Drosophila Voorbereiding en longitudinale beeldvorming van het hart functie in vivo met behulp van Optical Coherence Microscopy (OCM)
12 december 2016
Hier worden de experimentele protocollen beschreven voor het voorbereiden van Drosophila in verschillende ontwikkelingsstadia en het uitvoeren van longitudinale optische beeldvorming van Drosophila hartslagen met behulp van een aangepast systeem voor optische coherentiemicroscopie (OCM). De morfologische en dynamische veranderingen in het hart kunnen kwantitatief worden gekenmerkt door het analyseren van de structurele en functionele parameters van het hart uit OCM-beelden.
Het algemene doel van deze procedure is om de hartfunctie van Drosophila longitudinaal in vivo te beeldvormen met behulp van een optische coherentiemicroscopietechniek. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen te beantwoorden op het gebied van de structurele en functionele ontwikkeling van het hart van Drosophila door metrische gegevens te verstrekken, zoals veranderingen in de hartdiameter, hartslag en de hartactiviteitsperiode tijdens de metamorfose van Drosophila. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de optische coherentiemicroscopie in staat is om kleine dierlijke harten non-invasief met hoge ruimtelijke en temporele resolutie te beeldvormen.
Deze techniek kan helpen om de mechanismen van menselijke hartziekten en de relatie met hartontwikkeling te onthullen vanwege de genetische overeenkomsten die bestaan tussen Drosophila en gewervelde dieren. Deze methode kan ook worden toegepast op andere systemen, zoals optogenetische pacing voor het bestuderen of behandelen van verzwakte pacemakerfunctie in diermodellen. Wanneer je de vliegen voor dit experiment produceert, laat dan voortplantende oudervliegen zich paren en eieren leggen in een verse fles gedurende acht uur.
Zo zal de gelegde klomp eieren zich ontwikkelen tot vliegen van een vergelijkbare leeftijd. Om een larve voor OCM-beeldvorming te monteren, bereid eerst een schone zijde voor met een stuk dubbelzijdig plakband. Druk eventuele luchtbellen die zich onder het plakband bevinden naar buiten.
Gebruik vervolgens een zachte borstel om een larve van de juiste grootte uit de fles te verwijderen. Plaats de larve op een schoon tissue. Verwijder eventueel voedsel dat eraan kleeft met een bevochtigde borstel en laat het vervolgens drogen.
Bevestig nu onder een breedveldmicroscoop het ontwikkelingsstadium van de larve. Plaats vervolgens de larve met de dorsale kant naar boven voor montage. Laat vervolgens de plakplaat op de larve zakken en gebruik matige druk om deze aan het plakband te bevestigen.
Plaats de gemonteerde larve op de verstelbare tafel van het OCM-systeem langs de y-transversale richting met de dorsale kant naar boven. Een klein gaatje in de tafel zorgt ervoor dat de larve niet in contact komt met het tafelvlak. Een breed lumen van de hartbuis wordt gevonden van segmenten A5 tot A8. Gebruik de realtime beelden op de computer om het achterste gebied van de hartbuis te vinden en beweeg de tafel naar voren tot het A7-segment zichtbaar is.
Stel nu de parameters van de beeldverwerving in. Gebruik 100 A-scans per B-scan en gebruik 100 B-scans. Stel vervolgens de scannerspanning in om ongeveer 0,28 millimeter in de x-transversale richting te dekken en stel deze in op 0 volt in de y-transversale richting.
Blokkeer vervolgens de monsterstraalpadding met een donkere doek en klik op de startknop in de software om achtergrondruisgegevens te verzamelen voor achtergrondsubtraksie. Om transversale M-modusbeelden te verzamelen, pas de parameters aan naar 128 A-scans per B-scan en gebruik 4.096 B-scans. Stel vervolgens de spanning opnieuw in om 0,28 millimeter in de x-richting en 0 volt in de y-richting te dekken, zoals eerder.
Vervolgens verzamel je beelden in de transversale M-modus van het A7-segment van de vlieghartbuis. Tijdens het gegevensopslaan, blokkeer je de beeldafbeeldstraal met een donkere doek om de lichtblootstelling aan het monsterspecimen te minimaliseren. Beeld het hart vijf keer af om een betrouwbare meting van de hartfunctie te krijgen.
Gebruik voor het verzamelen van driedimensionale beelden 400 A-scans per B-scan, 800 B-scans en gebruik spanning voor 1,7 millimeter op de x-transversale en ongeveer 4 millimeter op de y-transversale. Beweeg vervolgens de microscooptafel om het hele vlieg te observeren en pas de focus aan om duidelijke beelden te zien. Om de larve te verwijderen, gebruik een natte, zachte borstel om deze over te brengen naar een nieuwe fles met vers voedsel voor verdere ontwikkeling en longitudinaal onderzoek.
Het brede lumen van de hartbuis blijft op segmenten A5 tot A8 in de popstadium PD1. Bij PD1, probeer de A7-segment af te beelden, zoals gedaan met L2 en L3 larve-stadia. De PD1 popstadium wordt geïdentificeerd door het witte poparium.
Deze tijdsvenster is ideaal voor het uitvoeren van optische beeldvorming van de vroege pop omdat de hoge transparantie leidt tot hogere lichtpenetratie voor OCM-beeldvorming. Reinig de pop met de borstel als er voedsel aan het lichaam kleeft. Monteer de pop met een natte borstel op een kleine glazen schuif en houd de dorsale kant naar boven gericht.
De schuif moet in een vliegbuis passen om de ontwikkeling van het dier in zijn eigen kamer te behouden. Droog overtollig water van de pop en plaats deze vervolgens op de tafel met de pop naar boven en ga verder met het afbeelden van het A7-segment zoals gedaan met de larve. Na het beeldvormen, breng de glazen schuif met de pop over in de buis voor continue cultuur.
Na de PD1-fase, beginnend bij de PD2, begint een conische kamer zich te ontwikkelen tussen de A1 en A4 segmenten. Omdat de pop progressief ondoorzichtiger wordt, wordt de penetratiediepte van het beeldvormingssysteem verminderd. Bij PD2 wordt de popschil geelachtig en het lichaam is minder transparant dan PD1.
Bij PD3 is de kleur van de pop nog steeds iets donkerder dan die van de PD2-fase. Tegen de PD4-fase kunnen zwarte strepen in de schaal worden waargenomen. Sommige PD4 zullen zich ontwikkelen tot volwassenen en andere zullen de PD5-fase ingaan.
In de PD5-fase zijn de zwarte strepen nog duidelijker. Pak een PD2 pop op met een pincet en monteer deze op een schuif. Zoek op het OCM-systeem het voorste uiteinde van de hartbuis en beweeg vervolgens ongeveer 50 micron naar het achterste om het A1-segment van de hartbuis te vinden.
Merk op dat in de PD2-fase de conische kamer van het hart erg klein is en mogelijk nog niet klopt. Ga door met de beeldvorming zoals
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft protocollen voor het prepareren van Drosophila in verschillende ontwikkelingsstadia en het uitvoeren van longitudinale optische beeldvorming van hartslagen met behulp van een op maat gemaakt optisch coherent microscopiesysteem (OCM). De studie karakteriseert kwantitatief morfologische en dynamische veranderingen van het hart door analyse van structurele en functionele hartparameters op basis van OCM-beelden.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Cardiale beeldvorming
- Ontwikkelingsbiologie
Achtergrond
- Drosophila dient als modelorganisme voor het bestuderen van de hartontwikkeling.
- Optische coherentiemicroscopie maakt niet-invasieve beeldvorming van harten van kleine dieren mogelijk.
- De techniek biedt een hoge ruimtelijke en temporele resolutie.
- Inzicht in de hartfunctie van Drosophila kan aanwijzingen geven over menselijke hartaandoeningen.
Doel van de studie
- Om de hartfunctie van Drosophila in vivo longitudinaal in beeld te brengen.
- Om metrieken te verkrijgen over de hartdiameter, hartslag en activiteit tijdens de metamorfose.
- Om genetische overeenkomsten tussen Drosophila en gewervelden in de hartontwikkeling te onderzoeken.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van Drosophila in verschillende ontwikkelingsstadia.
- Longitudinale beeldvorming met behulp van een op maat gemaakt optische coherentiemicroscopiesysteem.
- Analyse van structurele en functionele hartparameters op basis van OCM-beelden.
- Toepassing van de techniek op andere systemen, zoals optogenetische pacing.
Belangrijkste resultaten
- Kwantitatieve karakterisering van morfologische veranderingen aan het hart.
- Beoordeling van de hartslag en de activiteitsperiode tijdens de metamorfose.
- Het onthullen van mechanismen van hartontwikkeling en hartaandoeningen.
- Potentiële toepassingen bij het bestuderen van een verzwakte pacemakerfunctie.
Conclusies
- De OCM-techniek is effectief voor niet-invasieve beeldvorming van Drosophila-harten.
- De bevindingen kunnen bijdragen aan het begrip van menselijke hartaandoeningen.
- Deze methode kan worden aangepast voor diverse experimentele opstellingen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Longitudinale in vivo beeldvorming van de hartfunctie van Drosophila met behulp van optische coherentiemicroscopie maakt een kwantitatieve beoordeling van de structurele en functionele dynamiek van het hart over verschillende ontwikkelingsstadia mogelijk. Deze benadering ondersteunt target-validatie en mechanistische risicoreductie in de vroege ontdekkingsfase door reproduceerbare, fenotypische gegevens met een hoge resolutie te leveren die relevant zijn voor mechanismen van menselijke hartaandoeningen. De methode verhoogt het voorspellend vermogen in preklinische modellen door gestandaardiseerde, niet-invasieve monitoring van de hartslag, de periode van de hartactiviteit en morfologische veranderingen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door het kwantificeren van veranderingen in de hartslag en de perioden van cardiale activiteit tijdens de metamorfose.
- Operationele waarde: Biedt reproduceerbare, niet-invasieve beeldvorming van de cardiale functie zonder weefseldissectie of kleuring.
- Predictieve waarde: Ondersteunt fenotypische screening van genetische modifiers die de cardiale ontwikkeling en functie beïnvloeden.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve metingen van afhankelijke variabelen, waaronder hartslag, cardiale activiteitsperiode en cardiale diameter, op basis van M-mode en 3D OCM-beelden.
- Operationele waarde: Maakt standaardisatie van assays mogelijk door consistente beeldparameters en segmentatie van hartbuissegmenten A5 tot A8.
- Schaalbaarheid: Ondersteunt longitudinaal onderzoeksontwerp met herhaalde beeldsessies tijdens de larvale, poppen- en adulte stadia.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Faciliteert mechanistische risicoreductie door de cardiale dynamiek van Drosophila te koppelen aan geconserveerde genetische pathways bij vertebraten.
- Translationele continuïteit: Maakt extrapolatie van bevindingen tussen verschillende soorten mogelijk vanwege de hoge orthologie in genen voor hartziekten.
- Risicogestuurde voortgang: Ondersteunt go/no-go-beslissingen door ontwikkelingsstadia met een gecompromitteerde hartfunctie te identificeren.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode integreert in workflows voor ontdekkingsbiologie door kwantitatieve functionele read-outs te bieden die dienen als input voor de fasen van targetvalidatie en leadidentificatie.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing door middel van longitudinale tracking van hartfunctiemetrische waarden tijdens metamorfose.
- Screening: Levert assay-klare biologische systemen met gestandaardiseerde montage- en imagingprotocollen voor consistente data-acquisitie.
- Analytics: Genereert histogrammen van de hartslag en de periode van cardiale activiteit, M-mode video's en en face/axiale sectiebeelden voor comparatieve conditieanalyse.
- Translationeel onderzoek: Verbindt cardiale fenotypes van Drosophila met menselijke ziektemechanismen via gedeelde moleculaire pathways.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar imagingplatform dat toepasbaar is over verschillende ontwikkelingsstadia en genetische modellen.
Operationele impact & impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit in studies naar hartontwikkeling door middel van functionele beeldvorming met een hoge spatiotemporele resolutie.
- Operationele waarde: Garandeert reproduceerbaarheid via gestandaardiseerde preparatie, montage en stadiumspecifieke beeldvormingsparameters voor larven en poppen.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door vroege detectie van hartfenotypes mogelijk te maken, waardoor het risico op falen in een laat stadium wordt verminderd.
- Impact op portfolio: Informeert de risico-gecorrigeerde prioritering van genetische targets op basis van kwantitatieve functionele trajecten van het hart.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in de hantering van Drosophila, het bepalen van ontwikkelingsstadia en het bedienen van optische coherentiemicroscopie.
- Afhankelijk van een op maat gemaakt OCM-systeem met configureerbare A-scan/B-scan-snelheden en controle over de scanner-voltage.
- Vereist standaardisatie tussen teams van montageprocedures en de identificatie van ontwikkelingsstadia (L2/L3, PD1–PD5).
- Omvat overwegingen voor aanpassingen bij beeldvorming tijdens ondoorzichtige ontwikkelingsstadia als gevolg van toenemende pupale melanisatie.
- Beperkt door afnemende penetratiediepte in latere popstadia, waardoor beeldvormingsstrategieën moeten worden aangepast aan het stadium.
