De productie van replicatie-defecte Retrovirus door transiënte transfectie van 293T-cellen

We zijn hier bij het Molecular Oncology Research Institute van het Tufts New England Medical Center. Mijn naam is Christina Lesco en ik ben postdoctoraal onderzoeker in het laboratorium van Dr. Rick Van. Ons laboratorium richt zich op het bestuderen van humane immuunogene leukemie, CML en CML-achtige ziekten.

We modelleren deze menselijke ziekte in muizen door het menselijke oncogen via een retrovirale vector te introduceren. De eerste stap om dit menselijke oncogen in muiscellen te brengen, is het maken van het virus zelf. De volgende stap zal zijn om het virus daadwerkelijk te titreren.

Dit is mijn plaat met stock 293T-cellen. Ik moet het medium wegwassen met PBS. 293T-cellen zijn adhesiecellen, maar ze hechten niet supersterk, dus elke beweging moet zeer voorzichtig gebeuren. Zodra het gewassen is, vervangen we de PBS door trypsine.

Om de cellen uit de plaat te lossen, moeten we de plaat ongeveer drie minuten terugplaatsen in de incubator. Na twee tot drie minuten bevinden de cellen zich in suspensie. We voegen vervolgens nog enkele ml regulier medium toe.

Dit zal de tripsine neutraliseren. Op dit punt brengen we de suspensie omhoog en omlaag om er zeker van te zijn dat alle cellen mooi in suspensie zijn; we brengen de suspensie over naar een buis van 50 ml en tellen de cellen in aanwezigheid van trypaanblauw met behulp van een hemocytometer door ze handmatig te tellen. Ik maak nu mijn verdunning zoals berekend en vervolgens ga ik 3 x 10⁶ cellen per plaat uitplaten.

In vier ml medium zorgen we ervoor dat de cellen goed zijn uitgeplaat en we plaatsen de platen terug in de incubator voor 16 tot 18 uur, wat gewoonlijk de volgende ochtend is. We zijn nu 48 uur na de GFP-virusinfectie. Chloroquine wordt gebruikt om de opname van het DNA dat we op de cellen zullen aanbrengen, te verhogen.

We hebben het medium voorzichtig bij de cellen weggezogen, die nu aan de zijkant van de platen zijn gehecht. Op dit punt plaatsen we de platen ongeveer een uur terug in de incubatoren. Ondertussen bereiden we ons DNA-mengsel voor om toe te passen op de cellen: de ene groep expresseert een neomycine-resistent gen en de andere groep expresseert GFP. Ik gebruik XI DNA om als controle te dienen voor de gehele transfectie.

Ten slotte voegen we calciumchloride toe. Het gebruik van calciumchloride verhoogt de transfectie-efficiëntie aanzienlijk. We zijn nu een uur verder; we hebben de plaatjes met chloroquine-medium gepakt en we gaan nu onze transfectie-oplossing toevoegen.

De laatste stap die we moeten uitvoeren, is het toevoegen van 1 ml steriele 2x HBS. Terwijl de 2x HBS-oplossing wordt toegevoegd, moeten we de buis gelijktijdig vortexen en de vloeistof langzaam druppelsgewijs toevoegen. Dit is om neerslag te voorkomen. Verdeel vervolgens onmiddellijk 1 ml van de oplossing over de betreffende plaat, wat we eveneens druppelsgewijs doen.

Op dit punt zijn de 2 9 3 T-cellen behoorlijk gesensitiseerd, vanwege het medium met chloroquine dat we gebruiken. We moeten ervoor zorgen dat het hele oppervlak bedekt is en de platen zo min mogelijk verplaatsen; label de plaat met het construct dat u heeft toegevoegd en herhaal dit voor het volgende construct.

Plaats de platen op dit punt gedurende zeven tot 11 uur terug in de incubator. Minstens zeven, maar niet meer dan 11 uur, omdat de cellen zeer gevoelig zijn door de chloroquine en we na deze tijd het medium moeten vervangen. We zijn nu ongeveer 30 uur na transfectie.

Dit is op dit moment onze laatste mediumwisseling; de 2 9 3 C3 T-cellen hebben confluentie bereikt. We moeten opnieuw zeer voorzichtig zijn bij het toevoegen van het nieuwe medium aan de zijkant van de plaat. Ik gebruik hiervoor een spuit van 10 ml met een naald.

Ik ga de naald vervangen door een filter, dus ik meng het medium nu goed. We hebben ons virus verzameld en kunnen dit bewaren bij -80 °C tot aan het gebruik. De eerste stap is om het virus daadwerkelijk te titeren. Er zijn verschillende gevoelige stappen bij het produceren van het virus, en de eerste daarvan is de juiste concentratie van 293T-cellen.

We zaaien ze uit met 10⁶ cellen per plaat, zodat ze na 18 uur ongeveer 80% confluent zijn. Dit geeft ze nog de tijd om verder te groeien, waardoor ze 24 uur na transfectie 100% confluent zullen zijn. Er is aangetoond dat dit essentieel is voor een uitstekende virustiter.

De volgende stap is het gebruik van chloroquine; het gebruik van chloroquine sensitiseert de 2 9 3-cellen en alle mediumveranderingen moeten zeer voorzichtig worden uitgevoerd om te voorkomen dat de gehele laag 2 9 3 T-cellen van de plaat loslaat. Ten slotte moet het DNA dat u gebruikt om virus te produceren extreem zuiver zijn. Wij maken gebruik van C-banded DNA.

Zodra we ons virus hebben, bewaren we dit bij -80 °C. Gewoonlijk volgen we dit eenmaal op, waarbij elke stap de titer van het virus twee keer verlaagt. Daarom bevriezen we het virus dat we hebben geproduceerd voordat we de eigenlijke titer van het virus bepalen.

Afhankelijk van de virussen kunnen we GFP-expressie in het virus hebben om de daadwerkelijk geïnfecteerde cellen te volgen, of kunnen we neomycine-resistentie hebben. Bovendien is het zeer belangrijk om de titer van het virus te bepalen voordat het wordt gebruikt, om consistentie tussen experimenten of tussen verschillende mutanten te kunnen waarborgen.