisch antilichaam

Dit protocol beschrijft de methodologie voor het niet-invasief volgen van T-cellen die genetisch gemanipuleerd zijn om chimere antigeenreceptoren in vivo tot expressie te brengen met een klinisch beschikbaar platform.

Dynamische beeldvorming van chimere antigeenreceptor T-cellen met [18F]Tetrafluoroboraat positronemissietomografie/computertomografie

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor het radioactief labelen van cellen met een positronemissietomografie (PET) radio-isotoop, 89 Zr (t1/2 78,4 uur), met behulp van een kant-en-klaar radioactief labelend synthon, [89 Zr]Zr-p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine ([89Zr]Zr-DBN). Radiolabeling van cellen met [89Zr]Zr-DBN maakt niet-invasieve tracking en beeldvorming mogelijk van toegediende radioactief gelabelde cellen in het lichaam met PET tot 7 dagen na toediening.

Positronemissietomografie Beeldvorming van celhandel: een methode voor celradiolabeling

Leer hoe je oplosbare T-celreceptor- en peptide-HLA-eiwitten genereert voor biofysische en structurele analyse met röntgenkristallografie. Deze methode biedt inzicht in T-celherkenning van kankerantigenen voor immunologisch onderzoek.

Via röntgenkristallografie, Biophysics en functionele testen om de mechanismen van T-cel-receptorherkenning van kankerantigenen bepalen (Video) | JoVE Journal

Via röntgenkristallografie, Biophysics en functionele testen om de mechanismen van T-cel-receptorherkenning van kankerantigenen bepalen

Meer video's verkennen