Name: De productie van replicatie-defecte Retrovirus door transiënte transfectie van 293T-cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-12-04T04:22:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Leer hoe u replicatie-defecte retrovirussen produceert via transiënte transfectie van 293T-cellen. Deze methode maakt veilige introductie van humane oncogenen mogelijk voor muismodellen van myeloproliferatieve ziekten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li> De avond voor transformatie, plaat 293T cellen in 3-5x10 6 cellen / 6 cm weefsel cultureplate. Opmerking: Wij gebruiken 293T-cellen voor hun gemak van transfectie en efficacyas virus producerende cellen. Deze cellen zijn deficiënt in de verpakking van het virus, tenzij een helper plasmide wordt geïntroduceerd. </li><li> De eerste ochtend, voorzichtig verwijderen medium en te vervangen door 4 ml 293T-cellen med die 25 mM Chloroquine. Zet in de incubator gedurende 1 uur. Let op: de plaat moet ongeveer 80% confluent. </li><li> Ondertussen bereiden virus-maken mengsel voor 2 borden tegelijk, in 5 ml buizen: <ol><li> 2 x 10 mg retrovirale plasmideconstruct </li><li> 2 x 5 mg verpakking construct (Ecopak), </li><li> 2 x 62 ml CaCl </li><li> compleet tot 1 ml met een steriele DDH 2 O Opmerking: Als het retrovirale plasmide codeert voor het oncogen van belang en een marker, Ecopak codeert gag-pol-env. Samen met de 293T cellen, zullen zij een ecotropic retrovirus (RV) die specifiek zijn voor muizen cellen, maar niet besmettelijk voor de menselijke cellen. Zowel Chloroquine en CaCl 2 is aangetoond dat transfectie-efficiëntie te verhogen. </li></ol></li><li> Voeg 1 ml 2x sterileHBS druppelsgewijs aan het mengsel, terwijl zachtjes vortexen de buis. </li><li> Onmiddellijk toevoegen deze oplossing tot en met 2 platen, 1 ml per stuk, zachtjes, druppel voor druppel. </li><li> Zet in incubator voor 7 tot 11 uur. </li><li> In de avond (7 tot 11 uur. Later), voorzichtig verwijderen medium, en heel voorzichtig te vervangen door 5 ml vers 293T medium. Zet in incubator tot het middaguur, de volgende dag. Let op: deze stap is belangrijk, als je nodig hebt om op te stijgen van de chloroquine van de cellen. Indien gedurende langere tijd, chloroquine is giftig. De oplossing in de platen ziet er vaag, als gevolg van een zeer fijne, stof-achtige neerslaan van de transfectie mengsel. Opmerking: Het is belangrijk om te doen alle media veranderingen met extreme zachtheid, zoals de cellen zijn gesensibiliseerd door de chloroquine, en kan gemakkelijk los van de plaat. </li><li> De volgende dag, 18 tot 24 uur. voor het ophalen van het virus (rond de middag), voorzichtig verwijderen medium, en heel voorzichtig te vervangen door 3 ml vers 293T medium. Vervang in de incubator O / N. </li><li> De derde morgen (18 tot 24 uur. Later) voorzichtig zuigen het medium vormen de platen met een 10 ml injectiespuit voorzien van een 18 G naald. Dit supernatant bevat het retrovirus. </li><li> Vervang de naald een 45 mm spuitfilter, omkeren spuit een paar keer om de oplossing goed te mengen, passeren supernatant door het filter, en aliquot in cryotubes Opmerking: Als alternatief, als u het maken van 3 + platen van virus, zwembad de hele supernatanten van hetzelfde virus in een 5 0 ml conische buis. Meng goed, dan hoeveelheid supernatanten die het retrovirus in cryotubes door te filteren. </li><li> De buizen met het virus vol supematanten worden gehouden in -80 ° C tot gebruik. </li></ol>

<ol><li>DuBridge, R. B., Tang, P., Hsia, H. C., Leong, P. M., Miller, J. H., Calos, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mutation+in+human+cells+by+using+an+Epstein-Barr+virus+shuttle+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of mutation in human cells by using an Epstein-Barr virus shuttle system.</a> Mol Cell Biol. 7, 379-387 (1987).</li>
<li>Cherry, S. R., Biniszkiewicz, D., van Parijs, L., Baltimore, D., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+expression+in+embryonic+stem+cells+and+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Retroviral expression in embryonic stem cells and hematopoietic stem cells.</a> Mol Cell Biol. 20, 7419-7426 (2000).</li>
<li>Finer, M. H., Dull, T. J., Qin, L., Farson, D., Roberts, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((kat%3A+A+high-efficiency+retroviral+transduction+system+for+primary+human+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">kat: A high-efficiency retroviral transduction system for primary human T lymphocytes.</a> Blood. 83, 43-50 (1994).</li>
<li>Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pCL+vector+system%3A+rapid+production+of+helper-free%2C+high-titer%2C+recombinant+retroviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses.</a> J Virol. 70, 5701-5705 (1996).</li>
<li>Pear, W. S., Miller, J. P., Xu, L., Pui, J. C., Soffer, B., Quackenbush, R. C., Pendergast, A. M., Bronson, R., Aster, J. C., Scott, M. L., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+rapid+induction+of+a+chronic+myelogenous+leukemia-like+myeloproliferative+disease+in+mice+receiving+P210+bcr%2Fabl-transduced+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Efficient and rapid induction of a chronic myelogenous leukemia-like myeloproliferative disease in mice receiving P210 bcr/abl-transduced bone marrow.</a> Blood. 92, 3780-3792 (1998).</li>
<li>Pear, W. S., Nolan, G. P., Scott, M. L., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+high-titer+helper-free+retroviruses+by+transient+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Production of high-titer helper-free retroviruses by transient transfection.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 90, 8392-8396 (1993).</li>
<li>Stocking, C., Kollek, R., Bergholz, U., Ostertag, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+terminal+repeat+sequences+impart+hematopoietic+transformation+properties+to+the+myeloproliferative+sarcoma+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Long terminal repeat sequences impart hematopoietic transformation properties to the myeloproliferative sarcoma virus.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 82, 5746-5750 (1985).</li>
<li>Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+chronic+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Oncol+Rep%22%5BJournal%5D)">Models of chronic myeloid leukemia.</a> Curr Oncol Rep. 3, 228-237 (2001).</li>
<li>Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+the+pathogenesis+of+BCR-ABL%2B+leukemia+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Studying the pathogenesis of BCR-ABL+ leukemia in mice.</a> Oncogene. 21, 8643-8651 (2002).</li>
</ol>

Vier kritieke punten zullen verzekeren het succes van een goede viral voorraad: <ol><li> De 293T-producerende cellen moeten zijn erg gezond, wat betekent dat ze zijn gesplitst op een zeer regelmatig schema, werden nooit overwoekerd, en zijn vergulde bij de optimale dichtheid van 3.5-5 miljoen per 6 cm weefselkweek bord, zodat ze een dichtheid te bereiken van 80% van de plaat op de ochtend van de transfectie. </li><li> Toevoeging van chloroquine verbetert de transfectie-efficiëntie en de daaropvolgende virustiter, ongeveer 3 ...

Alle gebruikte reagentia in de transfectie moeten steriel gefiltreerd (CaCl 2, 2x HBS, miliQ H 2 O) en bleef steriel.

de productie van replicatie-defecte retrovirus door transiënte transfectie van 293t-cellen

Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells

Ons laboratorium onderzoek naar menselijke myeloproliferatieve ziekten veroorzaakt door dergelijke oncogenen als Bcr-Abl of groeifactor receptor-afgeleide oncogenen (ZNF198-FGFR1, Bcr-PDGFRα, etc.). We zijn in staat om het model en een mens-achtige ziekte te bestuderen in ons muismodel, door het transplanteren van beenmergcellen die eerder geïnfecteerd met een retrovirus uiting van de oncogen van belang. Replicatie-defecte retrovirus dat codeert voor een menselijk oncogen en een marker (GFP, RFP, antibiotica-resistentie-gen, enz.) wordt geproduceerd door een transiënte transfectie protocol met behulp van 293T-cellen, een menselijke nier epitheel cellijn getransformeerd door het adenovirus E1A genproduct. 293 cellen hebben de bijzondere eigenschap dat zeer transfectable door calciumfosfaat (Capo 4), met maximaal 50-80% transfectie-efficiëntie gemakkelijk haalbaar. Hier hebben we co-transfecteren 293 cellen met een retrovirale vector uiting van de oncogen van belang en een plasmide die de gag-pol-env verpakking functies, zoals de single-genoom verpakking kat of PCL, bouwt in dit geval de Ecopak plasmide uitdrukt. De initiële transfectie wordt verder verbeterd door het gebruik van chloroquine. Voorraden ecotropic virus, verzameld als cultuur supernatant 48 uur. post-transfectie, kunnen worden opgeslagen bij -80 ° C en worden gebruikt voor infectie van cel-lijnen in het licht van transformatie en in vitro studies, of primaire cellen zoals beenmergcellen van de muis, die vervolgens kunnen voor transplantatie worden gebruikt in ons muismodel .

Deze techniek laat een efficiënte manier om replicatie-defecte retrovirale aandelen dat codeert voor een menselijk oncogen voor te bereiden, en vervolgens gebruikt voor de inductie van myeloproliferatieve ziekte in de muis model.

De productie van replicatie-defecte Retrovirus door transiënte transfectie van 293T-cellen

Ons laboratorium bestudeert humane myeloproliferatieve aandoeningen die worden geïnduceerd door oncogenen zoals Bcr-Abl of oncogenen afgeleid van groeifactorreceptoren (ZNF198-FGFR1, ...

We zijn hier bij het Molecular Oncology Research Institute van het Tufts New England Medical Center. Mijn naam is Christina Lesco en ik ben postdoctoraal onderzoeker in het laboratorium van Dr. Rick Van. Ons laboratorium richt zich op het bestuderen van humane immuunogene leukemie, CML en CML-achtige ziekten.We modelleren deze menselijke ziekte in muizen door het menselijke oncogen via een retrovirale vector te introduceren. De eerste stap om dit menselijke oncogen in muiscellen te brengen, is het maken van het virus zelf. De volgende stap zal zijn om het virus daadwerkelijk te titreren.Dit is mijn plaat met stock 293T-cellen. Ik moet het medium wegwassen met PBS. 293T-cellen zijn adhesiecellen, maar ze hechten niet supersterk, dus elke beweging moet zeer voorzichtig gebeuren. Zodra het gewassen is, vervangen we de PBS door trypsine.Om de cellen uit de plaat te lossen, moeten we de plaat ongeveer drie minuten terugplaatsen in de incubator. Na twee tot drie minuten bevinden de cellen zich in suspensie. We voegen vervolgens nog enkele ml regulier medium toe.Dit zal de tripsine neutraliseren. Op dit punt brengen we de suspensie omhoog en omlaag om er zeker van te zijn dat alle cellen mooi in suspensie zijn; we brengen de suspensie over naar een buis van 50 ml en tellen de cellen in aanwezigheid van trypaanblauw met behulp van een hemocytometer door ze handmatig te tellen. Ik maak nu mijn verdunning zoals berekend en vervolgens ga ik 3 x 10⁶ cellen per plaat uitplaten.In vier ml medium zorgen we ervoor dat de cellen goed zijn uitgeplaat en we plaatsen de platen terug in de incubator voor 16 tot 18 uur, wat gewoonlijk de volgende ochtend is. We zijn nu 48 uur na de GFP-virusinfectie. Chloroquine wordt gebruikt om de opname van het DNA dat we op de cellen zullen aanbrengen, te verhogen.We hebben het medium voorzichtig bij de cellen weggezogen, die nu aan de zijkant van de platen zijn gehecht. Op dit punt plaatsen we de platen ongeveer een uur terug in de incubatoren. Ondertussen bereiden we ons DNA-mengsel voor om toe te passen op de cellen: de ene groep expresseert een neomycine-resistent gen en de andere groep expresseert GFP. Ik gebruik XI DNA om als controle te dienen voor de gehele transfectie.Ten slotte voegen we calciumchloride toe. Het gebruik van calciumchloride verhoogt de transfectie-efficiëntie aanzienlijk. We zijn nu een uur verder; we hebben de plaatjes met chloroquine-medium gepakt en we gaan nu onze transfectie-oplossing toevoegen.De laatste stap die we moeten uitvoeren, is het toevoegen van 1 ml steriele 2x HBS. Terwijl de 2x HBS-oplossing wordt toegevoegd, moeten we de buis gelijktijdig vortexen en de vloeistof langzaam druppelsgewijs toevoegen. Dit is om neerslag te voorkomen. Verdeel vervolgens onmiddellijk 1 ml van de oplossing over de betreffende plaat, wat we eveneens druppelsgewijs doen.Op dit punt zijn de 2 9 3 T-cellen behoorlijk gesensitiseerd, vanwege het medium met chloroquine dat we gebruiken. We moeten ervoor zorgen dat het hele oppervlak bedekt is en de platen zo min mogelijk verplaatsen; label de plaat met het construct dat u heeft toegevoegd en herhaal dit voor het volgende construct.Plaats de platen op dit punt gedurende zeven tot 11 uur terug in de incubator. Minstens zeven, maar niet meer dan 11 uur, omdat de cellen zeer gevoelig zijn door de chloroquine en we na deze tijd het medium moeten vervangen. We zijn nu ongeveer 30 uur na transfectie.Dit is op dit moment onze laatste mediumwisseling; de 2 9 3 C3 T-cellen hebben confluentie bereikt. We moeten opnieuw zeer voorzichtig zijn bij het toevoegen van het nieuwe medium aan de zijkant van de plaat. Ik gebruik hiervoor een spuit van 10 ml met een naald.Ik ga de naald vervangen door een filter, dus ik meng het medium nu goed. We hebben ons virus verzameld en kunnen dit bewaren bij -80 °C tot aan het gebruik. De eerste stap is om het virus daadwerkelijk te titeren. Er zijn verschillende gevoelige stappen bij het produceren van het virus, en de eerste daarvan is de juiste concentratie van 293T-cellen.We zaaien ze uit met 10⁶ cellen per plaat, zodat ze na 18 uur ongeveer 80% confluent zijn. Dit geeft ze nog de tijd om verder te groeien, waardoor ze 24 uur na transfectie 100% confluent zullen zijn. Er is aangetoond dat dit essentieel is voor een uitstekende virustiter.De volgende stap is het gebruik van chloroquine; het gebruik van chloroquine sensitiseert de 2 9 3-cellen en alle mediumveranderingen moeten zeer voorzichtig worden uitgevoerd om te voorkomen dat de gehele laag 2 9 3 T-cellen van de plaat loslaat. Ten slotte moet het DNA dat u gebruikt om virus te produceren extreem zuiver zijn. Wij maken gebruik van C-banded DNA.Zodra we ons virus hebben, bewaren we dit bij -80 °C. Gewoonlijk volgen we dit eenmaal op, waarbij elke stap de titer van het virus twee keer verlaagt. Daarom bevriezen we het virus dat we hebben geproduceerd voordat we de eigenlijke titer van het virus bepalen.Afhankelijk van de virussen kunnen we GFP-expressie in het virus hebben om de daadwerkelijk geïnfecteerde cellen te volgen, of kunnen we neomycine-resistentie hebben. Bovendien is het zeer belangrijk om de titer van het virus te bepalen voordat het wordt gebruikt, om consistentie tussen experimenten of tussen verschillende mutanten te kunnen waarborgen.

production-replication-defective-retrovirus-transient-transfection

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Te maken lentivirussen, zijn DNA-vectoren getransfecteerd in humane 293 cellen. Na de oogst en het concentreren van de supernatant, is virustiter bepaald door fluorescentie expressie met een flowcytometer.

Lentivirus Productie

Lentivirussen zijn een waardevol onderzoeksinstrument voor het verkennen van genfunctie, maar onderzoekers kunnen wensen om de productie van pantropic bekende lentivirus codering of vermoede oncogenen te vermijden. Als alternatief, presenteren we een veiliger protocol voor het gebruik van ecotropic lentivirus op menselijke cellen aangepast aan de ecotropic receptor mSlc7a1 uit te drukken.

Transductie van menselijke cellen met Polymer-gecomplexeerd Ecotropic lentivirus voor Enhanced Biosafety

In dit protocol beschrijven we de productie, zuivering en titratie van lentivirale vectoren. Wij bieden een voorbeeld van lentivirale vector-gemedieerde gen-levering in de eerste gekweekte neuronen en astrocyten. Onze methoden kunnen ook van toepassing op andere...

De productie van lentivirale vectoren voor transduceren Cellen van het centrale zenuwstelsel

RNA-interferentie (RNAi) beschikt over een groot aantal voordelen ten opzichte van gen knock-out en is in brede kring gebruikt als een instrument in gen functionele studies. De uitvinding van DNA-vector-gebaseerde RNAi-technologie heeft op lange termijn en induceerbaar gen knockdown mogelijk, en verhoogde ook de haalbaarheid van gene...

DNA vector-gebaseerde RNA-interferentie op genfunctie in Cancer Study

Hier maken we gebruik van retrovirale transductie en concatemere transfectie van een cellijn die de componenten van een lentivirale vector (LV) in de afwezigheid van tetracycline kan uitdrukken. Dit LV GFP codeert en gepseudotypeerd met een glycoproteïne, SVGmu, dat specifiek is voor een receptor op dendritische cellen.

Een tetracycline-gereguleerde Cell Line Produceert hoge titer lentivirale vectoren die specifiek zijn gericht op dendritische cellen

De CRISPR / Cas9 systeem biedt de mogelijkheid om gerichte genoom bewerken toegankelijk en betaalbaar voor de wetenschappelijke gemeenschap. Dit protocol is bedoeld om te demonstreren hoe virussen die een gen van belang met behulp van de CRISPR / Cas9 systeem zal knock-out, en dan injecteren ze stereotaxically in de volwassen hersenen van muizen te creëren.

Ontwerpen, Verpakkingen en Levering van hoge titer CRISPR Retro en Lentivirussen via Stereotaxische Injection

We beschrijven een protocol voor het amplificeren van retrovirale integratieplaatsen vanuit het genomische DNA van geïnfecteerde cellen, het sequencen van de versterkte virus-gastheer grenzen, en vervolgens het in kaart brengen van deze sequenties naar een referentie-genoom. We beschrijven ook technieken om de verdeling van integratieplaatsen te kwantificeren ten opzichte van verschillende genomische annotaties met behulp van BEDTools.

Versterking, next-generation sequencing en Genomic DNA in kaart brengen van retrovirale integratie Sites

Hier presenteren we een protocol voor de directe omzetting van muis embryonale fibroblasten in volledig functionele en stabiele trofoblast-stamcellen door tien dagen overexpressie van Tfap2c, Gata3, Eomes en Ets2.

Protocol voor de directe omzetting van muizen embryonale fibroblasten in Trofoblast Stamcellen

We schetsen een 9-daags protocol voor de transductie en uitbreiding van rhesus macaque perifere bloedmononucleaire cellen die cellen oplevert met een uitstekende co-expressie van de genen van belang in voldoende aantal voor infusie studies van celwerkzaamheid.

Transductie en uitbreiding van primaire T-cellen in negen dagen met onderhoud van centraal geheugen Fenotype

Dit manuscript beschrijft een gedetailleerd protocol voor het genereren en zuiveren van adeno-geassocieerde virale vectoren met behulp van een geoptimaliseerde op heparine gebaseerde affiniteitschromatografiemethode. Het biedt een eenvoudige, schaalbare en kosteneffectieve aanpak, waardoor ultracentrifugatie niet nodig is. De resulterende vectoren vertonen een hoge zuiverheid en biologische activiteit, wat hun waarde bewijst in preklinische studies.

Isolatie van adeno-geassocieerde virale vectoren door middel van een eenstaps en semi-geautomatiseerd heparine-affiniteitschromatografieprotocol

Leer hoe u replicatie-defecte retrovirussen produceert via transiënte transfectie van 293T-cellen. Deze methode maakt veilige introductie van humane oncogenen mogelijk voor muismodellen van myeloproliferatieve ziekten.

De productie van replicatie-defecte Retrovirus door transiënte transfectie van 293T-cellen

Meer video's verkennen